PENDAHULUAN
Judul
Enumerasi mikrobia
Latar belakang
Mikrobia dapat dinggal dimana-mana atau yang kita kenal dengan istilah kosmopolitan (tanah, air dan sebagai simbiosis dari organisme lain), serta mikrobia bersifat mikroskopis, yang hanya bisa dilihat dengan menggunakan mikroskop, salah satunya adalah bakteri. Mikrobia dapat tumbuh dan berkembang dengan sangat pesat di alam. Bakteri merupakan makhluk hidup yang sering ditumbuhkan dalam medium untuk tujuan suatu penelitian. Pertumbuhan dan perkembangan mikrobia berbentuk koloni-koloni yang sulit dihitung jumlah bakterinya. Setelah mempelajari bagaimana menumbuhkan suatu koloni bakteri, tentunya kita harus mengetahui kuantitas dan kualitas dari bakteri tersebut. Kualitas suatu bakteri dapat diketahui dengan melihat sifat-sifat bakteri baik yang menguntungkan maupun merugikan. Sedangkan, untuk menentukan kuantitas bakteri dapat dengan berbagai cara perhitungan jumlah bakteri, antara lain dengan cara perhitungan mikroskopis langsung (direct microscopis count) dan metode hitungan tak langsung (indirect count) yang menggunakan metode hitung pada cawan (spread plate maupun pour plate).
Dalam percobaan kali ini akan dipraktikan cara penghitungan langsung bakteri menggunakan mikroskop dengan metode counting chamber (haemocytometer) dan cara penghitungan tak langsung bakteri menggunakan teknik plate count dengan metode hitung pada spread plate pada medium NA. Penghitungan jumlah bakteri biasanya bertujuan untuk mengetahui banyaknya jumlah bakteri yang mungkin ada pada suatu bahan (khususnya bahan makanan) yang disimpan dengan waktu tertentu sehingga kualitas bahan tersebut dapat diketahui atau diketahui masa dimana bahan makanan tidak boleh di konsumsi lagi.
Tujuan
Melakukan perhitungan jumlah bakteri pada Tempe, jamu, saos, dan susu dengan perhitungan langsung
Melakukan perhitungan jumlah bakteri pada Tempe, jamu, saos, dan susu dengan perhitungan perhitungan tidak langsung
Mengetahui kelebihan dan kekurangan perhitungan secara langsung
Mengetahui kelebihan dan kekurangan perhitungan secara tidak langsung
TINJAUAN PUSTAKA
Enumerasi bakteri adalah teknik perhitungan jumlah mikroba dalam suatu media tanpa mengidentifikasi jenis mikroba (bakteri, jamur, yeast) yang bertujuan untuk menentukan jumlah sel dari suatu kultur bakteri secara kuantitatif (Jutono, 1980). Penetapan jumlah bakteri dilakukan dengan menghitung jumlah sel bakteri yang mampu membentuk koloni di dalam media biakan atau membentuk suspense dalam larutan biak (Dwidjoseputro, 1990). Analisis kuantitatif mikrobiologi pada bahan pangan ini penting dilakukan untuk mengetahui mutu bahan pangan dan menghitung proses pengawetan yang akan diterapkan pada bahan pangan tersebut (Fardiaz, 1993).
Menurut Jannasch dan Jones (1959), indek aktivitas dan nilai biomassa mikroorganisme dapat ditunjukkan dengan mengetahui jumlah mikroorganisme dalam perairan tersebut. Untuk mengetahui jumlah mikroorganisme dalam suatu perairan ada dua cara dasar yaitu:
Perhitungan mikroorganisme secara langsung (direct count)
Perhitungan bakteri secara tidak langsung (indirect count).
Perhitungan jumlah mikroba dapat dilakukan dengan perhitungan langsung maupun tidak langsung. Perhitungan secara langsung dapat mengetahui beberapa jumlah mikroorganisme pada suatu bahan pada saat tertentu tanpa memberikan perlakuan terlebih dahulu, sedangkan jumlah orgnisme yang diketahui dari cara tidak langsung terlebih dahulu harus memberikan perlakuan tertentu sebelum dilakukan perhitungan. Perhitungan secara langsung, dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain, adalah dengan membuat preparat dari suatu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber). Sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viable count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu: perhitungan pada cawan petri (total plate count/ TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN methode), dan calorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri) (Carrol, 1964).
Menurut Lay (1994) cara untuk menentukan jumlah bakteri dalam suatu medium dapat dilakukan dengan :
Jumlah bakteri secara keseluruhan (tottal cell counts), bila menggunakan cara ini maka semua bakteri dalam medium tersebut akan terhitung baik yang hidup maupun mati
Jumlah bakteri hidup (viable counts), bila menggunakan cara ini maka sel hidup daja yang di hitung sehingga lebih akurat
Perhitungan secara langsung dilakukan secara mikroskopis, yaitu dengan menghitung sel dibawah mikroskop. Setiap sel dalam suspensi contoh dengan volume yang sangat sedikit dan telah diukur secara teliti, diukur dengan menggunakan slide khusus yaitu kotak penghitung (counting chamber). Volume cairan yang terdapat pada tiap kotak kecil pada kotak hitung dapat diketahui secara pasti sehingga jumlah sel dalam tiap kotak dapat terlihat dan dihitung, jadi jumlah sel/ml larutan sel dapat diketahui (Buckle dkk, 1987).
