INFORME N°1 DE MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA

INGENIERIA AMBIENTAL

TÍTULO: NORMAS DE SEGURIDAD SEGURIDAD EN EL LABORATORIO. LABORATORIO.

MATERIAL DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL. LIMPIEZA, DESINFECCIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIAL. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO .

INFORME DE LABORATORIO N°1

CURSO: MICROBILOGIA AMBIENTAL

BO112

PROFESOR: MARTINEZ VILA, ALVARO MARTIN

ALUMNO: ÑOPE CADILLO, VLADIMIR VLADIMIR ALCIDES

20131381B

11 DE ABRIL DEL 2014 LIMA – PERÚ PERÚ

Normas de Seguridad En El Laboratorio. Material De Laboratorio De Microbiología Ambiental. Limpieza, Desinfección Y Esterilización De Material.

OBJETIVO

A) Conocer las normas de seguridad del laboratorio B) Conocer los principales instrumentos, equipos y material de vidrio usado en un laboratorio de microbiología para el diagnóstico de enfermedades infecciosas. C) Familiarizar al estudiante con el manejo y uso adecuado de instrumentos, materiales y reactivos en la práctica microbiológica. D) Tratamiento de los materiales antes de un apractica en el laboratorio. E) Familiarizar con los distintos metodos de desinfeccion y esterilización de material.

FUNDAMENTO TÉORICO


NORMAS DE SEGURIDAD El laboratorio debe ser un lugar seguro para trabajar donde no se deben permitir descuidos o bromas. Para ello se tendrán siempre presente los posibles peligros asociados al trabajo con materiales peligrosos. Nunca hay excusa para los accidentes en un laboratorio bien equipado en el cual trabaja personal bien informado. A continuación se exponen una serie de normas que deben conocerse y seguirse en el laboratorio: A) Durante la estancia en el laboratorio el alumno debe ir provisto del guardapolvo que deberá emplearse durante toda la estancia en el laboratorio. las gafas de seguridad siempre que se manejen productos peligrosos y durante el calentamiento de disoluciones. los guantes deben utilizarse obligatoriamente en la manipulación de productos. B) Quítese todos los accesorios personales que puedan comprender riesgos de accidentes mecánicos, químicos o por fuego, como son anillos, pulseras, collares y sombreros. C) Está prohibido fumar, beber o comer en el laboratorio, así como dejar encima de la mesa del laboratorio ningún tipo de prenda. D) Como regla general no se debe pipetear nunca con la boca. E) El mechero debe cerrarse, una vez utilizado, tanto de la llave del propio mechero como la toma del gas de la mesa. F) Las heridas y quemaduras deben ser tratadas inmediatamente

NORMAS DE TRABAJO 1) Cada equipo de trabajo es responsable del material que se le asigne, además del equipo especial en caso de pérdida o daño, deberá responder de ello. 2) Al finalizar cada sesión de prácticas el material y la mesa de laboratorio deben dejarse perfectamente limpios y ordenados. 3) El material asignado a cada práctica debe permanecer en el lugar asignado a dicha práctica.

EQUIPOS DE LABORATORIO En el laboratorio existen materiales que son útiles para cada experimento y que necesitan adecuado tratamiento para su utilización en cada experimento. Es importante elegir el equipo adecuado para el trabajo microbiológico. Los proveedores de equipos científicos proporcionan una amplia gama de aparatos, materiales de vidrio y útiles de plásticos, pero por desgracia, no todos son adecuados para el uso microbiológico.

MATERIAL DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL


1) MICROSCOPIO Los microscopios más usados son el óptico de campo claro (hasta 2000 aumentos) y el electrónico (hasta 100 000 aumentos), además existen otros con fines más específicos como los microscopios ópticos de inmunofluorescencia, el de campo oscuro, el de contraste de fases y el de luz ultravioleta. Microscopio óptico: 1. Partes: 1. Mecánica. 2. Óptica. 3. Sistema de Iluminación. 2. Mecánica: a) Pie. b) Platina (Circular o rectangular fija o móvil, el vernier y el sistema de movimiento o tren). c) Tubo óptico, revólver. d) Sistema de enfoque: tornillos micrométricos y macrométricos (cremallera). 3. Sistema óptico: a) Oculares: 05-10-20X. b) Objetivos: 05-10-40-100X. 4. Sistema de iluminación:    

i)

Fuentes de iluminación: natural y artificial. Espejo: Plano y Cóncavo. Diafragma, filtros. Condensador.

