ISOLASI DNA KROMOSOM BAKTERI
Oleh: Nama NIM Kelompok Rombongan Asisten
: Kasriati Heruningsih Heruningsi h : B1J011155 :3 : IV : Roman Bramandita
LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER
KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2013
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Asam nukleat yang merupakan polimer dari molekul nukleotida.Asam nukleat ini terikat protein dalam sel (nukleoprotein). Untuk mengisolasi DNA dari suatu sel maka dilakukan pemisahan antara protein dan asam nukleat dengan mengekstrasi nukleoprotein yang terdapat dalam sel. Isolasi DNA merupakan langkah untuk mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi.
Sentrifugasi
merupakan
teknik
untuk
memisahkan
campuran
berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell et al ., ., 2000). Dua tipe utama asam nukleat adalah asam dioksiribonukleat (DNA) dan asam ribonukleat (RNA). DNA terutama ditemui dalam inti sel, asam ini merupakan pengemban kode genetik dan dapat memproduksi atau mereplikasi dirinya dengan tujuan membentuk sel-sel baru untuk memproduksi organisme itu dalam sebagian besar organisme, DNA suatu sel mengerahkan sintesis molekul RNA, satu tipe RNA, yaitu messenger RNA (mRNA), meninggalkan inti sel dan mengarahkan tiosintesis dari berbagai tipe protein dalam organisme itu sesuai dengan kode DNA-nya (Fessenden, 1990). DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molecul (molekul utama) yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida .Molekul DNA ini terikat membentuk kromosom, dan ditemukan di nukleus, mitokondria dan kloroplas. DNA yang menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang tersusun heliks
ganda
(double
helix),
dimana
basa
nitrogen
dan
kedua
”benang”
polinukleotida saling berpasangan dalam pasangan yang tetap melalui ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang satu dengan nukleotida yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup dan disebut
sebagai ”cetak biru kehidupan” karena molekul ini berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan struktur protein dan proses metabolisme lain (Istanti, 1999). B. Tujuan
Tujuan praktikum kali ini adalah mengetahui prinsip serta proses isolasi DNA kromosom dan mengisolasi DNA kromosom bakteri E. bakteri E. coli. coli.
II. MATERI DAN METODE
A. Materi
Bahan yang digunakan adalah isolat cair E. coli, coli, buffer TE 1x, tenderizer 30%, SDS 10%, etanol absolut, kloroform, isopropanol, alkohol 70% dan akuades. Alat yang digunakan adalah mikrosentrifuga, tabung eppendorf, inkubator, sarung tangan, seperangkat mikropipet beserta tipnya, lemari pendingin ( freezer freezer ), ), kertas tisue dan kamera digital.
B. Metode
1. Isolate E. coli cair dimasukkan ke dalam tabung eppendorf sebanyak 1,5 ml. kemudian disentrifugasi selama 3 menit pada kecepatan 5000 rpm dengan suhu 25o C. 2. upernatan dibuang, lalu tambahkan ml akuades kemudian dibolak - balik balik entrifugasi lagi selama menit pada kecepatan rpm dengan suhu 3. Supernatan dibuang, lalu tambahkan 50 µl tenderizer 30% kemudian diinkubasi o
selama 1 jam pada suhu 37 C. 4. Hasil inkubasi ditambahkan 50 µl SDS 10% lalu digoyang-goyang. Setelah itu disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 10000 rpm. 5. Supernatan dipindahkan ke tabung eppendorf baru sebanyak 100 µl kemudian ditambahkan klorofom dengan perbandingan 1:1. 6. Sentrifugasi lagi selama 10 menit pada kecepatan 10000 rpm. Supernatan dipindahkan lagi ke tabung eppendorf baru sebanyak 100 µl dan ditambahkan etanol absolut dengan perbandingan 1:1. Diendapkan selama 7 x 24 jam didalam freezer. 7. Hasil inkubasi disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 10000 rpm pada o
suhu 4 C. Supernatan dibuang, lalu tambahkan alkohol 70% sebanyak 1000 µl. 8. Sentrifugasi lagi selama 10 menit pada kecepatan 10000 rpm, lalu buang supernatan dan tabung eppendof dibalik. 9. Sebanyak 50 µl larutan buffer TAE 1x ditambahkan kemudian dielektroforesis dan hasilnya didokumentasikan.
III.
