Laporan Mikrobiologi (Sterilisasi Alat dan Bahan)
I.
Tujuan
Memahami dan melaksanakan proses sterilisasi yang tepat dan sesuai untuk alat dan bahan yang digunakan pada pengujian mikrobiologiserta mampu menyiapkandan membuat media steril untuk pengujian mikrobiologi.
II.
Teori Dasar
Sebelum melakukan percobaan dengan mikroorganisme, diperlukan proses dekontaminasi terlebih dahulu untuk meminimalisir organisme yang aktif dari suatu sistem bakteri atau virus. Upaya untuk mengeleminasi mikroba patogen dengan memanfaatkan bahan kimia yaitu antiseptik dan disinfektan, serta memanfaatkan metode disinfeksi dengan memanfaatkan energi panas. Semua metode tersebut dapat membunuh mikroba patogen kecuali endospora bakteri. Maka dari itu pemusnahan digunakan dengan cara sterilisasi, agar semua mikroba patogen dan endosporanya dapat hancur. Sterilisasi atau suci hama yaitu suatu proses membunuh segala kehidupan mikroorganisme yang ada dalam sample/contoh, alat-alat atau lingkungan tertentu. Dalam bidang bakteriologi, kata sterilisasi sering dipakai untuk menggambarkan langkah yang diambil agar memcapai tujuan untuk meniadakan atau membunuh semua bentuk kehidupan mikroorganisme. mikroorganisme. Teknik sterilisasi dapat dibagi menjadi dua : 1. Secara fisis a. Metode radiasi Dalam mikrobiologi radiasi sinar elektromagnetik yang banyak digunakan adalah radiasi sinar ultraviolet, radiasi sinar gamma atau sinar X dan sinar matahari. Sinar matahari mengandung sinar ultraviolet , sehingga secara langsung dapat dipakai untuk proses sterilisasi. Sinar oltraviolet dapat didapat dengan mengggunakan katoda panas yaitu kedalam tabung katoda bertekanan rendah yang diiisi dengan uap air raksa, panjang gelombang yang dihasilkan biasanya dalam orde 2500-2600 Angstrom. Lampu jalan mengandung sinar ultraviolet, tetapi sinar ultraviolet ultraviolet nya lebih sering diserap diserap oleh tabung gelas gelas yang dilaluinya, dilaluinya, sehingga dalam proses sterilisasi harus diperhatikan dosis sinar ultravioletnya. Sinar ultraviolet yang diserap oleh sel organisme organisme yang hidup, khususnya nukleotida maka elektron-elektron dari molekul sel hidup akan mendapatkan tambahan energi. Tambahan energi tersebut dapat merubah ikatan intramolekular, seperti ikatan hidrogen dan DNA. Perubahan ikatan intramolekular tersebut dapat membunuh sel-sel tertentu. Beberapa plasma sangat peka terhadap sinar ultraviolet sehingga akan rusak. Sinar gamma memiliki kekuatan lebih besar daripada sinar ultraviolet, merupakan radiasi pengion. Interaksi sinar gamma dengan materi biologi sangat tinggi sehingga mampu memukul elektron pada kulit atom sehingga menghasilkan pasangan ion. Cairan intraselular ataupun ekstraselular akan terionisasi sehingga menyebabakan kerusakan dan kematian pada mikroorganisme tersebut. Sterilisasi dengan sinar gamma digunakan untuk jarum suntik, stick untuk swab. Tidak boleh digunakan untuk makanan ataupun obat-obatan. b. Metode pemanasan dengan uap air Pada metode pemanasan uap, alat yang digunakan yaitu autoklaf. Benda yang akan disuci hamakan diletakkan diatas lempengan saringan dan tidak langsung mengenai air dibawahnya.
c.
d.
e.
f.
g.
Pemanasan dilakukan hingga air mendidih (kira-kira 100°C) pada tekanan 15 lb temperatur mencapai 121°C. Organisme yang tidak berspora dapat dimatikan dengan waktu 10 menit saja. Banyak spora hanya dapat mati dengan pemanasan 100°C selama 30 menit tetapi ada spora yang bertahan dalam temperatur tersebut dalam waktu berjam-jam. Spora-spora yang dapat bertahan selama 10 jam dalam temperatur 100°C dapat dimatikan dengan cara menambahkan nartrium carbonat (Na2CO3) dalam airnya. Faktor-faktor yang mempengaruhi sterilisasi uap ada 3 yaitu : suhu, waktu dan kelembaban. Metode pemanasan secara kering Metode ini kurang efektif apabila temperatur kurang tinggi. Untuk mencapai keefektifan temperatur harus mencapai 160-180°C. Pada temperatur ini akan menyebabkan kerusakkan pada sel-sel hidup dan jaringan, hal ini karena adanya auto oksidasi sehingga pathogen dapat terbakar. Pada sistem pemanasan kering terdapat udara, hal ini diketahui bahwa udara merupakan penghantar panas yang buruk sehingga sterilisasi panas kering memerlukan waktu cukup lama rata-rata 45 menit. Pada temperatur 160°C memerlukan waktu 1 jam, sedangkan temperatur 180°C memerlukan waktu 30 menit. Pada metode ini yang alat-alat yang digunakan adalah alatalat pipet, tabung reaksi, stick swab, jarum operasi, jarum suntik, syringe. Metode pemanasan secara intermittent/terputus-putus John Tyndall (1877) memperoleh dari hasil penelitiannya bahwa temperatur didih (100°C) selama 1 jam tidak akan membunuh semua mikroorganisme tetap apabila dididihkan berulangulang sampai lima kali, akan membunuh mikroorganisme. Metode incineration (pembakaran langsung) Alat-alat platina, khrome dapat disterilkan dengan cara pembakaran secara langsung pada nyala api bunsen sampai merah padam. Hanya saja lama kelamaan akan rusak tetapi keuntungannya dapat membunuh mikroba secara keseluruhan. Metode penyaringan (filtration) Metode penyaringan berbeda dengan metode pemanasan. Pada metode pemanasan mikroba yang mati tetap berada pada material tersebut, sedangkan pada sterilisasi penyaringan mikroorgamisme tetap hidup tetap dipisahkan dengan materialnya. Bahan penyaring dibuat dari bahan porselin yang berpori dan dibuat khusus. Metode filtrasi hanya digunakan untuk sterilisasi larutan gula, cairan lain seperti serum atau sterilisasi hasil produksi mikroorganisme seperti enzym, eksotoksin dan untuk memisahkan filtrable virus dan bakteria dari organisme lain. Strerilisasi gas Sterilisasi gas digunakan dalam pemaparan gas atau uap untuk membunuh mikroorganisme dan sporanya. Meskipun gas dengan cepat berpenetrasi ke dalam pori dan serbuk padat, sterilisasi adalah fenomena permukaan dan mikroorganisme yang terkristal akan dibunuh. Sterilisasi yang digunakan dalam bidang farmasi untuk mensterilkan bahan-bahan dan menghilangkan dari bahan yang disterilkan pada akhir jalur sterilisasi, gas ini tidak inert, dan kereaktifannya terhadap bahan yang disterilkan harus dipertimbangkan misalnya thiamin, riboflavin, dan streptomisin kehilangan protein ketika disterilkan dengan etilen oksida. Sterilisasi gas berjalan lambat waktu sterilisasi tergantung pada keberadaan kontaminasi kelembaban, temperatur dan konsentrasi etilen oksida. Konsentrasi minimum etilen oksida dalam 450 mg/L, 271 Psi, konsentrasi ini 85°C dan 50% kelembaban relatif dibutuhkan 4-5 jam pemaparan. Di bawah kondisi sama 1000 mg/L membutuhkan sterilisasi 2-3 jam. Dalam pensterilan digunakan bahan kimia dalam bentuk gas atau uap, seperti etilen oksida, formaldehid, propilen oksida, klorin oksida, beta propiolakton, metilbromida, kloropikrin. Digunakan untuk sterilisasi bahan yang termolabil seperti bahan biologi, makanan, plastik, antibiotik. Aksi antimikrobialnya adalah gas etilen oksida mengadisi
gugus – SH, SH, -OH, -COOH,-NH2 dari protein dan membentuk ikatan alkilasi sehingga protein mengalami kerusakan dan mikroba mati. Faktor-faktor yang mempengaruhi sterilisasi ini termasuk kelembaban, konsentrasi gas, suhu dan distribusi gas dalam chamber pengsterilan. Penghancuran bakteri tergantung pada adanya kelembaban, gas dan suhu dalam bahan pengemas, penetrasi melalui bahan pengemas, pada pengemas pertama atau kedua, harus dilakukan, persyaratan desain khusus pada bahan pengemas. 2. Secara kimia Dalam sterilisasi kimia zat yang sering digunakan adalah alkohol 96%, aceton tab formalin, sulfur dioksida, dan klorin. Materi yang disuci hamakan dibersihkan terlebih dahulu kemudian direndam dalam alkohol atau aceton tab formalin. Bakteri dibiakan secara luas dilaboratorium fakultas fakultas kedokteran, rumah sakit, lembaga penelitian medis, dan di Universitas serta di pabrik komersial yang menghasilkan antibiotik, zat kimia organik dan produk bakteri lain yang secara ekonomis berharga. Teknik medium padat lebih baik digunakan untuk tempat pembiakan bakteri daripada teknik lain. Medium yang digunakan dalam pembiakan bakteri harus mengandung nutrisi untuk bakteri. Nutrisi tersebut dicampur dengan agar-agar, diaduk dengan air matang hingga membentuk campuran cairan yang pekat.
III. Alat dan Bahan III. 1. Alat Autoklaf Oven Erlenmeyer Tabung reaksi Cawan petri Rak tabung Gelas ukur Pipet ukur Labu takar Gunting Kertas label III. 2. Bahan Benang kasur Alumunium foil Kertas bekas Media (Nutrien agar dan Nutrien Broth) Kapas IV.
Prosedur Kerja
Persiapan dan Sterilisasi alat Alat-alat yang akan disterilkan dicuci dan dikeringkan. Ditutup alat-alat yang mempunyai mulut seperti : Tabung reaksi, Erlenmyer, Botol media, Gelas ukur, Labu takar, Pipet, dengan kapas berlemak. Cara :
-
-
Diambil sepotong kapas, dilipat kedua ujungnya sehingga berbentuk segi empat (besar tergantung besar mulut). Digulung kapas hingga berbentuk silinder yang cukup padat, dibungkus dengan kain kasa, kemudain dimasukkan ke dalam mulut alat (2/3 masuk dibagian mulut alat). Khusus untuk pipet, tutup kapas dimasukkan dengan sebatang kawat dan kapas yang terurai keluar dari bagian mulut pipet dihilangkan dengan melewatkan mulut pada api bunsen. Kapas penutup ditutup kembali dengan alumunium foil atau bahan lain yang sesuai, bila diperlukan ikat dengan benang kasur. Alat yang permukaannya harus steril ditutup dengan alumunium foil satu per satu. Cawan petri dibungkus seluruhnya dengan kertas bekas yang bersih (bukan kertas koran). Alat-alat gelas baik yang berupa alat ukur (harus presisi) maupun bukan, b ukan, disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121°C, selama 15-20 menit. Setelah disterilisasi dengan autoklaf dikeringkan dengan alat-alat dalam oven pengering 70°C selama 30 menit atau disimpan ditempet terbuka, untuk menghilangkan uap air yang masih m asih tersisa. Pembuatan dan sterilisasi media serta larutan pengenceran Ditimbang Nutrien agar untuk pembuatan 150 ml dan Nutrien Broth untuk pembuatan 50 ml. Bobot serbuk Nutrien agar dan Nutrien Broth yang digunakan sesuaikan dengan komposisi yang tertera pada label kemasan masing-masing bahan. Dihitung berapa yang dibutukan. Dimasukkan masing-masing media yang telah ditimbang ke dalam erlenmeyer yang sudah diberi tanda (sesuai nama media). Ditambahkan aquadest lalu dipanaskan diatas nyala api bunsen sambil diaduk sampai larutan tidak keruh/jernih. Dituangkan daln botol media, lalu ditutup dengan kapas dan alumunium foil serta diikat dengan benang kasur dan diberi etiket. Disterilisasi menggunakan autoklaf. Setelah steril didinginkandi suhhu kamar, kemudian dimasukkan dalam lemari pendingin untuk disimpan. Diamati dan dicatat kondisi media. Pengamatan dilakukan 24 jam.
