LAPORAN PRAKTIKUM ANALISIS INSTRUMEN
“”
KELOMPOK 1D Anggota : Rahmi
Sertiana
N.
A.
Ana Yuliana
1111102000085
1111102000109
Subhan Asfari
Hestiawati
1111102000086
1111102000110
Ambar
Niekha Zoelienna I.
Khaerinnisa
1111102000090 Ichsana
Eskha
1111102000111 Widya
1111102000092 Nindya
Nurfitriani
1111102000095 Sri Puji Astuti 1111102000097 M.A.W. Khairurrijal 1111102000102 Beryl Zahyin Adyani 1111102000106
Raaflyan
Wahyu
1111102000112 A.
Khairunnisa 1111102000113 Andis Saputra 1111102000119 Khairul Bahtiar A. 1111102000117
P.
Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta Landasan Teori KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI Kromatografi cair kinerja tinggi(KCKT) atau biasa disebut dengan HPLC(High Performance Liquid Chromatography) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industri-industri makanan. Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawasenyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis; analisis ketidakmurnian(impuritis); analisis senyawa-senyawa yang tidak menguap(nonvolatil); penentuan molekul-molekul netral,ionik, maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama; pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit (trace elements), dalam jumlah banyak, dan dalam skala proses industri.
Cara Kerja KCKT
Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini di atur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan fase diam. Prinsip kerja instumentasi HPLC HPLC menggunakan fasa gerak untuk memisahkan komponen dari sebuah campuran komponen (analit). Prinsip keja HPLC adalah pemisahan setiap komponen dalam sampel berdasarkan kepolarannya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Fasa diam yang biasa digunakan (pada kolom) HPLC jenis fasa terbalik adalah RMe2SiCl, dimana R adalah rantai alkana C-18 atau C8. Sementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur komposisinya (gradien elusi), misalnya : air:asetonitril (80:20), hal ini bergantung pada kepolaran analit yang akan dipisahkan. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan waktu retensinya akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang punsak-puncaknya terpisah.
Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas delapan komponen pokok, yaitu: wadah fase gerak, sistem penghantaran fase gerak, alat untuk memasaukan sampel, kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, tabung penghubung, dan suatu computer atau integrator atau perekam.
Gambar KCKT secara umum
1. Wadah fase gerak Wadah fase gerak harus bersih dan lembam(inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak.Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1-2 liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing(penghilangan gas) yang ada fase gerak. Sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detector sehingga akan mengacaukan analisis. 2. Fase gerak Fasa gerak dari HPLC merupakan zat cair yang disebut eluen atau pelarut. Berfungsi untuk membawa komponen-komponen campuran menuju ke detektor, selain itu juga dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penetu keberhasilan proses pemisahan. Persyaratan zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak sebagai berikut: a) Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis b) Zat cair harus murni, untuk menghindari masuknya kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatogram c) Zat cair harus jernih, untuk meghindari penyumbatan pada kolom d) Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak beracun e) Zat cair tidak kental dan harus sesuai dengan detektor Fasa gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil. Selain itu adanya gas dalam fasa gerak juga
harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fasa gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas. Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan buffer dengan metanol atua campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fasa gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding fase terbalik. 3. Pompa Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan dengan kecepatan 20mL/menit. Tujuan pengggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah menjamin proses penghantaraan fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari pengguan. Ada 2 jenis pompa dalam KCKT yaitu: pompa dengan tekanan konstan dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan. Dikenal 3 jenis pompa yang masing-masing memiliki keuntungan yaitu : a) Pompa Reciprocating Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston maju mundur yang dijalankan oleh motor. Gerakan piston memberikan aliran eluen yang konstan, memiliki volume internal kecil (35-400 mL) menghasilkan tekanan tinggi (sampai 10.000 psi). Piston berupa batang gelas dan berkontak lengsung dengan pelarut. b) Pompa Displacement Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) tersiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang digerakkan oleh motor. Menghasilkan aliran yang cenderung tidak tergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut. Memiliki keterbatasan kapasitas pelarut ( c)
250 mL) dan tidak
mudah untuk pergantian pelarut. Pompa Pneumatic Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi.Pompa jenis ini murah, tetapi memiliki keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan tekanan balik kolom.
