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Informe laboratorio n° 6-7 “Estudio cinético de la β-galactosidasa; Influencia del pH y la temperatura en la reacción enim!tica"
#signatura$
-
%étodo %étodos s de an!li an!lisis sis en bio&u'mica
Integrantes$
-
%ar'a #guilar Ignacio (andia )elipe (astillo %arcela (astro *anesa %ic+aga
,ocente$
-
% .ilo (ar/a0al
Introducción Las enzimas son proteínas de alto peso molecular con propiedades capaces de cumplir funciones catalizadoras con el objetivo de acelerar reacciones en el metabolismo del ser vivo. Son altamente especícas dado que poseen un centro activo con los componentes responsables para cada catálisis. Por esto, es fundamental estudiar el comportamiento de las enzimas a nivel del organismo con el objetivo de comprender como este trabaja. La cintica enzimática es el mtodo más antiguo para estudiar mecanismos de reacci!n enzimáticos " consiste en la determinaci!n de la velocidad de la reacci!n " el modo en que sta cambia en respuesta a cambios en los parámetros e#perimentales $Le%ninger, &''(). Para que una reacci!n se lleve a cabo, se debe contar con sustrato, la enzima, un cofactor " la formaci!n de producto. *ic%aelis " *enten propusieron un modelo simple para e#plicar la ma"oría de las reacciones catalizadas por enzimas. +n este modelo la enzima se combina reversiblemente con su sustrato para formar el complejo enzimasustrato $+S) que subsecuentemente se rompe para formar el producto, %ec%o que regenera a la enzima.
+#isten factores naturales que pueden alterar la velocidad de la reacci!n catalizada por la enzima, estos corresponden a emperatura, P del medio, presencia de in%ibidores " la concentraci!n de sustrato. La modicaci!n que realizan en la reacci!n se relaciona considerando que la enzima es una proteína " tiene propiedades como tal, pudiendo llegar siempre a la desnaturalizaci!n en condiciones no favorables. +n este laboratorio se presentará una demostraci!n e#perimental de las alteraciones de la temperatura " p en la actividad enzimática utilizando la enzima /-galactosidasa proveniente de la bacteria E.coli 0&'. +sta enzima se clasica como %idrolasa " su sustrato natural es la lactosa, sin embargo, se utilizará el 1-nitrofenil-/-galactosido como sustrato $en presencia de agua), con el objetivo de obtener como producto 2alactosa " ortonitrofenol.
Procedimiento Para el estudio cinético (laboratorio n°6) &. Se preparan un tubo de volumen nal &3 mL con los siguientes componentes. +nzima 4-galactosidasa 4u5er fosfato 3.36 *, p 7,8 • •
9gua Se prepara 1:P2 " una soluci!n blanco $sin sustrato) para uso posterior. Se pre incuba el tubo a (7;< por = minutos. Se prepara un set de > tubos con carbonato de sodio 3.' * en volumen nal '.= ml, completando con agua destilada. Se adiciona 1:P2 al tubo preincubado e inmediatamente se e#traen 3.> ml de este %acia el primer tubo del set con carbonato de sodio. Luego de un minuto se adiciono 3.> ml del incubado al siguiente tubo del set %asta completar los > tubos. ?inalmente se midi! la absorbancia el set de tubos a 83= nm. •
'. (. 8. =. 6. 7.
Para la infuencia del pH – 8,5(laboratorio n°7 – parte ) &. Se preparan un tubo de volumen nal &3 mL con los siguientes componentes. +nzima 4-galactosidasa 4u5er fosfato 3.36 *, p >,= 9gua '. Se prepara una soluci!n blanco $sin sustrato) " una soluci!n de 1:P2 para uso posterior. (. Se pre incuba el tubo a (7;< por = minutos. 8. Se prepara un set de > tubos con carbonato de sodio 3.' * en volumen nal '.= ml, completando con agua destilada. =. Se adiciona 1:P2 &3 m* al tubo preincubado e inmediatamente se e#traen 3.> ml de este %acia el primer tubo del set con carbonato de sodio. 6. Luego de un minuto se adiciono 3.> ml del incubado al siguiente tubo del set %asta completar los > tubos. 7. ?inalmente se midi! la absorbancia el set de tubos a 83= nm. • • •
Para la infuencia de temperatura – 56°! (laboratorio n°7" parte #) &. Se preparan un tubo de volumen nal &3 mL con los siguientes componentes. +nzima 4-galactosidasa 4u5er fosfato 3.36 *, p 7,8 9gua '. Se prepara 1:P2 " una soluci!n blanco $sin sustrato) para uso posterior. (. Se pre incuba el tubo a =6;< por = minutos. 8. Se prepara un set de > tubos con carbonato de sodio 3.' * en volumen nal '.= ml, completando con agua destilada. =. Se adiciona 1:P2 al tubo preincubado e inmediatamente se e#traen 3.> ml de este %acia el primer tubo del set con carbonato de sodio. 6. Luego de un minuto se adiciono 3.> ml del incubado al siguiente tubo del set %asta completar los > tubos. 7. ?inalmente se midi! la absorbancia el set de tubos a 83= nm. • • •
$esultados %&'$&$I 6 Preparar bufer Fosato de Sodio 0,06M, pH 7.4. p@ p0 a A log B4C B9C 7,8@ 6,>' A log B4C (,>3&>B9C @ B4C B9C
