MICROBIOLOGÍ INGARUCA LAZO, Katherine A Mishel LAZO CÁRDENAS,
INTEGRANTES: • • •
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ORDOEZ BALDE!N, Ga"riela #ALACIOS GALINDO, C$sar #ERALES %ILC&EZ, 'ean RA#RE ROSALES, '(ssel)n TAI#E TAI#E CONDORI Dennis
AISLAMIENTO Y SELECCIÓN PRIMARIA DE BACTERIAS
Docente: JOSÉ CARLOS AZABACHE ASMAT ASMAT
I.
II.
OBJETIVOS Aislar bacterias productoras de amilasas a partir de muestras de tierra. MARCO TEORICO Las amilasas son enzimas etracelulares !ue "idrolizan el almid#n$ % !ue puede ser producido por di&erentes microor'anismos$ entre ellos las bacterias % "on'os. Estas enzimas tienen di&erentes aplicaciones en la industria$ se utilizan para modi&icar las caracter(sticas de almidones naturales$ es asi$ !ue en panader(a % moliner(a se usa para la reducci#n de la )iscosidad de las pastas$ aceleraci#n del proceso de &ermentaci#n$ incremento del )olumen de pan$ me*oramiento de la mi'a % tetura$ mantenimiento de &rescura % sua)idad$ me*oramiento de la tetura de las pastas$ reducci#n de tiempo de mezclado$ incremento del )olumen de masa+ en cer)ecer(a$ para el proceso de malteado+ cereales$ alimentaci#n con pre cocidos para in&antes$ alimentos instant,neos+ c"ocolate % cocoa$ para la manu&actura de *arabes+ en industria alimentaria para la producci#n de edulcorantes. Actualmente en nuestro medio$ no se "an pro&undizado estudios de producci#n de amilasa$ utilizando bacterias sil)estres % sustratos de ori'en a'r(cola con alto contenido de almid#n. Este polisac,rido es ideal para la inducci#n de las permeasas !ue "idrolizan el almid#n en productos como detrinas$ maltosa % 'lucosa$ !ue lue'o de "idrolizarlos "asta monosac,ridos$ apro)ec"ados por las bacterias para su metabolismo$ la epresi#n de la enzima amilasa ecedente$ !ueda en el medio &ermentado !ue puede ser recuperada posteriormente. Las enzimas son sustancias or',nicas elaboradas por las c-lulas )i)as capaces de desencadenar % de re'ular reacciones !u(micas especi&icas en el interior o en el eterior de las c-lulas )i)as sin eperimentar modi&icaciones en su propia estructura !u(mica. Los microor'anismos como las bacterias producen enzimas$ !ue pueden ser amilasas etracelulares. Como por e*emplo de amilasa bacteriana$ se pueden citar las al&a amilasas /obtenidas &undamentalmente deBacillus subtilis0 son enzimas !ue licuan el almid#n % !ue se utilizan para la producci#n de ad"esi)os o de recubrimientos a base de almid#n para papeles $ en panader(a o en otras industrias alimentarias o para la obtenci#n de productos de desencolado en la industria tetil. Los microbios productores de enzimas pueden encontrarse en di)ersos ambientes. en ambientes marinos por e*emplo $ se "an "ec"o b1s!uedas % aislamientos de cepas de bacterias nati)as productoras de sustancias bioacti)as $ como el de las amilasas etracelulares . Estas enzimas en el sector industrial tienen un desarrollo !ue se "a producido
en &orma eplosi)a en los 1ltimos a2os. Las amilasas se emplean como aditi)os en la industria alimentaria. En el aislamiento de bacterias productoras de amilasas etracelulares se utiliza el m-todo de &ormaci#n de macro colonias. Es necesaria un medio base al cual se le incorpora el sustrato correspondiente a una concentraci#n determinada. La acti)idad enzim,tica de las cepas sobre los sustratos en prueba se determina por la presencia % tama2o de la zona de "idr#lisis alrededor de las macro colonias. 2.1. Enzima amilasa: Acción y clasificación
Las amilasas son enzimas las cuales "idrolizan mol-culas de almid#n dando como productos detrinas % pol(meros compuestos pro'resi)amente por unidades de 'lucosa Esta &amilia de enzimas "idrol(ticas esta compuesta por a prote(nas catal(ticas al&a3amilasa$ beta3amilasa+ 'lucoamilasa+ isoamilasa. Se encuentran ampliamente distribuidas en te*idos )e'etales$ donde *ue'an un rol mu% importante en la de'radaci#n del almid#n en la 'erminaci#n de las semillas+ en te*idos animales$ cumpliendo una misi#n di'esti)a+ % en di)ersas especies de microor'anismos como "on'os % bacterias . Como bien es conocido las cadenas de almid#n est,n