LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI UJI FISIOLOGI BAKTERI
Disusun untuk memenuhi tugas matakuliah Praktikum Mikrobiologi Lanjut yang dibina oleh Prof. Dr. Dra. Utami Sri Hastuti, M.Pd.
Oleh : Offering B/Kelompok 4 1. Saparuddin 2. Indri Pratiwi 3. Indra Pratiwi
(160341801190) (160341800938) (160341801342)
UNIVERSITAS NEGERI MALANG PASCASARJANA PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI 2016
UJI FISIOLOGI BAKTERI KUE LUMPUR
1
I. Topik : Pengamatan aktivitas metabolisme bakteri II. Tujuan :
Mahasiswa dapat mengetahui kemampuan bakteri menghidrolisis lemak Mahasiswa dapat mengetahui kemampuan bakteri menghidrolisis protein Mahasiswa dapat mengetahui kemampuan bakteri menghidrolisis amilum
III. Waktu Pelaksanaan Praktikum : Hari/Tanggal : Kamis, 13 Oktober 2016 melakukan inokulasi bakteri Jumat, 14 Oktober 2016 melakukan pengamatan bakteri Pukul : 09.30 s/d 13.00 WIB Tempat
: Laboratorium Mikrobiologi Lantai III Jurusan Biologi FMIPA, UM
IV. Dasar Teori : Mikroba memiliki sifat-sifat pertumbuhan, morfologi, dan sifat fisiologi yang dapat dipelajari dengan melakukan
isolasi terlebih dahulu.
Isolasi merupakan suatu metode untuk memisahkan mikroba tertentu dari populasi campuran sehingga memudahkan proses identifikasi. Salah satu teknik isolasi adalah isolasi pada cawan agar untuk jenis mikroba yang dapat membentuk koloni terpisah pada media padat, yaitu bakteri dan kapang (Dwidjoseputro 1998). Uji fisiologis bakteri dilakukan untuk mengidentifikasi bakteri berdasarkan aktivitas selnya. Bakteri yang dapat menghidrolisis pati mempunyai aktivitas amilolitik, yaitu menghasilkan enzim amilase yang dapat mengubah pati menjadi molekul-molekul gula sederhana (monosakarida) untuk kebutuhan metabolisme sel. Aktivitas tersebut ditandai dengan adanya zona bening di sekeliling koloni pada uji hidrolisis pati atau amilum (Hadioetomo, 1993). Amilum merupakan karbohidrat yang masuk dalam jenis polisakarida. Polisakarida
merupakan
makromolekul,
polimer
dengan
beberapa
monosakarida yang dihubungkan dengan ikatan glikosidik. Beberapa 2
polisakarida berfungsi sebagai materi simpanan atau cadangan yang nantinya ketika diperlukan akan dihidrolisis untuk menyediakan gula bagi sel. (Sukarminah, 2010). Kemampuan untuk menghidrolisis amilum menjadi glukosa, maltosa, dan dekstrin karena mempunyai enzim amilase. Amilum tidak dapat langsung digunakan, sehingga bakteri harus menghidrolisis amilum terlebih dahulu menjadi molekul sederhana dan masuk ke dalam sel (Sukarminah, 2010). Iodium digunakan sebagai indikator adanya amilum, bila medium yang mengandung pati atau amilum diberi iodium maka akan Nampak warna biru. Namun jika pati atau amilum tersebut telah terhidrolisis maka warnanya akan jernih atau bening. Warna jernih tersebut mengindikasikan bahwa pati atau amilum sudah terhidrolisis oleh eksoenzim pada bakteri (Hadioetomo, 1990). Bakteri penghidrolisis lemak mampu mengubah senyawa menjadi asam lemak dan gliserol. Bakteri dengan kemampuan hidrolisis lemak akan menimbulkan warna merah kekuningan pada bagian bawah dan sekitar koloni. Lemak merupakan campuran trigleserida yang terdiri atas 1 molekul gliserol yang berikatan dengan 3 molekul asam lemak. Lemak memiliki sifat antara lain: tidak larut dalam air, bila dipanaskan akan terjadi perubahan pada titik cair, titik asap dan titik nyala, serta plastis dan bentuknya mudah berubah-ubah bila mendapat tekanan, biasanya mengalami ketengikan, dan reaksi dengan alkali
akan
membentuk
sabun
dan
gliserol.