V.
Data Pengamatan dan Perhitungan
M1/V1 = M2/V2 Nutrien agar 20gr/1000ml =M2/150 ml = 3 gr Nutrien Broth 8 gr/1000ml = M2/50 ml =0,4 gr Media
VI.
Warna awal
Warna akhir
Nutrien agar
Kuning keruh
Kuning bening
Nutrien Broth
Kuning keruh
Kuning bening
Pembahasan
Pada percobaan kali ini dilakukan sterilisasi alat-alat dan media yang akan digunakan untuk pembiakan mikroba. Tujuan sterilisasi yaitu agar tidak terjadi kontaminasi oleh mikroba ketika dilakukan percobaan. Sterilisasi yang digunakan adalah sterilisasi uap dengan suhu 121°C dan waktu yang digunakan 20 menit. Digunakan sterilisasi uap, karena alat-alat tidak akan rusak atau memuai khususnya untuk alat-alat ukur pada suhu 121°C. Alat-alat seperti erlenmeyer, tabung reaksi, gelas ukur, pipet ukur, cawan petri, labu ukur dimasukkan kedalam alat yang
disebut dengan autoklaf. Sebelum dimasukkan kedalam autoklaf alat-alat yang memiliki mulut diberi kapas berlemak dan kain kasa agar alat-alat dapat benar-benar steril dari mikroba. Kemudain dibalut dengan kertas dan alumunium foil agar ketika telah disterilisasi (keluar dari autoklaf) tidak terkontaminasi kembali oleh miroba. Pada sterilisasi uap, alat-alat diletakkan dalam saringan agar tidak mengenai air yang berada dipermukaan autoklaf, dilakukan pemanasan 2 pada autoklaf terlebih dahulu sampai suhu air tepat 100°C pada tekan 1,5 kg/cm . Cara pengaturan tekanan dengan cara membuka tutup pada autoklaf. Karena suhu akan naik terus menerus bila penutup tidak terbuka. Dilakukan sterilisasi bahan agar bahan yang digunakan bener-bener steril, apabila tidak disterilkan terlebih dahulu mungkin saja akan terjadi kontaminasi oleh bakteri lain yang akan mempersulitkan dalam pengamatan bakteri yang seharusnya diamati. Pada peercobaan ini nutrien yang digunakan untuk pembiakan mikroba yaitu nutrien agar dan nutrien Broth dimana media ini diencerkan terlebih dahulu dengan aquadest dan dilakukan pemanasan untuk mempermudah pencampuran. Nutrien Agar adalah medium umum untuk uji air dan produk pangan. Nutrien juga digunakan untuk pertumbuhan dari mikroorganisme yang tidak selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof. Media ini merupakan media sederhana yang dibuat dari ekstrak daging, pepton dan agar. Lalu Nutrien Broth adalah media untuk mikroorganisme yang berbentuk cair. Kegunaan dari Nutrien Broth tidak jauh berbeda dengan Nutrien Agar. Pada percobaan kali ini membutuhkan nutrient agar yang di pakai sebanyak 3 gram dan nutrient broth sebanyak 0,4 gram dilarutkan sampai 50 ml aquadest dan masing – masing dipanaskan pada suhu 100 – 125 C. Mulut erlenmeyer diberi kapas yang dibatul oleh kain kasa dan dimasukkan dalam autoklaf untuk disterilkan. VII.
Kesimpulan
1. Sterilisasi adalah proses penghancuran seluruh mikroba hidup d engan spora-sporanya. 2. Sterilisasi uap menggunakan uap air dan tekanan sebagai penstesilnya. 3. Prinsip penggunaan autoclave di dasarkan pada mikroorganisme termasuk spora yang tahan panas, mudah terbunuh dengan panas lembab pada temperatur sedikit di atas titik didih air. 4. Media Nutrien Agar dan Nutrien Broth hasil yang diperoleh tidak terdapat bakteri maupun jamur di karenakan alat-alat yang dipakai masih steril VIII.
Daftar Pustaka
Darmadi. 2008. Infeksi Nosokimial Problematika dan Penyelesaiannya .Salemba Merdeka. Jakarta. Gabriel ,J.F.1996.Fisika Kedokteran . Buku Kedokteran EGC.Jakarta. Setiowati, Tetty. Furqonita, Deswanty.2007. Biologi Intensif Jilid 1untuk SMA/MA Kelas X . Azka Press.Jakarta.
PANDUAN PRAKTIKUM – PEMBUATAN MEDIA NUTRIEN AGAR DAN STERILISASI
Tujuan
1. Untuk mengenal beberapa cara sterilisasi 2. Mengetahui macam-macam media dan pembuatannya 3. Memperoleh alat dan media yang steril II. Dasar Teori
Bahan atau peralatan yang digunakan dalam bidang mikrobiologi harus dalam keadaan steril. Steril artinya tidak didapatkan mikroba yang tidak diharapkan kehadirannya baik yang mengganggu atau yang merusak media atau mengganggu kehidupan dan proses yang sedang dikerjakan. Setiap proses baik fisika, kimia, maupun mekanik yang membunuh semua bentuk kehidupan terutama mikroorganisme disebut dengan sterilisasi (Waluyo, 2005). Ketika anda pertama kali melakukan pemindahan biakan secara aseptik, sesungguhnya anda sudah menggunakan salah satu cara sterilisasi, yaitu pembakaran. Sterilisasi adalah proses menghancurkan semua jenis kehidupan sehingga menjadi steril. Sterilisasi seringkali dilakukan dengan pengaplikasian udara panas. Ada dua metode yang sering digunakan, yaitu Panas lembab dengan uap jenuh bertekanan. Sangat efektif untuk sterilisasi karena menyediakan suhu jauh di atas titik didih, proses cepat, daya tembus ku at dan kelembaban sangat tinggi sehingga mempermudah koagulasi protein sel-sel mikroba yang menyebabkan sel hancur. Suhu efektifnya adalah 121C pada tekanan 5 kg/cm2 dengan waktu standar 15 menit. Alat yang digunakan : pressure cooker, autoklaf (autoclave) dan retort. Panas kering, biasanya digunakan untuk mensterilisasi alat-alat laboratorium. Suhu efektifnya adalah 160C selama 2 jam. Alat yang sering digunakan pada umumnya adalah oven (Hadioetomo, 1993).
Agar biakan murni dapat dibuat, medium harus steril sebelum inokulasi; yaitu kita harus yakin bahwa tidak ada organismehidup dapat berada dalam medium jika diinokulasi. Metode yang lazim digunakan untuk mensterilkan media ialah menempatkannya dalam otoklaf (sebetulnya panci masak bertekanan besar dan dielaborasi). Otoklaf menggunakan uap bertekanan untuk menaikkan suhu barang yang sedang disterilkan sampai suatu taraf yang mematikan semua bentuk kehidupan. Untuk sterilisasi rutin, otoklaf biasanya dioperasikan pada tekanan uap 15 lb/in2. Pada tekanan ini suhu menjadi 121C. Waktu yang diperlukan pada suhu ini adalah 15 sampai 20 menit. Apabila medium berukuran besar disterilkan, maka waktu yang diperlukan akan lebih panjang, karena panas memerlukan waktu untuk menembus bahan tersebut (Volk & Wheeler, 1993).
Metode sterilisasi secara fisik dapat dipakai bila selama sterilisasi dengan bahan kimia tidak akan berubah akibat suhu yang tinggi atau tekanan yang tinggi. Cara kerja dari panas tersebut, bahwa panas membunuh mikroba karena mendenaturasi protein, terutama enzim dan membran sel. Panas kering membunuh bakteri karena oksidasi komponen-komponen sel. Daya bunuh panas
kering tidak sebaik panas basah. Hal ini dibuktikan dengan memasukkan biakan mikroba dalam air mendidih akan cepat mematikan daripada dipanasi secara kering (Waluyo, 2005). Faktor yang mempengaruhi keberhasilan sterilisasi sistem batch adalah temperatur dan l ama pemanasan. Proses pemusnahan mikroba kontaminan dapat digambarkan sesuai reaksi kimia orde satu yang memenuhi persamaan kinetika : 1. Dimana N adalah jumlah sel yang hidup pada waktu t tertentu, t adalah lama sterilisasi dan Kd adalah konstanta laju kematian spesifik. Dengan memplot nilai terhadap t, maka didapat garis lurus dengan kemiringan – Kd. pada kematian mikroorganisme secara sterilisasi juga berlaku persamaan Arhenius yang menunjukkan bahwa t emperatur mempengaruhi konstanta laju kematian spesifik. 2. Dimana A adalah konstanta Arhenius, Ea adalah energi aktivasi, dan R adalah konstanta gas dan T adalah temperatur absolut pemanasan. Dari persamaan ini terlihat bahwa laju reaksi kematian sel akan meningkat jika temperatur sterilisasi meningkat karena peningkatan temperatur menyebabkan peningkatan Kd. nilai Ea dan Kd didapat dari hubungan pada persamaan Arhenius tersebut dengan cara mengalurkan ln Kd terhadap 1/T (Achmad, 2007). Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrien) yang berguna untuk membiakkan mikroba. Dengan menggunakan bermacam-macam media dapat dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian sifat fisiologis dan perhitungan sejumlah mikroba. Supaya mikroba dapat tumbuh baik dalam suatu media, maka medium tersebut harus memenuhi syarat-syarat, antara lain: 1. 2. 3. 4. 5.
harus mengandung semua zat hara yang mudah digunakan oleh mikroba, harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroba yang akan tumbuh, tidak mengandung zat-zat yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba, harus berada dalam keadaan steril sebelum digunakan, agar mikroba yang ditumbuhkan dapat tumbuh dengan baik (Sutedjo, 1991).
Agar-agar, gelatin atau gel silika merupakan bahan untuk membuat medium menjadi padat. Namun, yang paling umum digunakan adalah agar-agar. Meskipun bahan utama a gar-agar adalah gelatin, yaitu suatu kompleks karbohidrat yang die kstraksi dari alga marin genus Gelidium, namun sebagian besar mikroorganisme tidak dapat menggunakannya sebagai makanan sehingga agar-agar dapat berlaku hanya sebagai pemadat (Hadioetomo, 1993). Saat ini media agar merupakan media yang sangat umum digunakan dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Media agar ini memungkinkan untuk dilakukannya isolasi bakteri dari suatu sampel, karakterisasi morfologi, sampai penghitungaan bakteri yang dikenal dengan nama total plate count. Bentuk koloni bakteri dan warna-warninya mudah sekali dikenali dengan media ini dengan cara mengubah komposisi nutrien atau menambahkan indikator. Komposisi media bakteri dapat dimodifikasi sehingga dapat digolongkan menjadi media umum, media selektif (bakteri tertentu saja yang dapat tumbuh) dan media diferensial (bakteri tumbuh dengan memberikan ciri-ciri tertentu) (Achmad, 2007).
Media alamiah, misalnya susu skim, tidak begitu sulit di dalam penyiapannya sebagai media pertumbuhan mikroba, karena hanya cukup dengan dituang ke dalam wad ah yang telah disterilkan. Media dalam bentuk kaldu nutrien atau yang mengandung agar, disiapkan dengan cara melarutkan masing-masing bahan yang dibutuhkan atau lebih mudah lagi dengan cara menambahkan air pada suatu produk komersial berbentuk medium bubuk yang sudah mengandung semua nutrien yang dibutuhkan. Pada praktisnya, semua media tersebut secara komersial dalam bentuk bubuk, seperti PCA (Plate Count Agar), NA (Nutrient Agar), TSA (Trypticase Soy Agar) dan lain-lain. Bakteri, dari kata latin bacterium (jamak, bacteria) adalah kelompok raksasa dari organisme hidup, mereka sangatlah kecil (mikroskopik) dan kebanyakan uniseluler (bersel tunggal), dengan struktur sel yang relatif sederhana tanpa nukleus (inti sel), Cytoskelen, dan organik lain seperti mitokondria dan kloroplas. Karena bakteri merupakan prokaryota, untuk membedakan dengan organisme lain yang memiliki sel yang lebih kompleks, disebut eukaryota. Bakteri adalah yang paling berkelimpahan dari semua organisme. Mereka tersebar (berada dimana-mana) di tanah, air dan sebagai simbiosis dari organisme lain. Banyak patogen merupakan bakteri. Kebanyakan dari mereka kecil, biasanya berukuran 0.5 – 5 µm, meskipun akan ada juga jenis yang dapat menjangkau 0.3 mm dalam diameter (Thiomargarita) (Rachdie, 2006). III. Alat
1. Cawan Petri, 2. Erlenmeyer, 3. Tabung reaksi, 4. Otoklaf, 5. Pipet mohr, 6. Sudip, 7. Neraca analitik, 8. Magnetic stirer, 9. Hot plate dan 10. Rak tabung reaksi IV. Bahan
1. 2. 3. 4.