USO ADECUADO Para determinar el aumento del microscopio se multiplica la cifra del ocular con la del objetivo; ambas representan el aumento proporcionado por cada lente. (Utilice los objetivos secos para pequeños aumentos). A menor aumento se requiere menor iluminación, lo cual se consigue bajando el condensador y cerrando parcialmente el diafragma. La observación de las muestras húmedas, es decir en fresco, se hace con lentes de menor aumento o sea sin inmersión; este queda para las muestras coloreadas y en general para aquellos casos en que se requiere la máxima cantidad de luz. a. Para la observación microscópica proceda según el siguiente orden: i. Ilumine empleando el espejo cóncavo o plano; la elección depende de la fuente de luz, aumentos empleados y otros factores. ii. Enfoque de preferencia con la lente de menor aumento que por lo común tiene un tope inferior que impide la ruptura de las láminas la observar. iii. Una vez enfocado el objeto, haga rotar el revólver y utilice el objetivo deseado. Para el enfoque preciso, use tornillo micrométrico. iv. Mantenerlos ojos abiertos, aunque el microscopio sea monocular.

v. Al terminar la observación limpie el objetivo con un papel especial para lente o con algodón o un lienzo fino. Si hay impregnación de aceite utilice


alcohol isopropílico en pequeña cantidad y seque bien. Las láminas una vez observadas se depositarán en un recipiente apropiado, el que contiene mezcla sulfocrómica.

2) AUTOCLAVE Una autoclave es un recipiente de presión metálico de paredes gruesas con un cierre hermético que permite trabajar a alta presión para una esterilización con vapor de agua Destinado a la esterilización con calor húmedo y presión (121°C x 15' a 15 Lbs/pulg 2 ), se esteriliza: materiales de desecho, medios de cultivo, ropa de sala de operaciones, agua destilada, etc. Las autoclaves funcionan permitiendo la entrada o generación de vapor de agua pero restringiendo su salida, hasta obtener una presión interna de 103 kPa, lo cual provoca que el vapor alcance una temperatura de 121 grados Celsius. Un tiempo típico de esterilización a esta temperatura y presión es de 15-20 minutos.

3) HORNO Destinado a la esterilización con calor seco (se llama también horno de Pasteur o Poupinel). La temperatura usual es de 180 -160°C por 1-2 horas. Se esteriliza material de vidrio e instrumentos metálicos. Posee un termostato que controla la temperatura mediante un control digital. Su aislamiento térmico es de doble pared para mantener el calor y ahorrar energía: la capa interna posee una conductividad térmica baja, y su capa exterior es metálica. También hay un espacio lleno de aire entre ambas capas como refuerzo del aislamiento. A diferencia de un autoclave, estos hornos no necesitan agua y tampoco deben resistir presiones elevadas, haciéndolos más seguros para trabajar. Esto también los hace más aptos para ser utilizados en un entorno de laboratorio. Son mucho más pequeños que las autoclaves, pero su eficacia puede ser similar. Generalmente funcionan con temperaturas más altas, en comparación con otros medios. El calor seco no permite eliminar algunas sustancias como los priones, que sí pueden eliminarse con calor húmedo. Un ciclo completo de uso consiste en calentar el horno a la temperatura requerida, mantener esta temperatura durante el intervalo de tiempo adecuado, apagar la máquina y dejar el horno cerrado hasta que los objetos se enfríen y alcancen la temperatura ambiente. Los modos estándar de funcionamiento de un horno de aire caliente son:   

1,5 a 2 horas a 160 °C (320 °F) 45 min a 1 hora minutos a 190 °C (374 °F) 30 min a 250 ºC.

A los tiempos anteriores hay que añadir el tiempo necesario para calentar la cámara antes de comenzar el ciclo de esterilización. Si la puerta se abre antes de tiempo, se escapa el calor y el proceso se queda incompleto.

