UNIVERSIDAD DEL ATLANTICO FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS PROGRAMA DE BIOLOGIA INFORME DE LABORATORIO: TECNICA DE PCR Y ELECTROFORESIS
Rodríguez Sanjuán Deiwer Estudiante del programa de Biología de la Universidad del Atlántico
INTRODUCCION:
La técnica de PCR (Polymerase chain Reaction) es de gran utilidad hoy en día en el campo de la Biología Molecular, ya que este este método es importante a la hora de sintetizar muchas veces un pedazo o fragmentos de ADN in vitro, utilizando una polimerasa que puede resistir a muy elevadas temperaturas ya que proviene de la bacteria thermus aquaticus de ahí el nombre de taq polimerasa en el mercado. Para la realización de esta técnica tal cual como sucede en las células ha de tener todos los componentes necesarios en el tubo tales como los oligonucleótidos (necesarios para que dé inicio a la transcripción), dinucleotidos (dNTPs), y las condiciones para que se trabaje correctamente (pH, determinada cantidades de MgCl2, KCl, y pueden utilizarse otras sales y reactivos), además de agua y buffers. Para describir este método para llevar a cabo la amplificación del fragmento a estudiar se necesita pasar necesariamente por 35 ciclos (Parkers, 2003) la cual necesita de los siguientes pasos: la desnaturalización del ADN, alineamiento y extensión. Por lo anterior se dice que la reacción de PCR los fragmentos se amplifican de manera exponencial (Vierstracte, 2001).
Al final de la PCR, para saber a ciencia cierta si las reacciones funcionaron correctamente, las ampliaciones son visualizadas a través de una electroforesis en gel de agarosa. En esta práctica se tuvo como objetivo de reforzar el conocimiento sobre replicación apoyado en un método In Vitro como es la PCR Y así identificar y analizar lo que se necesita para la amplificación de un fragmento de ADN de interés. METODOS Y MATERIALES
La práctica de laboratorio donde se desarrolló la técnica de PCR y posteriormente la electroforesis para su posterior análisis, donde el primer método se utilizó dos métodos el de coctel y el Master Mix, en mi caso me correspondió trabajar con el Mater Mix, los primers de leptospira (7a y 7b), ADN y dNTPs, anteriormente se mezclaron en tubos de eppendorf con los siguientes volúmenes, el Master Mix con 56.25 μL, 3 μL de los dos primers (7a y 7b), ADN 1.25 Μl y dNTPs con 2 μL, los materiales mencionados anteriormente se mezclaron en tubos de eppendorf donde se homogenizo y se mezcló bien, para luego colocarlos en el termociclador para comenzar los ciclos necesarios, en este caso fueron 25 ciclos. Luego se llevó a cabo la electroforesis en gel de agarosa con marcador de pesos molecular de 100 pb a unos 100 voltios para dos horas para conocer y verificar si la reacción funcionó de manera eficiente y su posterior análisis.
Tubos de eppendorf
Termociclador
RESULTADOS
CALCULO COCTEL
A continuación se hará los cálculos para las respectivas concentraciones finales de cada ingrediente del coctel a) Buffer de PCR: como está 10 veces concentrado, debemos diluirlo 10 veces. Así tendremos que agregar 50 μl del tampón 10 veces concentrado,
a 500 μl de volumen final, para obtener tampó n 1 vez concentrado (1X) en la Master Mix. b) MgCl2: Se basara para calcular la C F la siguiente ecuación
CONCENTRACIÓN INICIAL x VOLUMEN INICIAL = CONCENTRACIÓN FINAL x VOLUMEN FINAL
Ci x Vi = Cf x Vf
C1 x V1 = C2 V2 50 m M x 2.5 μL = 10 m M 12.5 μL C) dNTPs
C1 x V1 = C2 V2 2 m M x 6.25 μL = 1 m M 12.5 μL D) Primers
C1 x V1 = C2 V2 10 m M x 2.5 μL = 2 m M 12.5 μL E) Dmso
C1 x V1 = C2 V2 2 % x 1.25 μL = 0.002 % 12.5 μL F) taq C1 x V1 = C2 V2
5 u / μL x 1 μL = 0.4 u / μL
12.5 μL
INGREDIENTE Buffer dNTPs Primers MgCl2 Dmso taq
C1 10X 2mM 10 m M 50 m M 2% 5 u / μL
C2 1X 1mM 2nM 25 m M 0.002 % 0.4 u / μL
V1 6.25 μL 6.25 μL 2.5 μL 2.5 μL 1.25 μL 1 μL
V2 12.5 μL 12.5 μL 12.5 μL 12.5 μL 12.5 μL 12.5 μL
Tabla 1. Concentraciones y volúmenes para llevar a cabo el coctel para la realización de PCR.
Figura 1. Electroforesis en gel de Agarosa de la PCR realizada en la práctica. DISCUSION:
Luego de realizar los protocolos pertinentes para la PCR, se obtuvieron los resultados de la electroforesis para verificar de manera más simple su amplificación en la figura 1, se puede deducir lo siguiente, como se trabajó con un marcador de peso molecular de 100 pb, que en las corridas de los pozos subrayados con los números 1, 2 y 3 que son del Master Mix, el primero puede tener aproximadamente unos 750 a 800 pb, la segunda a unos 700 pb, los otros que son por medio del coctel (4,5 y 6), la dos primeras las 4 y la 5 se observa de manera fragmentada por lo que se puede inferir un mal manejo del protocolo o
quizás también Los inhibidores pueden actuar directamente inhibiendo la acción de la Taq polimerasa o como en el caso de las proteínas y carbohidratos pueden unirse los iones de magnesio no dejándolos disponibles para la polimerasa, por lo que se puede notar en el pozo 6 donde claramente no se puede observar nada, además la calidad va disminuyendo cuando se observa los 7,8 y 9, donde el 7 y el 8 se puede observar un amplicon que puede oscilar de 600 y 200 pb respectivamente, mientras que la corrida del pozo 9 se observa un gran manchón por lo que no se puede valorar como efectivo el taq en este segmento de ADN y ya en los siguientes 3 corridas de los pozos 9,10 y 12 no se observa nada y yal cual ocurrió como en el 6, por ser del mismo medio, es decir del coctel pudo haber influido el mal manejo al igual inhibidores que no ayudaron a observar amplicones en estas zonas.
CONCLUSION
Con la experiencia y los resultados abordados durante la práctica se puede concluir que como todo protocolo que se lleve a cabo en Biología Molecular deben ser exactos no se deben cometer errores ya que así no se obtendrán los resultados esperados como sucedió en el caso de esta práctica, además nos ayudó a implementar nuestros conocimientos acerca del funcionamiento de la polimerasa en este caso de manera in vitro, de tal manera que se pudo entender mejor de como este trabaja, en que medio y en cuales condiciones para llevar a cabo su función, además que todo esto nos ayuda abrir campo sobre de tan cuán importante es la Biología molecular como herramienta para el conocimiento ya que gracias a estos métodos en este caso como lo es el PCR y toda su fundamentación ayuda a entender mejor la transcripción de manera in vivo.
BIBLIOGRAFIA
http://www.revistaaquatic.com/aquatic/html/art1501/basespcr.htm
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