compuestas por dos 'randes sub3cadenas$ amilosa % amilopectina. La al&a3amilasa se caracteriza por atacar los enlaces 4$53al&a3'licos(dicos en el centro de la cadena de los polisac,ridos$ por lo !ue se la conoce como endoamilasa$ produciendo 'lucosa$ maltosa % oli'osac,ridos. La enzima al&a3amilasa en su accionar de'rada la amilosa en maltosa % pe!ue2os compuestos de 'lucosa. Sin embar'o$ esta enzima solo es capaz de de'radar parcialmente la amilopectina % el 'luc#'eno debido a !ue no es capaz de desdoblar los enlaces 'licosidicos436 encontrados en los puntos de rami&icaci#n de la cadena del polisac,rido. 7or otro lado$ La beta3amilasa$ presente en plantas % bacterias$ tambi-n cumple la &unci#n de de'radar los enlaces 4$53a3'lucos(dicos pero comienza su acci#n por el etremo libre no reductor del almid#n$ liberando maltosa al i'ual !ue la enzima al&a3amilasa. La "idr#lisis se detiene en los puntos de rami&icaci#n de la amilopectina % el residuo se conoce como detrina l(mite. La pululanasa o isoamilasa$ tambi-n perteneciente a la esta &amilia$ "idroliza los enlaces 4$63al&a3'licos(dicos !uitando las ramas de la amilopectina o las detrinas. Si eiste un acompa2amiento 'eneral del comple*o de las amilasas se puede lo'rar e&ecti)a una de'radaci#n total del almid#n. En cuanto a la nomenclatura de las enzimas de la &amilia amilasa$ mundialmente se reconoce a la comisi#n enzimolo'ica /E.C.0 !uien es el encar'ado de identi&icar a todas % cada una de las enzimas eistentes. Este instituto reconoce la enzima al&a3Amilasa como E.C. 8.9.4.4. Su
nombre sistem,tico es al&a34$53'lucan353'lucano"idrolasa. Otros nombres comunes en el comercio % el ,mbito cient(&ico son 'luco'enasa % endoamilasa. Estas se caracterizan en lle)ar a cabo la reacci#n de endo"idr#lisis !ue se sit1a de los enlaces 4$53al&a3:3'lucosidicos en polisac,ridos !ue contienen 8 o m,s enlaces 4$53al&a3:3'lucosidicos. Los 'rupos reducidos son liberados en una con&i'uraci#n al&a. Este termino al&a$ esta relacionado con la con&i'uraci#n anom-rica inicial de los 'rupos de azucares liberados . ;3amilasa bacteriana /EC 8.9.4.40. La ;3amilasa "idroliza el enlace 'lucos(dicos interno dando lu'ar a productos de ba*o peso molecular$ solubles % menos )iscosos$ cu%a ruptura est, limitada por la presencia de los enlaces 'lucos(dicos a3436 en los puntos de rami&icaci#n de la mol-cula del almid#n nati)o /amilopectina0. Los productos de "idr#lisis tienen con&i'uraci#n a en la 'lucosa del etremo reductor. Se piensa !ue la enzima act1a por la acci#n combinada de los 'rupos carboilo e "istidina del centro acti)o. Las a3amilasas obtenidas de Bacillus subtilis )ar am%ioli!(tedaciens tienen un ion calcio &uertemente li<'ado por mol-cula$ !ue es necesario para la acti)idad de= enzima % !ue lo esta? @C % p ?$?3 como una alternati)a a la utili
Estas dos amilasas pueden ser distin'uidas una de otra$ mediante el punto de inacti)aci#n !ue presentan a un p determinado. La enzima al&a3amilasa es inacti)ada a un p en el ran'o de 5.> 3 ?.. Mientras !ue a este mismo ran'o la beta3amilasa es estable. La enzima E.C. 8.9.4.9.$ es inacti)ada en un p alrededor de 6.3.$ % en caso reciproco las al&a3amilasa son estables ba*o estas condiciones . Otra enzima perteneciente a esta peculiar &amilia es la lucoamilasa tambi-n reconocida como amilo'lucosidasa. En la nomenclatura internacional esta identi&icada como E.C.8.9.4.8.$ % su nombre sistem,tico es 4$53al&a3:3'lucano 'luco"idrolasa. Su &unci#n es actuar en la reacci#n de "idr#lisis en cadenas de polisac,ridos operando en los enlaces 4$53al&a3:3'lucosa !ue est,n de manera residual despu-s de "aberse epuesto la cadena a la acci#n de al&a % beta amilasa . El principal producto &inal de la acci#n de la 'lucoamilasa sobre el almid#n es 'lucosa$ lo !ue la di&erencia claramente de la al&a % beta amilasas. La enzima tambi-n produce pe!ue2as cantidades de oli'osac,ridos. La sacari&icaci#n del almid#n puede alcanzar "asta F6D de detrosa. La acci#n de la enzima causa in)ersi#n de la con&i'uraci#n$ produciendo beta3'lucosa. Las 'lucoamilasas son inacti)as sobre almid#n nati)o. III.