Menurut Juntono dkk (1980), perhitungan mikrobia secara langsung dilakukan dengan cara menghitung jumlah sel yang hidup dan yang mati. Terdapat beberapa cara yang dapat dilakukan, antara lain :
Counting chamber
Pada perhitungan ini menggunakan haemocytometer dimana 1 tetes suspensi biakan mikrobia pada alat ini ditutupi dengan gelas penutup dan diamati dibawah mikroskop. Jumlah sel mikrobia tiap cc dapat ditentukan dengan cara menentukan jumlah dari sel rata-rata pada tiap petak yang volumenya telah diketahu
Pengecatan dan pengamatan mikroskopik
Pada cara ini, preparat mikroskopik dibuat pada gelas benda kemudian suspensi bahan atau biakan mikrobia yang volumenya telah diketahui diratakan diatas gelas benda pada luas tertentu. Preparat di cat dan dihitung dengan cara mengukur garis tengahnya sehingga jumlah mikrobia yang terdapat pada gelas benda dapat dihitung seluruhnya.
Filter membran
Pada cara ini, suspensi bahan atau biakan mikrobia disaring, lalu disaring lagi dnegan menggunakan filter membran yang telah disterilkan. Jumlah sel dari volume yang disaring dapat dihitung dari jumlah sel rata-rata tiap kesatuan luas pada filter membran.
Perhitungan langsung merupakan perhitungan yang dilakukan secara mikroskopis dengan cara menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil. Perhitungan ini menggunakan alat yang di sebut haemocytometer (Ferdiaz, 1992). Hemocytometer adalah ruang kaca atau gelas yang meliliki sisi-sisi ditinggikan dengan penutup kecil tembus cahaya yang tepat 0,1mm diatas lantai ruang (Hansen, 2013).Cairan yang digunakan dalam perhitungan tersebut memiliki volume tertentu, hingga gelas penutup dapat terpenuhi. Pada alat ini terdapat 9 kotak besar dengan luas 1 mm3, dalam 1 kotak besar ditengah terbagi menjadi 26 kotak sedang dengan panjang 0,2 mm. Sehingga dalam 1 kotak besar terdapat 400 kotak kecil. Tiap ruang hitung memiliki lebar 0,1 mm, tinggi sampel yag terletak antara gelas objek dan gelas penutup adalah 0,2 mm (Ferdiaz, 1992).
Menurut Carol dan Freund (1964), pada haemocytometer terdapat celah yang dipergunakan sebagai wadah untuk larutan dengan tinggi 0,1 mm, oleh karena itu volume larutan yang dapat masuk ke celah kotak hitung besar (counting grid) adalah 0,1 mm3. Perhitungan ini menggunakan teknik sampling, dimana 5 kotak diambil dari 25 kotak yang ada kemudian hasil di hitung rata-rata dan dianggap sebagai jumlah bakteri perkotak. Jumlah dari bakteri per kotak dikalikan dengan 25, hal ini dilakukan untuk mendapatkan jumlah bakteri per volume haemocytometer (0,1 mm-3). Volume pada haemocytometer memiliki satuan yang dikonversi ke cm3 dengan mengalikan 1000 lalu dikalikan dengan kebalikan dari faktor pengenceran hal ini disebabkan pengenceran berbanding terbalik dengan jumlah bakteri. Rumus perhitungan langsung dapat dituliskan :
bakteri total = jumlah bakteri rata-rata × 25 × 10 × 103×1faktor pengenceran
Gambar 1. Haemocytometer (Sumber: dokumentasi pribadi)
Menurut Hadioetomo (1990), kelebihan dari metode ini :
Pelaksanaan perhitungan cepat
Peralatan yang diperlukan dalam perhitungan tidak banyak
Kelemahan metode perhitungan tidak langsung menurt Hadioetomo (1990), yaitu :
Sulit menghitung sel yang berukuran sangat kecil, misalnya bakteri. Hal ini disebabkan oleh ketebalan hemocytometer yang tidak mungkin untuk digunakannya lensa obyektif celup minyak
Kecenderungan sel untuk bergerombol sehingga sukar untuk membedakan sel-sel individu
Metode yang digunakan dalam perhitungan tidak langsung yaitu metode perhitungan cawan. Prinsip perhitungan cawan ini adalah jika mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitive untuk menghitung jumlah mikroba karena adanya alas an yaitu hanya sel yang hidup dihitung, beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus, dapat digunakan untuk isolasi atau identifikasi mikroba karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari satu sel. Metode hitungan cawan dibagi menjadi dua yaitu metode tuang (Pour plate) dan metode permukaan (Surface plate) (Fardiaz, 1993).
Jumlah masing-masing cawan diamati setelah inkubasi, cawan yang dipilih untuk penghitungan koloni ialah yang mengandung antara 30 sampai 300 koloni, karena jumlah mikroorganisme dalam sampel tidak diketahui sebelumnya, maka untuk memperoleh sekurang-kurangnya satu cawan yang mengandung koloni dalam jumlah yang memenuhi syarat tersebut maka harus dilakukan sederetan pengenceran dan pencawanan. Jumlah organisme yang terdapat dalam sampel asal ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan (Penn, 1991).