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil
Gambar 1. Hasil Isolasi DNA Bakteri E. Bakteri E. coli
B. Pembahasan
Setiap sel baik itu prokariotik, eukariotik, maupun archaea mempunyai informasi hereditas yang dikode oleh DNA. Eukariotik memiliki DNA berbentuk linier yang terdiri atas segmen-segmen dan terikat dengan protein untuk membentuk kromosom yang tersimpan di dalam nukleus. Berbeda dengan bentuk DNA eukariotik, DNA prokariotik berbentuk sirkular untai ganda yang terletak terletak di dalam sitoplasma (Raven and Johnson,1989). Eukaryota mengandung DNA lebih banyak dibandingkan dengan prokaryota. Sebuah sel jamur lendir, salah satu yang tergolong eukaryota tingkat rendah, mengandung hingga 10 kali DNA sel E. coli. coli. Sel lalat buah ( Drosophilla Drosophilla melanogaster ) yang umumnya digunakan dalam penelitian genetika mengandung DNA 25 kali lebih banyak dibandingkan dengan DNA sel E. sel E. coli. coli. Setiap molekul sel eukaryota mengandung satu molekul DNA dupleks berukuran besar, yang dapat mencapai 4-100 kali ukuran DNA sel E. sel E. coli. coli. Sebagai contoh, panjang DNA salah satu kromosom terkecil pada manusia kira-kira 30 nM, hampir 15 kali lebih panjang dari DNA E. coli. coli. Ukuran molekul DNA didalam 46 kromosom manusia pada sel manusia tidak sama tetapi bervariasi pada kisaran 1-24 kali. DNA eukaryota berbentuk linier. Masing-masing kromosom dalam eukaryota membawa serangkain gen yang bersifat unik dan semua gen pada tiap sel menyusun genom. DNA dalam organisme prokariot umumnya tidak bergabung dengan protein selain protein yang terlibat dalam replikasi atau transkripsi DNA. Banyak DNA dalam organisme eukaryota terbungkus dalam sejumlah protein. Protein dan DNA ini membentuk suatu struktur kompleks, yaitu kromatin yang memungkinkan adanya sejumlah besar konfigurasi molekul DNA dan tipe-tipe pengendalian yang unik bagi organisme eukaryota. Informasi genetik dalam DNA sebuah kromosom dapat dialihkan melalui replikasi yang tepat, atau dapat ditukar lewat sejumlah proses yang mencakup persilangan, rekombinasi, transposisi dan konversi. Semua ini menghasilkan suatu sarana untuk dapat memastikan kemampuan adaptasi dan keanekaragaman bagi organisme tersebut, kendati juga dapat mengetahui adanya suatu penyakit (Jusuf, 2001). Isolasi DNA merupakan proses pemisahan dan pengambilan molekul DNA dari sel serta materi intrasel lainnya. Isolasi DNA genom sangat penting dalam rangka pengklonan DNA atau gen sasaran. Konstruksi pustaka genom dan
pengklonan DNA membutuhkan DNA yang utuh agar fragmen DNA betul-betul berasal
dari
proses
pemotongan
enzimatik
yang
sangat
spesifik.