MATERIALES G 7ROCE:IMIEHTO a. MATERIALES
•
Muestra
•
Medio de culti)o
•
A'ar Almid#n Etracto de Le)adura
Reacti)os$ colorantes % soluciones
•
Tierra de culti)o
A'ua destilada est-ril Alco"ol %odado Almid#n Soluci#n de lu'ol Set de coloraci#n RAM Soluci#n salina &isiol#'ica
Materiales de )idrio
Asa :ri'las% Ba'uetas Beaer ? Ml L,minas porta ob*etos
•
E!uipos
•
7ipetas de 4 mL % 4 mL 7lacas 7etri
Estu&a Microscopio.
Otros
Asa bacteriol#'ica$ Al'od#n$ Balanza$ Colador$ radillas$ 7lum#n indeleble.
b. 7ROCE:IMIEHTO Pre enriquecimiento
Recolectamos adecuadamente las muestras del suelo Colocamos en bolsas de polietileno de primer uso Transportamos al laboratorio Adicionamos almid#n$ c,scaras de tub-rculos$ ra(ces u otros desec"os !ue conten'an almid#n Remo)emos % "umedecimos diariamente por 6 d(as.
Preparación de las muestras de tierra
Cumplido el tiempo de pre enri!uecimiento$ "omo'enizamos la muestra adecuadamente Retiramos las part(culas 'ruesas$ como ramas$ piedras$ etc. Tamizamos con la a%uda de un colador 7esamos 4 ' de suelo % colocamos en un beacer conteniendo F mL de a'ua destilada. omo'enizamos Calentamos la muestra a >?@C acemos diluciones decimales en a'ua destilada est-ril.
Cultivo
IV.
Sembramos $4 mL de las tres 1ltimas diluciones$ de la muestra sometida a tratamiento t-rmico$ en placas conteniendo a'ar almid#n Incubamos a 8@C durante 95 a 5> "oras.
RESLTA:OS 4. :iluci#n a
−2
10
A partir de la diluci#n
−2
10
de las
muestras de suelo$ se obser)a abundantes colonias de bacterias$ no est,n mu% ale*adas
•
Colonias de color blanco$ cremosas Con bordes lisos o irre'ulares. Colonias ple'adas Cantidad de colonias. 9F
•
KC 8
• • •
9. :iluci#n a
1
10
−3
10
A partir de la diluci#n
−3
10
de las muestras
de suelo$ se obser)a mu% pocas colonias de bacterias !ue est,n mu% ale*adas
•
Colonias de color blanco$ cremosas Con bordes lisos o irre'ulares. Colonias ple'adas Cantidad de colonias. 4>
•
KC 9
• • •
1
10
Ho se obser)a producci#n de amilasa
8. :iluci#n a
−4
10
−4
A partir de la diluci#n 10 de las muestras de suelo$ se obser)a mu% pocas colonias de bacterias !ue est,n ale*adas • • • •
Colonias de color blanco$ cremosas Con bordes lisos o irre'ulares. Colonias ple'adas Cantidad de colonias. 95 1
KC 9 10 Se obser)a producci#n de amilasa /8 manc"as blancas0 •
5. :iluci#n a
−5
10
A partir de la diluci#n
−5
10
de las muestras
de suelo$ se obser)a pocas colonias bacterias !ue est,n mu% ale*adas
•
Colonias de color blanco$ cremosas Con bordes lisos o irre'ulares. Colonias ple'adas Cantidad de colonias. 94
•
KC 9
• • •
de
1
10
Ho se obser)a producci#n de amilasa
V.
VI.
:ISCSINH :E RESLTA:OS
Al sembrar 4l diluciones de "asta 44 de la muestra de suelo en las placas se obtu)o crecimiento masi)o en la placa /440 con tan solo 95 "oras de incubaci#n$ pero en estas muestras la presencia de KC es in&erior a 5 46'.7or otro lado$ se pudo comprobar la presencia de las bacterias con acti)idad amilasa en la tierra. Tambi-n podemos notar !ue al realizar una siembra pro&unda es m,s probable obtener KC$ pues puede darse una separaci#n de c-lulas bacterianas % la muerte de ciertas bacterias sensibles al calor.