Pada praktikum digunakan teknik penghitungan tidak langsung yaitu dengan metode plate count, pada perhitungan bakteri secara tidak langsung, suspensi susu dan tanah diambil 100 μl disetiap pengenceran 10-2, 10-4, dan 10-6, kemudian suspensi bahan yang mengandung bakteri diinokulasi pada medium NA dan diratakan dengan trigalski secara spread plate agar diperoleh koloni bakteri terpisah dan tersebar di seluruh permukaan medium tersebut sehingga dapat memudahkan perhitungan jumlah koloni bakteri. Plate count / viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah ditumbuhkan dalam media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai.
Setelah diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut. Koloni yang tumbuh tidak selalu berasal dari satu sel mikroorganisme karena beberapa mikroorganisme tertentu cenderung membentuk kelompok atau berantai. Berdasarkan hal tersebut digunakan istilah Coloni Forming Units (CFU's) per ml. Perhitungan ini menggunakan teknik spread plate, jadi nilai CFU yang terhitung adalah per 0,1 ml atau 0,1 gram sampel. Jadi konversi dari CFU/0,1 ml sampel menjadi CFU/ml sampel yaitu dengan nilai jumlah bakteri dikali 10 lagi untuk hasil per ml atau per gram.
TPC merupakan pemeriksaan kuantitatif terhadap bakteri dalam sampel. TPC adalah Total Plate Count, yaitu suatu hitungan jumlah bakteri yang terkandung didalam 1 ml sampel. Untuk menghitung Total Plate Count (TPC) dilakukan pemeriksaan terhadap sampel air dengan spread plate method. Setiap satu sampel dilakukan pengulangan tiga kali. Pertumbuhan koloni yang terjadi setelah 24 jam inkubasi, dihitung dengan bantuan qubec colony counter karena setiap sampel dilakukan pemeriksaan 3 kali (pengulangan 3 kali), maka hasil perhitungan TPC pada 3 petridisk dijumlahkan dan dibuat angka rata-ratanya (Rahayu, 2000).
Metode viable count atau disebut dengan metode TPC (Total Plate Count) merupakan kultur yang diencerkan sampai batas yang diinginkan. Kultur encer ditumbuhkan kembali pada media, sehingga diharapkan setiap sel tumbuh menjadi satu koloni, biasanya 4-12 jam. Namun, cara ini memiliki keterbatasan yaitu jumlah sel terhitung biasanya lebih kecil dari sebenarnya dan tidak dapat diaplikasikan pada bakteri yang tumbuh lambat. Faktor yang mempengaruhi perhitungan bakteri dengan metode ini adalah jumlah sel bakteri hatus mendekati kelipatan 10 pada setiap pengencerannya. Jika tidak, maka perhitungan dianggap gagal (Purwoko, 2007).
Menurut Waluyo (2007), pengamatan bakteri dapat dilakukan secara individual, satu per satu, maupun secara kelompok dalam bentuk koloni. Bila bakteri yang ditumbuhkan di dalam medium yang tidak cair, maka akan terjadi suatu kelompok yang dinamakan koloni. Bentuk koloni berbeda-beda untuk setiap spesies, dan bentuk tersebut merupakan ciri khas bagi suatu spesies tertentu. Untuk memenuhi persyaratan statistik, cawan yang dipilih untuk dihitung mengandung 30-300 koloni. Untuk memenuhi persyaratan tersebut dilakukan sederatan pengenceran dan pencawan. Jumlah mikroba dalam sampel ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan. Satuan yang digunakan untuk menyatakan jumlah koloni atau bakteri adalah cfu/mL (cfu = colony forming units).
Tempe adalah makanan yang dibuat dari fermentasi terhadap biji kedelai atau beberapa bahan lain yang menggunakan beberapa jenis kapang Rhizopus, seperti Rhizopus oligosporus, Rh. oryzae, Rh. stolonifer (kapang roti), atau Rh. arrhizus. Sediaan fermentasi ini secara umum dikenal sebagai "ragi tempe". Kapang yang tumbuh pada kedelai menghidrolisis senyawa-senyawa kompleks menjadi senyawa sederhana yang mudah dicerna oleh manusia. Tempe kaya akan serat pangan, kalsium, vitamin B dan zat besi. Berbagai macam kandungan dalam tempe mempunyai nilai obat, seperti antibiotika untuk menyembuhkan infeksi dan antioksidan pencegah penyakit degeneratif.
Jamu adalah sebutan untuk obat tradisional dari Indonesia. Jamu dibuat dari bahan-bahan alami, berupa bagian dari tumbuhan seperti rimpang (akar-akaran), daun-daunan, kulit batang, dan buah. Ada juga menggunakan bahan dari tubuh hewan, seperti empedu kambing, empedu ular, atau tangkur buaya. Seringkali kuning telur ayam kampung juga dipergunakan untuk tambahan campuran pada jamu gendong.
Saos Tomat mengandung energi sebesar 98 kilokalori, protein 2 gram, karbohidrat 24,5 gram, lemak 0,4 gram, kalsium 12 miligram, fosfor 18 miligram, dan zat besi 1 miligram. Selain itu di dalam Saos Tomat juga terkandung vitamin A sebanyak 1880 IU, vitamin B1 0,09 miligram dan vitamin C 11 miligram. Hasil tersebut didapat dari melakukan penelitian terhadap 100 gram Saos Tomat, dengan jumlah yang dapat dimakan sebanyak 100 %. Susu disebut sebagai makanan yang hampir sempurna karena kandungan zat gizinya yang lengkap. Selain air, susu mengandung protein, karbohidrat, lemak, mineral, enzim-enzim, gas serta vitamin A, C dan D dalam jumlah memadai. Manfaat susu merupakan hasil dari interaksi molekul-molukel yang terkandung di dalamnya.
