BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR LABORATORIO No 2: EXTRACCION DE ADN 1. INTRODUCCION Las características de un organismo están especificadas en su información genética, la cual está representada como una secuencia de ácidos nucleicos, donde la suma total de esta secuencia es lo que conforma su genoma. Quizás de los procedimientos en biología molecular, el más básico es la purificación de ácidos nucleicos, en la forma de ADN o ARN. Por lo tanto se requieren métodos seguros para la separación de estos componentes de las células. Para lograr esto, se utilizan diversos métodos de extracción dependiendo del tipo de tejido a emplear, fresco, seco o congelado.
2. OBJETIVOS •
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Identificar las etapas indispensables en los protocolos de extracción de ADN Comparar varias técnicas de extracción de ADN Realizar un procedimiento procedimi ento modelo para la obtención de ADN
3. MARCO TEORICO El primer paso en cualquier protocolo de separación es el rompimiento del material inicial, ya sea de origen viral, bacteriano, vegetal o animal. El método utilizado para romper la célula debe ser tan leve como sea posible con el fin de causar el menor daño posible al ADN. La lisis celular se puede hacer por acción mecánica, pulverizando el tejido con hielo seco o nitrógeno líquido, también se puede utilizar la degradación enzimática de la pared celular (si está presente) y lisis con detergentes de las membranas celulares. Seguido al rompimiento celular la mayoría de métodos involucran una desproteinización, lo cual se lleva a cabo con un solvente orgánico, seguido de una precipitación con isopropanol o etanol y posterior solubilización con agua o tampón. Existen diferentes técnicas para la extracción del ADN, aunque todas conservan el uso de los mismos principios y fundamentos.
Para obtener ADN a partir de leucocitos totales (obtenidos de sangre periférica), células en cultivo, tejidos animales, vegetales, levaduras y bacterias; se usa generalmente una técnica de cuatro pasos secuenciales: • •
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El primer paso consiste en la lisis de las células y los núcleos. Luego, la separación del ADN a partir de sangre total involucra la lisis de eritrocitos, seguida por una lisis de leucocitos y de sus núcleos. Las proteínas celulares son entonces removidas por un paso de precipitación salina, y Finalmente el ADN genómico es concentrado por precipitación con isopropanol.
El ADN purificado por medio de este proceso, está listo para ser utilizado en diferentes aplicaciones, las cuales involucran: amplificaciones (PCR), digestión con endonucleasas de restricción, Southern blot y Dot blot. Existen otras técnicas que permiten la obtención de ADN genómico a partir de muestras sólidas y líquidas, que permiten la separación simple, rápida, segura y eficiente del ADN. Esta separación se basa en la utilización del isotiocianato de guanidina, como solución de lisis celular, lo cual permite una precipitación selectiva del ADN con etanol y solubilización en agua o en 8 mM de NaOH. Este procedimiento se puede realizar en 30 minutos, recobrando un 70% a un 100% del ADN.
4. PRE- LABORATORIO Diferentes métodos y tecnologías están disponibles en el mercado para realizar el aislamiento de ADN genómico. En términos generales la separación del ADN de los componentes celulares puede ser dividida en cuatro etapas: a. b. c. d. e.
Obtención de la muestra Disrupción o alteración de la membrana Lisis Remoción de proteínas y contaminantes Recuperación del ADN
Teniendo en cuenta el enunciado anterior responda: 1. Mencione y explique detalladamente los principales métodos de extracción de ADN 2. Mencione cuales son las diferentes muestras o tejidos de donde se puede obtener ADN, y cuál es su correcto manejo.
3. Los pasos b y c son combinados. Se emplea un buffer de lisis que contiene principalmente EDTA y SDS. ¿Cuál es la función de estos dos reactivos dentro de este contexto? 4. En la remoción de proteínas se utiliza una enzima, diga cuál es y cómo actúa. 5. La recuperación del ADN se puede realizar mediante diferentes métodos, los más comunes son: Salting-Out, extracción orgánica con fenol-cloroformo, métodos basados en sílica-gel o resina quelante (Chelex). Explique el principio de cada método.
5. MATERIALES Y REACTIVOS Tubos vacutainer con anticoagulante EDTA, heparina o citrato para obtención de sangre total (5 ml por mesa) Tubos Falcon de 15 mL y Eppendorf estériles de 1.5 mL Micro pipetas Puntas estériles Vortex Centrifuga con rotor para tubos de 15 mL y Micro centrifuga para viales de 1.5 mL Guantes Agua desionizada estéril Baño de agua a 37º C Isopropanol Etanol 70% Cloruro de amonio Bicarbonato de potasio EDTA SDS Acetato de amonio Kit de extracción de ADN para procariotas.