Akuades, Nutrient Agar (NA), Potato Destroxe Agar (PDA) dan MEA (Malt Extract Agar).
V. Prosedur Kerja Standarisasi Praktikum
1. Periksa autoclave dengan melihat kondisi aquades dibagian bawah dan kondisi umum autoclave (kebersihan, kabel, dll). 2. Bungkus alat-alat gelas dan non gelas dengan kertas cokelat dengan cara sedemikian mungkin.
3. Masukkan semua bahan dan alat kedalam keranjang sterilisasi dengan mengatur posisi yang mantap. 4. Tutup autoclave dengan memutar alat penutup sesuai direksi manualnya. 5. Setting waktu dan suhu. 6. Kemudian tekan “START”. 7. Tunggu sampai alarm berbunyi dan matikan dengan tekan tombol on/off dan cabut kabel. 8. Ingat biarkan sampai tanda indikator tekanan betul-betul menunjukkan angka nol. 9. Jangan dibuka sembarangan, jika tidak mengikuti aturan, autoclave akan meledak layaknya bom. 10. Hati-hati dalam bekerja. Jika tidak tahu, tanyakan ke petugas laboratorium. Pembuatan Media NA dan Sterilisasi
1. 1,2 gram nutrien agar (NA) ditimbang dan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer. 2. Ditambahkan 50 mL akuades. 3. Dipanaskan di atas hot plate hingga mendidih sambil diaduk dengan magnetic stirer sampai homogen, lalu dibiarkan beberapa saat. 4. Dipipet sebanyak 4 mL dan dimasukkan ke dalam tiga buah tabung reaksi. 5. Tabung reaksi disumbat dengan kertas dan ditutup dengan kertas yang diikat dengan karet gelang. 6. Dimasukkan dalam autoklaf untuk disterilkan beserta alat-alat yang ak an digunakan selama 2 jam pada suhu 121C dan tekanan 15 psi.
Pembuatan Media PDA dan Sterilisasi
1. 1,95 gram potato destroxe agar (PDA) ditimbang dan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer. 2. Ditambahkan 50 mL akuades. 3. Dipanaskan di atas hot plate hingga mendidih sambil diaduk dengan magnetic stirer sampai homogen, lalu dibiarkan beberapa saat. 4. Dipipet sebanyak 4 mL dan dimasukkan ke dalam tiga buah tabung reaksi. 5. Tabung reaksi disumbat dengan kertas dan ditutup dengan kertas yang diikat dengan karet gelang. 6. Dimasukkan dalam autoklaf untuk disterilkan beserta alat-alat yang ak an digunakan selama 2 jam pada suhu 121C dan tekanan 15 psi.
Pembuatan Media MEA (Malt Extract Agar) dan Sterilisasi
1. 2,4 gram MEA ditimbang dan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer. 2. Ditambahkan 50 mL akuades. 3. Dipanaskan di atas hot plate hingga mendidih sambil diaduk dengan magnetic stirer sampai homogen, lalu dibiarkan beberapa saat. 4. Dipipet sebanyak 4 mL dan dimasukkan ke dalam tiga buah tabung reaksi. 5. Tabung reaksi disumbat dengan kertas dan ditutup dengan kertas yang diikat dengan karet gelang. 6. Dimasukkan dalam autoklaf untuk disterilkan beserta alat-alat yang ak an digunakan selama 2 jam pada suhu 121 C dan tekanan 15 psi.
VI. ANALISIS DATA
Pembuatan Media NA dan Sterilisasi 1. Tentukan komposisi Nutrient Agar (20 gr/L). 2. Tentukan warna sesudah sterilisasi. Pembuatan Media PDA dan Sterilisasi 1. Tentukan komposisi Potato Destroxe Agar (39 gr/L). 2. Tentukan warna sesudah sterilisasi. Pembuatan Media Media MEA dan Sterilisasi 1. Tentukan komposisi Malt Extract Agar (48 gr/L). 2. Tentukan warna sesudah sterilisasi VII. Pertanyaan
1. 2. 3. 4. 5.
Apa fungsi dari media tanam mikroba? Apa saja syarat-syarat pemilihan medium tanam mikroba? NA, PDA, dan MEA termasuk media penanaman mikroba jenis apa? Apa fungsi dari sterilisasi? Apa saja teknik-teknik dalam proses sterilisasi?
Daftar Pustaka Achmad, D,. 2007, Media Agar. Ide Besar Istri Peneliti, http://www.nvtech.com , Diakses tanggal 1 November 2010
Hadioetomo, RS, 1993, Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium Mikrobiologi. Gramedia: Jakarta Rachdie, 2006, Mengenal Media Pertumbuhan Mikrobia, http://rachdie.blogsome.com/2006/10/18/mengenal-media-pertumbuhan-mikrobial/tracback , Diakses tanggal 1 November 2010 Sutedjo, 1991, Mikrobiologi Tanah, Rineka Cipta: Jakarta Volk & Wheeler, 1993, Mikrobiologi Dasar Jilid 1 Edisi kelima, Erlangga: Jakarta Waluyo, L., 2005, Mikrobiologi Umum, UMM Press: Malang Tinjauan Pustaka
Kepala Laboratorium Pendidikan Kimia, Fakultas Matematika dan ilmu pengetahuan alam, Universitas Islam Indonesia, Panduan Penulisan Laporan Praktikum
Editing, ahmad, M., Laporan Praktikum Teknik Sterilisasi dan Pembuatan Media Kuliah Mikrobiologi, http://proseduralatpengujiansnikualitaskadar.blogspot.com/2011/01/laporanpraktikum-tekniksterilisasi.html
Pembuatan Medium Dan Sterilisasi BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Dalam melakukan diagnosa mikrobiologi sterilisasi sangat diutamakan baik alat maupun medianya. Suatu alat dikatakan steril apabila alat atau bahan bebas dari mikroba baik bentuk vegetative maupun spora. Untuk itu sebagai pemula dalam mikrobiologi sangat perlu mengenal teknik sterilisasi, pembuatan media serta teknik penanaman . Secara umum sterilisasi merupakan proses pemusnahan kehidupan khususnya mikrobia dalam suatu wadah ataupun peralatan laboratorium. Sterilisasi dalam mikrobiologi adalah suatu proses untuk mematikan semua mikroorgansime yang terdapat pada atau didalam suatu benda. Ada tiga cara utama yang umum dipakai dalam sterilisasi yaitu penggunaan panas, penggunaan bahan kimia, dan penyaringan (filtrasi). Apabila panas digunakan bersama-sama dengan uap air maka disebut sterilisasi basah, bila tanpa kelembapan maka disebut sterilisasi kering. Medium merupakan bahan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme diatas atau didalamnya. Sebelum menumbuhkan mikroorganisme, pertama-tama kita harus memahami kebutuhan dasarnya lalu mencoba memformulasikan suatu medium yang memberikan hasil baik. Berdasarkan hal tersebut maka dilakukan percobaan untuk menambah pengetahuan tentang cara pembuatan medium dan juga cara menstrilisasikan medium.
B.
Tujuan Praktikum Adapun tujuan praktikum kali ini adalah : a. Mengetahui cara membuat media pertumbuhan mikrorganisme.
b. Mengetahui jenis medium. c. Mengetahui cara mensterilkan medium.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
Mikroorganisme yang ingin kita tumbuhkan, yang pertama harus dilakukan adalah memahami kebutuhan dasarnya kemudian memformulasikan suatu medium atau bahan yang akan digunakan. Air sangat penting bagi organisme bersel tunggal sebagai komponen utama protoplasmanya serta untuk masuknya nutrien ke dalam sel. Pembuatan medium sebaiknya menggunakan air suling. Air sadah umumnya mengandung ion kalsium dan magnesium yang tinggi. Pada medium yang mengandung pepton dan ektrak daging, air dengan kualitas air sadah sudah dapat menyebabkan terbentuknya endapan fosfat dan magnesium fosfat (Hadioetomo, 1993). Alat yang akan digunakan dalam suatu penelitian atau praktikum harus disterilisasi terlebih dahulu untuk membebaskan semua bahan dan peralatan tersebut dari semua bentuk kehidupan. Sterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua organisme yang teradapat pada suatu benda. Proses sterilisasi dapat dibedakan menjadi 3 macam, yaitu penggunaan panas (pemijaran dan udara panas); penyaringan; penggunaan bahan kimia (etilena oksida, asam perasetat, formaldehida dan glutaraldehida alkalin) (Hadioetomo, 1993). Memformulasikan suatu medium atau bahan yang akan digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme di dalamnya harus memperhatikan berbagi macam ketentuan seperti jika yang ingin kita membuat medium untuk organisme bersel tunggal, biasanya air sangat penting sebagai komponen utama protoplasmanya serta untuk masuknya nutrien ke dalam sel. Pembuatan medium agar padat, digunakan agar-agar, gelatin atau gel silika. Bahan agar yang utama adalah galaktan (komplek o
karbohidrat yang diekstrak dari alga genus Gelidium). Agar akan larut atau cair pada suhu hampir 100 C dan akan cair apabila kurang lebih 43 oC (Hadioetomo, 1993). Menurut Schlegel (1993) agar merupakan media tumbuh yang ideal yang diperkenalkan melalui metode bacteriaological. Organisme hidup memerlukan nutrisi untuk pertumbuhannya. Subtansi kimia organik dan inorganik diperoleh dari lingkungan dalam berbagai macam bentuk. Nutrien diambil dari likungan kemudian ditransformasikan melalui membran plasma menuju sel. Di sel beberapa nutrisi diolah
menghasilkan energi yang digunakan dalam proses seluler (Lim, 1998). Bakteri dalam medium juga memerlukan makanan untuk pertumbuhannya. Bakteri yang tidak punya akar harus berada pada permukaan larutan makanan yang cair. Pertumbuhan bakteri berarti meningkatnya jumlah sel yang konstituen (yang menyusun). Apabila disusun 10 bakteri dalam 1 ml medium yang cocok dan 24 jam kemudian ditemukan 10 juta bakteri tiap milimeternya, maka terjadilah pertumbuhan bakteri. Meningkatnya jumlah bakteri terjadi dengan proses yang disebut dengan pembelahan biner, dimana setiap bakteri membentuk dinding sel baru (Volk, 1993). Pertumbuhan bakteri selain memerlukan nutrisi, juga memerlukan pH yang tepat. Kebanyakan bakteri tidak dapat tumbuh pada kondisi yang terlalu basa, kecuali Vibrio cholerae yang dapat hidup pada pH lebih dari 8. Suhu juga merupakan variabel yang perlu dikendalikan. Kelompok terbesar yaitu o
mesofil, suhu optimum untuk pertumbuhannya 20-40 C (Volk, 1993). PH merupakan faktor yang sangat mempengaruhi suatu keberhasilan dalam pembuatan medium sehingga kondisi pH yang terlalu basa atau terlalu asam tidak cocok untuk dijadikan medium mikroba karena mikroba tidak dapat hidup pada kondisi tersebut. Medium didiamkan atau disimpan selama 2 x 24 jam untuk menyakinkan bahwa medium masih steril, karena selain pH sebagai penentu tumbuhnya mikroba, alat dan medium yang steril juga menentukan (Dwidjoseputro, 1994). Menurut (Suriawati, 2005), Sterilisasi yang umum dilakukan dapat berupa: a.