METODE
Alat
Alat yang dihunakan pada percobaan ini adalah bunsen, petri dish, gelas beker, gelas penutup, haemocytometer, handcounter, inkubator, kapas, karet gelang, kertas payung, korek api, label, laminair flow (LAF), mikropipet, mikroskop, mikrotip, pipet ukur, pro pipet, rak tabung reaksi, tabung reaksi, timbangan elektrik, trigalski, dan vortex.
Bahan
Bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah aquadest steril, alkohol 70%, medium NA dalam petri dish, tip, tissue, sampel tempe, sampel jamu, sampel susu dan sampel saos.
Cara Kerja
Perhitungan langsung
Pengenceran sampel
Susu, jamu dan saos diambil sebanyak 0,1 ml dengan menggunakan timbangan elektrik dan dimasukkan ke tabung reaksi yang berisi 9,9 ml aquades steril, untuk pengenceran 10-2. Tabung reaksi kemudian divortex. Susu, jamu dan saos pada pengenceran 10-2 diambil sebanyak 0,1 ml dengan menggunakan pipet ukur dan propipet kemudian dimasukkan ke tabung reaksi yang berisi 9 ml aquades steril, untuk pengenceran 10-3. Tabung reaksi kemudian di vortex. Susu, jamu dan saos pada pengenceran 10-3 diambil sebanyak 0,1 ml dengan menggunakan pipet ukur dan propipet kemudian dimasukkan ke tabung reaksi yang berisi 9 ml aquades steril, untuk pengenceran 10-4. Tabung reaksi kemudian di vortex. Susu, jamu dan saos pada pengenceran 10-4 diambil sebanyak 0,1 ml dengan menggunakan pipet ukur dan propipet kemudian dimasukkan ke tabung reaksi yang berisi 9 ml aquades steril, untuk pengenceran 10-5. Tempe ditumbang dengan menggunakan timbangan elektrik sebanyak 0,1 ml kemudian pengenceran sampel dilakukan seperti pada Susu, jamu dan saos.
Perhitungan langsung
Haemocytometer dan gelas penutup disterilkan dengan menggunakan alkohol 70% kemudian di panaskan diatas api bunsen. Haemocytometer kemudian ditutup dengan mengunakan gelas penutup dan suspensi sampel Saos, susu, tempe dan jamu dengan pengenceran 10-3, 10-4, dan 10-5 diteteskan pada haemocytometer sebanyak 0,1 ml pada kedua sisi yang berbeda. Haemocytometer diletakkan pada meja benda kemudian diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 45 x 10. Jumlah bakteri yang terdapat pada 5 kotak dalam bilik hitung diamati kemudian dihitung dengan menggunakan hand counter. Cara penghitungannya dari kiri ke kanan kemudian kebawah lalu kekiri, begitu seterusnya. Perghitungan secara langsung dengan cara ini dilakukan juga pada hati ayam. Rumus yang digunakan yaitu :
bakteri = bakteri rata-rata × 25×10×103×1faktor pengenceran
Perhitungan tidak langsung
Pengenceran sampel
Susu, jamu dan saos diambil sebanyak 0,1 ml dengan menggunakan pipet ukur dan propipet kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9,9 ml aquades steril, untuk pengenceran 10-2. Tabung reaksi kemudian divortex. Susu, jamu dan saos pengenceran 10-2 diambil sebanyak 0,1 ml dengan menggunakan pipet ukur dan propipet propipet kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9,9 ml aquades steril, untuk pengenceran 10-4. Tabung reaksi kemudian divortex. Susu, jamu dan saos pengenceran 10-4 diambil sebanyak 0,1 ml dengan menggunakan pipet ukur dan propipet propipet kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9,9 ml aquades steril, untuk pengenceran 10-6. Tempe ditumbang dengan menggunakan timbangan elektrik sebanyak 0,1 ml kemudian pengenceran sampel dilakukan seperti pada jus alpukat.
Perhitungan tidak langsung
Inokulasi bakteri dari Susu, jamu, tempe dan saos dilakukan pada ruang LAF. Suspensi sampel hus alpukat dengan pengenceran 10-2, 10-4, dan 10-6 diambil sebanyak 100 µl dengan menggunakan mikropipet dan tip kemudian di tuangkan ke atas medium pada petri dish. Teknik spread plate method dilakukan pada medium NA, sampel tersebut diratakan pada medium dengan trigalski. Petri dish dibungkus dengan menggunakan kertas payung dan diinkubasi dengan suhu 37°C pada inkubator selama 48 jam. Jumlah koloni dihitung kemudian bila memenuhi syarat CFU maka dihitung dengan menggunakan rumus :
Bakteri=rata-rata jumlah bakteri volume suspensi bakteri x 10 CFUml
HASIL DAN PEMBAHASAN
Enumirasi adalah suatu teknik perhitungan jumlah mikrobia dalam medium tanpa mengidentifikasi jenis mikrobia(bakteri, yeast, jamur). Teknik ini bertujuan untuk untuk menentukan jumlah sel dari suatu kultur bakteri secara kuantitatif (Cappucino dan Sherman, 1983). Analisis kulaitatif mikrobiologi pada bahan makanan berguna untuk mengetahui mutu bahan pangan dan menghitung proses pengawetan yang akan diterapkan pada bahan pangan terebut (Ferdiaz, 1992).