4. Penyuntikan sampel pada KCKT/ injektor
Sampel-sampel cair dan larutan disuntukkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup Teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel(sampel loop) internal atau eksternal.
Pada saat pengisian sampel, sampel digelontor melewati keluk sampel dan kelebihannya dikeluarkan ke pembuangan.Pada saat penyuntikan, katup diputar sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel dan menggelontor sampel ke kolom. Presisi penyuntikan dengan keluk sampel ini dapat mencapai nilai RSD 0,1%. Penyuntikan ini mudah digunakan untuk otomatisasi dan sering digunakan untuk autosampler pada KCKT. 5. Kolom Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Parameter Tabung kolom
Fase diam
Tekanan operasional Fase gerak
Kolom konvensional Stenless steel Panjang 3, 10, 15, 20, dan 25 cm Diameter luar 0,25 inci Diameter dalam 4,6 mm Porous, silika ukuran kecil, silika yang dimodifikasi secara kimiawi, atau polimer-polimer stiren/divinil benzen. Rata-rata diameter partikel 3,5 atau 10 µm dengan kisaran sempit 500-3000 psi (35-215 bar) Hidrokarbon+pelarut-pelarut terklorinasi atau alcohol untuk fase normal. Untuk fase terbalik digunakan metanol atau asetonitril+air atau buffer. Kecepatan alir : 1-3 mL/menit
Kolom mikrobor Stanless steel Panjang 25 dan 50 cm Diameter luar 0,25 inci Diameter dalam 1 tau 2 mm Porous, silika ukuran kecil, silika yang dimodifikasi secara kimiawi, atau polimer-polimer stiren/divinil benzen. Rata-rata diameter partikel 3,5 atau 10 µm dengan kisaran ukuran partikel yang sempit 1000-5000 psi (70-350 bar) Hidrokarbon+pelarutpelarut terklorinasi atau alcohol untuk fase normal. Untuk fase terbalik digunakan metanol atau asetonitril+air atau buffer. Kecepatan alir : 10-100 µL/menit. Modifikasi instrumen Sistem penghantaran
Kinerja
pelarut yang mempu memberikan control aliran di bawah 10 µL/menit. Katup injeksi sampel bervolume kecil; sel detector bervolume kecil. Efisiensi meningkat dengan Sangat efisien dan sensitif, berkurangnya ukuran akan tetapi lambat. partikel fase diam, akan Konsumsi fase gerak hanya tetapi umur kolom dengan ¼ dari kolom konvensional. ukuran partikel 3 µm lebih pendek.
6. Fase diam Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzene. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol(Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagenreagen seperti klorosilan.Reagen-reagen ini berekasi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lainnya. Oktadesil silika(ODS atau C18 ) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lebih sesuai untuk solute yang polar. 7. Detektor KCKT Detektor pada KCKT dikelompokan menjadi 2 golongan yaitu: detector universal(yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan slektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia. Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut: Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil Stabil pada pengoprasiannya Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mempu meminimalkan pelebaran pita. Untuk kolom konvensional, selnya bervolume 8 µl atau lebih kecil, sementara kolom mikrobor selnya bervolume 1 µl atau lebih kecil lagi. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas(kisaran dinamis linier) Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak. 8. Rekorder Rekorder adalah alat untuk mencetak hasil percobaan pada lembar berupa kumpulan puncak (kromatogram). Kromatogram HPLC yang didapat berguna untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran dan jumlah peak menyatakan jumlah komponen.