Sterilisasi secara fisik (pemanasan, penggunaan sinar gelombang pendek yang dapat dilakukan selama senyawa kimia yang akan disterilkan tidak akan berubah atau terurai akibat temperatur atau tekanan O
tinggi). Dengan udara panas, dipergunakan alat “bejana/ruang panas” (oven dengan temperatur 170 C – o
180 C dan waktu yang digunakan adalah 2 jam yang umumnya untuk peralatan gelas). b. Sterilisasi secara kimia (misalnya dengan penggunaan disinfektan, larutan alkohol, larutan formalin). c. Sterilisasi secara mekanik, digunakan untuk beberapa bahan yang akibat pemanasan tinggi atau tekanan tinggi akan mengalami perubahan, misalnya adalah dengan saringan/filter. Sistem kerja filter, seperti pada saringan lain adalah melakukan seleksi terhadap partikel-partikel yang lewat (dalam hal ini adalah mikroba). Autoklaf digunakan sebagai alat sterilisasi uap dengan tekanan tinggi. Penggunaan autoklaf untuk sterilisasi, tutupnya jangan diletakkan sembarangan dan dibuka-buka karena isi botol atau tempat medium akan meluap dan hanya boleh dibuka ketika manometer menunjukkan angka 0 serta dilakukan
pendinginan sedikit demi sedikit. Medium yang mengandung vitamin, gelatin atau gula, maka setelah sterilisasi medium harus segera didinginkan. Cara ini untuk menghindari zat tersebut terurai. Medium dapat langsung disimpan di lemasi es jika medium sudah dapat dipastikan steril (Dwidjoseputro, 1994).
BAB III METODOLOGI
A. Waktu dan Tempat Adapun praktikum ini dilaksanakan pada :
A.
Hari/Tanggal
: 03 November 2011
Waktu
: 10.00 sampai selesai
Tempat
: Laboratorium Mikrobiologi FMIPA
Alat Adapun alat yang digunakan dalam laboratorium yakni:
1. Erlenmeyer 100 ml 2. Neraca analitik 3. Hot plate 4. Gelas ukur 100 mL 5. Batang pengaduk / Magnet Stirrer 6. Sendok Zat 7. Pipet tetes 8. Autoklaf
B.
Bahan Adapun bahan yang digunakan dalam laborattorium mikrobiologi yakni:
1. Kapas 2. Aluminium Foil 3. Aquades 4. Agar 5. NA (Nutrien Agar) 6. MEA (Malt Extract Agar) 7. PDA (Potato Dextrose Agar) 8. LB ( Lactosa Broth) 9. KOH 1%
C. Prosedur Kerja Adapun prosedur kerja yang digunakan dalam praktikum ini yakni: 1.
Menimbang masing-masing bahan yang akan digunakan kedalam Neraca Analitik sesuai dengan jumlah yang diperlukan.
2.
Kemudian memasukkan kedalam Erlenmeyer 250 ml, dan menambahkan aquades sebanyak 250 ml dan agar 7 gram kedalam masing-masing bahan.
3.
Memanaskan larutan tersebut sampai mendidih di atas Hot Plate dan diaduk dengan magnetic stirer agar larutan homogen.
4. Kemudian larutan diangkat dan me ndinginkannya. 5. Setelah larutan dingin, kemudian mengukur pH nya.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Pengamatan Adapun hasil yang telah didapatkan dari percobaan yakni:
No
1.
Nama dan Gambar
PDA
Fungsi
Warna
Warna
sebelum
sesudah
pengadukan
pengadukan
Keruh
Kuning Tua
Merah
Merah Tua
Coklat
Coklat Tua
Sebagai tempat pembiakan mikroba
2.
LB
Sebagai tempat fermentasi
3.
MEA
Sebagai tempat pembiakan mikroba
4.
NA
Sebagai tempat pembiakan bakteri
Keruh
Kuning kecoklatan
C. Pembahasan Medium merupakan bahan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme diatas atau didalamnya, medium tersebut harus memenuhi syarat-syarat, antara lain adalah harus mengandung semua zat hara yang mudah digunakan oleh mikroba, harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroba yang akan ditumbuhkan, tidak mengandung zat-zat yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba, harus berada dalam keadaan steril sebelum digunakan, agar mikroba yang di tumbuhkan dapat tumbuh dengan baik. Percobaan kali ini yaitu pembuatan medium NA, PDA, LB DAN MEA. NA (Nutrien agar ) digunakan sebagai media pertumbuhan bakteri. Pembuatan medium percobaan ini dengan menggunakan NA (Nutrien Agar), dimana dalam pembuatannya terlebih dahulu dengan cara menimbang bahan yang akan digunakan kedalam neraca analitik sesuai dengan jumlah yang diperlukan kemudian memasukkan bahan kedalam Erlenmeyer 250 ml, dimana bahan tersebut adalah aqades 250 o
ml, NA 3,75 dan agar 7 gram setelah itu dipanaskan diatas hot plate 440 C di ikuti oleh pengadukan dengan menggunakan magnetik stirer, tujuan dari pemanasan dan pengadukan ini adalah untuk menghomogenkan NA dengan aqades, dimana dengan pemanasan dapat mempercepat pelarutan dari Na dan Aqades. Setelah dipanaskan beberapa menit larutan berubah warna dari keruh menjadi kuning kecoklatan hal ini menandakan larutan telah homogen. Setelah itu larutan ditambahkan KOH 1 % yang bertujuan mendapatkan pH netral yaitu 7 dan didinginkan kemidian diukur pHnya, pH yang diperoleh 7 hal ini menandakan bakteri dapat hidup pada pH tersebut, hal ini sesuai dengan literatrur yang menyatakan bakteri dapat hidup pada pH 6,8-7. Kemudian dimasukkan kedalam autoklav dengan mulut Erlenmeyer disumbat dengan kapas dan dilapisi kertas diluarnya. Tujuan dari penutupan ini agar
meminimalkan kontaminasi. Pembuatan NA berdasarkan konsistennya termasuk medium padat dan menurut kegunaannya termasuk medium umum. PDA (Potato Destore Agar ) digunakan untuk menumbuhkan fungi atau jamur. Pembuatan medium pada percobaan ini dengan menggunakan PDA (Potato Destore Agar ) dimana dalam pembuatannya terlebih dahulu dengan cara memasukkan 200 ml aqades dan 50 ml ekstrak kentang,3,75 deglucose dan o
7 gr agar kemudian dipanaskan diatas hot plate 440 C diikuti oleh pengadukan dengan tujuan dari pemanasan dan pengadukan ini untuk menghomogenkan PDA dengan aqades, dan pemanasan bertujuan mempercepat pelarutan dari PDA. Se telah dipanaskan beberapa menit larutan berubah warna dari keruh menjadi kuning tua, hal ini menunjukkan larutan telah homogen. Kemudian larutan didinginkan dan diperoleh pH 5,72 hal ini sesuai dengan liateratur fungi hidup pada pH 5,2-5,8. Setelah itu dimasukkan kedalam autoklav tetapi sebelum dimasukkan mulut Erlenmeyer ditutup dengan kapas dan kemudian dibungkus dengan kertas, hal ini bertujuan agar meminimalkan kontaminasi. PDA termasuk medium nonsintetik karena termasuk medium padat sedangkan menurut fungsinya termasuk medium umum. MEA (Malt Extract Agar ) digunakan sebagai media pertumbuhan khamir. Dimana dalam pembuatannya terlebih dahulu melarutkan MEA (Malt Extract Agar ) sebanyak 12,5 gram kedalam erlenmeyer 250 ml dan menambahkan aqades 250 ml setelah itu dipanaskan diatas hot plate dengan 0
suhu 480 C diikuti dengan pengadukan menggunakan magnetic stirer, tujuan dari pengadukan dan pemanasan untuk menghomogenkan MEA dengan aqades dan pemanasan bertujuan untuk mempercepat pelarutan dari MEA. Setelah dipanaskan beberapa menit larutan berubah warna dari coklat menjadi tua hal ini menujukkan larutan telah menjadi homogen kemudian larutan didinginkan dan diukur pHnya, Ph pada MEA = 5,4 ± -0,2 pH maksimal 5,6 dan pH minimal 5,2. pH yang diperoleh pada percobaan ini yaitu 5,6. Setelah itu dimasukkan kedalam autoklaf dengan mulut Erlenmeyer ditutup dengan kapas dan diluarnya dibungkus dengan kertas, hal ini bertujuan untuk meminimalkan kontaminasi. LB (Laktosa Broth) digunakan untuk fermentasi. Dimana dalam pembuatannya terlebih dahulu LB dilarutkan sebanyak 3,25 gram kedalam Erlenmeyer 250 ml dan menambahkan aqades 100 ml setelah 0
itu dipanaskan dengan suhu 300 C diikuti dengan pengadukan menggunakan magnetik stirrer, tujuan dari pengadukan untu menghomogenkan LB dengan aqades sedangkan pemanasan bertujuan untuk mempercepat pelarutan dari LB. Setelah dipanaskan larutan berubah warna dari merah menjadi merah tua, hal ini menujukkan larutan telah homogen. Setelah dipanaskan larutan didinginkan kemudian di
ukur pHnya, Ph yang diperoleh 6,7 sedangkan Ph netral untuk LB yaitu 6,8. Setelah itu mulut Erlenmeyer disumbat dengan kapas dan diluarnya dibungkus dengan kertas, hal ini bertujuan untuk meminimalkan kontaminasi dan dimasukkan kedalam autoklav. Autoklav adalah alat yang digunakan untuk sterilisasi. Autoklaf termasuk dalam teknik sterilisasi secara fisika dengan prinsip arus uap dan tekanan. Alat ini sering digunakan dalam teknik pensterilan karena tingkat koefisien dan sifat alat yang tidak merusak kandungan dalam media pertumbuhan yang dipakai yaitu NA, PDA, MEA dan LB. Sterilisasi
yang
dilakukan
bertujuan
untuk
menghindari
kontaminasi,
yaitu
masuknya
mikroorganisme yang tidak diinginkan. Sterilisasi merupakan suatu proses (kimia dan fisika) yang membunuh semua bentuk hidup terutama mikroorganisme. Sterilisasi yang digunakan dalam percobaan ini adalah secara fisika yaitu menggunakan panas, dimana panas yang digunakan adalah bersama uap air yang biasanya disebut sterilisasi basah.
BAB V PENUTUP A. Kesimpulan Kesimpulan yang didapat dari percobaan ini adalah: 1. Teknik sterilisasi dapat dilakukan dengan tekanan uap tinggi menggunakan otoklaf sehingga alat dan media steril. 2. NA (Nutrient Agar ) digunakan sebagai media pertumbuhan bakteri. 3. MEA (Malt Extract Agar) digunakan sebagai media pertumbuhan yeast at au khamir. 4. PDA (Potato Destroxe Agar) digunakan untuk menumbuhkan fungi atau jamur. 5. LB (Laktosa Broth) digunakan untuk fermentasi.
6. Sterilisasi dilakukan bertujuan untuk menghindari ko ntaminasi, yaitu masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkan. 7. Komposis media bahan sangat penting dalam memenuhi kebutuhan nutrisi sterilisasi dilakukan bakteri demi mengoptimalkan pertumbuhannya, yang mana tiap-tiap komposisi harus setimbang jumlahnya.
B.
Saran Pada praktikum selanjutnya medium untuk pertumbuhan mikroba dapat dibuat lebih banyak lagi dan pada saat praktikum kedepannya diharapkan praktikum berjalan dengan tertib tanpa kegaduhan dalam ruangan.
DAFTAR PUSTAKA
Dwidjoseputro, D, 1994, Dasar-Dasar Mikrobiologi . Djambatan, Jakarta. Hadioetomo, R. , 1993, Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium Mikrobiologi, Gramedia: Jakarta. Lim,D, 1998, Microbiology, 2nd Edition, McGrow-hill book, New york. Schegel, G.H, 1993, General Microbiologi seventh edition, Cambrige University Press, USA. Suriawiria, U, 2005, Mikrobiologi Dasar , Papas Sinar Sinanti, Jakarta. Volk & Wheeler, 1993, Mikrobiologi Dasar Jilid 1 Edisi kelima , Erlangga: Jakarta.