ALT atau Angka lempeng total adalah angka yang menunjukkan jumlah bakteri mesofil dalam tiap-tiap 1 ml atau 1 gram sampel makanan yang diperiksa. Prinsip dari ALT adalah menghitung pertumbuhan koloni bakteri aerob mesofil setelah sampel makanan ditanam pada lempeng media yang sesuai dengan cara tuang kemudian dieramkan selama 24-48 jam pada suhu 35-37°C (Joko Wibowo Ristanto, 1989). Uji angka lempeng total merupakan metode yang umum digunakan untuk menghitung adanya bakteri yang terhadap dalam sediaan yang diperiksa. Metode penentuan angka lempeng total ini digunakan untuk menentukan jumlah total mikroorganisma aerob dan anaerob (psikrofilik, mesofilik dan termofilik).
Psikofilik adalah kelompok mikroorganisme yang hidup pada suhu kurang dari 20°C,
Mesofilik adalah kelompok mikroorganisme yang hidup pada suhu 20 °C-40°C
Termofilik adalah kelompok mikroorganisme yang hidup pada suhu lebih besar dari 40°C.
Angka lempeng total aerob adalah jumlah mikroorganisma hidup yang membutuhkan oksigen yang terdapat dalam suatu produk yang diuji. Pertumbuhan mikroorganisme aerob dan anaerob (psikrofilik, mesofilik dan termofilik) setelah contoh diinkubasikan dalam media agar pada suhu 35°C ± 1°C selama 24 jam 48 jam ± 1 jam mikroorganisme ditumbuhkan pada suatu media agar, maka mikroorganisma tersebut akan tumbuh dan berkembang biak dengan membentuk koloni yang dapat langsung dihitung.
Fungsi perlakuan larutan vortex dengan tujuan agar sampel tercampur secara merata dengan aqades (homogen). Pengenceran dilakukan dengan fungsi untuk mengurangi jumlah koloni bakteri sehingga semakin mudah ketika dilakukan perhitungan. Seharusanya pada perhitungan, bila jumlah pangkat pengenceran makin kecil maka jumlah bakteri makin sedikit. tip/pipet setiap seri pengenceran harus berbeda memiliki fungsi agar tidak terjadi kontaminasi. Pengenceran dilakukan untuk mengurangi jumlah koloni bakteri sehingga semakin mudah ketika dilakukan perhitungan. Seharusanya pada perhitungan, bila jumlah pangkat pengenceran makin kecil maka jumlah bakteri makin sedikit.
Perbedaan jumlah bakteri secara langsung dan secara tidak langsung disebabkan karena pada perhitungan langsung menghitung jumlah bakteri total baik yang hidup maupun yang mati, sedangkan perhitungan tak langsung menghitung jumlah sel bakteri yang mampu hidup dengan menunjukkan pertumbuhan koloni. Sehingga sangat jelas apabila penghitungan langsung menunjukkan hasil yang lebih besar dibandingkan penghitungan secara tak langsung. Selain itu dapat disebabkan karena pada penghitungan tak langsung terdapat beberapa sel mikrobia yang terhitung sekaligus, terdapat beberapa sel berdekatan yang membentuk spreader sehingga tidak terhitung, dan proses inkubasi yang kurang sempurna sehingga koloni mikrobia yang terbentuk kurang maksimal.
Perbedaan dari perhitungan secara langsung dan tidak langsung adalah dalam perhitungan secara langsung, tidak dapat dibedakan antara bakteri yang mati dan yang hidup dan dilakukan perhitungan secara mikroskopis dengan menggunakan mikroskop.Sedangkan pada perhitungan secara tidak langsung, bakteri diinokulasi terlebih dahulu pada medium nutrient agar, sehingga yang dihitung hanya koloni bakteri yang hidup saja secara makroskopis.
Beberapa faktor yang mempengaruhi penghitungan bakteri baik secara langsung maupun secara tidak langsung, antara lain:
Faktor pengenceran, semakin tinggi pengenceran suatu suspensi maka jumlah bakteri yang dikandungnya akan semakin sedikit.
Temperatur dan pH, berkaitan dengan temperatur dan pH optimum dari suatu jenis bakteri.
Komposisi medium, medium yang digunakan untuk inokulasi harus sesuai dengan bakteri yang akan dihitung.
Keterampilan dan ketelitian dalam menggunakan alat.
Perhitungan Langsung
Berikut ini merupakan hasil dalam praktikum penghitungan jumlah bakteri secara langsung (menggunakan counting chamber dengan haemocytometer) dan secara tidak langsung menggunakan teknik plate count dengan metode spread plate.
Tabel 1. Hasil Perhitungan Langsung Jumlah bakteri pada tempe, jamu, saos dan susu.