Analisis kualitatif dapat dilakukan dengan cara membandingkan waktu retensi (rt) analit atau sampel dengan waktu retensi standar. Sedangkan analisis kuantitatif depat dilakukan dengan didasarkan pada luas peak atau tinggi peak dengan metode standar kalibrasi.
JENIS-JENIS HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut: 1. Kromatografi Adsorbsi Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor. (Kealey and Haines, 2002) 2. Kromatografi fase terikat Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik. Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat. (Kealey and Haines, 2002) 3. Kromatografi penukar ion KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut
campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin. (Meyer, 2004) 4. Kromatografi Pasangan ion Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampelsampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan. (Meyer, 2004) 5. Kromatografi Eksklusi Ukuran Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain. (Meyer, 2004) 6. Kromatografi Afinitas Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks. (Meyer, 2004) PARACETAMOL (ACETAMINOPHEN)
Paracetamol mengandung tidak kurang dari 98,0% dan tidak lebih dari 101,0% C8H9NO2, dihitung terhadap zat anhidrat BM : 151,16 Pemeriaan : Serbuk hablur, putih, tak berbau, rasa sedikit pahit
Kelarutan : Larut dalam air mendidih dan dalam NaOH 1N, mudah larut dalam etanol Titik lebur : 168-172oC Penyimpanan : disimpan di dalam wadah tertutup rapat dan tidak tembus cahaya (anonym, 1995) Acetaminophen atau Parasetamol adalah obat analgetik dan antipiretik yang digunakan untuk melegakan sakit kepala, sengal-sengal atau sakit ringan dan demam. Parasetamol digunakan dalam sebagian resep obat analgetik selesma dan flu. Berbeda dengan obat analgetik yang lain seperti aspirin dan ibuprofen, parastamol tidak memiliki sifat antiradang. Parasetamol merupakan derivate dari asetanilida yang efek enalgetiknnya dapat diperkuat dengan koffein dengan kira-kira 50% dan codein. Overdose dapat menimbulkan antara lain mual, muntah dan anoreksia. Penanggulangannya dengan cuci lambung, juga perlu diberikan zat-zat penawar (asam amino N-asetilsistein atau metionin) sedini mungkin, sebaiknya 8-10 jam setelah intoksikasi. Penggunaan parasetamol dalam dosis besar dan dalam jangka waktu yang lama dapat menyebabkan kerusakan pada hati, untuk itu parasetamol dikontraindikasikan untuk pasien dengan gangguan fungsi hati berat. Wanita hamil dapat menggunakan parasetamol dengan aman, juga selama laktasi walaupun mencapai susu ibu. Interaksi dengan dosis tinggi memperkuat efek antikoagulansia dan pada dosis biasa tidak interaktif ( Tjay, 2000). Parasetamol adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus kromofor yang dimilikinya menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. (Sani Ali, 2012)
Metode Kerja A. Judul Praktikum High Performance Liquid Chromatography (HPLC) / kromatografi cair kinerja tinggi B. Tempat dan tanggal praktikum Laboratorium PNA, 1 dan 8 Oktober 2013 C. Alat dan Bahan -
Beker glass Labu erlenmeyer Labu ukur Mikropipet
-
Membran filter Syringe Pipet tetes Gelas vial
-
HPLC Aquadest Paracetamol Coffein
-
KPOH4 Dapar fosfat Etanol
