Laporan Praktikum Hari, Tanggal : Rabu, 5 November 2014
Teknologi Asam Nukleat dan Protein Waktu : 13.00-16.00
PJP : Puspa J Puspita, MSc
Asisten : Lidya Agustin
M. Maftuchin Sholeh
Eva Selenia
Salmi
ISOLASI DNA PLASMID,
PEMBUATAN SEL KOMPETEN DAN TRANSFORMASI
Kelompok 06
Ayu Syafitri S G84110002
Widadi Tri Rizeky G84110017
Hasbi Narantika G84110035
Dezika Geniya G84110065
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PENDAHULUAN
Plasmid adalah salah satu vektor dalam proses pengklonan gen berupa molekul DNA utas ganda sirkuler yang berukuran kecil, terdapat di dalam sitoplasma, dan dapat melakukan replikasi secara autonom (Suharsono 2006). Plasmid merupakan material genetik diluar kromosom dengan ukuran dan berat sekitar 1-300 kb (Snustad dan Simmons 2003). Vektor ini berbentuk sirkular yang memungkinkan terjadinya replikasi karena adanya suatu urutan DNA sebagai asal replikasi. Plasmid memiliki gen penanda seleksi dominan, yaitu gen resisten antibiotik (Twyman 1998).
Keberhasilan tahapan isolasi bergantung pada sumber bahan, konsentrasi bahan, stabilitas, dan kadar kemurnian produk akhir. Isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan, yaitu tahap kultivasi dan pemanenan atau harvesting, tahap lisis dan tahap pemurnian DNA plasmid. Kultivasi yaitu proses reproduksi bakteri sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak. Perusakan (lisis) dinding sel bakteri dapat dilakukan dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku leleh maupun dengan cara kimiawi menggunakan larutan lisis. Plasmid yang diperoleh dimurnikan dari berbagai kontaminan dengan penambahan fenol (Brown 2003).
Rekayasa genetika merupakan teknik memanipulasikan gen untuk menghasilkan makhluk hidup baru dengan sifat yang diinginkan. Tahapan rekayasa genetika yaitu isolasi dan pemurnian plasmid DNA, pemotongan DNA plasmid, pembuatan sel kompeten dan transformasi, dan elektroforesis. Komponen yang dibutuhkan dalam proses rekayasa ini berupa sel inang, vektor, dan DNA insert. Menurut Brown (2003) bahwa keberhasilan proses tersebut bergantung pada keefektifan penyisipan DNA insert ke dalam plasmid sel inang.
Transformasi adalah proses introduksi DNA rekombinan (asing) ke dalam sel inang baik itu bakteri, fungi, tanaman, maupun sel hewan. Sel inang yang digunakan dalam praktikum adalah bakteri Escherichia coli karena dapat membelah secara cepat serta memiliki kandungan plasmid dalam jumlah banyak. Bakteri yang digunakan dalam proses transformasi adalah bakteri yang dibuat kompeten dengan perlakuan fisik agar mampu mengambil DNA yang akan disisipkan pada sel bakteri. Perlakuan fisik yang diberikan adalah melalui perlakuan dengan garam CaCl2 atau RbCl (Suharsono 2006). DNA yang berada di sekitar bakteri (DNA asing) dapat berupa potongan DNA atau fragmen DNA yang berasal dari sel bakteri yang lain atau organisme yang lain.
Penapisan atau screening merupakan tahapan untuk menyeleksi vektor rekombinan hasil kloning. Penapisan ini dapat dilakukan dengan beberapa cara, antara lain dengan menguji sensitivitas dan resistensi terhadap antibiotik, menumbuhkan sel transforman pada medium selektif nutrien, seleksi biru putih atau α-komplementasi, analisis restriksi dari DNA plasmid dan hibridisasi asam nukleat. Uji sensitifitas dan resistensi antibiotik dapat dilakukan apabila vektor pengklonan membawa sedikitnya satu gen penyebab resistensi terhadap antibiotik pada sel inang, misalnya ampisilin (ampR).
Tujuan dari praktikum kali ini menunjukkan sifat dan struktur DNA plasmid melalui proses isolasi terhadap DNA plasmid, menganalisis DNA plasmid yang mengalami pemotongan dengan enzim restriksi, membuat sel E. coli kompeten dan melakukan transformasi sel E. coli dengan DNA plasmid.