Posted by Nober bumbungan at 2:04 AM
Email ThisBlogThis!Share to TwitterShare to Facebook 1 comment:
1. DIEKY'S BLOGDecember 14, 2012 at 3:09 AM
Info yg sangat menarik nih gan BTW , kunjungi balik yah gan Reply
Laporan Mikrobiologi Media Pertumbuhan Mikroba BAB I PENDAHULUAN 1.1
1.1
Latar Belakang
Kita tahu bahwa semua makhluk hidup membutuhkan nutrient untuk pertumbuhan dan reproduksinya. Nutrien merupakan bahan baku yang digunakan untuk membangun komponenkomponen seluler baru dan untuk menghasilkan energy yang cdibutuhkan dalam proses kehidupan sel. Untuk membutuhkan dan mengembangbiakkan mikroba diperlukan suatu substrat yang disebut medium. Sedangkan medium itu sendiri sebelum digunakaan harus dalam keadaan steril artinya tidak ditumbuhi oleh mikroba lain yang tidak diharapkan agar mikroba dapat tumbuh dan berkembangbiak dengan baik di dalam medium, maka diperlukan syarat tertentu yang diantaranya bahwa didalam medium harus terkandung semua unsur hara yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangan mikroba kemudian susunan makanannya, tekanan osmosis, derajar, keasaman (pH), temperature, sterilisasi. Perlu kita ketahui pembuatan media didasarkan pada fungsi, komposisi media, dan konsistensinya sehingga dalam kultur atau media yang dibuat dapat menumbuhkan mikroba dengan baik dan sesuai dengan baik dan sesuai dengan yang diharapkan. Yang melatar belakangi praktikum pembuatan media adalah agar praktikan dapat menambah pengetahuan mengenai cara pembuatan medium pertumbuhan mikroba.
1.2
1.2 Tujuan
-
Mengetahui fungsi dari masing-masing medium
-
Mengetahui cara pembuatan medium NA (nutrient agar )
-
Mengetahui cara pembuatan medium PDA (potato dextrose agar)
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrient) yang berguna untuk membiakkan mikroba. Dengan mempergunakan bermacam-macam media dapat dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian sifat-sifat fisiologis dan perhitungan jumlah mikroba (Sutedjo,1996). Supaya mikroba dapat tumbuh baik dalam suatu media, maka medium tersebut harus memenuhi syarat-syarat antara lain : a.
Harus mengandung semua zat hara yang mudah digunakan oleh mikroba
b.
Harus mempunyai tekanan osmosa, tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroba yang ditumbuhkan
c.
Harus mengandung zat-zat yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba
d.
Harus berada dalam keadaan steril sebelum digunakan, agar mikroba yang diinginkan dapat tumbuh baik (Sutedjo,1996). Macam-macam media Media dapat digolongkan berdasarkan atas susunan kimianya, sifat wujudnya dan fungsinya. Penggolongan media berdasarkan susunan kimia :
1. Media anorganik. Yaitu media yang tersusun dari bahan-bahan anorganik 2. Media organik. Yaitu media yang tersusun dari bahan-bahan organik 3.
Media sintetik (media buatan). Yaitu media yang susunan kimianya diketahui dengan pasti. Media ini umumnya digunakan untuk mempelajari kebutuhan makanan suatu mikroba
4.
Media non sintetik. Yaitu media yang susunan kimianya tidak dapat ditentukan dengan pasti. Media ini umumnya digunakan untuk menumbuhkan dan mempelajari taksonomi mikroba (Sutedjo,1996).
Penggolongan media berdasarkan sifat wujudnya 1. Media cair yaitu media yang berbentuk cair 2. Media padat. Yaitu media yang berbentuk padat. Media ini dapat berupa bahan organik alamiah, misalnya yang dibuat dari kentang, wortel, dan lain-lain, atau dapat juga berupa bahan anorganik misalnya silica gel 3.
Media padat yang dapat dicairkan, (semi solid), yaitu yang apabila dalam keadaan panas berbentuk cair, sedangkan dalam keadaan dingin berbentuk padat, misalnya media agar (Sutedjo,1996). Penggolongan media berdasarkan fungsinya
1.
Media diperkaya. Yaitu media yang ditambahi zat-zat tertentu misalnya serum darah ekstrak tanaman dan lain sebagainya, sehinggan dapat digunakan untuk menumbuhkan mikroba yang bersifat heterotrof.
2.
Media selektif. Yaitu media yang ditambahi zat kimia tertentu untuk mencegah pertumbuhan mikroba lain (bersifat selektif). Misalnya media yang mengandung Kristal violet pada kadar tertentu dapat mencegah pertumbuhan bakteri gram positif tanpa mempengaruhi pertumbuhan bakteri gram negative.
3.
Media diferensial. Yaitu media yang ditambahi zat kimia (bahan) tertentu yang menyebabkan suatu mikroba membentuk pertumbuhan atau mengadakan perubahan tertentu sehingga dapat dibedakan tipe-tipenya. Misalnya media daerah agar dapat digunakan untuk membedakan bakteri homolitik (pemecah darah) dan bakteri non hemolitik.
4.
Media penguji. Yaitu media dengan susunan tertentu yang digunakan untuk pengujian vitamin. Vitamin asam-asam amino, antibiotika dan lain sebagainya.
5.
Media untuk perhitungan jumlah mikroba. Yaitu media spesifik yang digunakan untuk menghitung jumlah mikroba dalam suatu bahan.
6.
Media khusus. Yaitu media untuk menentukan tipe pertumbuhan mikroba dan kemampuannya untuk mengadakan perubahan-perubahan kimia tertentu (Sutedjo,1996). Cara pembuatan media Garis besar pembuatan media yang tersusun atas beberapa bahan adalah sebagai berikut :
a.
Mencampur bahan-bahan : bahan-bahan yang dilarutkan dalam air suling. Kemudian dipanaskan dalam pemanas air supaya larutannya homogeny.
b. Menyaring : beberapa jenis media kadang-kadang perlu disaring, dan sebagai penyaringan dapat digunakan kertas saring, kapas atau kain. Untuk media agar atau gelatin penyaringan harus dilakukan dalam keadaan panas. c.
Menentukan dan mengatur pH : penentuan pH media dapat dilakukan dengan menggunakan kertas pH, pH meter atau dengan komparator blok. Pengaturan pH media dapat dilakukan dengan penambahan asam atau basa (organik atau anorganik).
d.
Memasukkan media ke dalam tempat tertentu : sebelum disterilakan, media dimasukkan ke dalam tabung reaksi, Erlenmeyer atau wadah lain yang bersih, kemudian dibungkus kertas sampul (kertas perkamen) supaya tidak basah sewaktu disterilkan.
e.
Sterilisasi : pada umumnya sterilisasi media dilakukan dengan uap panas di dalam autoclave, pada suhu 121◦ C selama 15-30 menit (Sutedjo,1996). Media biak dan persyaratan bagi pertumbuhan. Media biak kompleks. Untuk banyak mikroorganisme bertuntutan tinggi belum dikenal benar bahan-bahan makanan yang diperlukan. Orang membiakkannya dalam larutan biak yang mengandung ekstrak ragi, otolisat ragi, pepton, atau ekstak daging. Untuk beberapa kelompok organisme lazim juga digunakan : rempah-rempah, dekok rumput kering, sari buah prem, sari buah wortel, santan dan untuk cendawan kupofil juga sari perasan tahi kuda. Mengingat biaya, larutan-larutan baik tidak dibentuk dari senyawa-senyawa murni tetapi lebih disukai untuk menggunakan zat-zat kompleks, seperti air didih, melaso, air rendaman jagung atau ekstrak kedelei, yang sebagai produk sisa tersedia dengan harga murah. Media bak seperti ini disebut media bak kompleks. (Schlegel, 1994). Media biak padat. Untuk membuat bak padat pada larutan bak cair di tambahkan bahan pemadat yang member konsistensi seperti selai pada larutan air. Hanya untuk keperluan tertentu 0
masih digunakan gelatin, karena sudah mencair pada suhu 26-30 C dan banyak mikroorganisme mampu mencairkan gelatin. +
-
Kadar ion hydrogen. Diantara semua ion, ion H dan OH adalah ion-ion yang paling mobil ; oleh sebab itu perubahan kadar yang kecil saja sudah menimbulkan pengaruh yang besar. (Schlagel, 1994). Karbondioksida, larun bak yang diperlukan untuk pertumbuhan mikroorganisme yang ototrof yang memfikasi CO2 biasanya ditambahi Na- bikarbonat dan diinkubasi dibawah atmosfir yang mengandung CO2 dalam wadah tertutup (Schlagel, 1994).
Kadar air dan tekanan osmotik. Mikroorganisme menunjukkan perbedaan yang luas dari segi tuntutan keperluan akan kadar air (Schlagel, 1994). Suhu. Memilih tuntutan mengenai suhhu inkubasi miroorganisme berbeda-beda prilakunya. Aerasi untuk semua mikroorganisme aerob obligat, oksigen merupakan akseptor electron yang sangat penting. Biak anaerob. Untuk menumbuhkan jenis bakteri yang anaerob kuat penyingkiran O2 udara merupakan persyaratan yang amat perlu (Schlegel, 1994) Zat hara yang ditambahkan ke dalam media. Untuk pertumbuhan diperlukan zat hara. Berbagai zat hara yang diperlukan adalah : Nitrogen : Pada umumnya bakteri tidak dapat langsung menggunakan N2 bebas dari udara, sehingga keperluannya diberikan dalam bentuk garam. Nitrogen diperlukan sebagai bahan dasar untuk protein, asam nukleat dan vitamin. Dalam media bahan yang mengandung N ini berupa : N inorganik - NH4Cl – - NaNO3 -
Pepton – N organik
Karbon : Sebagai sumber karbon digunakan bernagai gula, pati, glikogen. Gula yang dipakai berupa 5C,6C, atau disakarida (laktosa, sukrosa, dan maltose). Untuk dapat menggunakan sumber karbon ini bakteri dapat menguraikannua menjadi molekul yang lebih kecil yang kemudian digunakan untuk bahan dasar protein, polisakarida, lipida dan asam nukleat. Vitamin dan Faktor pertumbuhan : Berbagai vitamin yang diperlukan bakteri adalah thiamine, riboflavin, asam nikotinat, asam pantotenas biotin. Vitamin ini berfungsi sebagai koenzim atau bagian lain dari bahan dasar sel (Hastowo,1992).
BAB III METODE KERJA 3.1 Waktu dan Tempat
Praktikum kedua ini melakukan percobaan tentang media pertumbuhan mikroba yang dilaksanakan pada hari Rabu, pada tanggal 16 Maret 2011 pukul 10.00-12.00 WITA. Bertempat di Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Mulawarman Samarinda. 3.2 Alat dan Bahan
3.2.1 Alat-alat - Gelas kimia - Gelas ukur - Hot plate - Autoclave - Saringan - Tabung reaksi - Rak tabung reaksi - Pipet volume - Timbangan (neraca) - Erlenmeyer - Magnetic stirrer - Batang pengambil magnetic stirerr - Indicator pH - Gelas beker - Wadah (mangkuk) - Pensil - Inkubator
3.2.2 Bahan-bahan - Ekstrak daging - Ekstrak kentang - Pepton - Dextrose - Agar-agar - NaCl
- Aquades - Chloramphenicol - Alumunium foil - Karet gelang - Kertas - Indikator pH / kertas lakmus 3.2 Cara Kerja
3.3.1 Media nutrient agar (NA) 1. Ditakar ekstrak daging sebanyak 250 ml menggunakan gelas ukur 2.
Dicampurkan ekstrak daging 250 ml dengan pepton sebanyak 1,25 gr dan agar-agar 3,75 gr kedalam Erlenmeyer
3.
Dipanaskan diatas hot plate hingga mendidih sambil diaduk dengan magnetic stirrer sampai larutan homogen
4. Diukur kadar keasaman (pH) 5. Dimasukkan ke dalam 2 buah Erlenmeyer masing-masing sebanyak 125 ml 6. Ditutup mulut Erlenmeyer menggunakan alumunium foil 7.