D. Prosedur Kerja 1. Pembuatan larutan standar campuran kafein dan parasetamol Buat pengenceran dari larutan induk masing-masing larutan parasetamol dan kafein. Labu ukur 10 ml disiapkan sebanyak dua buah. Lakukan pengenceran untuk mendapatkan 6 ppm kafein dan 10 ppm parasetamol. Lalu kedua larutan dicampur hingga homogen. Larutan campuran dianalisis menggunakan HPLC, dengan optimasi yang sesuai. Diamati waktu retensi standar dan luas area dibawah kurva kromatogram. 2. Analisis kualitatif larutan kafein dan parasetamol Ditimbang masing-masing 5,0 mg kafein dan parasetamol Dimasukkan ke dalam labu terukur 50 mL Ditambahkan aquadest hingga batas tanda, sehingga didapat larutan kafein dan larutan parasetamol dengan konsentrasi 100 µg/mL (larutan induk) Encerkan masing-masing larutan induk, hingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 10 µg/mL. Lalu masing-masing larutan dianalisis menggunakan HPLC, dengan optimasi yang sesuai. Diamati waktu retensi standar dan luas area dibawah kurva kromatogram. 3. Pembuatan larutan standar Kafein dan Parasetamol untuk kurva kalibrasi Buat 5 seri standar yang terdiri dari campuran parasetamol dan kafein dengan konsentrasi tertentu. Larutan standar 1 2 3 4 5
Parasetamol
Kafein
10 12 14 16 18
6 8 10 12 14
4. Penetapan kadar sampel dalam sediaan yang beredar Ditimbang satu tablet sediaan yang mengandung paracetamol dan kafein. Lalu digerus. Serbuk dilarutkan menggunakan pelarut yang sesuai (air), cukupkan hingga 100mL. Dibuat larutan dengan konsentrasi 14 ppm untuk mengukur kadar PCT Dibuat larutan dengan konsentrasi 10 ppm untuk mengukur kadar kafein
-
-
Lalu masing-masing larutan dianalisis menggunakan HPLC, dengan optimasi yang sesuai. Hasil kromatorgram berupa waktu retensi dan luas area dibawah kurva diamati.
Hasil dan Pembahasan KUALITATIF
Hasil Standar Eksternal N o 1 2
Nama Peak Standar Parasetamol (10 ppm) Standar Kofein (10 ppm)
Waktu Retensi (menit) 1,63 4,34
27,942
Area (mAU x menit) 2,463
46,713
9,372
Tinggi (mAU)
Sampel Campuran N o
Nama Peak
1 2
Senyawa 1 Senyawa 2
Waktu Retensi (menit) 1,72 3.73
Tinggi (mAU) 37,602 47,751
Area (mAU x menit) 3,232 15,231
Perhitungan Kadar Karena waktu retensi senyawa 1 hampir sama dengan parasetamol, maka senyawa 1 dianggap parasetamol.
Serta karena waktu retensi senyawa 2 hampir sama dengan kofein, maka senyawa 2 dianggap dianggap.
Pembahasan Pada praktikum ini digunakan HPLC/KCKT untuk analisis paracetamol, coffein, serta sampel campuran dari paracetamol dan coffein secara kualitatif. Fase gerak yang digunakan adalah campuran KH 2PO4, metanol, dan asetonitril dengan perbandingan 90 ml: 6 ml : 4 ml. Sedangkan Okta Desil Silan (C18) digunakan sebagai fase diam. Penggunaan campuran eluen atau fase gerak yang
sedemikian rupa merupakan hasil dari pengalaman pemisahan campuran parasetamol dengan kofein. Dapar fosfat (KH 2PO4) pH 4,5 digunakan karena kedua senyawa tersebut stabil dalam kondisi yang sedikit asam. Campuran metanol dengan asetontril akan mengkondisikan sistem eluen bersifat semi polar, hal tersebut terkait sifat kepolaran senyawa yang dianalisis. Parasetamol dan kofein bersifat semi polar karena mengandung gugus yang memiliki elektron bebas (sehingga bersifat polar), sekaligus memiliki struktur siklik yang bersifat nonpolar.Fase diam yang berupa okta desil silan (C18) bersifat nonpolar. Kombinasi dari sistem eluent dan adsorban (fase diam) akan menimbulkan proses tarik menarik solute pada sampel diantara keduanya sehubungan dengan kemiripan dari sifat kepolaran solute dengan eluent dan adsorben. Hasilnya berupa waktu retensi yang bersifat khas dari senyawa tertentu dalam solute terhadap sistem KCKT yang digunakan.