Enzim
lipase
mampu
menghidrolisis lemak dan memecahkan menjadi 3 molekul asam lemak dan 1 molekul gliserol. (Gaman, dkk. 1981). Jenis bakteri yang dapat menghidrolisis protein adalah bakteri yang memproduksi enzim proteinase ekstraseluler. Semua bakteri memiliki enzim proteinase tapi tidak semuanya memiliki enzim proteinase ekstraseluler. Aktivitas enzim ini juga dapat dibuktikan dengan adanya zona bening di sekeliling koloni pada hasil uji (Winarno, 1980). V. Alat dan Bahan :
3
Alat 1. Jarum inokulasi lurus 2. Pipet 3. Tabung reaksi 4. Inkubator 5. Gelas ukur 10 ml 6. Kaki tiga dan kasa 7. Beaker glass 400 ml 8. Lampu spirtus 9. Rak tabung reaksi 10. Tabung durham 1. 2. 3. 4.
Bahan Biakkan murni bakteri Medium amilum agar Medium skim milk agar Medium NA + Lemak + Neutral red
VI. Prosedur Kerja 1. Uji Kemampuan Menghidrolisis Amilum
4
Medium Amilum Agar (AA) pada cawan petri yang telah dibuat disediakan, kemudian dibuat garis dengan menggunakan spidol pada bagian bawah cawan petri sehingga membagi medium menjadi dua bagian yang sama
Biakan murni bakteri koloni I diinokulasikan pada setengah bagian medium dengan menggunakan jarum inokulasi. Setengah bagian medium diinokulasikan dengan biakan murni bakteri koloni II. Dilakukan inkubasi biakan pada suhu 37oC selama 1 x 24 jam.
Dilakukan penuangan larutan Iodium ke permukaan medium. Perubahan warna diperhatikan pada sekeliling koloni bakteri dan pada medium agar. Berdasarkan pengamatan, disimpulkan kemampuan menghidrolisis amilum pada kedua koloni bakteri yang dibiakkan.
2. Uji Kemampuan Menghidrolisis Protein Medium Skim Agar (SA) disiapkan, kemudian dengan menggunakan spidol dibuat garis tengah pada bagian bawah cawan petri.
Biakan murni bakteri pada koloni I diinokulasikan pada setengah bagian medium SA, sedangkan biakan murni bakteri koloni II diinokulasikan pada setengan bagian medium SA yang tersisa. Inkubasi dilakukan pada suhu 37oC selama 1 x 24 jam.
Pengamatan dilakukan pada perubahan medium di sekitar koloni bakteri. Kemampuan menghidrolisis protein dari dua koloni bakteri disimpulkan berdasarkan pengamatan.
3. Uji Kemampuan Menghidrolisis Lemak
5
Medium NA yang mengandung 1% minyak zaitun dan indikator Neutral Red (NAL) disiapkan. Garis tengah pada bagian dasar cawan petri dibuat sehingga membagi medium NAL menjadi dua bagian
Biakan murni koloni I diinokulasikan pada setengah bagian medium NAL, sementara setengah bagian medium NAL yang tersisa diinokulasikan dengan biakan murni koloni II. Inkubasi dilakukan pada suhu 37oC selama 1 x 24 jam.
Perubahan warna medium NAL pada koloni bakteri diamati. Kemampuan menghidrolisis lemak pada kedua koloni di simpulkan dari pengamatan tersebut.
VII. Data Hasil Pengamatan Tabel 1. Hasil Pengamatan Kemampuan Hidrolisis Bakteri No 1.
Kemampua n Hidrolisis Amilum
Medium Amilum Agar (AA)
Foto Hasil Pengamatan
Koloni I
Koloni II
6
2.
Protein
Skim Agar (SA)
Koloni I
Koloni II
3.