Dimasukkan ke dalam autoclave untuk disterilkan beserta alat-alat yang akan digunakan, o
autoclave pada suhu 121 C dan tekanan 15 psi 3.3.2
Media potato dextrose agar (PDA)
1. Ditakar ekstrak kentang sebanyak 250 ml menggunakan gelas ukur 2.
Dicampurkan ekstrak kentang 250 ml dengan dextrose 2,5 gr dan agar-agar 3,75 gr ke dalam Erlenmeyer
3.
Dipanaskan diatas hot plate hingga mendidih sambil diaduk dengan menggunakan magnetic stirrer sampai homogen, lalu dibiarkan beberapa saat
4. Dilarutkan chloromphenicol dengan aquades sebanyak 10 ml ke dalam media ekstrak kentang 5. Dihomogenkan kemudian diukur kadar keasamannya (pH) 6. Ditutup mulut Erlenmeyer menggunakan alumunium foil, kemudian dibungkus dengan kertas 7.
Dimasukkan ke dalam autoclave untuk disterilokan beserta alat-alat yang akan digunakan, o
autoclave pada suhu 121 C dan tekanan 15 psi 3.3.3 -
Garam fisiologis
Ditakar 150 ml aquades dengan labu takar
-
Dicampurkan 1,275 gr NaCl dengan 150 ml aqudes kedalam Erlenmeyer
-
Dihogenkan menggunakan magnetic stirrer
-
Dimasukkan ke dalam tabung reaksi masing-masing 9 ml
-
Ditutup mulut tabung reaksi menggunakan alumunium foil , kemudian dibungkus dengan kertas
-
Dimasukkan ke dalam autoclave untuk disterikan beserta alat-alat yang akan digunakan, o
autoclave pada suhu 121 C dan tekanan 15 psi
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil pengamatan
4.1.1
Tabel hasi pengamatan media pertumbuhan bakteri No.
Media
01.
Keterangan
Warna awal pengamatan, berwarna kuning.
Setelah
pemanasan
warna
media agak cokelat Komposisi : kaldu daging 250 ml, pepton 1,25 gr, dan agar 3,75 gr pH = 7
4.1.2
Tabel hasil pengamatan media pertumbuhan jamur No.
Media
Keterangan
02.
Warna awal pengamatan, sebelum proses pemanasan berwarna keruh, setelah pemanasan warna media agak cokelat muda Komposisi : kaldu kentang 250 ml, dextrose 2,5 gr, dan agar 3,75 gr, ditambah chloromphenicol pH = 5,9
4.3 Pembahasan
Pada media NA digunakan ekstrak daging karena daging sebagai sumber vitamin B, mengandung nitrogen organik, dan senyawa karbon. NA adalah nutrient agar. Pada media PDA (potato dextrose agar) digunakan ekstrak kentang karena kentang sebagai sumber karbon (karbohidrat), vitamin, dan energy. Dextrose sebagai sumber gula dan energy, dan agar berguna untuk mendapatkan media PDA. Pepton sebagai sumber protein, karbohidrat, dan penghasil nitrogen. Dan diberi agar sebanyak pemadat media NA. Pembuatan media nutrient agar (NA) berasal dari bahan ekstrak daging sebanyak 250 ml, lalu dicampurkan dengan pepton sebanyak 1,25 gr dan agar 3,75 gr. Dipanaskan diatas hot plate hingga mendidih, wadah yang digunakan adalah Erlenmeyer. Campuran ini selama dipanaskan juga diaduk menggunakan magnetic stirrer, setelah itu diuku pHnya, sesuai standarisasinya. Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrient) yang berguna untuk membiakkan mikroba. Dengan menggunakan bermacam-macam media dapat dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian sifat-sifat fisiologis dan perhitungan juimlah mikroba (schlegel,1994). Tujuan dalam pembuatan media untuk wadah membiakkan mikroba, sehingga mikroba dapat tumbuh baik dalam suatu media yang telah dibuat.
Chloromphrnicol adalah antibiotik yang diberikan pada media yang berfungsi untuk membunuh mikroba-mikroba yang tidak diinginkan supaya mikroba yang akan kita buat tidak terganggu atau dengan kata lain agar media tidak terkontaminasi (Sutedjo,1996). Pada pembuatan media NA, ekstrak daging 250 ml, dicampurkan pepton 1,25 gr, dan agar 3,75 gr.didapatkan pada awal pengamatan, berwarna kuning. Setelah pemanasan didapatkan hasil warna media agak cokelat, dan diukur keasamannya (pH). pH yang ada pada NA sudah sesuai dengan standarisasi pH 6,8-7,0 , pH NA adalah 7. Sehingga tidak harus diberi tambahan NaCl. Kemudian pada pembuatan media potato dextrose agar dengan menggunakan bahan dasar ekstrak kentang 250 ml, ditambah dextrose 2,5 gr, dan agar 3,75 gr ditambah chloramphenicol. Didapatkan pada awal pengamatan, sebelum proses pemanasan berwarna keruh, setelah dilakukan pemanasan didapatkan hasil warna media agak cokelat muda, kemudian diukur keasamannya didapatkan pH 5,9. Pada pembuatan larutan garam fisiologis aquades dan NaCl ditakar untuki membuat larutan NaCl 0,85%, larutan distirer supaya larutan aquades dan NaCl tercampur. Mulut tabung reaksi ditutup dengan menggunakan alumunium foil dan dibungkus dengan kertas, dilakukan ini berfungsi untuk media tetap steril, tidak terkontaminasi terhadap mikroorganisme yang ada diluar. Kemudian larutan disteril menggunakan autoclave, ini berfungsi untuk membunuh semua mikroorganisme yang terdapat dalam larutan. Dalam melakukan percobaan dilakukan beberapa perlakuan yaitu menakar ekstrak kentang dan daging agar sesuai dengan komposisi yang ada. Memanaskan atau autoclave larutan agar mikroorganisme yang lain mati. Menggunakan sstirer agar larutan menjadi larutan homogen. Menutup mulut Erlenmeyer dengan alumunium foil agar tidak ada mikroorganisme yang masuk. Faktor kesalahan terjadi apabila pada saat pemanasan diatas hot plate tidak hati-hati sehingga air mendidih dan berhamburan keluar dari Erlenmeyer.
BAB V PENUTUP 5.1 Kesimpulan
Dari praktikum pada media pertumbuhan mikroba dapat disimpulkan bahwa : -
Fungsi medium (NA) berdasrkan susunan kimianya merupakan medium non sintetik atau semi ilmiah, berdasarkan konsistennya merupakan medium padat, untuk menumbuhkan bakteri, (PDA) termasuk media padat, berdasarkan susunan kimianya termasuk sintetik untuk menumbuhkan jamur.
-
Pembuatan media (NA) menggunakan bahan utama ekstrak daging 250 ml dengan komposisi pepton sebanyak 1,25 gr dan agar 3,75 pada pembuatan media ini ditambahkan pepton agar mikroba cepat tumbuh karena mengandung N2
-
Pembuatan medium (PDA) menggunakan bahan utama ekstrak kentang 250 ml dengan komposisi dextrose 2,5 gr dan agar 3,75 gr. Pada media ini ditambahkan chlorainphericol sebagai antibiotik sehingga mikroba yang tidak digunakan tidak tumbuh.
5.2 Saran
Sebaiknya pada saat praktikum, dilakukan dengan berhati-hati, pada saat pemanasan menggunakan hot plate harus diperhatikan agar tidak terjadi air mendidih dan bertumpahan keluar.
Laporan Mikrobiologi 'pengujian sterilitas' BAB I PENDAHULUAN I.1 Prinsip Percobaan Uji Sterilitas berdasarkan ketentuan Farmakope Indonesia IV I.2 Tujuan percobaan Menguji sterilitas sediaan obat dan alat kesehata n
BAB II TINJAUAN PUSTAKA Sediaan steril memiliki beberapa sifat bentuk takaran yang unik, seperti bebas dari mikroorganisme, bebas dari pirogen, bebas dari partikulat dan standar yang s angat tinggi dalam hal kemurnian dan kualitas; bagaimanapun, tujuan utama pembuatan sediaan steril adalah mutlak tidak adanya kontaminasi mikroba. Tidak seperti syarat banyak sediaan yang lain, syarat sterilitas adalah nilai yang mutlak. Sebuah sediaan baik steril maupun non steril. Secara historis, pertimbangan sterilitas bersandar pada uji sterilitas lengkap yang resmi, namun sediaan akhir pengujian sterilitas mengalami banyak batasan. Batasan yang paling nyata adalah sifat dasar dari uji sterilitas. Ini adalah uji yang dekstruktif; sehingga, hal ini tergantung pemilihan statistik sampel acak dari keseluruhan lot. Ketidakpastian akan selalu ada selama sampel secara tegas mewakili keseluruhan. Jika diketahui bahwa satu unit dari 1000 unit terkontaminasi (yakni, angka kontaminasi = 0,1%) dan 20 unit disampel secara acak dari 1000 unit, kemungkinan unit yang terkontaminasi dari 20 sampel itu adalah 0,02. Dengan kata lain, hanya 2% peluang dari yang unit yang terkontaminasi akan dipilih sebagai bagian 20 wakil sampel dari keseluruhan 1000 unit. Bahkan jika unit yang terkontaminasi satu dari 20 sampel dipilih untuk uji sterilitas, kemungkinan uji sterilitas akan gagal masih ada untuk mendeteksi kontaminasi. Konsentrasi kontaminan mikroba mungkin saja terlalu rendah untuk terdeteksi selama periode inkubasi atau dapat saja tidak cukup berkembang cukup cepat atau tidak sama sekali karena ketidakcukupan media dan inkubasi. Jika perkembangan mikroba terdeteksi dalam uji sterilitas, maka hal ini dapat mencerminkan pembacaan positif yang salah (false-positive reading) karena masalah kontaminasi aksidental dari media kultur pada saat uji sterilitas berlangsung. Masalah
kontaminasi aksidental adalah hal serius, merupakan batasan yang masih tidak dapat dihindari dari uji sterilitas. Food and Drug Administration (FDA) menerbitkan pedoman mengenai prinsip umum dari proses validasi. Konsep umum dan elemen kunci dari proses validasi yang betul-betul dapat diterima oleh FDA telah diuraikan. Titik utama yang ditekankan pada pedoman adalah ketidakcukupan kepercayaan dari uji sterilitas sediaan akhir dalam memastikan sterilitas dari kumpulan sediaan parenteral steril. Arti yang lebih besar harus ditempatkan pada validasi proses semua sistem yang terlibat dalam produksi hasil akhir. Batasan-batasan utama ini menunjukkan bahwa kepercayaan pada pengujian sterilitas produk akhir saja dalam memastikan sterilitas sediaan parenteral dapat mengarahkan kepada hasil yang keliru. Salah satu tujuan validasi pada pembuatan sediaan steril adalah untuk meminimalkan ketidakpercayaan terhadap pengujian produk akhir. Tiga prinsip yang terlibat dalam proses validasi sediaan steril adalah : 1. Untuk membuat sterilitas kedalam sediaan 2. Untuk menunjukkan tingkat kemungkinan maksimum yang pasti dimana proses dan metode sterilisasi memiliki sterilisasi yang terpercaya terhadap semua unit dari batch sediaan. 3. Untuk memberikan jaminan yang lebih luas dan mendukung hasil dari uji sterilitas sediaan akhir. Validasi sediaan steril pada konteks bab ini akan merujuk pada konfirmasi bahwa sebuah produk telah terekspos proses pembuatan dan khususnya metode sterilisasi yang sesuai menghasilkan batch sediaan yang diketahui memiliki derajat nonsteril. Sediaan steril dapat berwujud: 1. Padat steril merupakan obat steril merupakan obat untuk injeksi, yaitu obat kering yang disuspensikan bila akan digunakan. Contoh: sodium ampisilin. Karena ampisilin tidak stabil dalam cairan, maka dibuat padat. Cara pembuatannya yaitu dengaa liofilisasi pada suhu rendah dengan pengeringan steril, kemudian didinginkan sampai -60oC untuk pembekuan. Selanutnya dilakukan sublimasi (dengan pengurangan tekanan secra bertahap), cairan menguap, sodium ampisilin padat tertinggal. 2. Semi padat, misal salep mata. 3. Cair, misal injeksi. Ada beberapa metode Uji sterilitas 1. Direct inoculation of culture medium Meliputi pengujian langsung dari sampel dalam media pertumbuhan. Menurut British Farmakope:
a. media tioglikolat cair yang mengandung glukosa dan Na Tioglikolat cocok untuk pembiakan aerob. Suhu inkubasi 30-35 oC. b. Soya bean casein digest medium Media ini membantu pertumbuhan bakteri anaerob dan fungsi. Suhu inkubasi 30-35 oC, sedang fungi 20-25oC. 2. Membran filtrasi Teknik yang banyak direkomendasikan farmakope, meliputi filtrasi cairan melalui membran steril. Filter lalu ditanam dalam media. Masa inkubasi 7-14 hari karena mungkin organisme perlu adaptasi dulu. 3. Introduction od concentrate culture medium Medium yang pekat langsung dimasukkan dalam wadah sampel yang akan ditumbuhkan. Tidak banyak digunakan, hanya dipakai bila ada kecurigaan akan adanya bakteri.