Parasetam olnknjnjolo l
Kofein
Gugus yang menentukan sifat polar, Gugus yang menentukan sifat nonpolar Detektor yang digunakan berupa detektor UV-Vis dengan pertimbangan bahwa senyawa yang dianalisis memiliki gugus kromofor. Panjang gelombang yang digunakan adalah 215 nm, suhu 27.3 0C-27.50C, dan volume alir 0,7 ml/menit. Pengkondisian sistem kromatografi ini diadaptasi dari hasil pengalaman optimasi untuk memisahkan sampel campuran parasetamol-kofein serta disesuaikan dengan campuran eluen dan adsorban yang digunakan. Sehubungan dengan telah diketahuinya komponen dalam sampel, maka elusi digunakan dengan sistem isokratik, dimana gradien persentasi komponen eluen selalu sama. Sebelum dilakukan pengujan terhadap sampel campuran, dibuat larutan standar dari komponen sampel tersebut. Metode analisis ini menggunakan standar eksternal karena kadar komponen sampel cukup besar dan dalam rentang deteksi teliti instrument analisis yang digunakan. Dibuat larutan standar parasetamol dan kofein dengan kadar masing-masing 10 ppm. Medium pelarut yang digunakan untuk pembuatan standar adalah aquades terkait ketidaktersediaan aquades.Untuk meminimalisasi keikutsertaan pengotor saat analisis, standar disaring terlebih dahulu dengan penyaring mikro.Selanjutnya standar dianalisis menggunakan KCKT dengan sistem instrument yang telah dipersiapkan sebelumnya, untuk menentukan waktu retensi masing-masing
senyawa. Diketahui bahwa waktu retensi parasetamol pada sistem KCKT ini adalah 1,63 menit dengan luas area di bawah kurva 2,463 mAU*menit sedangkan kofein 4,34 menit dengan luas area di bawah kurva 9,372 mAU*menit. Waktu retensi akan menjadi acuan untuk menentukan identitas peak yang dihasilkan pada kromatogram hasil analisis sampel campuran. Dari hasil analisis larutan standar, dihasilkan bentuk kromatogram berbahu (shoulder) dengan sedikit tailing. Hal ini disebabkan oleh terlalu banyak pengotor yang ikutserta dalam proses analisis dengan KCKT. Selanjutnya dilakuan analisis sampel campuran parasetamol.Waktu retensi yang dihasilkan pada peak 1 adalah 1.72 menit dengan luas area di bawah kurva 3.232 (mAU*min) dan peak 2 adalah 3.73 (menit) dengan luas area dibawah kurva 15.231 (mAU*min).Bentuk kromatogram yang dihasilkan adalah bentuk berbahu (shoulder) dengan sedikit tailing.Kemudian dibandingkan waktu retensi standar dengan waktu retensi sampel.Dilihat dari kedekatan nilai (waktu retensi), diputuskan bahwa peak 1 merupakan parasetamol dan peak 2 merupakan kofein.Dilihat dari perbandingan waktu retensi standard dan sampel, terjadi perubahan yang cukup signifikan.Perubahan ini mungkin terjadi karena terjadi reaksi antara komponen sampel dengan campuran eluen yang didukung dengan kondisi sistem saat analisis.Reaksi tersebut mungkin menghasilkan produk yang secara struktur kimia berbeda dengan senyawa sampel yang selanjutnya berimplikasi pada perubahan waktu retensi.Selain itu ketidakstabilan temperature kolom meningkatkan viskositas eluent serta kelarutan senyawa dalam sampel.Perubahan viskositas eluent serta kelarutan senyawa sampel mendukung perubahan waktu retensi pada setiap kali analisis. Selain melakukan uji kualitatif terhadap sampel, dilakukan pula uji kuantitatif terhadap kadar komponen dalam sampel campuran. Penghitungan kadar dapat dilakukan dengan membandingkan luas area dibawah kurva pada komponen sampel terhadap luas area kurva pada standar, dikali dengan konsentrasi standar. Dengan cara tersebut, diperoleh kadar parasetamol pada sampel campuran sebesar 13,122 ppm dan kofein sebesar 16,252. Untuk memastikan tingkat kepercayaan analisis, perlu dilakukan uji validasi terhadap data hasil analisis.