Lemak
Nurtient Agar Lipid (NAL)
Koloni I
Koloni II
Tabel 2. Hasil Pemeriksaan Kemampuan Hidrolisis Bakteri No
Koloni Bakteri
Kemampuan Menghidrolisis Amilum Protein Lemak 1. I 2. II +++ Keterangan: (-) Tidak mampu menghidrolisis (+) Kemampuan menghidrolisis lemah (++) Kemampuan menghidrolisis sedang (+++) Kemampuan menghidrolisis kuat
7
VIII. Analisis Data 1. Uji kemampuan hidrolisis amilum Koloni I tidak mampu menghidrolisis amilum. Hal ini dikarenakan tidak terbentuk zona bening di sekeliling koloni setelah medium diberi reagen Iodin. Koloni II mempunyai kemampuan menghidrolisis amilum kuat karena terbentuk zona bening sejauh 8 mm disekitar koloni bakteri setelah medium diberi reagen Iodin. 2. Uji kemampuan hidrolisis protein Koloni I tidak mampu menghidrolisis protein karena tidak terbentuk zona bening di sekitar koloni. Koloni II juga memperlihatkan sifat tidak mampu menghidrolisis protein karena di sekitar koloni II juga tidak terbentuk zona bening. Medium pada kedua koloni yang tumbuh tetap berwarna putih susu. 3. Uji kemampuan hidrolisis lemak Koloni I tidak mampu menghidrolisis lemak karena tidak terbentuk koloni berwarna merah. Koloni II juga tidak mampu menghidrolisis lemak karena juga tidak terbentuk koloni berwarna merah pada NAL. IX. Pembahasan Pada praktikum kali ini, kami menggunakan 3 macam medium sebagai bahan untuk menguji sifat biokimiawi bakteri yaitu medium amilum agar, skin milk agar (medium yang mengandung protein), dan NA+ minyak zaitun+indikator neutral red. Bakteri yang diamati sifat biokimiawinya yaitu bakteri biakan yang telah disediakan.. 1 Uji kemampuan hidrolisis amilum Pada medium amilum agar, Koloni I tidak mampu menghidrolisis amilum tersebut. Hal ini dikarenakan tidak terbentuk zona bening di sekeliling koloni setelah medium diberi reagen Iodin. Adanya zona bening menunjukkan bahwa pada medium amilum Agar terdapat koloni bakteri amilolitik yang dapat mengurai amilum. Bakteri amiloliti kini dapat mengurai amilum karena bakteri tersebut memiliki enzim amilase yang dapat mengurai amilum menjadi gula 8
sederhana. Menurut Zahidah (2013), potensi amilolitik diukur berdasarkan kemampuan isolat bakteri dalam mensekresikan enzim amilase. Pengujian enzim amilase secara kualitatif dilakukan dengan menguji aktivitas bakteri aerob dalam mendegradasi amilum pada medium amilum Agar. Koloni II mempunyai kemampuan menghidrolisis amilum kuat karena terbentuk zona bening sejauh 8 mm di sekitar koloni bakteri setelah medium diberi reagen Iodin. Hal ini berarti bahwa bakteri koloni II juga merupakan bakteri amilolitik. Menurut Hadioetomo (1993), Larutan iodium gram adalah indikator amilum. Bila medium yang mengandung amilum diberi larutan iodium, maka akan tampak warna biru. Bila amilum telah terhidrolisis, maka tempat-tempat yang tidak mengandung amilum lagi akan tampak jernih. Hal tersebut membuktikan bahwa bakteri melakukan aktivitas menghidrolisis amilum, dan hal itu juga berarti kedua bakteri yang kami amati dapat menghasilkan enzim amilase 2
Uji kemampuan hidrolisis protein Koloni I tidak mampu menghidrolisis protein karena tidak terbentuk zona bening di sekitar koloni. Hal yang sama terjadi pada Koloni II yang juga memperlihatkan sifat tidak mampu menghidrolisis protein karena di sekitar koloni II juga tidak terbentuk zona bening. Medium pada kedua koloni yang tumbuh tetap berwarna putih susu. Berdasarkan gambar, pada medium Skim Milk Agar menunjukkan tidak terdapatnya bakteri proteolitik, ditandai dengan tidak tditemukan terbentuknya zona bening pada mediumSMA. Bakteri proteolitik menghasilkan enzim protease yang dapat menguraikan protein menjadi asam amino. Menurut Winarwi (2006), protease
dihasilkan oleh
mikroba proteolitik yang mengkatalisis pemutusan ikatan peptida pada protein. Protease dibutuhkan secara fisiologi untuk kebutuhan organisme
pada
tumbuhan, hewan maupun mikroorganisme. Tidak di dapatkannya hasil seperti indikasi hasil aktifitas bakteri menghidrolisis protein yang telah di jelaskan dalam petunjuk praktikum dimungkinkan karena memang bakteri biakan yang ada pada medium kami tidak dapat menghidrolosis protein
9
ataukah kurangnya kecermatan dan ketelitian dalam pelaksanaan prosedurprosedur praktikum. 3
Uji kemampuan hidrolisis lemak Koloni I tidak mampu menghidrolisis lemak karena tidak terbentuk koloni berwarna merah. Begitupun pada Koloni II juga tidak mampu menghidrolisis lemak karena juga tidak terbentuk koloni berwarna merah pada NAL. Indikasi dari hasil aktifitas bakteri yang telah menghidrolisis lemak yaitu adanya warna merah pada bagian dasar koloni bakteri yang tumbuh, sedangkan warna medium yang ada di sekitar koloni bakteri berwarna kekuningan.. Tidak di dapatkannya hasil seperti indikasi hasil aktifitas bakteri menghidrolisis lemak dimungkinkan karena kurangnya pemberian neutral red pada medium agar lemak yang kami gunakan jadi warna merah tersebut tidak dapat terlihat. Namun juga dapat disebabkan memang bakteri biakan yang ada pada medium kami tidak dapat menghidrolosis lemak atau kemungkinan lain kesalahan dalam prosedur praktikum yang tidak sesuai arahan asisten dan dosen pengampu mata kuliah mikrobiologi lanjut.