6. PREPARACION DE REACTIVOS Se utilizaran kit comerciales según disponibilidad en el laboratorio Central para extracción de ADN a partir de sangre periférica y a partir de cultivo celular. También se puede utilizar el protocolo Salting out preparando los siguientes reactivos: Buffer de lisis de glóbulos rojos (100 mL): 0.83 g de Cloruro de Amonio 0.1 g de Bicarbonato de Potasio •
0.2 mL de EDTA 0.5 M pH 8.0 80 mL de agua destilada estéril Mezclar en un Erlenmeyer con magneto hasta homogenización completa. Completar a 100 ml con agua destilada estéril. Autoclavar. Almacenar a 4ºC. Buffer de lisis celular (100 ml): 5 ml de EDTA 0.5 M pH 8.0 20 ml de SDS 10% 60 ml de agua destilada estéril •
Mezclar cuidadosamente (evitando la formación de espuma) en un erlenmeyer hasta homogenización completa. Completar a 100 ml en una probeta con agua destilada estéril. No Autoclavar. Almacenar a temperatura ambiente Solución precipitante de proteínas (50 ml): 38,54 g de Acetato de Amonio 10 ml de agua destilada estéril •
Mezclar en un Erlenmeyer usando magneto hasta completa homogenización. Puede requerir calentamiento ligero. Completar a 50 ml con agua destilada estéril. Autoclavar Almacenar a 4ºC. Solución de rehidratación 10 ml TE (Tris-HCL 10 mM EDTA 1mM) •
Preparar TRIS 1 M pH 8.0 100ml PM 121.1g EDTA 0.5 M pH 8.0 100ml Y a partir de estos hacer la mezcla TE y dilución correspondientes
7. PROCEDIMIENTO •
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TECNICA PROBE – EXTRACCION DE ADN Si se requiere utilizar volúmenes pequeños de muestra seguir el protocolo descrito en el anexo Master pure DNA purificación Kit for Blood. Si no es ese el caso realizar el siguiente protocolo:
1. En un tubo de 15 mL, medir 8 mL de Buffer de lisis de glóbulos rojos y sobre este adicionar con una pipeta de Pasteur 2 mL de sangre total. Con la misma pipeta mezclar muy bien y con mucha suavidad hasta lograr una completa homogenización. 2. Por inversión agitar muy suavemente durante 7 minutos a temperatura ambiente. 3. Centrifugar a 3000 R.P.M. durante 8 minutos. 4. Descartar el sobrenadante y conservar el pellet. 5. Mezclar con una pipeta Pasteur muy suavemente el pellet en el líquido residual. 6. Adicionar 2.5 ml de Buffer de lisis celular y mezclar varias veces, hasta homogenizar. Dejar al menos 20 minutos a temperatura ambiente. (En este paso se puede suspender el procedimiento, incluso hasta el día siguiente, dejando los tubos a 4ºC). 7. Adicionar 800 µl de solución precipitante de proteínas. Mezclar fuerte, hasta observar grumos de las proteínas precipitadas. 8. Centrifugar a 4000 R.P.M. durante 10 minutos. 9. Verter todo el sobrenadante sobre un tubo de 15 mL que contenga 2,4 mL de isopropanol frío (alcohol isopropílico), dejar en reposo al menos unos 5 minutos. 10. Mezclar cuidadosamente por inversión hasta precipitar el ADN. 11. Envolver el ADN en una pipeta y pasarlo rápidamente por etanol al 70% frío, dejar secar a temperatura ambiente y resuspender finalmente en buffer TE (Tris-HCL 10 mM EDTA 1mM) de 50-500 µl, dependiendo de la cantidad de ADN recuperado. Nota: El ADN se puede recuperar tomándolo con pipeta Pasteur y centrifugando a 10.000 rpm por 5 min y lavar con 200 µl etanol al 70%.
8. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS 1. ¿Por qué se deben usar cambios en los protocolos para extraer ADN en células procarióticas? 2. Consulte otras técnicas o kit de extracción de ADN y explique el fundamento de tres de estas, especificando el uso de los reactivos claves 3. ¿Qué conclusiones saca al comparar las diferentes técnicas o kit de extracción de ADN?