Al sembrar las bacterias de amilasas aisladas en 5 placas de a'ar almid#n$ se pudo notar !ue en 9 de ellas se dio la p-rdida de acti)idad enzim,tica$ este &en#meno pudo "aberse dado por contaminaci#n o por desacti)aci#n del sistema !ue desencadena la producci#n de enzima. La desacti)aci#n se pudo producir por la presencia de &uentes de carbono de menor tama2o !ue el almid#n en el medio$ "aciendo innecesaria la producci#n de amilasas. Esto concuerda con la in)esti'aci#n realizada por :"arani en 95$ en la !ue establece !ue la producci#n de amilasas depende de la naturaleza de la &uente de carbono$ siendo la me*or el almid#n.
COHCLSIOHES ?. La amilasa es una enzima !ue "idroliza al almid#n !ue tiene m1ltiple aplicaciones$ esta enzima tiene tres tipos al&a$ beta % ome'a$ obteni-ndose a partir de &uentes animales$ )e'etales % microbianas+ teniendo como &uente m,s usada para el aislamiento de bacterias productoras de amilasa al suelo$ para nuestro
an,lisis utilizamos tierra de suelo enri!uecida con almid#n$ !ue nos permiti# obser)ar "ab(a bacterias !ue produzcan amilasa$ % elencontrando como resultado positi)o en dos placas en diluci#n − − a 10 % en diluci#n 10 $ pero con ma%or presencia en la de 2
−2
10
VII.
4
.
Obser)amos la producci#n de amilasa solo en dos placas 7etri con un crecimiento de manc"as blancas &orm,ndose colonias bacterianas$ pero notamos !ue en dos placas no "a% producci#n de amilasa %a !ue no se presenci# nin'una acti)idad$ esto debido a contaminaci#n o por desacti)aci#n del sistema !ue desencadena la producci#n de enzima.
En las si'uientes colonias obser)amos un color blanco cremoso con bordes lisos % ple'adas &orm,ndose as( numerosas colonias en las di&erentes placas unas ale*as entre si % otras no tanto.
CESTIOHARIO 1. Finalidad de aislar productoras de amilasa
Tiene el &in de optimizar procesos % con)ertirlos en bioprocesos /proceso !ue usa c-lulas )i)as completas o sus componentes para obtener los cambios &(sicos o !u(micos deseados en la industria0 La amilasa es la enzima m,s estudiada en este campo debido a su in&luencia directa en la de'radaci#n del almid#n uno de los productos alimentarios m,s eplotados a ni)el mundial. 2. ¿Por qu se calienta la muestra a !"# C$
:ebido a !ue las al&a amilasas pueden ser obtenidas de di&erentes &uentes !ue di&ieren en el 'rado de "idrolisis !ue presentan sobre la mol-cula del almid#n$ as( como en su estabilidad t-rmica$ por e*emplo la al&a amilasa bacteriana puede ser utilizada a temperaturas de >?@ C o ma%ores$ mientras !ue la al&a amilasa producida por "on'os se inacti)an alrededor de los 6@ C. Las a3amilasas obtenidas de Bacillus subtilis )ar am%ioli!(tedaciens tienen un ion calcio &uertemente li<'ado por mol-cula$ !ue es necesario para la acti)idad del enzima % !ue lo esta3biliza en 'ran medida &rente al calentamiento. %. ¿&u microor'anismos productores de amilasa soportan altas temperaturas$
Bacillus coa'ulans Bacillus lic"eni&ormis
Bacillus stearot"ermop"ilus
(. ¿Por qu se )usca tener menor colonias productoras de amilasa$
7ara obser)ar el crecimiento del microor'anismo productor de amilasa % comparar &rente a otros microor'anismos en i'ual condici#n e identi&icar el !ue tiene ma%or crecimiento % la me*or &uente de "idrolisis de almid#n. ". Cómo se procede para aislar microor'anismos que de'raden amilasa$
Cultivo Est*tico En el culti)o est,tico$ la celulosa se obtiene
en &orma de 'el$ en el cual la celulosa es aproimadamente el 4D del peso total. Estudios realizados muestran !ue$ en un primer estado$ el microor'anismo incrementa su poblaci#n 'racias al consumo de o('eno disuelto !ue se encuentra en el medio de culti)o+ durante este tiempo$ el microor'anismo sintetiza cierta cantidad de celulosa en el medio l(!uido. S#lo las bacterias !ue se encuentran cerca de la inter&ase airePmedio de culti)o % tienen disponibilidad de o('eno$ pueden mantener su acti)idad % producir celulosa$ la cual &orma capas superpuestas+ a medida !ue transcurre el tiempo de &ermentaci#n$ el espesor de la pel(cula se incrementa por la 'eneraci#n de nue)as capas en la super&icie$ &ormando una estructura de capas suspendidas en el medio de culti)o. El principal incon)eniente con las &ermentaciones en culti)o est,tico es !ue se re!uiere de tiempos lar'os % una 'ran ,rea super&icial$ lo !ue no "ace pr,ctica su producci#n a 'ran escala.