X. Kesimpulan : Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat diketahui bahwa : 1
Bakteri pada koloni I dan II terbukti dapat menguraikan amilum pada medium amilum agar sehingga kedunya termasuk bakteri amilolitik.
2
Bakteri pada koloni I dan II tidak dapat menguraikan protein pada medium skim milk sehingga kedunya tidak termasuk bakteri proteolitik
3
Bakteri pada koloni I dan II tidak dapat menguraikan lemak pada medium lemak+ neutral red sehingga kedunya tidak termasuk bakteri lipolitik
XI. Diskusi 1. Adakah perubahan yang terjadi pada masing-masing pengujian? ` Jawaban :
10
perubahan hanya terjadi pada medium amilum agar (pengujian amilum) sementara medium skim milk (pengujian protein) dan medium NA + Neutral Red (pengujian lemak) tidak mengalami perubahan apapun 2. Bagaimanakah perubahan tersebut dapat terjadi?Jelaskan! Jawaban : Indikator yang dipakai pada uji hidrolisis amilum adalah iodine. Amilum akan bereaksi dengan iodine membentuk warna biru hitam yang terlihat pada media. NA yang mengandung amilum digunakan sebagai media. Amilum akan bereaksi dengan iodine membentuk kompleks warna biru hitam yang terlihat pada media. Warna biru hitam terjadi jika iodine masuk ke dalam bagian kosong pada amilum yang berbentuk spiral. Hidrolisis amilum terlihat sebagai zona jernih di sekeliling koloni, sedangkan hasil negatif ditunjukkan warna sekitar koloni tetap biru hitam. Uji
proteolitik
ditujukan
untuk
mengetahui
kemampuan
mikroorganisme menghasilkan enzim protease. Pada praktikum ini protein yang digunakan dalam bentuk kasein susu. Hidrolisis kasein secara bertahap akan menghasilkan monomernya berupa asam amino. Proses ini dinamakan peptonisasi atau proteolisis. Aktivitas proteolitik ditunjukkan oleh terbentuknya zone jernih di sekeliling koloni. Untuk mendapatkan energi dari lipid, mikroba menghasilkan enzim lipase dan esterase yang memecah ikatan ester menghasilkan gliserol dan asam lemak. Pengujian ini menggunakan indikator neutral red yang mampu mendeteksi keberadaan asam lemak yang terbentuk akibat hidrolisis lemak. Jadi apabila terdapat warna merah di bawah bakteri dapat diartikan bahwa terdapat asam lemak yang dihasilkan dari aktivitas hidrolisis lemak oleh bakteri. XII. Daftar Rujukan Hadioetomo, Ratna Siri. 1993. Mikrobiologi dasar dalam praktek (Teknik dan prosedur dasar laboratorium). Jakarta: Gramedia Pustaka Utama.
11
Setyawati, W.A., Subagyo. 2012. Isolasi dan Seleksi Bakteri Penghasil Enzim Ekstraseluler (Proteolitik, Amilolitik, Lipolitik Dan Selulolitik) yang Berasal dari Sedimen Kawasan Mangrove. Jurnal Ilmu Kelautan. 17(3). 4: 165-166. Dwidjosaputro, D . 2005. Dasar-dasar mikrobiologi. Jakarta : Djambatan Gaman, N. 1981. Unsur-unsur Mineral dan Air. Pengantar Ilmu Pangan Nutrisi dan Mikrobiologi. Yogyakarta. Gajahmada University Press. Hadioetomo, R.S.1993. Mikrobiologi dasar dalam praktek. Jakarta : Gramedia Sukarminah, E, Sumanti, D.M. dan Hanidah, I. 2010. Mikrobiologi Pangan. Universitas Pajajaran. Winarno, S.G.S Fardiaz dan Devardiaz. 1980. Pengantar Teknologi Pangan. Jakarta : Gramedia. XIII. Laporan sementara
12