Kelom
Pok
Sampel
Rata-rata bakteri
Sel bakteri sel/ml
10-3
10-4
10-5
10-3
10-4
10-5
1
Tempe
27
21,3
39
0,68.1010
5,325.1010
9,75.1010
2
45
40
30,67
1,13.1010
10.1010
76,7.1010
3
Jamu
152,8
140,2
115
38,2.1010
35,1.1010
287,5.1010
4
152,8
140,2
115
38,2.1010
35,1.1010
287,5.1010
5
Saos
44
23,5
42,6
1,1.1010
5,87.1010
107.1010
6
57,67
23,5
42,6
1,44.1010
5,83.1010
107.1010
7
Susu
137
129
37,3
3,425.1010
3225.1010
93,25.1010
8
83,8
35
20,2
2,095.1010
8,75.1010
50,5.1010
Pada metode ini, sampel diencerkan dengan pengenceran 10-2, 10-3, 10-4, 10-5. Sebelumnya sampel yang berbentuk padatan di tumbuk terlebih dahulu, lalu ditimbang sebanyak 1 gram, tambahkan aquades hingga larutan menjadi 9 ml. Sampel (Tempe, jamu, susu, dan saos) di ambil menggunakan pipet ukur sebanyak 1 mL dimasukkan ke dalam aquades steril 9 mL. Semua sampel di ambil hanya 1 mL dan aquades sebanyak 9 mL dikarenakan pengenceran dilakukan lompat dari 10 menjadi 10-2. Larutan kemudian di vortex, Pengenceran selanjutnya dilakukan secara berurutan sehingga larutan pengenceran sebelumnya yang diambil yaitu 1mL dan aquades steril pada tabung reaksi yaitu 9 mL, setelah itu selalu di vortex.
Untuk mengamati jumlah sel bakteri, haemocytometer disterilkan kemudian diletakkan gelas penutup diatasnya. Pengenceran 10-3, 10-4, 10-5 diamati secara berurutan dengan meneteskan larutan pada haemocytometer dan diamati dibawah mikroskop. Hand counter digunakan untuk menghitung bakteri yang dapat diamati. Pengenceran ini dilakukan untuk memenuhi syarat penghitungan statistik, yaitu jumlah mikroba yang dihitung tidak boleh lebih dari 100 dengan demikian, kesalahan penghitungan dapat diminimalkan. Suspensi bakteri ini diteteskan sebanyak 1 tetes pada alat yang disebut Hemocytometer yang telah dibersihkan dengan alkohol, hal ini dimaksudkan agar hemositometer bersih dari debu dan kuman yang dapat mengganggu perhitungan, prinsip dari cara pemakaian alat ini adalah dengan menempatkan 1 tetes suspensi mikrobia pada ruang hitung yang terdiri dari 9 kotak besar yang luasnya 1 mm2. Hemositometer dengan ukuran besar, 1 x 1 mm (1 mm2) ini dibagi dalam 3 cara: 0,25 x 0,25 mm (0,0625 mm2), 0,25 x 0,20 mm (0,05 mm2) dan 0,20 x 0,20 mm (0,04 mm2). Pusat, 0,20 x 0,20 mm ditandai, 1 x 1 mm2 yang kemudian dibagi lagi menjadi 0,05 x 0,05 mm (0,0025 mm2). Struktur sel-ukuran yang akan dihitung adalah yang terletak antara tengah tiga baris di atas dan kanan alun-alun dan dari tiga baris di bagian bawah dan kiri alun-alun. Sel bakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui dan dapat digunakan sebagai data dalam rumus untuk mengetahui jumlah sel mikrobia tiap ml.
Rumus yang digunakan pada perhitungan Langsung :
bakteri total = jumlah bakteri rata-rata × 25 × 10 × 103×1faktor pengenceran
Logika perhitungan :
Jumlah bakteri rata-rata : merupakan jumlah bakteri rata-rata yang dihitung dalam lima kotak perwakilan yang diasumsikan sebagai jumlah bakteri setiap kotak.
Angka 25 : setelah diketahui asumsi jumlah bakteri tiap kotak, maka asumsi jumlah bakteri tiap kotak dikalikan 25, karena ada 25 kotak yang kita hitung melalui perwakilan dari 5 kotak.
Angka 10 : berasal dari volume yang kita hitung, dengan rumus volume = p x l x t. Panjang kotak adalah 1 mm, lebar kotak adalah 1 mm, dan ketinggian haemocytometer dari dasar (bukan dari kanal) hingga permukaan gelas penutup adalah 0,01 mm. Jumlah sel yang sudah kita kali di bagu dengan volume 1/10, sehingga didapat angka perkalian dengan 10.
Angka 103 : berasal dari konversi mm3 dari satuan volume sebelumnya menjadi cm3 karena cm3 = ml.
1/faktor pengenceran : berdasarkan faktor pengenceran dari suspensi yang kita gunakan.
Setelah mengetahui kekurangan perhitungan langsung adalah terlalu kecilnyua bakteri menyebabkan sulit untuk melihat yang kecil bahkan bakteri individu, maka dari itu hasil perhitungan langsung terkadang lebih banyak dibandingkan perhitungan tidak langsung. Karena pada perhitungan langsung juga sulit untuk membedakan antara bakteri atau kotoran.
Seharusanya pada perhitungan jumlah bakteri, bila jumlah pangkat pengenceran makin kecil maka jumlah bakteri makin sedikit. Sedangkan pada rata-rata jumlah bakteri semakin kecil pangkat pengenceran makan semakin banyak jumlahnya. Kolom rata-rata bakteri tidak sebanding dengan kolom total bakteri di karenakan ada faktor pengenceran pada rumus total bakteri. Jumlah rata-rata bakteri berbanding terbalik dengan faktor pengenceran pada rumus, semakin tinggi rata-rata bakteri maka semakin rendah faktor pengenceran yang berpengaruh. Jika tidak sesuai maka perhitungan langsung bisa saja di sebabkan dengan beberapa faktor yang tidak di sengaja. Faktor-faktor yang mempengaruhi perhitungan secara langsung jumlah bakteri pada praktikum yang sudah dilakukan adalah skill praktikan dalam membuat suspense ataupun dalam memakai mikroskop, kedalaman pipet untuk mengambil suspense, adanya debu mikroskop, subjektivitas pengamatan dan penumpukan koloni.