4) ESTUFA O INCUBADORA Es un dispositivo que sirve para mantener y hacer crecer cultivos microbiológicos o cultivos


celulares. La incubadora mantiene la temperatura, la humedad y otras condiciones en grado óptimo, tales como el contenido de dióxido (CO2) y de oxígeno en su atmósfera interior. Las incubadoras son esenciales para una gran cantidad de trabajos experimentales en biología celular, la microbiología y en biología molecular y se utilizan para cultivos celulares, tanto bacterianos como de células eucariotas.

Proporciona una temperatura que se mantiene fija mediante un termostato; esta temperatura se elige según el requerimiento del microorganismo a cultivar. Generalmente es de 37°C por 24 a 48 horas.

5) REFRIGERADOR O NEVERA Consiste en un armario aislado térmicamente, con un compartimento principal en el que se mantiene una temperatura de entre 2 y 6 °C y también, frecuentemente, un compartimento extra utilizado para congelación a −18 °C y llamado, apropiadamente, congelador.

Permite conseguir bajas temperaturas y se utiliza con fines de conservación de gérmenes, de medios de cultivos, muestras, reactivos, etc. Por lo general se usa a temperatura de Oº a 4ºC.

6) CENTRIFUGA

El centrifugado es una sedimentación acelerada, ya que la aceleración de la gravedad se sustituye por la aceleración centrífuga.

Aparato de muy diversa capacidad que permite separar una sustancia sólida en suspensión del líquido respectivo. Por ejemplo para centrifugar orina o sangre, para obtener el "sedimento urinario o el suero" respectivamente.

7) LA BALANZA Se usa en el laboratorio para pesar colorantes, componentes de medios de cultivos,reactivos, etc. Las hay de diferentes tipos según su aplicación y sensibilidad. 8) BAÑO MARÍA El baño de María es un equipo que se utiliza en el laboratorio para realizar pruebas serológicas y procedimientos de incubación, aglutinación, inactivación, biomédicos, farmacéuticos y hasta industriales. Por lo general, se utilizan con agua, pero también permiten trabajar con aceite. Los rangos de temperatura en los cuales normalmente son utilizados están entre la temperatura ambiente y los 60 °C. También se pueden seleccionar temperaturas de 100 °C, utilizando una tapa de características especiales. Los baños de María son fabricados con cámaras cuya capacidad puede seleccionarse entre los 2 y los 30 litros. Permite la transmisión indirecta y atenuada de calor, de un líquido sobre una sustancia a través de un recipiente.Evita el calor directo.


9) AGITADOR MECÁNICO Es un equipo de diversos diseños y con frecuencia variable por el número de veces que oscilan por minuto. Se utilizan para agitar tubos, frascos, pipetas y láminas excavadas. 

Agitador magnético (con o sin calefactor): Es una placa metálica sobre la que se coloca un vaso de precipitados o recipiente de fondo plano que contiene el líquido o la disolución que debe ser agitada. En ella se introduce el imán del agitador, una pequeña barra imantada cubierta de plástico inerte. Un motor eléctrico bajo la placa produce fuerzas magnéticas que ponen en rotación el imán, provocando el movimiento circular del líquido. La velocidad de rotación puede ser controlada.

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Agitador de bandeja: La bandeja posee un movimiento circular mediante un motor que lo controla. También pueden tener movimientos de balanceo o vibraciones. Se emplean para mover cultivos celulares. A veces tienen un control termostático adicional. El movimiento puede ser orbital o de balanceo.