Cultivo A'itado: Al realizar las &ermentaciones en culti)o
a'itado se pueden obtener pellets de celulosa o a'lomeraciones amor&as de las &ibras$ los cuales dependen del tipo de reactor % condiciones de operaci#n empleados. Estos culti)os pueden realizarse por lotes o en continuo$ en reactores de tan!ue a'itado o airli&t. El culti)o a'itado se in)esti'a con miras a escalar el proceso a ni)el industrial$ pero las ba*as producti)idades reportadas$ menores !ue en culti)os est,ticos$ "acen !ue no sea &,cil su escalamiento+ la ba*a producti)idad obedece al "ec"o de !ue la a'itaci#n &a)orece el crecimiento de c-lulas no productoras de pol(mero !ue consumen el sustrato$ denominadas celulosa/30+ al'unos autores atribu%en este &en#meno a mutaciones !ue lesionan la ma!uinaria enzim,tica encar'ada de la polimerizaci#n de la 'lucosa. 7or otra parte$ se "an aislado % caracterizado cepas
altamente productoras en culti)o a'itado$ tales como Acetobacter %linum BCR?$ Acetobacter %linum subsp. sucro&ermentans B7R94 % Acetobacter sp. AF+ la producci#n encontrada es 4.5$ 5. % 9.8 )eces superior respecti)amente con relaci#n a la reportada empleando la cepa caracterizada ATCC 495?. n incon)eniente adicional !ue presenta este m-todo de culti)o es la "abilidad de las c-lulas de Acetobacter para con)ertir la 'lucosa en ,cidos 'luc#nico % ceto'luc#nico$ por lo !ue se consume la 'lucosa del medio en detrimento del rendimiento para la celulosa. +. ,dentificación de la -idrolisis de almidón.
El lu'ol con el almid#n &orman un comple*o color ca&-3purpura !ue desaparece cuando el almid#n "a sido de'radado. . ¿Cómo se procede de'radan prote/nas$
para
aislar
microor'anismos
que
El aislamiento de cepas puede lle)arse a cabo del si'uiente es!uema a partir de una muestra de suelo La muestra de suelo se suspende en a'ua est-ril. El sobrenadante se dilu%e 434 a 434 )eces. Muestras de estas series de diluciones /c.a. 4 QL0 se siembran sobre )arios medios de culti)o /dependiendo del tipo de microor'anismos !ue !ueramos aislar0 % lue'o se incuban. Se a(slan colonias separadas de distinta mor&olo'(a % se puri&ican por resiembra. Los culti)os puros se mantienen en tubos de ensa%o como culti)os en medio s#lido listos para realizar las pruebas de selecci#n. procedimiento de selecci#n puede ser acelerado El &recuentemente probando la acti)idad biol#'ica de los aislados iniciales directamente. VIII. •
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BIBLIORAKIA Broc Biolo'(a de los microor'anismos. 4 edici#n /980. J. 7arer$ J.M. Martino$ M.T. Madi'an. 7earson Education. Manual 7r,ctico de Microbiolo'(a. 8 edici#n /9?0. R. :(az$ C. amazo$ I. L#pez3o2i. Else)ier3Masson. 7resccot$ L. M.$ arle%$ J. 7.$ :.A. 4FFF. Microbiolo'(a. Cuarta edici#n. Mc ra ill Interamericana. M-ico. :a)is$ B. :.$ :ulbecco$ R. 4F>. Tratado de Microbiolo'(a. 9da. Edici#n. Ed. Sal)at Editores. Espa2a.
I.
AHEOS
MUESTRAS DE ALMIDON
TUBOS DE ENSA*O CON LAS MUESTRAS DE TIERRA
IMAGEN DE LA TIERRA NUTRITI%A &IR%IENDO
TUBOS DE ENSA*O UBICADAS DEACUERDO A SU DEGRADACION
#i.ete( e la +-estra .ara s- sie+"ra
Sie+"ra en esta( e esterilia
Se+"ra( e la +-estra en al+i(n
Sie+"ra e las +-estras