3,=>@ log B4C
anti log B9C B9C A B4C @
3,36 * B9C A (,>3&>B9C@3,36 B9C $& A (,>3&>) @ 3,36 * 3,3&'8 *
B9C @ 3,36 *
B4C A 3,3&'8 * @ 3,36 * 3,3876 * B9C :a'P18
B9C @
8,>3&> B4C@ 3,36 D 3,3&'8
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E@ (,(7>6 gr R// Para preparar un Bufer Fosato de Sodio 0,06 M a pH 7,4 se necesitan 0,67! "r de #aH !P$4 % &,&7'6 "r de #a!HP$4 para lue"o ser aorado (asta los )00 *+ con a"ua destilada. Preparar solución de o-nitroenol – – !alactósido "#$P%& a '0 (M. & mol @ 3.33'= mol E
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3,3& * @
E 3,'= L
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R// Para prepara la solucin de $#P- a 0 *M se necesitan 0,7)& "ra*os % lue"o aorar (asta los !)0 *+. Preparar solución de )arbonato de Sodio "$a *)#+ & al 0,* M 3,' * @
E 3,'= L
@ 3,3= moles G &3=,H> @ =,'HH gramos
R// Se necesitan ),! "ra*os de caronato de sodio para tener una *olaridad de 0,! M en !)0 *+.
abla
7 ubos 'lanco +olución madre ubos # ; 3 5 6 7
!arbona to de sodio (ml)
&*ua destilada (ml)
+ustrat o P (ml)
.n/ima 0– *alactosidasa (1%)
'u2er (pH 7,3) (ml)
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3,> 3,> 3,> 3,> 3,> 3,>
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8 ubos ubos 'lanco +olución madre # ; 3 5 6 7 8
!arbona to de sodio (ml)
&*ua destilada (ml)
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+ustrat o P (ml)
.n/ima 0– *alactosidasa (1%)
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#
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3.3' 3.3'
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iempo (minutos)
l tie(po i!ual a 4 (inutos la eni(a alcana su (aor capacidad catal/tica a pH 7.4 +7) de te(peratura, 1abiendo utiliado 0.0' (! de eni(a.
%&'$&$I ° 74 I@%.!I& .% PH +'$. %& A.%!I& . %& $.&!!IB .CI&I!& D. !&&%IC& %& ' " -&%&!+I&+& Preparar bufer Fosato de Sodio 0,06M, pH 2.3. p@ p0 a A log B4C B9C >,=@ 6,>' A log B4C 87,>6B9C @ B4C B9C
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!arbona to de sodio (ml)
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iempo (minutos)
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&*ua destilada (ml)
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3.3' 3.3'
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?ormula 3,338(@3,H83(# 3,33'6@3,H83(# 3,33(8@3,H83(# 3,33'>@3,H83(# 3,33(3@3,H83(# 3,33'&@3,H83(# 3,333(@3,H83(# 3,333&@3,H83(#
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iempo (minutos)
iscusión +n el laboratorio n;6 se analiz! la curva de progreso de la %idrolisis de 1:P2 por la acci!n de la enzima 4-galactosidasa $(7;< " P 7.8), llegando al resultado de que al transcurrir 8 minutos se alcanza la má#ima actividad catalítica de esta, %abiendo utilizado 3.3& mg de enzima. .= se observa una curva de progreso regular, %iperb!lica, alcanzando una actividad catalítica má#ima a los 7 minutos. Puede observarse que al minuto 6, la concentraci!n disminu"e considerablemente, esto se considera un error analítico que puede %aber sido provocado por %aber agregado de manera inadecuada la alícuota de 3.> ml al tubo n;6 o fuera del tiempo correspondiente. Sin embargo, analizando la curva puede observarse un avance de la reacci!n más estable que a p@7.8 retardando el decaimiento de la actividad enzimática, lo cual puede ser til para pr!#imas actividades prácticas en donde se requiera un tiempo de acci!n ma"or a 8 minutos. +sto puede deberse a que a p >.= la enzima posee $por arreglo espacial de grupos ionizados de la proteína) un sitio activo distinto al que contiene a p 7.8, generando un lapso de tiempo entre uno " otra molcula de sustrato, retardando la saturaci!n por sustrato o producto,
como ocurre en el p más acido. ?inalmente, la actividad enzimática en relaci!n a una temperatura de =6;< se puede concluir a travs de la curva de progreso, que la acci!n enzimática fue mu" irregular o casi nula. +n general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones químicasO por cada &3< de incremento, la velocidad de reacci!n se duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta le" general. Sin embargo, al ser proteínas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. +n este paso practico, se incub! a =6;<, casi '3 grados por encima de la temperatura de la actividad :;6. +n general se considera que llegando a los =3;< las enzimas se desnaturalizan, perdiendo su actividad catalítica. Se cree pertinente en otra actividad analizar el comportamiento de la 4-galactosidasa a 87;< para observar si es que %a" una duplicaci!n de la velocidad de reacci!n o si e#istiese algn impedimento para ello " su posterior estudio.