BAB III PROSEDUR PERCOBAAN III.1 Sediaan Air 1. Disiapkan sediaan cair yang akan diuji kesterilannya (injeksi,tetes mata), media NA dan SDA, 1 pipet steril 1 ml, 1 pipet media steril, 2 cawan petri. 2.
Pipet @ 1 ml sediaan uji, dimasukkan kedalam 2 cawan petri
3.
Cawan 1 ditambahkan dengan 15 ml media NA dan cawan-2 dengan 15 ml SDA
4. Memutar cawan diatas meja hingga homogen dan dilakukan pra-inkubasi pada suhu kamar selama 30 menit 5. Cawan NA diinkubasi pada suhu 35-370C dan cawan SDA pada 20-25 0C, selama 4 hari 6.
Pengamatan dilakukan dengan teliti, dicatat perubahan yang terjadi
III.2 Sediaan Padat 1. Disiapkan 1 media pelat NA, 1 media pelat SDA, kasa steril (ukuran 2 cm), benang bedah steril 2 cm, pinset, gunting 2. Membagi media pelat menjadi 2 bagian area dengan cara mebarik garis batas pada dasar cawan petri dengan spidol marker 3. Dilakukan ‘flambir’ terhadap gunting dan pinset, kemu dian kasa steril dijepit dan digunting dengan ukuran seperti diatas, disiapkan 2 potong kasa 4. 1 potongan kasa steril diletakan disalah satu area media NA, juga diatas media SDA 5. Dikedua sisi media NA dan SDA diletakkan potongan benang bedah dengan ukuran @2 cm. Pemotongan benang dilakukan dengan aseptis juga 6. Keduanya diinkubasi selama 4 hari, media NA pada suhu 35-37 0C dan cawan SDA pada 20-250C 7.
Pengamatan dilakukan dengan teliti, dicatat perubahan yang terjadi
BAB IV HASIL PERCOBAAN Media NA Hasil Percobaan
Pengamatan Injeksi Pengamatan hari pertama setelah 0 diinkubasi pada suhu 35-37 C selama 24 jam, belum terjadi pertumbuhan bakteri. Injeksi Setelah diinkubasi pada suhu 350
37 C selama 4 hari, terdapat sedikit pertumbuhan bakteri berwarna putih
Salep Pengamatan hari pertama setelah 0 diinkubasi pada suhu 35-37 C selama 24 jam, belum terjadi pertumbuhan bakteri.
Salep Setelah diinkubasi pada suhu 350 37 C selama 4 hari, terdapat banyak pertumbuhan bakteri berwarna putih dan kuning, berkoloni lebih dari 5 Kasa Pengamatan hari pertama setelah 0
diinkubasi pada suhu 35-37 C selama 24 jam, belum terjadi pertumbuhan bakteri. Kasa Setelah diinkubasi pada suhu 350 37 C selama 4 hari, terdapat sedikit pertumbuhan bakteri berwarna putih agak kuning pada bagian kasa yang steril maupun tidak steril
Media SDA Hasil Percobaan
Keterangan Injeksi 0 Setelah diinkubasi pada suhu 20-25 C selama 4 hari, terdapat banyak pertumbuhan khamir, berbentuk bulat putih berukuran sangat kecil, sedikit
berlendir Salep 0
Setelah diinkubasi pada suhu 20-25 C selama 4 hari, terdapat sedikit pertumbuhan khamir, berbentuk bulat putih berukuran kecil, sedikit berlendir Kasa 0
Setelah diinkubasi pada suhu 20-25 C selama 4 hari , terdapat pertumbuhan koloni kapang dan khamir berwarna hitam dan putih, sedikit berlendir dan berspora pada kasa tidak steril dan steril
BAB V PEMBAHASAN Sediaan obat dan alat kesehatan seharusnya bersifat steril, bebas dari kuman terutama sediaan obat yang langsung kontak dengan mukosa atau langsung masuk ke aliran darah seperti injeksi, tetes mata, cairan infuse dan salep mata. Demikian juga dengan alat-alat kesehatan seperti kasa dan benang bedah. Standar ini dibuat dengan tujuan agar tidak terjadi infeksi pada pasien yang menggunakan sediaan obat maupun alat kesehatan tersebut akibat kontaminasi bakteri patogen. Pada percobaan ini kelompok kami melakukan percobaan pada cairan injeksi, sediaan salep dan kasa yang steril dan tidak steril pada media NA dan SDA. Pada media NA setelah 24 jam dilakukan inkubasi pada suhu 35-37 0C tidak terlihat adanya pertumbuhan koloni bakteri. Namun ketika inkubasi dilakukan sampai hari ke-4 ternyata positif terjadi pertumbuhan bakteri pada semua cawan. Hal ini disebabkan 2 kemungkinan, pertama mungkin karena kelompok kami bekerja kurang aseptis sehingga bakteri dari luar dapat masuk. Kemungkinan yang kedua adalah cairan injeksi, salep dan kasa yang dijadikan sampel sudah terkontaminasi bakteri atau tidak steril.
Pada media SDA setelah diinkubasi selama 4 hari pada suhu 20-250C atau suhu ruangan secara makroskopis terlihat adanya spora dan berlendir. Ini menunjukan adanya pertumbuhan koloni kapang dan khamir. Penyebabnya hampir sama dengan pertumbuhan bakteri pada media NA. Dapat kami simpulkan bahwa pengujian sterilitas injeksi, salep dan kasa yang kami lakukan positif terjadi pertumbuhan mikroba ini menunjukan bahwa ketiga sediaan tersebut tidak steril. Penyebabnya antara lain: kontaminasi mikroba dari udara saat membuka cawan petri, saat penuangan media atau disebabkan pekerjaan kelompok kami yang kurang aseptis atau dari sediaan tersebut yang sejak awal pembuatannya memang sudah tidak steril atau sudah terkontaminasi mikroba.
BAB VI KESIMPULAN
Sterilisasi adalah suatu proses penghancuran secara lengkap semua mikroba hidup dan spora-sporanya. Sediaan steril harus bebas dari jasad renik, bakteri patogen non patogen baik yang vegetatif maupun non vegetatif. Ketelitian saat percobaan sangat penting karena jika pekerjaan yang kita lakukan tidak aseptis sangat rentan terkontaminasi mikroba Pada percobaan kami positif pada larutan injeksi, salep dan kassa terjadi pertumbuhan mikroba, maka ketiga sediaan tersebut tidak steril.
DAFTAR PUSTAKA o
o o o
Mikrobiologi E.C.S., Chan, Michael. J. Jr.,Pelczar (1986).”Dasar -dasar Terjemahan.University of Indonesia”, Jakarta. Volk, W.A. dan Wheeler, M.F. 1990.Mikrobiologi Dasar . Erlangga : Jakarta Dwidjoseputro, D. 1998.Dasar-Dasar Mikrobiologi . Djambatan : Malang. http://id.shvoong.com/exact-sciences/biology/1639454-pengantar-mikrobiologiumum/
PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI DASAR Teori dan Metodenya (revisi)
Pendahuluan dan Daftar Isi Bab 1. Alat-alat dalam Laboratorium Mikrobiologi (bagian 1) Bab 1. Alat-alat dalam Laboratorium Mikrobiologi (bagian 2) Bab 2. Media Pertumbuhan Mikroorganisme (bagian 1) Bab 2. Media Pertumbuhan Mikroorganisme (bagian 2) Bab 3. Sterilisasi (bagian 1) Bab 3. Sterilisasi (bagian 2)
ARTIKEL MIKROBIOLOGI
Hubungan antara MPN dan CFU Homogenisasi sampel : blender atau stomacher ? Menghitung koloni secara otomatis menggunakan software OpenCFU Pengujian Kualitas Media Padat Menggunakan Metode Goresan (Ekometri) Prosedur Perhitungan Coliform, Fecal Coliform dan E. coli Menggunakan Metode MPN Diagram Alur Menghitung Koloni Saran Teknis Metode Plate Count untuk Pemula Bagaimana Menentukan Aman atau Tidaknya Suatu Bahan Pangan dari Mikroorganisme ? Indikator Mikrobiologis Metode MPN ( Most Probable Number) atau APM (Angka Paling Mungkin) Bagian 1 Metode MPN ( Most Probable Number) atau APM (Angka Paling Mungkin) Bagian 2 Tabel MPN 3 seri dan 5 seri t abung Tabel MPN 10 seri tabung Pengambilan Sampel Mikroorganisme Udara (Air S ampling). Bagian 1 Pengambilan Sampel Mikroorganisme Udara (Air Sampling) Bagian 2 Perhitungan Kematian Mikroorganisme pada Proses Ste rilisasi Pengambilan dan Preparasi Sampel Bakteri dalam Mikrobiologi Teknik Membran Filter untuk Menghitung Mikroba (bagian 1) Teknik Membran Filter untuk Menghitung Mikroba (bagian 2) Prinsip Dasar Teori Menghitung Mikroorganisme Pada Cawan (bagian 1) Prinsip Dasar Teori Menghitung Mikroorganisme Pada Cawan (bagian 2) Bekerja Tanpa Kontaminasi (Dasar Teknik Aspetis) Penentuan Sifat Gram Dengan KOH 3% dan Pe rbandingannya Dengan Pewarnaan Gram Pentingnya Penggambaran Morfologi Koloni di Cawan Bakteri Kontrol Harga Murah untuk Pewarnaan Gram Kunci Awal Identifikasi Bakteri Bagaimana Membedakan Flagellar Movement dengan Brownian Movement ?
MEDIA PERTUMBUHAN MIKROORGANISME (bagian 1)
Media pertumbuhan :
a.
Pengertian dan Fungsi media
b. Nama-nama media c.
Bahan-bahan media pertumbuhan 1.Sumber nutrisi atau zat makanan Sumber karbon Sumber hidrogen Sumber nitrogen Sumber oksigen Sumber fosfat Sumber unsur sekelumit (trace element ) 2.Komposisi media pertumbuhan Agar Peptone Meat / plant extract Faktor tumbuh Komponen selektif Komponen diferensial pH buffer
d. Macam-macam media pertumbuhan 1.Berdasarkan sifat fisik Solid media Liquid media Semisolid media 2.Berdasarkan kandungan bahan Media sintetik
Media non sintetik Media semi sintetik 3.Berdasarkan tujuan e.
Hal-hal penting dalam pembuatan media Bahan baku air Penimbangan media pertumbuhan Konsentrasi agar dan proses pelarutan agar Ketebalan agar dan luas cawan yang digunakan Pengaturan pH Proses sterilisasi Pencairan kembali media agar Penuangan media ke dalam cawan atau tabung Pemyimpanan media jadi Perlakuan untuk media kultivasi anaerob
f.