KUANTITATIF A. Pembuatan seri standar Larutan induk 1000 ppm 1. Konsentrasi 4 ppm M1 X V1 = M2 X V2 100 ppm X V1 = 4 ppm X 5 mL V1 = 0,2 mL = 200 µL 2. Konsentrasi 6 ppm M1 X V1 = M2 X V2 100 ppm X V1 = 6 ppm X 5 mL V1 = 0,3 mL = 300 µL 3. Konsentrasi 8 ppm
M1 X V1 = M2 X V2 100 ppm X V1 = 8 ppm X 5 mL V1 = 0,4 mL = 400 µL 4. Konsentrasi 10 ppm M1 X V1 = M2 X V2 100 ppm X V1 = 10 ppm X 5 mL V1 = 0,5 mL = 500 µL 5. Konsentrasi 12 ppm M1 X V1 = M2 X V2 100 ppm X V1 = 12 ppm X 5 mL V1 = 0,6 mL = 600 µL Hasil Kromatogram 1. Optimasi Volume injection
: 10
Run time : 7 menit Panjang gelombang : 215 nm Dtektor : Uv-Vis Jenis kolom : Silika C18 Jenis pelarut : - Kalium dihidrogen fosfat 90% Methanol 4% Asetonitril 6% -
2. Uji Kualitatif (Data terlampir) a. Parasetamol Ret. Time (min) 1.63
Heig ht (MAU ) 27.94 2
Area MAU*min
Rel.Area %
Type
2.463
66.69
BMB
Heig ht (MAU ) 46.73 1
Area MAU*min
Rel.Area %
Type
9.372
74.91
BM
Heig ht (MAU ) 37.60 2 47.75 1
Area MAU*min
Rel.Area %
Type
3.232
15.89
M
15.231
74.89
MB
b. Kafein Ret. Time (min) 4.34 c. Campuran Ret. Time (min) 1.72 3.73
2. Uji Kuantitatif kadar Sampel yang beredar (Data Terlampir)
a. Persamaan linier Parasetamol dan Kafein Stand ar 1 2 3 4 5
Konsentra si (ppm) PC Kafei T n 10
6
12
8
14
10
16
12
18
14
Luas Area (mAU*min) PCT Kafei n 10.48 3.592 7 14.23 8.531 1 21.17 6.520 0 23.61 12.34 3 4 29.7 13.3 63 09
Plates PCT 256 8 198 6 242 9 269 6 234 7
Kafei n 3681 2405 4386 4450 415 3
Asym PCT 2,9 7 3,1 0 3,3 0 3,4 4 3,3 3
Resolusi
Kafei n 2,41
PCT 9,12
Cafeii n -
3,31
9.58
-
1,44
-
3,33
10,5 0 9,74
2,50
9,84
-
-
b. Penetapan kadar parasetamol (10 ppm) dalam Panadol® Diketahui : kadar pada etiket 500 mg Luas area mAU*min = y = 90,208 Persamaan regresi untuk parasetamol y = 2,3967x – 13,701 90.208 = 2,3967x – 13,701
Konsentrasi sebelum pengenceran pengenceran
= 43,355 ppm X faktor
= 43,355 ppm x = 21677,5 ppm
c. Penetapan kadar kafein (10 ppm) dalam Panadol® Diketahui : kadar pada etiket 65 mg Luas area mAU*min = y = 10,055 Persamaan regresi untuk kafein y = 1,1624 x – 2,7643 10,055 = 1,1624 x – 2,7643
Konsentrasi sebelum pengenceran pengenceran
= 11.0283 ppm X faktor
= 11.0283 ppm x
= 716,8395 ppm
d. Penetapan kadar parasetamol (14 ppm) dalam Bodrex® Diketahui : kadar pada etiket 600 mg Luas area mAU*min = y = 25,14 Persamaan regresi untuk parasetamol y = 2,3967x – 13,701 25,142 = 2396,7x - 13701
Konsentrasi sebelum pengenceran pengenceran
= 16,2069 ppm X faktor
= 16,2069 ppm x = 6945,814 ppm
e. Penetapan kadar kafein (10 ppm) dalam Bodrex® Diketahui : kadar pada etiket 50 mg Luas area mAU*min = y = 7,635 Persamaan regresi untuk kafein y = 1,1624 x – 2,7643 7,635 = 1,1624 x – 2,7643
Konsentrasi sebelum pengenceran pengenceran
= 8,9464 ppm X faktor
= 8,9464 ppm x = 447.32 ppm
Pembahasan