Apabila
terpotongnya DNA bukan karena reaksi enzimatik, maka fragmen DNA tersebut sulit disa di samb mbun ungk gkan an deng de ngan an DNA DN A dari da ri vektor vektor pengkl pengklona onan. n. Oleh Oleh seba sebab b itu, itu, isola isolasi si DNA DNA genom genom yang yang utuh sangat diperlukan bila DNA tersebut akan diproses untuk pengklonan (Anam, 2010). Menurut (Jusuf, 2001), isolasi DNA kromosm bakteri secara garis besar meliputi tahap-tahap (1) pemanenan sel, (2) perusakan dan pembuangan dinding sel, (3) lisis sel, (4) pembuangan remukan sel, serta (5) pemisahan DNA dari protein dan RNA. Pemanenan sel dilakukan dari biakan yang telah diinkubasi sebelumnya. Perusakan dinding sel antara lain dapat dilakukan dengan pemberian lisozim, sedangkan untuk lisis sel biasanya digunakan detergen atau sodium duodesil sulfat ( SDS). Pembuangan remukan sel dilakukan dengan cara sentrifugasi, sedangkan protein dan RNA masing-masing dihilangkan menggunakan kloroform dan RNAase. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan,misalnya dengan penambahan ammonium ammo nium asetat dan alkohol. DNA hasil isolasi dikatakan baik apabila mempunyai tingkat kemurnian yang tinggi dan tidak mengalami fragmentasi. Isolasi DNA kromosom buah dan bakteri secara garis besar meliputi tahaptahap perusakan dan pembuangan dinding sel, lisis sel, pembuangan remukan sel, serta pemisahan DNA dari protein dan RNA. Perusakan dinding sel antara lain dapat dilakukan dengan pemberian lisozim, sedangkan untuk lisis sel biasanya digunakan triton X-100 atau sodium atau sodium dodesil sulfat (SDS). Pembuangan remukan sel dilakukan dengan cara sentrifugasi, sedangkan protein dan RNA masing-masing dihilangkan menggunakan kloroform dan RNAse. Molekul DNA yang telah di isolasi tersebut kemudian dimurnikan, misalnya dengan penambahan amonium asetat dan alkohol. DNA hasil isolasi dikatakan baik apabila mempunyai tingkat kemurnian yang tinggi dan tidak mengalami fragmentasi (Albert, 1994). Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Arai, 1992). Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian
atas dan pelet pada bagian bawah. Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran (Does, 2004). Penggunaan mikrosentrifuga dan tabung mikrosentrifuga (tabung (tabung eppendorf) pada praktikum ini sebagai penunjang proses sentrifugasi pada tahapan pemisahan remukan-remukan DNA dengan kromosom bakteri pada isolasi. Buffer TE 1x berfungsi sebagai preservasi menginaktivasi DNAse, tenderizer 30% berfungsi sebagai protease dan melisis dinding sel, larutan SDS 10% digunakan untuk lisis sel dengan merusak lipid bilayernya, etanol absolut digunakan untuk menghilangkan residu-residu klorofom, alokohol 70% untuk membuang sisa-sisa etanol absolut, klorofom digunakan untuk mendenaturasi protein, dan akuades sebagai pelarut. Inkubator digunakan untuk menginkubasi isolat cair E.coli E.coli selama semalam. Penggunaan sarung tanag bertujuan untuk menghindari tercampurnya DNA keringat manusia dengan DNA sampel pada saat praktikan menggoyang-go yang kan tabung eppendorf pada saat menghomogenkan sampel. Seperangkat mikropipet dan tip digunakan untuk memindahkan larutan dalam ukuran mikro (µ). Lemari pendingin digunakan untuk menyimpan stok isolat cair E.coli, dan kamera digunakan untuk mendokumentasikan hasil pengamatan. Cara kerja praktikum dimulai dengan isolate E. coli coli cair dimasukkan ke dalam tabung eppendorf sebanyak 1,5 ml, kemudian disentrifugasi selama 3 menit pada kecepatan 5000 rpm dengan suhu 25oC. Supernatan dibuang, lalu tambahkan 1 ml akuades kemudian dibolak-balik. Sentrifugasi lagi selama 3 menit pada kecepatan o
5000 rpm dengan suhu 25 C. Kemudian supernatan dibuang, lalu tambahkan 50 µl tenderizer 30% dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37oC. Hasil inkubasi ditambahkan 50 µl SDS 10% lalu digoyang-goyang. Setelah itu disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 10000 rpm. Supernatan dipindahkan ke tabung eppendorf baru sebanyak 100 µl kemudian ditambahkan klorofom dengan perbandingan 1:1. Sentrifugasi lagi selama 10 menit pada kecepatan 10000 rpm. Supernatan dipindahkan lagi ke tabung eppendorf baru sebanyak 100 µl dan ditambahkan etanol absolut dengan perbandingan 1:1. Diendapkan selama 7 x 24 jam didalam freezer. Hasil inkubasi disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 10000 rpm pada suhu 4oC. Supernatan dibuang, lalu tambahkan alkohol 70% sebanyak 1000 µl. Sentrifugasi lagi selama 10 menit pada kecepatan 10000 rpm, lalu buang supernatan