METODE PERCOBAAN
Tempat dan Waktu
Praktikum dilakukan di Laboratorium Biokimia, Departemen Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Waktu pelaksanaannya yaitu Rabu, 5 November 2014 pukul 13.00-16.00 WIB.
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan adalah gelas piala, neraca analitik, sudip, bunsen, ose, vortex, tabung reaksi, sentrifus, pH meter, tabung sentrifus, mortar, penangas es, vial, inkubator, autoklaf, pipet mikro 10µl, 100 µl, 1000 µl, tip pipet mikro, gelas piala, aluminium foil, cawan petri, penangas, erlenmeyer, sentrifus, tabung sentrifus, laminar air flow, alat-alat gelas, dan inkubator.
Bahan-bahan yang digunakan adalah Tris-HCl, EDTA, sukrosa, NaOH, natrium asetat, fenol, akuades, kultur bakteri E. coli, medium LB, tripton, NaCl, ampisilin, kloroform, etanol 70%, etanol absolut, dH2O DNA plasmid, buffer restriksi, enzim restriksi, media LB cair dan padat, ampisilin, biakan sel E. coli, CaCl2 75 mM, MgCl2 100 mM, es, DNA plasmid, bufer ekstraksi (akuades steril, Tris-HCl 1 M pH 8.0, edta 0.5 M pH 8.0, NaCl 5 M dan CTAB 10%), daun kunyit, Na Asetat 3 M pH 5.2, etanol absolut dingin, kloroformisoamil alkohol (24:1), PVP, es, dan RNAse dan dH2O steril.
Prosedur Percobaan
Isolasi dan pemurnian plasmid DNA. Pertama, disiapkan larutan satu, dua, dan tiga. Larutan satu dibuat dari campuran tris-HCl 25 mM pH 7.5, EDTA 10 mM, dan sukrosa 15%. Larutan kedua dibuat dari campuran NaOH 0.2 M dan SDS 1%. Larutan NaOH 0.2 M dibuat dengan dilarutkannya 0.4 gram kristal NaOH dalam 1000 mL akuades. Sedangkan larutan SDS 1% dibuat sebanyak 50 mL dengan cara 0.5 gram SDS ditimbang dan dilarutkan dalam 50 mL akuades. Larutan tiga dibuat dari Na-asetat 3 M pH 4.6. Langkah kedua yaitu bakteri dibiakkan dalam medium LB. Medium LB ini dibuat dari campuran 0.5 gram yeast extract, 1 gram tripton, 0.5 gram NaCl, dan ampicilin sebagai antibiotik. Konsentrasi akhir medium LB dijadikan 50 µg/mL.
Langkah selanjutnya, biakan bakteri yang telah disiapkan diambil dan dipindahkan ke dua tabung Eppendorf, masing-masing sebanyak 1.5 mL. Tabung kemudian disentrifus pada kecepatan 8000 rpm selama tiga menit. Supernatan yang terbentuk kemudian dibuang dan ke dalam masing-masing tabung ditambahkan 100 µL larutan satu. Tabung kemudian divorteks lalu disimpan dalam es selama lima menit. Berikutnya 200 µL larutan dua ditambahkan pada masing-masing tabung dan tabung dicampur dengan cara dibolak-balik. Tabung kembali disimpan dalam es selama lima menit. Selanjutnya, ditambahkan 150 µL larutan tiga ke dalam masing-masing tabung dan disimpan lagi dalam es selama lima menit. Langkah berikutnya adalah sentrifugasi tabung dengan kecepatan 8000 rpm selama 10 menit pada suhu 40C. Setelah terpisah antara supernatan dan pelet, supernatan dipindahkan ke tabung baru.
Larutan fenol/kloroform sebanyak 300 µL dimasukkan ke tabung baru tadi dan divorteks kemudian dilanjutkan dengan sentrifugasi selama lima menit.. Supernatan diambil dan dipindahkan ke kuvet baru kemudian ditambah dengan 1 mL etanol absolut. Kuvet selanjutnya divorteks dan didiamkan dalam suhu ruang selama 5 menit. Selanjutnya kuvet kembali divorteks dan supernatannya dibuang. Ke dalam pelet ditambahkan 1 mL etanol 70% dan divorteks lagi selama 1 menit dan disentrifus. Terakhir, pelet dikeringkan dan ditambah 30 µL dH2O lalu disimpan dalam lemari es.
Pemotongan DNA plasmid dengan enzim restriksi. Sebanyak 5-10 mg DNA plasmid, 5 mL buffer enzim (10x), 1 mL enzim restriksi dan dH2O steril dimasukkan ke dalam erlenmeyer 50 mL hingga volume larutan mencapai 50 m lalu dimasukkan ke dalam es. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 370 C selama 1 jam. Aktivitas enzim dihentikan dengan memanaskan pada suhu 650-700 C.
Pembuatan sel kompeten dan transformasi. Media LB sejumlah 150 mL dibuat dari campuran tripton, NaCl, dan yeast extract. Bakteri dibiakkan di dalam 100 mL media LB. Dua buah tabung reaksi bersih disiapkan dan diisi dengan masing-masing 10 mL media LB. Ke dalam 10 mL media LB dimasukkan bakteri yang telah dibiakkan selama satu hari. Tabung kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 90 menit. Selanjutnya tabung disentrifus pada kecepatan 8000 RPM, suhu 40C, selama dua menit. Sebelumnya tabung sentrifus ditimbang dan digunakan tabung berisi air sebagai penyeimbang saat sentrifugasi. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang dan ke dalam pelet ditambahkan 5 mL CaCl2. Tabung kembali disentrifugasi. Supernatan kembali dibuang dan ditambahkan 5 mL CaCl2 75 mM. Tabung disimpan dalam es selama 30 menit. Selanjutnya tabung disentrifus, supernatan dibuang dan ditambahkan 1 mL CaCl2 75 mM. Terakhir, diambil 100 µL dan disimpan di lemari pendingin untuk transformasi.
DNA plasmid dengan konsentrasi 0.4 µg sebanyak 2 µL dimasukkan ke dalam dua tabung yang berisi masing-masing 100 µL. Sel kompeten Tabung disimpan dalam es selama 30 menit. Langkah berikutnya, diberi perlakuan kejut panas 420C selama 45 detik. Isi tabung lalu dicampur ke dalam Erlenmeyer yang berisi 400 µL agar LB dan diinkubasi selama 30 menit. Agar LB diambil 150 µL dan dituang dalam cawan petri. Cawan kemudian diinkubasi selama 18 jam pada suhu 37°C. Pengamatan dilakukan dengan penghitungan jumlah koloni yang terbentuk.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. DNA yang biasa diisolasi dan dimurnikan dalam rekayasa genetika, yaitu DNA total sel, DNA plasmid, dan DNA faga. Prinsip dasar isolasi DNA/RNA dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA total dan RNA. Kemudian ekstrak sel dipurifikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang mengandung DNA/RNA total (Artama 1991). Namun, pada isolasi DNA plasmid terdapat proses yang akan memisahkan antara DNA total dan DNA plasmid.
Langkah pertama dalam proses isolasi DNA adalah perusakan dan atau pembuangan dinding sel bakteri yang dapat dilakukan dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku leleh maupun dengan cara kimiawi menggunakan larutan lisis (Brown 2003). Pada praktikum ini, perusakan dinding sel dilakukan dengan pemberian larutan lisis dan SDS pada kultur bakteri. Larutan lisis yang digunakan mengandung EDTA 10 mM, Tris HCl 25 mM, dan sukrosa 15%. EDTA 10 mM yang berfungsi sebagai perusak sel dengan cara mengkelat ion magnesium. Tris-HCL berperan sebagai buffer untuk menjaga pH DNA berada dalam keadaan optimum. Sedangkan sukrosa 15% berfungsi memecah dingding sel bakteri (Ausubel et al. 1994).
Setelah optimalisasi reaksi pada suhu dingin, maka ditambahkan larutan untuk mengendapkan dinding sel. Larutan tersebut adalah NaOH dan sodium dodesil sulfate (SDS). Penambahan NaOH akan menyebabkan pH menjadi 12.0 - 12.5 sehingga ikatan hidrogen pada molekul DNA tidak berlilitan akan pecah dan menyebabkan heliks ganda terurai dan rantai polinukleotida memisah. Penambahan Na-asetat yang bersifat asam menyebabkan DNA bakteri yang terdenaturasi akan mengelompok kembali menjadi benang kusut sehingga dengan proses sentrifugasi dapat terpisah (Brown 2003).
Plasmid yang diperoleh masih belum murni sehingga perlu dilakukan pemurnian dari berbagai kontaminan. Setelah penambahan fenol, kecepatan sentrifugasi ditingkatkan agar kontaminan protein yang terdapat dalam ampel dapat dihilangkan. Kecepatan yang semakin tinggi diperlukan untuk mengendapkan asam nukleat karena densitas DNA yang lebih tinggi yakni sekitar 1.7 g cm-3 dibanding protein dan molekul lain yang densitasnya berkisar kurang dari 1 g cm-3 (Albert et al. 2004). Saat sentrifugasi, dilakukan penmbahan etanol absolut agar proses presisipitasi DNA menjadi lebih sempurna. Berbagai penambahan pelarut dilakukan sebagai upaya dalam pemurnian plasmid. Menurut Ausubel et al. (1994) bahwa penambahan etanol 70% akan menghilangkan berbagai pelarut yang telah ditambahkan selama tahapan pemurnian sehingga diharapkan yang tersisa hanyalah DNA plasmid (Ausubel et al. 1994).
Pembuatan DNA rekombinan diawali dengan pemotongan DNA plasmid dan DNA insert menggunakan enzim restriksi sejenis. Enzim restriksi yang digunakan dalam praktikum adalah BamH1. Enzim ini akan menghasilkan ujung lengket yang sama yakni GATC. Sifat ini dikenal dengan isochizomer yakni enzim yang memiliki situs pengenalan sama dan hasil pemotongan bisa sama atau tidak. Fragmen DNA hasil pemotongan oleh salah satu enzim tersebut dapat disambung karena tiap fragmen memiliki ujung lengket yang komplementer. Akan tetapi hasil ligasi tersebut tidak dapat dipotong lagi dengan enzim yang sama karena telah dimasukkan dalam vektor sehingga ukurannya menjadi lebih besar.
Pemotongan plasmid dengan enzim restriksi menggunakan beberapa perlakuan. Penyimpanan sampel di es bertujuan untuk menjaga aktivitas enzim. Proses inkubasi suhu 370 C selama 1 jam bertujuan untuk meningkatkan aktivitas enzim. Pemanasan pada suhu 650-700 C bertujuan untuk menghentikan aktivitas enzim. Penambahan bromfenolbiru berfungsi sebagai penanda migrasi pada proses elektroforesis. Proses elektroforesis bertujuan untuk mengetahui bobot molekul DNA plasmid nyang dipotong oleh enzim restriksi dan DNA plasmid yang utuh. Selanjutnya, DNA plasmid yang telah dipotong disambungkan dengan DNA insert menggunakan enzim ligase untuk membentuk DNA rekombinan. Pada praktikum ini tidak digunakan DNA insert, sehingga setelah pemotongan terjadi DNA plasmid disatukan kembali oleh ligase.
Plasmid yang diperoleh dari proses isolasi ialah plasmid pUC19 (Gambar 1). Plasmid ini banyak digunakan sebagai vektor kloning karena memiliki ukuran kurang dari 10 kb sehingga dapat menghindari kerusakan DNA saat pemurnian. Ukuran plasmid ini sebesar 2686 bp, menunjukkan bahwa pemurnian dapat dilakukan dengan mudah. Vektor ini membawa dua gen resisten antibotika yakni ampisilin dan tetrasiklin. Antibiotika tersebut dapat digunakan sebagai penanda seleksi dan tiap gen penanda mengandung tempat restriksi yang khas untuk kloning. Selain itu, plasmid ini memiliki banyak kopi, sekitar 15 molekul dalam sel E.coli dan jumlahnya dapat ditingkatkan hingga 3000 kopi dengan cara amplifikasi plasmid (Brown 2003).