10) POTENCIÓMETRO Aparato destinado a determinar la concentración de iones H (pH en una solución). El de mayor aplicación es el de Beckman. 11) BOMBA DE VACÍO Produce presión negativa y se utiliza de preferencia para filtrar muestras de agua potable, a través de una membrana filtrante donde se retienen las bacterias contaminantes. 12) CONTADOR DE COLONIAS Un contador de colonias es un instrumento utilizado para contar colonias de bacterias o de otros microorganismos que crecen en una placa de agar. Se utiliza para el recuento de colonias en una placa de cultivo; de una manera más exacta y con mayor facilidad. Modo de conteo Estos contadores se utilizan para estimar la densidad de microorganismos en un cultivo líquido. Una dilución adecuada, o varias diluciones en serie dentro del rango estimado apropiado, se propaga utilizando una técnica estéril en la placa de agar, que se incubaen las condiciones adecuadas para el crecimiento hasta que aparecen las colonias individuales. Cada colonia marca el lugar donde se colocó un solo organismo originalmente, con lo que el número de colonias en la placa es igual al número de organismos en el volumen de líquido existente en la placa. Esta concentración se extrapola a partir de la dilución practicada sobre el cultivo original, para estimar la concentración de organismos existentes en ese cultivo inicial. 

13) MATERIALES DE VIDRIO: Tubos de ensayo, balones, matraces, kitasatos, vasos, probetas, buretas, pipetas, placa Petri, placas de Roux, placas de Brewer, tubos de centrífuga, tubos de vidrio de diversos calibres, pipetas Pasteur, jeringas, frascos, goteros, perlas de vidrio, embudos, micropipeta, etc.

14) OTROS MATERIALES: EN VIDRIO CORRIENTE, MADERA Y PORCELANA Láminas excavadas de vidrio, láminas portaobjetos y cubreobjetos, termómetros, mechero de alcohol, gradillas, ASA DE KOLLE o asa Bacteriológica, pinzas de madera, pilón y mortero de porcelana.


DESINFECCIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIAL Durante las secciones del laboratorio, se van manipulan diferentes tipos de muestras, los cuales pueden contener agentes infecciosos importantes, que requieren ser eliminados antes de descartar los envases respectivos. Por otro lado, existen materiales de laboratorio reusables que requieren posterior a su utilización, de una limpieza y esterilización apropiada, tal que puedan ser utilizados posteriormente. Es importante recordar que al realizar cualquier procedimiento de limpieza y desinfección, se deben tener presente las precauciones universales, los equipos de bioseguridad requeridos y considerar todas las muestras como de alto riesgo.

DEFINICION o

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o

Esterilización: Proceso que destruye toda forma de vida microbiana. Un objeto estéril (en sentido microbiológico) está libre de microorganismos vivos. Desinfección: Es la destrucción, inactivación o remoción de aquellos microorganismos que pueden causar infección u ocasionar otros efectos indeseables; la desinfección no implica necesariamente esterilización. Desinfectante: Agente usualmente químico, que mata las formas en crecimiento de los microorganismos, pero no necesariamente las esporas. El término se refiere a sustancias utilizadas sobre objetos inanimados. LA ESTERILIZACIÓN

La esterilización es un proceso a través del que se puede lograr la destrucción total de los microorganismos viables presentes en un determinando material. Este procedimiento es de gran utilidad en todo los campos de microbiología. -



El acondicionamiento del material (pipetas, tubos, placas de Petri, pinzas, etc.) que va a ser utilizado en los laboratorios de microbiología. La preparación de medios de cultivo que serán empleados con diferentes propósitos (cultivo de microorganismos, control de ambiente, equipos o personal, análisis microbiológico de medicamentos, cosméticos, alimentos, etc.). Existen diversos métodos de esterilización. La selección del método es dependiendo de cada caso o tipo de material.

Clasificación de los métodos de esterilización:

Principales métodos de esterilización, clasificados de acuerdo al tipo de agente que actúa. 1) Agentes físicos El calor se puede aplicar como agente esterilizante de dos formas: el calor húmedo el cual destruye a los microorganismos por desnaturalización de las proteínas y el calor seco que destruye a los microorganismos por oxidación de su componente celulares. El calor seco que destruye a los microorganismos es considerado en método esterilización por excelencia siempre y cuando el material esterilizarle soporte altas temperaturas sin sufrir ningún tipo de daño.