dan tabung eppendof dibalik. Sebanyak 50 µl larutan buffer TAE 1x ditambahkan kemudian dielektroforesis dan hasilnya didokumentasikan. Menurut Brindha dan Mathew (2012), proses isolasi DNA dilakukan dengan cara kultur disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama 5 menit. Kumpulkan pelet dan tambahkan 30 µl SDS 10% dan 3 µl dari 20 µg/ml proteinase-K untuk memberikan konsentrasi akhir 100 µg/ml proteinase-K pada 0,5% SDS. Campur secara menyeluruh dan inkubasi 1 jam pada suhu 37oC. Tambahkan 80 µl larutan CTAB/NaCl. Campur secara menyeluruh dan inkubasi 10 menit pada 65oC. Tambahkan volume yang kira-kira sama (0,7-0,8 ml) kloroform/isoamil alkohol, aduk, dan sentrifugasi selama 4 sampai 5 menit dalam mikro-centrifuge. Supernatan dipindahkan ke tabung mikro-centrifuge baru, tambahkan volume yang sama dari fenol/ kloroform/ isoamil alkohol, dan sentrifugasi selama 5 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung baru dan tambahkan volume 0,6 Isopropanol untuk mengendapkan asam nukleat. Cuci DNA dengan etanol 70% untuk menghilangkan residu CTAB dan sentrifugasi kembali selama 5 menit pada suhu ruang untuk mendapatkan endapannya. Tambahkan 100 µl larutan buffer-TE dan ukur menggunakan NanoVue. Berdasarkan hasil isolasi DNA kromosom bakteri E. coli coli kelompok 3, diperoleh hasil bahwa DNA kromosom bakteri berhasil diisolasi tetapi sedikit. Hal tersebut ditandai dengan terbentuknya endapan dan supernatan yang menandakan terpisahnya DNA dengan sel dan remukan sel setelah dilakukan beberapa kali sentrifugasi. Menurut Albert (1994) konsentrasi DNA yang terpresipitasi tergantung dari beberapa hal, antara lain adalah keenceran sumber DNA yang digunakan dan suhu alkohol. Semakin encer filtrat, maka DNA yang terpresipitasi akan semakin sedikit. Sementara semakin dingin alkohol, DNA yang terpresipitasi semakin pekat. Pernyataan tersebut menyatakan alasan mengapa alkohol yang ditambahkan harus dingin, karena semakin dingin alkohol, maka konsentrasi DNA yang akan terikat oleh alkohol tersebut akan semakin pekat atau tinggi. Kadar air juga mempengaruhi presipitasi DNA, semakin tinggi kadar air yang terkandung dalam buah maka semakin rendah DNA yang akan terpresipitasi.
IV. KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil dan pembahasan sebelumnya dapat diambil kesimpulan bahwa: 1. Hasil dalam isolasi DNA kromosom bakteri E. coli coli didapat hasil berupa terbentuknya endapan dan supernatan setelah sentrifugasi selama dua tahap yang menandakan terpisahnya DNA dengan sel dan remukan sel. 2. Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu isolasi sel, lisis dinding dan membran sel, ekstraksi dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi.
B. Saran
Untuk praktikum selanjutnya mungkin isolat bakteri yang digunakan tidak hanya E. coli saja, tetapi bakteri-bakteri yang lain juga dapat ditambahkan. Sehingga hasilnya lebih variatif.
DAFTAR REFERENSI
Albert, Brush. 1994. Biologi Molekular Sel Edisi ke-2. Gramedia, Jakarta. Anam, K. 2010. Laporan II – II – Isolasi Isolasi DNA Genom. Institut Pertanian, Bogor. Arai, M., Mori, H. & Imaseki, H. (1992) Cloning and sequence of cDNAs of intracellular invertase from etiolated hypocotyl of mung bean and expression of the gene during growth of seedlings. Plant seedlings. Plant Cell Physiol., 33, 245-252. Brindha, V. dan Mathew, A.A. 2012. Molecular characterization and identification of unknown bacteria from waste water. Indian J. Innovations Dev., Vol. 1, No. 2 Campbell, N.A. Reece, J.B. dan Mitchell. 2000. Biologi Edisi Kelima-Jilid 1. Erlangga. Jakarta Does, M. P. et al. (1991) A quick method to estimate the TDNA copy number in transgenic plants at an early stage after transformation, using inverse PCR. Plant Mol. Biol., 17, 151-153. Fessenden. 1990. Molecular 1990. Molecular and cellular biology. biology. Wadsworth Publishing Company, Belmont: xviii + 1145 hlm. Istanti, Annie. 1999. Biologi Sel. Malang: jurusan Biologi FMIPA UM. Jusuf, M. 2001. Genetika I. Sagung Seto, Jakarta. Raven and Johnson. 2001. Biology 5th edition. Mc-Graw Hill Company, New York.