Pada praktikum kali ini, dilakukananalisis kuantitatif kadar paracetamol dan coffein pada sampel obat yang beredar yaitu Panadol® dan Bodrex® dengan instrument analisis HPLC. Sebelum masuk tahap pengujian terhadap kadar paracetamol dan coffein, dilakukan optimasi instrument analisis yang digunakan. HPLC/KCKT dioptimasi melalui studi literature analisis sampel campuran paracetamol dan coffein. Berdasarkan hasil studi,
ditentukan bahwa fase gerak yang digunakan adalah campuran KH 2PO4, metanol, dan asetonitril dengan perbandingan 90 ml: 6 ml : 4 ml. Sedangkan Okta Desil Silan (C18) digunakan sebagai fase diam.Detektor yang digunakan berupa detektor UV-Vis dengan pertimbangan bahwa senyawa yang dianalisis memiliki gugus kromofor. Panjang gelombang yang digunakan adalah 215 nm, suhu 27.30C-27.50C, dan volume alir 0,7 ml/menit. Penggunaan campuran eluen atau fase gerak yang sedemikian rupa merupakan hasil dari hasil uji peneliti lain terhadap campuran parasetamol dengan kofein. Dapar fosfat (KH2PO4) pH 4,5 digunakan karena kedua senyawa tersebut stabil dalam kondisi yang sedikit asam. Campuran metanol dengan asetontril akan mengkondisikan sistem eluen bersifat semi polar, hal tersebut terkait sifat kepolaran senyawa yang dianalisis. Parasetamol dan kofein bersifat semi polar karena mengandung gugus yang memiliki elektron bebas (sehingga bersifat polar), sekaligus memiliki struktur siklik yang bersifat nonpolar. Fase diam yang berupa okta desil silan (C18) bersifat nonpolar. Kombinasi dari sistem eluent dan adsorban (fase diam) akan menimbulkan proses tarik menarik solute pada sampel diantara keduanya sehubungan dengan kemiripan dari sifat kepolaran solute dengan eluent dan adsorben. Hasilnya berupa waktu retensi yang bersifat khas dari senyawa tertentu dalam solute terhadap sistem KCKT yang digunakan. Setelah instrument analisis dioptimasi, dilakukan praperlakuan terhadap sampel. Kedua jenis sampel digerus dalam lumpang yang berbeda, selanjutnya di larutkan dalam fase gerak sampai 100 mL. Selanjutnya disaring dengan penyaring mikro untuk meminimalisasi terbawanya esksipien yang tidak larut. Diprediksi bahwa kadar dalam larutan uji masih terlalu tinggi untuk dilakukan analisis kadarnya dengan HPLC/KCKT, dan sehingga diperlukan pengenceran. Prediksi kadar dilakukan dengan melihat komposisi sediaan yang tertera pada brosur. Rata-rata, kedua sediaan tersebut mengandung 500 mg parasetamol dan 50 mg kafein. Pengenceran dilakukan dengan menambah sejumlah larutan fase gerak pada sejumlah sampel uji. Karena kafein memiliki kadar yang paling kecil, maka pengenceran dilakukan dengan bertolak pada kadar kaffein pada sediaan. Sebelum dilakukan pengujan terhadap sampel, dibuat larutan standar dari komponen sampel tersebut. Metode analisis ini menggunakan kruva standar yang berisi campuran parasetamol dan kaffein dalam rentang tertentu. Digunakan larutan standar yang berisi campuran senyawa komponen sampel karena kemungkinan pergeseran waktu retensi dapat terjadi jika komponen standar dibuat dalam masig-masing larutan. Medium pelarut yang