!onclusión +n este procedimiento se actu! con la enzima en su análisis sobre los cambios de regulaci!n de su actividad enzimática en donde se puede agregar que las enzimas son catalizadores de naturaleza proteica, el cual realiza actividades celulares, donde tiene la capacidad de acelerar las reacciones químicas, sin alterarse en presencia de la reacci!n " acta en un solo tipo de reacci!n, "a que estos son catalizadores que funcionan en una concentraci!n molar menor a la del reactivo, en donde una molcula enzimática generalmente cataliza la conversi!n de &3 a &333 molculas de sustrato, provocando que su velocidad de reacci!n sea ma"or. 9 su vez se desnaturalizan por calor al igual que las proteínas, tambin se precipitan en presencia de etanol o aumento concentraci!n de sales orgánicas. Qa que para que una enzima acelere su reacci!n, llevarla a rebajar el nivel de energía de activaci!n necesaria para que tenga lugar una reacci!n química, la energía de activaci!n es la cantidad de energía necesaria para inducir en una sustancia un estado de reactividad, la que se combina con la sustancia S inducindole una situaci!n transitoria que requiere una menor energía de activaci!n, para que tenga lugar la reacci!n. Para esto como se dijo anteriormente para una reacci!n de la actividad enzimática, una molcula de enzima no tiene por qu actuar a la misma velocidad, donde su actividad puede variar despendiendo del estado como P, temperatura, presencia de cofactores, concentraci!n de sustrato, presencia de in%ibidores o isoenzimas. Lo que lleva a este estudio donde se utiliz! la enzima /-galactosidasa proveniente de la bacteria E.coli 0&', la cual se utiliz! 1-nitrofenil-/galactosido como sustrato, la cual paso a %acer distintos procedimientos, eso sí utilizando la misma enzima " los demás componentes o soluciones como el carbonato de sodio " el 1-nitrofenil-/-galactosido, la cual se utiliz! una soluci!n madre " > tubos para cada laboratorio " así obtener la colorancia esperada para cada procedimiento, donde solo se produjo cambios tanto en su p " temperatura, a partir de esto representamos el
primer laboratorio n6 como muestra estándar para la comparaci!n con los siguientes laboratorios el cual tendrán cambios de temperatura " p, donde obtuvimos una alteraci!n donde no se encontr! absorbancias " se volvi! a cambiar la proporci!n de estos, la repetici!n con un p estable de 7,8 " una emperatura de (7;<, mostro que la soluci!n madre mantuvo valores de absorbancia en los tubos (>er aneEo) con una constante " en forma gradiente tanto su concentraci!n con su absorbancia en donde los parámetros para formar la curva de calibraci!n fue proporcional a la preparaci!n de sus soluciones. +n tanto en el laboratorio n7 se procur! actuar con el cambio de p sobre la velocidad de reacci!n enzimática de la /-galactosidasa, donde se prepar! un p de >,=, el cual fue ma"or al primer procedimiento, la cual se aRadi! las mismas soluciones anteriores como en el carbonato de sodio " el 1nitrofenol. Kespus al obtener "a soluci!n madre tras su incubaci!n a (7;<, la incorporaci!n de los tubos de la soluci!n madre, mostro absorbancias (>er aneEo#) que fueron menor a las del laboratorio n6, donde su curva de calibraci!n o la pendiente fue menor a la anterior, no obstante, las concentraciones se mantuvieron similares entre ellas.
Por ultimo en el laboratorio n7 parte ' se utiliz! el cambio de temperatura sobre la velocidad de reacci!n enzimática de /-galactosidasa, lo cual se formul! una temperatura a =6;< para la incubaci!n de la soluci!n madre, pero usando los mismas concentraciones de las soluciones utilizadas " a su vez con un p a 7,8. +sto formo una absorbancia menor a la de los anteriores laboratorios (>er aneEo;), "a que la temperatura afecto a la actividad de la enzima e %izo que su actividad deca"era transcurrido el tiempo, lo que llev! a que las concentraciones del producto fueran mínimas " descendentes.
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Se muestra la colorancia del laboratorio n6 de p 7,8 " temperatura a (7;<, concentraci!n de carbonato de sodio a 3,' * " 1:P2 de &3m*
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Se muestra la colorancia del laboratorio n7 de p >,= " temperatura a (7;<, concentraci!n de carbonato de sodio a 3,' * " 1:P2 de &3m*
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Se muestra la colorancia del laboratorio n7 parte ' de p 7,8 " temperatura a =6;<, concentraci!n de carbonato de sodio a 3,' * " 1:P2.