Sampel yang jumlah mikrobanya tertinggi adalah sampel pada Susu. Pada percobaan yang pertama dan kedua pada angka pengenceran 10-3 secara berturut-turut jumlah mikrobanya adalah 3,425.1010 dan 2,095.1010. Pada pengenceran 10-4 pada pengulangan yang pertama dan kedua secara berturut-turut adalah 3225.1010 dan 8,75.1010. Pada pengenceran 10-5 pengulangan pertama dan kedua secara berturut-turut adalah 93,25.1010 dan 50,5.1010. sampel yang jumlah mikrobanya ter-rendah adalah sampel pada Tempe. Pada pengenceran 10-3 di pengulangan pertama dan kedua didapatkan hasil secara berturut-turut 0,68.1010 dan 1,13.1010. Pada pengenceran 10-4 pada npengulangan pertama dan kedua di dapatkan hasil secara berturut-turut 5,325.1010 dan10.1010. Pada pengenceran 10-5 pengulangan pertama dan kedua di dapatkan hasil secara berturut-turut 9,75.1010 dan 76,7.1010.
Perhitungan Tidak Langsung
Sampel yang digunakan dalam percobaan perhitungan tidak langsung sama seperti sampel perhitungan langsung yaitu tempe, saos, susu dan jamu. Dilakukan pengenceran 10-3, 10-4 dan 10-6 dengan cara sama seperti di atas. Suspensi sampel kemudian di ambil sebanyak 100µl dengan menggunakan mikropipet dan tip. Dilakukan teknik spread plate pada medium lalu diinkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam. Penggunaan suhu ini, karena bakteri tersebut bekerja optimum pada suhu tersebut. Perhitungan ini dilakukan dengan menghitung jumlah koloni.
Tabel 2. Tabel hasil perhitungan tidak langsung pada Tempe, Jamu, Saos, dan Susu
Kelompok
Sampel
Rata-rata bakteri
Jumlah Mikroba (CFU/ml)
10-3
10-4
10-5
1
Tempe
TNTC
152
85
2,85.105
2
TNTC
-
105
3
Jamu
TFTC
TNTC
TNTC
1,73.106
4
TFTC
173
TNTC
5
Saos
157
54
TFTC
2,0818.105
6
190
57
TFTC
7
Susu
TNTC
TNTC
TNTC
TNTC
8
TNTC
TNTC
TNTC
Keterangan :
TNTC = bakteri lebih dari 300
TFTC = bakteri kurang dari 30
Pada penentuan jumlah bakteri secara tidak langsung, jumlah masing-masing cawan diamati setelah inkubasi, cawan yang dipilih untuk penghitungan koloni ialah yang mengandung antara 30 sampai 300 koloni, karena jumlah mikroorganisme dalam sampel tidak diketahui sebelumnya, maka untuk memperoleh sekurang-kurangnya satu cawan yang mengandung koloni dalam jumlah yang memenuhi syarat tersebut maka harus dilakukan sederetan pengenceran dan pencawanan. Pengenceran bertujuan untuk memperoleh bakteri dengan medium dan motilitas bakteri yang menyebar sehingga dapat dihitung dengan mudah. Pengenceran dibuat dengan kelipatan 10 dan diambil 100 μl di setiap pengenceran 10-2, 10-4, 10-6 untuk membandingkan jumlah koloni dari tiap konsentrasi pengenceran, dimana pada pengenceran yang kecil jumlah bakterinya dalam medium tersebut akan menjadi terlalu padat dan nutrisi yang diterima bakteri semakin sedikit, sementara pada pengenceran yang lebih besar, jumlah bakteri dalam medium tersebut tidak sepadat seperti pada medium pengenceran yang kecil, sehingga nutrisi yang diperoleh bakteri dapat tercukupi, kemudian diinokulasi pada medium Nutrient Agar, medium NA ini dipilih karena medium ini merupakan medium serbaguna yang baik untuk pertumbuhan bakteri dan selanjutnya diinkubasi menggunakan inkubator. Perhitungan secara tidak langsung ini hanya untuk menghitung sel yang hidup saja.
Menurut Fardiaz (1993), beberapa syarat perhitungan tidak langsung dengan menggunakan metode ini adalah :
Tidak ada spreader.
Jumlah koloni mulai dari 30-300.
Perbandingan jumlah bakteri antara pengenceran yang lebih besar dengan pengenceran yang lebih kecil :
Jika 2, hasil perhitungan dirata-rata.
Jika ˃ 2, dipakai hasil pengenceran yang sebelumnya.