digunakan untuk pembuatan standar adalah fase greak yang digunakan. Untuk meminimalisasi keikutsertaan pengotor saat analisis, standar disaring terlebih dahulu dengan penyaring mikro. Selanjutnya standar dianalisis menggunakan KCKT dengan sistem instrument yang telah dipersiapkan sebelumnya, untuk menentukan waktu retensi masingmasing senyawa. Waktu retensi akan menjadi acuan untuk menentukan identitas peak yang dihasilkan pada kromatogram hasil analisis sampel campuran. Dari hasil analisis larutan standar, dihasilkan bentuk kromatogram berbahu (shoulder) dengan sedikit tailing. Hal ini disebabkan oleh terlalu banyak pengotor yang ikutserta dalam proses analisis dengan KCKT. Dengan memplot luas area dibawah kurva pada masing-masing larutan standar sebagai y, dan konsentrasi yang dibuat sebagai x, didapatkan persamaan regresi linier untuk parasetamol y = 2.3967x - 13.701 dengan nilai R = 0.99217 dan koffein y = 1.1624x - 2.7643 dengan nilai R =
0.909945. Dapat dilihat dari nilai R bahwa kurva regresi linier untuk kaffein tidak terlalu linier. Kemudian dilakukan pengujian terhadap kedua larutan sampel pada HPLC/KCKT. Dari hasil pengujian, didapatkan luas area permukaan masing-masing komponen larutan uji. Dengan mensubstitusi luas area permukaan sebagai y pada masing-masing persamaan linier, maka didapat konsentrasi komponen tertentu dalam larutan. Lalu masing-masing kadar yang diperoleh dikalikan faktor pengenceran dan volume pengenceran awal untuk mengetahui jumlah masing-masing komponen. Diketahui dari larutan uji Panadol terdapat paracetamol 2167.75 mg dan koffein 71,683 mg, dan pada bodrex mengandung parasetamol 694,58 mg dan kaffein 44,732 mg. Setiap komponen hasil uji memiliki jumlah berbeda dengan yang tertera pada etiket. Hal ini mungkin terjadi karena masih terdapat pengotor yang ikut terbaca pada HPLC/KCKT. Untuk menguji kevalidan hasil analisis, maka dilakukan perhitungan terhadap % recovery. Dari hasil perhitungan, didapatkan % recovery PCT 2,219% dan kaffein 10,863%.Karena % recovery lebih dari 2%, maka disimpulkan bahwa hasil percobaan tidak valid.
Kesimpulan dan Saran
Kesimpulan Waktu retensi parasetamol pada sistem KCKT menurut percobaan kali ini adalah 1,63 menit dengan luas area di bawah kurva 2,463 mAU*menit, sedangkan waktu retensi kofein adalah 4,34 menit dengan luas area di bawah kurva 9,372 mAU*menit. Sementara itu waktu retensi yang dihasilkan pada sampel campuran adalah peak 1 adalah 1.72 menit dengan luas area di bawah kurva 3.232 (mAU*min) dan peak 2 adalah 3.73 (menit) dengan luas area dibawah kurva 15.231 (mAU*min), dengan bentuk kromatogram yang dihasilkan
adalah bentuk berbahu (shoulder) dengan sedikit tailing. