ARTIKEL ILMIAH
IDENTIFIKASI PROTEIN PREGNANCY ASSOCIATED GLYCOPROTEIN (PAG) DALAM AIR SUSU SAPI PERAH PERANAKAN FRIESIAN HOLSTEIN (pFH)
Oleh : ELLEN LINDI L.H NIM 060710186
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS AIRLANGGA SURABAYA 2011
IDENTIFICATION OF PREGNANCY ASSOCIATED GLYCOPROTEIN (PAG) FROM FRIESIAN HOLSTEIN (FH) MILK
Abdul Samik1) ,Ellen Lindi L.H2) , Ajik Azmijah3) 1) Departemen Reproduksi Veteriner, 2)Mahasiswa, 3) Departemen Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga ABSTRACT
Pregnancy diagnosis is an important part in reproduction management of ruminant. Pregnancy Associated Glycoprotein (PAG) structurally related to aspartic proteinase, expressed in the outer epithelial cell layer (tropectoderm) of ungulate plecenta. Bovine PAG synthesized by mono- and binucleic trophoblast before complete implantation. Of this, Bovine-Pregnancy Associated Glycoprotein (boPAG) could be used as a marker for early pregnancy. The research on Pregnancy Associated Glycoprotein (PAG), a blastocyst protein isolated from cow pregnant serum was conducted to find out it’s characterisation. In this study, concentration of the Pregnancy Associated Glycoprotein (PAG) were investigated in the milk of dairy cow. The aim of the research was to identification the PAG from Fresian Holstein milk. The procedure included collection milk from pregnant cow in day 90. The cow were diagnosed as pregnant by rectal palpation. After SDS PAGE test, it was ten different molecular weights isolating from cow milk, namely 210,51 ;149,97; 138,89; 102,28; 95,27; 72,63; 59,88; 51,41; 40,25 and 37,85 kDa. After chromatography by Nitroselulose membrane, the PAG molecular weight isolating from Fresian Holstein milk is 59,88 kDa. Key words: boPAG, SDS-PAGE, milk
Menyetujui untuk dipublikasikan dengan Author Ellen Lindi L.H, Surabaya, 5 Agustus 2011. Mahasiswa:
Menyetujui Dosen Pembimbing I:
Menyetujui Dosen Pembimbing II:
(Ellen Lindi L.H) NIM.060710186
(Dr. Abdul Samik, drh., M.Si) NIP.196405081990111001
(Ajik Azmijah, drh., S.U) NIP.195011191978032001
Menyetujui Dosen Terkait I:
Menyetujui Dosen Terkait II:
Menyetujui Dosen Terkait III:
(Prof.Dr. Wurlina,drh.,M.S) (Dr.Rr. Sri Pantja M.,drh.,M.Si) (Dr. Pudji Srianto,drh.,M.Kes) NIP.195409181983012001 NIP.196310021989032003 NIP. 195601051986011001
IDENTIFIKASI PROTEIN PREGNANCY ASSOCIATED GLYCOPROTEIN (PAG) DALAM AIR SUSU SAPI PERAH PERANAKAN FRIESIAN HOLSTEIN (pFH)
Ellen Lindi L.H1) ,Abdul Samik2) , Ajik Azmijah3) 1) Mahasiswa, 2) Departemen Reproduksi Veteriner, 3) Departemen Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga ABSTRAK
Deteksi kebuntingan merupakan salah satu hal yang penting dalam manajemen pemeliharaan ternak ruminansia. Pregnancy Associated Glycoprotein (PAG) merupakan suatu protein yang memiliki struktur hampir sama dengan aspartic proteinase, dikeluarkan oleh sel epitel (tropectoderm) dari plasenta spesies ungulata. Bovine PAG diproduksi oleh sel mono- dan binucleat tropoblas sebelum implantasi. Oleh karena itu Bovine Pregnancy Associated Glycoprotein (boPAG) dapat digunakan untuk mendeteksi kebuntingan dini pada sapi. Penelitian tentang Pregnancy Associated Glycoprotein (PAG), protein yang dihasilkan oleh sel blastosis dan telah diisolasi dari serum sapi bunting, berhasil melakukan karakterisasi dari protein ini. Konsentrasi Pregnancy Associated Glycoprotein (PAG) pada penelitian ini diteliti dari air susu sapi perah yang sedang bunting. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi protein PAG dari sapi perah peranakan Friesian Holstein (pFH). Prosedur penelitian ini meliputi pengambilan susu dari sapi perah yang sedang bunting 90 hari. Sapi dideteksi kebuntingannya dengan metode palpasi rektal. Setelah dilakukan uji SDS PAGE ditemukan sepuluh protein yang memiliki berat molekul 210,51 ;149,97; 138,89; 102,28; 95,27; 72,63; 59,88; 51,41; 40,25 dan 37,85 kDa. Setelah uji kromatografi dengan membran nitroselulosa diketahui berat molekul dari protein PAG yang berhasil diisolasi dari susu sapi peranakan FH adalah 59,88 kDa. Kata kunci : boPAG, SDS PAGE, susu Pendahuluan
Sapi perah merupakan komoditi yang sangat menguntungkan dalam dunia peternakan, mengingat kebutuhan konsumsi susu nasional masih jauh dari cukup. Kebutuhan konsumsi susu nasional pada tahun 2006 sebesar 896.791 ton/tahun. Sedangkan produksi susu nasional pertahun sebesar 577.626 ton, sehingga masih banyak kekurangan produksi susu nasional sebesar 319.165 ton/tahun (Direktur Jendral Peternakan, 2005). Melihat kondisi tersebut maka efisiensi reproduksi sangat diperlukan untuk menutupi kekurangan kebutuhan susu nasional.
Sapi perah yang dipelihara harus mencapai efisiensi yang optimal, dengan Conception Rate (Angka Kebuntingan) 65-75 %, Calving Interval (Jarak antar Melahirkan)
365 hari (12 bulan), Service Period (Jarak dari Melahirkan Sampai Bunting Kembali) 60-90 hari, Service Per-Conception (Angka Perkawinan per Kebuntingan) 1,65, Calving Rate (Angka Kelahiran) 45-65 %, dan Day Open (Masa Kosong) sekitar 80-85 hari (Hardjopranjoto, 1995). Efisiensi reproduksi ini juga berkaitan dengan ketepatan deteksi kebuntingan dini dalam upaya meningkatkan efisiensi manajemen pemeliharaannya (Arthur et al.,1989). Pencarian dan pengembangan metode pemeriksaan kebuntingan secara dini masih terus dilakukan. Metode diagnosa kebuntingan secara klinik yang digunakan selama ini meliputi metode palpasi rektal, USG, dan hormonal (dengan pengukuran kadar progesteron). Pemeriksaan kebuntingan dengan cara eksplorasi rektal dapat dilakukan pada umur kebuntingan 35 hari, tetapi diagnosis semakin akurat setelah 45 – 60 hari kebuntingan (Ismudiono dkk., 2010). Ultrasonografi (USG) merupakan
alat deteksi
kebuntingan yang dapat dilakukan pada 22 hari setelah inseminasi atau perkawinan, akan tetapi ada resiko trauma dari penggunaan alat ini. Selain itu harga alat ini cukup mahal dan dibutuhkan operator yang berpengalaman untuk penggunaan alat ini. Jainudeen dalam Hafez (2000) melaporkan bahwa dari dari berbagai metode deteksi kebuntingan secara klinis dan imunologis, maka metode deteksi kebuntingan secara imunologis yang melibatkan banyak protein spesifik yang diproduksi blastosis pada awal terjadinya implantasi dapat digunakan sebagai dasar pembuatan kit diagnosa untuk mendeteksi kebuntingan lebih dini. Salah satunya adalah Pregnancy Associated
Glycoprotein (PAG) yang berhasil di identifikasi berada pada aliran darah induk yang
sedang bunting. Pregnancy Associated Glycoprotein (PAG) merupakan protein yang mampu memberi
sinyal pada sistem maternal tentang adanya konsepsi, sehingga tidak ada reaksi penolakan oleh sistem imun induk tersebut. Pregnancy Associated Glycoprotein adalah acidic-glycoprotein dengan pH 4,4-5,4 dengan berat 57 kDa. Semua protein yang bersifat
imunogenik, apabila diinjeksikan pada hewan coba misalnya kelinci maka akan dapat menginduksi terbentuknya antibodi terhadap protein itu sendiri (Aulanni’am, 2005 dan Rantam, 2003). Perenyi et al. (2002) menggunakan antisera caprine PAG untuk mendeteksi PAG pada sapi bunting. Pregnancy-Associated Substance dapat dideteksi pada 6-24 jam setelah fertilisasi pada semua spesies (Cavanagh, 1996; Du Plants, 2000) serta tetap berada pada darah induk sampai akhir kebuntingan dan menghilang sebelum partus (Du Plants, 2000). Selama ini PAG pada sapi hanya diisolasi dari serum darah induk atau dari kotiledon foetus. Menurut Gonzales et al. (2000) menemukan bahwa konsentrasi PAG dalam susu kambing perah sangat berhubungan dengan umur kebuntingan. Materi Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Perusahaan Susu Murni Surabaya Jl. Kaliwaron No. 36 untuk pengambilan sampel, dan laboratorium Biomolekuler Fakultas Kedokteran Hewan Unair untuk menghitung berat molekul PAG dengan metode SDS-PAGE dan Western blot. Sedangkan untuk pelaksanaanya pada bulan Januari – April 2011 Penelitian ini menggunakan 1 ekor sapi perah betina bunting 3 bulan yang ada di peternakan Perusahaan Susu Murni Surabaya.
Sampel yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah susu dari sapi yang sedang dalam kondisi bunting, PBST PMSF, etanol absolute 1:1, larutan buffer. Bahan yang digunakan untuk teknik SDS-PAGE ini adalah Acrylamide; aquades; Tris-HCL (pH 8,8 dan 6,8); Sodium Dodecyl Sulphate 0,5 %; Amoniumpersulphate (APS) 10 %; N,N,N’,N’-tetramethylethylendiamina (TEMED); Bahan untuk Western Blot antara lain: membran nitroselulosa, kertas Whatman, BSA 3%, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, Abpo-PAG, PBS tween, BSA 1%, antibodi sekunder (Anti Rabbit Anti Ig G Alkaline Phospatase Conjugated, pengenceran 1:2500), pewarna Western Blue. Peralatan yang digunakan untuk SDS Page dan Western Blot antara lain Plate gel, alat elektrofloresis, penangas air, Shaker (alat penggoyang otomatis), selotip, label, membran nitroselulose (PVDF), trans blotter Semi Dry Transfer Cell (Bio Rad). Sedangkan peralatan untuk isolasi protein susu adalah bak penampung susu, gelas ukur, pipet pasteur, micropipet, sentrifuse, tabung sentrifus, stopwatch, sonikator, tabung Erlenmeyer, pengaduk kaca. Metode Penelitian Isolasi Protein Susu
Pengambilan susu dilakukan pada sapi perah yang telah dipastikan bunting 3 bulan dengan menggunakan palpasi rektal. Susu yang sudah diperoleh dipisahkan proteinnya dari bahan lain. Susu sebanyak 200 µl ditambah dengan PBST PMSF sebanyak lima kali volume susu (1000 µl) dan disonikasi selama 10 menit. Kemudian disentrifuse 6000 rpm selama 15 menit. Endapan yang terjadi dibuang dan supernatannya disonikasi selama 10 menit, setelah itu disentrifus 10.000 rpm selama 15 menit. Supernatan ditambah
dengan etanol absolut 1:1 dan dibiarkan sampai terbentuk endapan. Setelah terbentuk endapan, dikeringkan dan hasilnya ditambahkan buffer sesuai dengan pH yang diinginkan (Aulanni’am, 2005). Identifikasi Protein PAG dengan Teknik SDS-PAGE
Identifikasi protein dengan teknik SDS-PAGE bertujuan untuk mengetahui gambaran protein PAG yang ditunjukkan dengan terbentuknya area (pita-pita dari protein). Tahapan-tahapan yang harus dilakukan adalah mencetak running gel dan membuat separating gel. Bahan-bahan untuk membuat running gel dimasukkan ke dalam gelas plate sampai bawah batas atas. Selanjutnya permukaan bagian atas running gel diratakan dengan menambahkan aquades. Langkah ini dilanjutkan dengan menambahkan stacking gel dalam cetakan running gel sampai penuh. Comb dimasukkan dalam stacking gel,
dan di inkubasi selama 25 menit pada suhu kamar sampai memadat. Lalu comb dilepas dan dibersihkan dari sisa-sisa gel. Cetakan gel yang telah siap dimasukkan kedalam chamber (bak elektroforesis) kemudian direndam dalam running buffer . Sampel susu yang
mengandung protein PAG dimsukkan kedalam lubang sumuran cetakan sebanyak 10µl, selanjutnya Elektrofloresis dialiri arus listrik 600 volt dan kuat arus 30 mA selama 2-3 jam hingga reaksi mencapai dasar chamber . Alat di matikan, plate dibuka dan dipisahkan. Lembaran gel hasil running diwarnai dengan commasie blue, digoyang 30 menit, lalu diangkat dan ditambahkan cairan Destaining, lalu digoyang 30 menit, jika cairan sudah telihat berwarna biru diganti dengan cairan destaining yang baru, bagitu seterusnya sampai cairan berwarna putih dan hasil yang berupa band-band (pita-pita) Berat Molekul akan dapat terlihat pada cetakan gel SDS-PAGE (Rantam, 2003).
Cara pembacaan hasil SDS-PAGE menurut Rantam (2003) berat molekul antigen dapat dicari dengan menghitung nilai Rf ( Retardation Faktor ) dari masing-masing pita dengan rumus: Rf = Jarak pergerakan protein dari tempat awal Jarak pergerakan warna dari tempat awal
Selanjutnya dibuat kurva standart dari protein dengan menggunakan persamaan regresi linier:
y=a+bx
Dengan: y = berat molekul sampel, x = Rf sampel Sehingga bisa ditentukan massa relatif molekul sampel. Identifikasi Protein Spesifik Pregnancy Associated Glycoprotein (PAG) dari Susu Sapi yang sedang Bunting dengan Teknik Western Blot
Gel hasil elektroforesis dicuci dengan aquades kemudian direndam pada transfer buffer. Selanjutnya disusun sandwich dengan urutan: kertas saring membrane PVDF-gel hasil elekrofloresis-kertas saring dan dilakukan transfer dengan Transbolt Semi Dry Cell (Bio Rad) selama 1 jam pada 1 Amp pada 4 0C. Western blot dilakukan dengan menggunakan fragmen pita PAG yang telah dirunning dalam SDS-PAGE dalam kondisi tereduksi dan ditransferkan pada membran Nitrosellulosa. Membran diblok dengan 3% BSA dalam 20 mM Tris-HCL selama satu jam, selanjutnya diinkubasi dalam Tris NaCl yang mengandung 1% BSA dengan Abpo-PAG, sebagai antibodi primer. Kemudian dicuci dengan Tris-Cl yang mengandung 0,05% Tween 20. Membran diinkubasi dengan antibodi sekunder (Anti Rabbit Anti Ig G Alkaline Phospatase Conjugated, pengenceran 1:2500) dan ditambah substrat western blue (dalam ruangan gelap) sampai terlihat warna band atau
selama semalaman. Selanjutnya dicuci dengan aquades (stop reaksi) (Sumitro dkk, 1996 dan Aulanni’am 2004). Hasil dan Pembahasan Karakterisasi Protein Pregnancy Associated Glycoprotein (PAG) dari Susu Sapi Perah Bunting Peranakan FH dengan metode SDS-PAGE Pada penelitian ini, karakterisasi PAG pada susu sapi perah yang sedang bunting dilakukan berdasarkan berat molekul relatifnya dengan menggunakan metode SDS-PAGE. Preparasi protein dengan menggunakan metode SDS-PAGE ini dengan menentukan perbedaan letak pita pada gel dibandingkan dengan marker protein. Protein standar yang sudah diketahui berat molekulnya (BM) juga dielektrofloresis dengan mengukur mobilitasnya dan dihitung sebagai fungsi dari log BM. Mobilitas protein yang tidak diketahui dapat ditentukan dengan berat molekulnya dapat dicari dari plot mobilitas protein standar terhadap log BM (Sutiman dkk. 1989).
Hasil analisis protein yang berasal dari susu sapi peranakan FH yang bunting dengan metode SDS-PAGE dapat dilihat pada gambar 1:
Gambar 1. Pita-pita protein air susu sapi perah bunting Keterangan : M : Marker 1 : Sampel air susu
Penentuan berat molekul dilakukan dengan bantuan protein standar. Berat molekul isolat PAG didapat dengan melakukan perhitungan menggunakan persamaan linear antara nilai Rf dan log BM. Pada penelitian ini pita-pita protein pada marker memiliki persamaan linear Y= -1.8933X + 2.2756. Pita protein yang diidentifikasi dari protein susu sapi perah bunting dapat dilihat pada tabel 1. Tabel 1. Berat molekul pita-pita protein air susu sapi perah bunting Rf (X) 0,0252 0.0526 0.0702 0.1404 0,1567 0,2189 0.2632 0.2982 0,3543 0.3684
LogBM(Y) 2,323273 2.176012 2.14269 2.009781 1,978956 1,861116 1.777283 1.711018 1,604766 1.578108
BM kDa 210,51 149.97 138.89 102.28 95,27 72,63 59.88 51.41 40,25 37.85
Karakterisasi dengan menggunakan metode SDS-PAGE belum menunjukkan antigen yang spesifik. Prinsip dari metode ini adalah denaturasi protein oleh Sodium dodecyl sulphate yang dilanjutkan dengan separasi molekul berdasarkan berat molekulnya
dengan metode elektrofloresis yang menggunakan gel poliakrilamid. Metode tersebut dapat mendeteksi protein berdasarkan berat molekulnya, tetapi tidak spesifik terhadap protein tertentu. Berdasarkan hasil karakterisasi, pita-pita protein PAG dari susu sapi perah bunting yang muncul dari pemeriksaan dengan metode SDS-PAGE setelah dibandingkan dengan marker berkisar antara 55,6-66,4 kD
Identifikasi Pregnancy Associated Glycoprotein (PAG) dari Susu Sapi Perah Peranakan FH dengan Metode Western Blot
Sifat imunogenik dari suatu protein yang sudah diketahui berat molekul relatifnya dapat dibuktikan dengan teknik Immunoblotting. Teknik ini dimanfaatkan karena sangat membantu penentuan berat molekul relatif protein antibodi susu yang dapat berikatan dengan protein antigen yang digunakan. Ikatan yang terjadi berarti bahwa antibodi yang terbentuk sesuai dengan antigen yang digunakan atau dapat disimpulkan bahwa protein antigen yang dapat menimbulkan respon imun tersebut bersifat imunogenik. Molekul protein PAG bereaksi spesifik dengan antibodi hasil induksinya dapat diketahui dengan metode Western blot. Hasil identifikasi protein PAG dengan metode Western blot dapat dilihat pada gambar 3:
59,88 kDa
Gambar 3. Hasil Western Blot isolat PAG dengan BM 59,88 kDa Keterangan : M : Marker S : Sampel air susu Pada penelitian ini, hasil dari karakterisasi protein PAG dengan SDS-PAGE dilanjutkan dengan metode Western blot. Pada pangujian dengan metode Western blot diketahui reaksi ikatan antara anti-PAG dengan PAG dengan berat molekul 59,88 kDa.
Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan maka dapat diambil kesimpulan bahwa dalam air susu sapi perah peranakan Friesian Holstein terdapat sepuluh protein yang berhasil diisolasi dengan metode SDS-PAGE dan memiliki berat molekul 210,51 ;149,97; 138,89; 102,28; 95,27; 72,63; 59,88; 51,41; 40,25 dan 37,85 kDa. Setelah dilakukan uji spesifisitas dengan metode Western blot diketahui bahwa protein Pregnancy Associated Glycoprotein (PAG) memiliki berat molekul 59,88 kDa. Daftar Pustaka Arthur G.F., D.E Noakes, and H. Pearson. 1989. Veterinary Reproduction and Obstetrics. 6th. ELBS. Bailliere Tindall. London.p: 60-86. Aulanni’am. 2005. Protein dan Analisisnya.Citra Mentari Group. Malang Cavanagh, A. C. 1996. Identification of Early Pregnancy Faktor as Chaperonin 10: Implication for Understanding Its Role.J. Reprod. Fertil. 1: 28-32. Direktur Jendral Peternakan.2005. Produksi Daging, Telur, dan Susu. http://www.deptan.go.id/infoeksekutif/nak/isi_infoekse_nak.htm Du Plants, L.J.2000. Early Pregnancy Faktor. Lifeissues.net. Kochi, Japan. All Rights Reserved. pp. 1-2 Gonzales F., J Sulon, JM Garbayo, M Batista, F Cabrera, Po Calero, A Gracia and JF Backers.2000. Secretory Profile of Pregnancy-Associated Glycoprotein at Different Stage of Pregnancy in the Goat. Reproduction in Domestic Animals. Vol.35:79. Hafez, E.S.E and B. Hafez.2000. Reproduksi in Farm Animals.7ed. Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. Harjopranjoto, S.1995. Ilmu Kemajiran pada Ternak. Airlangga University Press. Surabaya. Ismudiono, P. Srianto, S.P. Madyawati, A. Samik, dan E. Safitri.2010. Fisiologi Reproduksi pada Ternak. Bagian Reproduksi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga. Perényi, Z., O. Szenci, J. Sulon, P. Drion, J. and Beckers. 2002. Comparison of the Ability of Three Radioimmunoassay to Detect Pregnancy-associated Glycoproteins in Bovine Plasma. Reproduction in Domestic Animals, 37: 100–104. doi: 10.1046/j.1439-0531.2002.00341.x Rantam, F.A. 2003. Metode Imunologi. Edisi 1. AUP. Surabaya Sumitro, B. S. S. Rahayu. Fatchiyah dan S. Widyarti. 1996. Materi Kursus Teknik-Teknik Dasar Analisa Protein dan DNA. Jurusan Biologi. FMIPA. Unibraw. Malang. 2526. Sutiman, B. S.,Rahayu, Fatchiyah,Widyarti, dan L.E. Arumingtyas. 1996. Kursus Teknikteknik Dasar Analisis Protein dan DNA. Jurusan Biologi. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Brawijaya. Malang