Rumus yang digunakan padaperhtitungan tidak langsung adalah sebagai berikut :
Bakteri=rata-rata jumlah bakteri volume suspensi bakteri x 10 CFUml
Sampel yang jumlah mikrobanya terbanyak terbanyak adalah pada Susu karena pada susu sudah lebih dari 300 sehingga hasilnya TNTC. Sampel yang terendah mikrobanya adalah pada sampel jamu yaitu 1,73.106. Perhitungan yang lebih akurat atau lebih valid adalah pada teknik perhitungan secara tidak langsung, karena yang dihitung hanya bakteri yang hidup saja sedangkan sel-sel kontaminan tidak ikut dihitung. Beberapa bakteri dapat dihitng sekaligus. Perhitungan secara tidak langsung juga dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikrobia.
SIMPULAN
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, maka dapat diperoleh kesimpulan :
Pada perhitungan langsung, jumlah bakteri Tempe pada pengenceran 10-3 yaitu 0,68 x 1010, pengenceran 10-4 jumlah bakteri terhitung yaitu 5,325 x 1010, pengenceran 10-5 jumlah bakteri terhitung yaitu 97,5 x 1010. Pada perhitungan langsung, jumlah bakteri Jamu pada pengenceran 10-3 yaitu 38,2 x 1010, pengenceran 10-4 jumlah bakteri terhitung yaitu 35,1 x 1010, pengenceran 10-5 jumlah bakteri terhitung yaitu 287,5 x 1010. Pada perhitungan langsung, jumlah bakteri saos pada pengenceran 10-3 yaitu 1,1 x 1010, pengenceran 10-4 jumlah bakteri terhitung yaitu 5,87 x 1010, pengenceran 10-5 jumlah bakteri terhitung yaitu 107 x 1010. Pada perhitungan langsung, jumlah bakteri susu pada pengenceran 10-3 yaitu 2,095 x 1010, pengenceran 10-4 jumlah bakteri terhitung yaitu 8,75 x 1010, pengenceran 10-5 jumlah bakteri terhitung yaitu 50,5 x 1010.
Pada perhitungan tidak langsung, jumlah bakteri pada Tempe yaitu 2,85 x 10-5. Pada perhitungan tidak langsung, jumlah bakteri pada Jamu yaitu 1,73 x 10-6. Pada perhitungan tidak langsung, jumlah bakteri pada Saos yaitu 2,0818 x 10-5. Pada perhitungan tidak langsung, jumlah bakteri pada Susu yaitu TNTC atau lebih dari 300 koloni.
Kelebihan perhitungan langsung yaitu pelaksanaan perhitungan cepat dan peralatan yang diperlukan dalam perhitungan tidak banyak. Sedangkan kekurangan metode perhitungan langsung yaitu sulit menghitung sel yang berukuran sangat kecil dan kecenderungan sel untuk bergerombol sehingga sukar untuk membedakan sel-sel individu
Kelebihan perhitungan tidak langsung yaitu sel mikrobia yang dapat dihitung hanyalah sel mikrobia hidup, beberapa mikrobia atau jasad renik dapat dihitung sekaligus, dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikrobia Sedangkan kekurangan metode perhitungan tidak langsung yaitu hasil perhitungan dengan menggunakan metode ini tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya, bila medium dan kondisi inkubasi berbeda, maka akan menghasilkan jumlah perhitungan yang berbeda pula, mikrobia yang akan dihitung jumlahnya harus dapat hidup pada medium padat dan dapat membentuk koloni yang kompak, jelas dan tidak menyebar, memerlukan persiapan dan waktu inkubasi relatif lama sehingga koloni dapat dihitung.
DAFTAR PUSTAKA
Buckle. 1987. Ilmu Pangan. Universitas Indonesia Press, Jakarta.
Carol, B., Freund, M. 1964. Factors Affecting Haemocytometer Counts of Sperm
Concentration in Human Semen. The Journal of the Society for
Dwidjoseputro. 1990. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta.
Fardiaz, S. 1992. Mikirobiologi Pangan. Gramedia Pustaka Utama,
Hadioetomo, R. S. 1990. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.
Hansen, P. J. Counting of Bacterial Colony Forming Units for Direct Enumeration of Viable and Total Bacteria in Drinking Water. Departement of Civil Engineering Journal of Microbiological Methods Canada, 37 : 77-79.
Jakarta.
Jannasch, H.W., dan G.E., Jones. (1959). Bacterial Population in Sea Water as Determined by Different Methods of Enumeration. Limnal. Oceanogr. 4:128-139.
Jutono, J., Soedarsono, S., Hartadi, S., Kabirun, S., Suhadi, D., Soesanto. 1980. Pedoman Praktikum Mikrobiologi Umum. Departemen Mikrobiologi Fakultas Pertanian UGM, Yogyakarta.
Lay, W. B. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Raja Grafindo Persada, Jakarta.
Penn, C. 1991. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek: Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. PT Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.
Purwoko, T. 2007. Fisiologi Mikrobia. Bumi Aksara, Jakarta.
Rahayu, Asih. 2000. Deteksi Adanya Bakteri Pada Air Minum dalam Kemasan Galon. Jurnal Dosen Fakultas Kedokteran Universitas Wijaya Kusuma. Surabaya.
Reproduction and Fertility, 8 : 149-155.
Soetarto, E. S., Suharni, T. T., Nastiti, S. Y., Sembiring, L. 2008. Mikrobiologi. Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Tomasiewicz, D. M. 1980. The Most Suitable Number Colonies On Plates for Counting. Journal of Food Protection. 43(4) : 282-286.
Waluyo, L. 2007. Teknik dan Metode Dasar Dalam Mikrobiologi. UMM Press, Malang.