9. BIBLIOGRAFÍA -
Catálogos y fichas técnicas 2012 de las casas comerciales: Invitrogene, Promega, Biorad, Biologend, Bioline, etc. David, L.G. Dibner, M.D.& Battery, J.F. Bassin methods in molecular biology. Elsiever Science Publishing Co. Ind. NY. 1986 Perbal, B. A practical guide to molecular cloning. 2nd edition John Wiley 6 Sons, 1988 Sambrook, J. et al. 1989 Molecular cloning: a Laboratory Manual, 2 nd edition, Col Spring. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. Catálogos de los Kit de Promega, Corpogen, Dnazol y Probes
10. AUTOEVALUACION. NUMERO DE LA PRACTICA
LOGRO (Objetivos cumplidos) SI NO
FORTALEZAS
DEBILIDADES
SUGERENCIAS A CADA DEBILIDAD
ANEXO COMPLEMENTARIO A LA PRÁCTICA No. 2: EXTRACCIÓN DE ADN
PROTOCOLO PARA AISLAMIENTO DE ADN PROCARIOTICO Este procedimiento se usa para el aislamiento de ADN genómico a partir de bacterias grampositivas y gramnegativas. El ADN obtenido es apto para estudios de PCR, RFLPs, RAPDs, etc. Para la extracción del ADN genómico, las bacterias son lisadas a 80ºC en presencia de un detergente iónico. La pared de bacterias grampositivas es debilitada previamente con lisozima. Enseguida se remueven las proteínas contaminantes por medio de una alta concentración salina y finalmente se recupera el ADN genómico de alta calidad a partir de 1 ml de cultivo bacteriano, con la ventaja de no utilizar solventes orgánicos tóxicos. La lisozima se debe almacenar a -20ºC. El tampón de lisis usualmente forma un precipitado al ser almacenado a 4ºC, se debe calentar por unos minutos a 37ºC en baño de maría hasta que desaparezca el precipitado por completo.
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MATERIALES Y REACTIVOS
Isopropanol. Grado biología molecular a analítico Etanol al 70%. Preparado a partir de etanol absoluto grado reactivo Hielo Micro centrifuga Baño de calentamiento a 37ºC Baño de calentamiento a 80ºC Vortex Tubos eppendorf de 1,5 ml para Micro centrifuga Micro pipetas Puntas para micro pipeta
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1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27.
PROCEDIMIENTO Transferir 1 ml de cultivo bacteriano (de aproximadamente 16 horas) a un tubo Eppendorf. Centrifugar a 12000 RPM durante 5 minutos. Desechar el sobrenadante y añadir 1 ml de solución de lavado. Centrifugar a 12000 RPM durante 1 minuto. Desechar el sobrenadante dejando un volumen de 20 µl aproximadamente. Para bacterias gramnegativas continuar con el paso No. 12. Para bacterias grampositivas seguir con el paso No. 7. Agregar 480 µl de EDTA 50 mM. Resuspenda muy bien. Añadir 60 µl de lisozima (10mg/ml). Mezclar suavemente. Incubar a 37ºC durante 1 hora. Centrifugar a 12000 RPM durante 2 minutos. Desechar el sobrenadante dejando un volumen de 20 µl aproximadamente. Resuspender muy bien las células con el vortex. Agregar 500 µl de solución de lisis. Mezclar suavemente por inversión. Incubar a 80ºC por 5 minutos. Dejar enfriar a temperatura ambiente y luego añadir 3 µl de RNasa. Mezclar por inversión 2 a 5 veces. El paso 15 y 16 se omitirá en esta práctica. Incubar a 37ºC por 1 hora. Dejar enfriar a temperatura ambiente y luego añadir 500 µl de la solución de precipitación de proteínas. Mezclar muy bien con el vortex durante 20 segundos. Incubar en hielo por 5 minutos. Centrifugar a 14000 RPM durante 10 minutos. Transferir 1 ml del sobrenadante a un tubo Eppendorf nuevo, teniendo cuidado de no tocar el precipitado. Añadir 600 µl de isopropanol. Mezclar muy bien por inversión. Centrifugar a 14000 RPM por 5 minutos. Desechar el sobrenadante. Lavar 2 veces con 250 µl de etanol al 70%. Centrifugar cada vez a 14000 RPM por 2 minutos. Desechar el sobrenadante y dejar secar al aire durante 20 minutos. Resuspender el ADN en una cantidad adecuada (50-100 µl) de solución de resuspensión (TE).