Penanganan commercial dehydrated media.
g. Ilustrasi pembuatan media h. Referensi
Media pertumbuhan :
a. Pengertian dan fungsi media Medium (jamak : media) pertumbuhan adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi yang disediakan dari media berupa molekul-molekul yang selanjutnya dirakit untuk menyusun komponen sel dan memperbanyak diri sehingga sel-sel tersebut dapat dimanfaatkan. Dengan adanya media pertumbuhan dapat dilakukan isolasi mikroorganisme menjadi kultur tunggal dan juga memanipulasi mikroorganisme yang didapatkan untuk kepentingan tertentu. Sedangkan menurut Andrews et al. (2004:4) kultur media adalah substansi dengan kadar tertentu dalam bentuk cair,
setengah padat atau padat yang mengandung bahan alami dan atau buatan untuk mendukung perkembangbiakan mikroorganisme.
b. Nama-nama media Media pertumbuhan memiliki banyak nama yang umumnya mengacu kepada nama asli sesuai literatur. Terdapat juga media dengan komposisi yang sama tetapi memiliki nama yang berbeda karena diproduksi oleh perusahaan yang berbeda. Misalnya Trypticase™ Soy Agar diproduksi oleh BBL (BD Diagnostic Systems), Tryptone Soy Agar diproduksi oleh Oxoid Unipath, dan Tryptic Soy Agar produced diproduksi Difco (BD Diagnostic Systems) yang semuanya memiliki komposisi yang sama. Banyak media juga dikenal sebagai akronim, misalnya TSA adalah singkatan dari Trypticase™ Soy Agar. Jika seseorang memodifikasi komposisi media yang telah ada (memiliki nama asli), maka istilah “ modified” diletakkan setelah nama media. Misalnya TSA, modified bukan Modified TSA. Media yang tidak memiliki nama formal
umumnya
dinamai
berdasarkan
organisme
yang
ditargetkan,
misalnya
Bacillus
stearothermophilus Broth (Atlas, 2010:1).
c.
Bahan-bahan media pertumbuhan
1.Sumber nutrisi atau zat makanan Analisa dari komposisi kandungan unsur sel mikroorganisme menunjukkan lebih dari 95% dari berat kering terdiri dari unsur utama (major elements) yaitu unsur C, O, H, N, S, P, K, Na, Ca, Mg, dan Fe. Jika suatu jenis mikroorganisme ingin ditumbuhkan dalam cawan petri atau tabung maka harus dipenuhi kebutuhan unsur tersebut dari molekul organik yang terdapat pada media. Komposisi setiap bahan pada media tertentu terhadap mikroorganisme target menggambarkan kondisi nutrisi pada habitat aslinya karena pada keadaan itulah mikroorganisme tersebut optimal tumbuh. Berikut adalah sumber nutrisi media.
Sumber karbon Molekul organik umumnya mengandung karbon sebagai tulang punggungnya seperti karbohidrat, lemak, protein yang terdapat pada pepton, glukosa, dll. Bahan organik inilah yang menjadi sumber karbon utama untuk mikroorganisme heterotrof yang umum dikultivasi.
Sumber nitrogen
Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa bernitrogen lain yang terkandung pada peptone, meat extract , atau tryptose. Sejumlah mikroba juga dapat menggunakan sumber N anorganik seperti urea.
Sumber oksigen Untuk mikroorganisme heterotrof yang dikulturkan pada cawan, sebagian besar oksigen didapatkan langsung dari udara sedangkan mikroorganisme yang dikultur pada media cair sumber oksigen berasal dari oksigen yang terlarut air. Oleh karena itu aerasi pada kultur cair dapat meningkatkan pasokan oksigen kepada mikroorganisme.
Sumber fosfat Sumber fosfat organik seperti beberapa protein, kofaktor atau ATP yang dapat dijumpai pada bahan yeast extract atau pepton. Namun hampir semua mikroorganisme dapat memanfaatkan fosfat anorganik yang ditambahkan langsung pada media seperti potassium phosphate, sodium phosphate dll. (Prescott & Harley, 2002:98).
Sumber unsur sekelumit (mikronutrient/trace element ) Pada lingkup media pada cawan petri, unsur mikronutrien (Zn, Mn, Mo, Ni, Co, Cu dll.) dapat diperoleh dari akuades atau peralatan gelas. Fungsi mikronutrien ini umumnya menjadi bagian dari enzim atau kofaktor untuk menjadi katalis reaksi atau menjaga struktur protein. Oleh karena itu pembuktian kebutuhan unsur mikronutrien sangat sulit dilakukan dalam skala laboratorium karena setiap jenis mikroorganisme membutuhkannya dalam jumlah yang sangat sedikit (Prescott & Harley, 2002:96).
2.Komposisi media pertumbuhan Formulasi media pertumbuhan prinsipnya hampir sama dengan resep masakan di dapur yang setiap bahan bakunya diatur dengan takaran tertentu. Berikut adalah beberapa bahan-bahan yang umum dipakai dalam pembuatan media pertumbuhan menurut Atlas (2010:1-8).
Agar Agar adalah bahan yang paling umum digunakan sebagai gelling agent pada media yang terbuat dari ekstrak alga. Agar bukan sebagai sumber nutrisi bagi mikroorganisme namun fungsinya lebih bersifat mekanis yaitu memadatkan media cair sehingga sel tidak larut dalam cairan. Struktur agar terdiri dari D-
galactose, 3,6-anhydro-L-galactose, dan D-glucuronic acid . Umumnya agar terbuat dari ganggang merah. Agar cocok menjadi agen pemadat karena setelah dilarutkan pada suhu mendidih dapat didinginkan sampai 40-42°C sebelum memadat dan tidak akan mencair lagi sebelum suhu mencapai 80-90°C. Pencairan dan pemadatan berkali-kali atau sterilisasi yang terlalu lama dapat menurunkan kekuatan agar, terutama pada pH yang asam.
Peptone Peptone adalah hasil hidrolisis protein yang dibentuk dari proses enzimatik atau digesti asam. Casein banyak digunakan sebagai substrat pembentuk peptone, tetapi beberapa bahan lain seperti soybean meal juga sering digunakan.
Meat / plant extract Ekstrak dagung dan tumbuhan mengandung asam amino, peptida dengan berat molekul rendah, karbohidrat, vitamin, mineral dan trace metals. Ekstrak jaringan hewan mengandung lebih banyak bahan protein larut air dan glikogen sedangkan ekstrak tumbuhan lebih banyak terdapat karbohidrat di dalamnya.
Faktor tumbuh Banyak mikroorganisme yang membutuhkan faktor tumbuh spesifik yang harus ada dalam media pertumbuhannya. Beberapa diantaranya adalah vitamin, asam amino, asam lemak dan nutrisi dari darah.
Komponen selektif Suatu bahan yang berfungsi untuk menghambat pertumbuhan mikroorganisme non target disebut komponen selektif. Komponen selektif dipakai pada media selektif yang berguna untuk mengisolasi bakteri spesifik dari populasi campuran. Bile salts (garam empedu), selenite, tetra-hionate, tellurite, azide, phenylethanol, sodium lauryl sulfate, sodium chloride (konsentrasi tinggi), dan beberapa pewarna (eosin, Crystal Violet, dan Methylene Blue) umumnya dipakai sebagai bahan selektif. Bahan antimikroba juga dapat digunakan untuk menekan pertumbuhan bakteri tertentu, diantaranya adalah ampicillin, chloramphenicol, colistin, cycloheximide, gentamicin, kanamycin, nalidixic acid, sulfadiazine, dan vancomycin.
Komponen diferensial
Berbeda dengan komponen selektif, komponen diferensial ini tidak menekan pertumbuhan mikroorganisme tertentu namun sebagai bahan untuk memudahkan pembedaan mikroorganisme target dari populasi campurannya (deteksi visual). Bahan diferensial seperti pH indikator akan membuat koloni target berbeda warna karena memproduksi asam. Bahan lainnya berupa pewarna kromogenik yang mampu berubah warna jika suatu reaksi enzim spesifik terjadi.
pH buffer / buffer salts pH buffer digunakan untuk menjaga pH media selama digunakan untuk tumbuh karena beberapa mikroorganisme akan tumbuh optimal pada kisaran pH yang spesifik.
d. Macam-macam media pertumbuhan
1.Berdasarkan sifat fisik
Solid media Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15g/L sehingga setelah dingin media menjadi padat. Media padat berguna untuk menjaga sel tidak berpindah tempat sehingga akan mudah dihitung dan dipisahkan jenisnya ketika tumbuh menjadi koloni. Media padat juga menampakkan difusi hasil metabolit bakteri sehingga memudahkan dalam pengujian suatu hasil metabolit.
Liquid media Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB ( Nutrient Broth), LB (Lactose Broth). Medium cair akan memberi kesempatan bakteri untuk menyebar dan tercampur dengan seluruh nutrisi sehingga lebih cocok untuk mengoptimumkan pertumbuhan mikroba. Dapat juga untuk mengetahui karakter suatu mikroba berdasarkan kebutuhan oksigen.
Semisolid media Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat dan tidak begitu cair. Media semi solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB (Nitrogen free Bromthymol Blue) semisolid akan
membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada media Nitrate Broth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media.
2.Berdasarkan kandungan bahan
Media sintetik / media terdefinisi (synthetic media / defined media) Media sintetik adalah media yang seluruh komposisinya diketahui. Media sintetik digunakan dalam penelitian
mengenai
uji
metabolisme
suatu
mikroorganisme.
Banyak
jenis
mikroorganisme
kemoorganotrof heterotrof dapat tumbuh pada media sintetik dengan glukosa sebagai sumber karbon dan ammonium salt sebagai sumber nitrogen (Prescott et al . 2002:105). Berikut contoh komposisi media sintetik : BG –11 Medium for Cyanobacteria (g/liter) -Agar 10.0g -NaNO3 1.5g -MgSO4·7H2O 0.075g K -H2PO4 0.04g -CaCl2·2H2O 0.036g -Na2CO3 0.02g -Citric acid 6.0 mg -Ferric ammonium citrate 6.0 mg -EDTA disodium salt 1.0 mg -Trace metal mix A5 1.0 mL
Media kompleks (complex media) Media kompleks adalah media yang sebagian komposisinya tidak diketahui dengan pasti. Media kompleks seringkali dibutuhkan karena kebutuhan nutrisi dari beberapa bakteri tidak diketahui sehingga media sintetik tidak dapat dibuat untuk keperluan ini. Seringkali satu jenis media kompleks dapat cukup
kaya untuk memenuhi kebutuhan banyak jenis bakteri. media ini dapat mengandung bahan yang tidak diketahui pasti komposisinya seperti peptone, meat extract dan yeast extract . Contoh media kompleks adalah nutrient broth, tryptic soy broth dan MacConkey agar (Prescott et al . 2002:105).
3.Berdasarkan tujuan Berikut adalah pembagian media berdasarkan tujuan menurut Barrow & Feltham (1993:8 -9) :
Media isolasi Media isolasi adalah media umum yang digunakan untuk mengisolasi suatu mikroba menjadi kultur murni. Biasanya mengandung semua kebutuhan untuk tumbuh, misalnya Blood agar atau Chocolate agar.
Media selektif (selective or inhibitory media) Berfungsi untuk menumbuhkan mikroba target / yang diinginkan dan menekan pertumbuhan mikroba yang tidak diinginkan (background flora). Umumnya media selektif menseleksi mikroba target berdasarkan kelompok, genus atau spesiesnya, misalnya EMB agar untuk menseleksi E. coli, Baird parker untuk isolasi S. aureus.
Media pengkaya (enrichment media) Media pengkaya termasuk media selektif namun lebih berfungsi untuk memperbanyak mikroba target sehingga saat dilakukan pengkulturan, mikroba yang tidak diinginkan tidak dalam jumlah besar. Media pengkaya harus dalam bentuk cair dan digunakan di awal tahap analisa.
Media untuk peremajaan kultur (maintenance of cultures) Media peremajaan kultur seharusnya tidak begitu kaya nutrisi sehingga mempercepat pertumbuhan, misalnya Nutrient agar.
Media untuk penentuan kebutuhan nutrisi / kemampuan penggunaan substrat. Media ini berfungsi untuk mendeteksi dan mengidentifikasi kebutuhan suatu substrat dari bakteri (yang tidak diketahui kebutuhan nutrisinya) dengan menghilangkan atau mensubtitusi komponen suatu substrat. Media ini tidak digunakan untuk kebutuhan sehari-hari namun lebih untuk keperluan penelitian. Sebagai contoh sederhananya adalah Koser Citrate untuk mendeteksi penggunaan citrate sebagai sumber karbon tunggal.
Media untuk karakterisasi bakteri Umumnya mengandung nutrisi yang cukup untuk pertumbuhan dan ditambah substrat yang akan diuji penggunaannya. Reagen atau indikator tertentu dapat juga ditambahkan untuk mengetahui hasil reaksi.