Gambar 1 Plasmid pUC19
Tahap selanjutnya ialah penyisipan DNA rekombinan dalam sel inang (transformasi). Secara alami, beberapa jenis bakteri mempunyai kemampuan untuk menyerap (up take) untaian DNA yang diatur oleh serangkat gen (gen-gen kompeten). Proses transformasi ke sel bakteri pada umumnya menggunakan metode heat shock. Secara artificial, bakteri dapat dibuat kompeten dengan larutan kalsium klorida (CaCl2) dingin. Ion kalsium akan menetralisir aksi tolak-menolak antara muatan negatif dan bagian kepala fosfolipid dengan muatan negatif gugus fosfat DNA. Selain itu, CaCl2 dingin menyebabkan terganggunya struktur membran sel sehingga membentuk pori dan bersifat permeabel. Bakteri kemudian diperlakukan dengan suhu 42oC (heat shock) selama 45 detik. Pemanasan menimbulkan gradien panas yang menyebabkan aliran yang mengalir ke dalam sel yang memungkinkan DNA masuk ke dalam sel (Brown 2003).
Proses transformasi menggunakan kontrol positif dan kontrol negatif (Gambar pada Tabel 1). Kontrol positif dari sel kompeten E. coli tumbuh karena sel tersebut mengandung plasmid pUC19 yang telah ditransformasikan sehingga mengandung gen resistem ampisilin. Penggunaan kontrol positif dan negatif bertujuan untuk mengetahui keberhasilan proses transformasi tanpa adanya kontaminasi serta untuk memastikan kualitas sel kompeten yang telah dibuat sebelumnya (Sambrook dan Russell 2011). Selain dengan screening, untuk menyeleksi transforman dapat dilakukan dengan deteksi menggunakan XGal (5-bromo kloro-indolil-β-D-galaktosida), transposon, dan menggunakan pelacak (probe).
Tabel 1 Hasil seleksi bakteri transforman
Cawan
Gambar
Kontrol positif (ampisislin)
Kontrol negatif
Plasmid rekombinan
Berdasarkan hasil yang diperoleh, sel E. coli berhasil ditransformasikan yang diperoleh dari cawan hasil inkubasi. Pada cawan yang berisi bakteri hasil transformasi, terdapat koloni bakteri yang tumbuh yang menunjukkan bahwa proses transformasi telah terjadi. Terdapat berbagai faktor yang mempengaruhi keberhasilan proses transformasi. Salah satunya adalah keberhasilan pembuatan sel kompeten. Sel kompeten yang masih baru akan memiliki kemampuan menerima plasmid lebih baik dibandingkan sel kompeten yang telah disimpan lama. Selain itu, enzim restriksi dan pengaruh pemanasan saat heat shock juga sangat mempengaruhi hasil.
SIMPULAN
DNA plasmid dapat digunakan sebagai vektor cloning karena mampu bereplikasi secara autonomous. Plasmid berhasil diisolasi dengan penumbuhan kultur E.coli, pemanenan sel E.coli, dan pemurnian dari kontaminan lain melalui metode lisis alkali. Pemotongan plasmid dilakukan dengan enzim restriksi oleh BamH1 akan menghasilkan ujung lengket yang sama yakni GATC. Plasmid yang dipotong oleh BamH1 akan mudah disisipi gen target dari pada plasmid pada umumnya. Pemotongan ini merupakan salah satu langkah dari proses rekayasa genetika. Plasmid pUC19 telah berhasil ditransformasi ke sel E.coli yang terlihat dari adanya koloni putih pembawa resistensi antibiotik ampisilin.
DAFTAR PUSTAKA
Alberts B et al. 2004. Essential Cell Biology. 2nd edition. New York (UK): Garland Science.
Artama WT. 1991. Rekayasa Genetika. Yogyakarta (ID): UGM Press.
Ausubel FM et al. 1990. Current Protocols in Molecular Biology. Kanada (US): John Willey & Sons.
Brown TA. 2003. Pengantar Kloning Gen. Muhammad SA, penerjemah. Terjemahan dari: Gene Cloning an Introduction. Yogyakarta (ID): Yayasan Essentia Medika
Sambrook J & DW Russell. 2001. Molecular Clonning: A Laboratory Manual. New York (US): Coldspring Harbor Laboratory Pres.
Snustad DP & MJ Simmons. 2003. Principles of Genetic. Hoboken (US): Wiley & Sons Inc.
Suharsono WU. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen. Bogor (ID): Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi IPB.
Twyman RM. 1998. Advanced Molecu;ar Biology. New York (US): BIOS Scientific Publisher.