1. Esterilización por calor El calor es el método de elección para esterilizar el material de laboratorio resistente a las altas temperaturas. La temperatura y el tiempo requeridos para esterilizar un material dependen de que se esté utilizando calor seco o calor húmedo. En ausencia de humedad se necesita una temperatura más alta, ya que en esta forma los microbios son destruidos al absorber el calor. Pueden ser dos tipos:  

Directa: flameado o incineración más utilizada en la boratorios . Indirecto: aire caliente u horno de Pasteur con temperatura de 160ºC a 180ºC por 1 a 2 horas siendo el más eficaz y seguro el eléctrico.

Esterilización con calor húmedo: El calor húmedo es la forma de vapor saturado a presión es eficaz para la destrucción de todas las formas microbianas, incluso espora. La muerte de las bacterias es causada por la desnaturalización y coagulación de su proteína o su sistema intercelular enzimaproteína. Estas reacciones son catolizadas por medio del agua. 

Vapor a presión: conocido como autoclave, que posee todos los requisitos indispensables como grados de temperatura y tiempo de exposición, que junto con el tamaño del autoclave y el flujo del vapor, la densidad y el tamaño de la carga en la cámara aumentan la tasa se muerte de los microorganismos, en una temperatura de 121ºC – 132ºC durante 15 minutos o más.

2. Esterilización por radiación: La ionización por radiación genera iones al liberar electrones de los átomos, estos se desprenden violentamente con átomos adyacentes y se une a ellos, o bien sedes prenden del segundo átomo. La energía liberada se transforma en energía térmica o química la cual causa la muerte de los microorganismos al romper la molécula del ADN e impide la división molecular y la propagación de la vida. Las principales fuentes de radiación ionizante son las partículas Beta y rayos gamma. 3. Agentes químicos Algunas sustancias químicas pueden ser usadas como agentes esterilizantes porque tienen la capacidad de promover una o más reacciones químicas capaces de dañar los componentes celulares de los microorganismos (proteínas, membranas, etc.) CONTROL DEL PROCESO DE ESTERILIZACIÓN:

Todos los procesos de esterilización se deben controlar para poder asegurar que han sido efectivos. Para ello se pueden utilizar indicadores físicos, químicos y/o biológicos, los cuales deben ser colocados encada carga de esterilización. -

Indicadores físicos Entre los principales indicadores físicos se encuentran los medidores de presión y los termómetros los cuales permiten constatar las condiciones físicas dentro de la cámara de esterilización. También existen los termógrafos los cuales, además de registrar la


temperatura alcanzada en el proceso, permiten conocer durante cuánto tiempo ésta se mantuvo. -

Indicadores químicos La mayoría de estos indicadores son cintas adhesivas que se adhieren al material a esterilizar. Estas cintas están impregnadas con una sustancia química que cambia de color cuando el material ha sido sometido al proceso de esterilización. Este tipo de cintas no son completamente confiables debido a que muchas veces sólo indican que se llegó a la temperatura deseada, pero no indican por cuanto tiempo ésta se mantuvo. También existen cintas diseñadas de manera que el cambio de color es progresivo, estas cintas son un poco más seguras porque permiten estimar si el tiempo de esterilización fue el adecuado.

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Indicadores biológicos Son preparaciones de una población específica de esporas de microorganismos, las cuales son altamente resistentes a un proceso de esterilización en partic ular. Estos indicadores se deben colocar junto con la carga de esterilización, en el sitio que se considera que es más difícil que llegue el vapor y después del proceso, se deben incubar durante 24 horas en condiciones adecuadas. Si después de este periodo hay evidencia de crecimiento microbiano (por ejemplo cambio de color del medio de cultivo), el proceso de esterilización no fue satisfactorio. Cuando se utilizan indicadores biológicos se debe verificar: 

Tipo de microorganismo  Tipo de proceso de esterilización  Número de lote 

Fecha de expiración



Medio de cultivo utilizado  Condiciones de incubación del indicador después de aplicado el proceso de esterilización 

Controlar la temperatura y la humedad de las áreas de almacenamiento.



Utilizar, preferiblemente, estantes cerrados para colocar el material.

AUTOCLAVE


MICROSCOPIO

HORNO

ACENTRIFUGA

ESTUFA O INCUBADORA


AGITADOR MAGNETICO

CONTADOR DE COLONIAS

INFORME N°1 DE MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

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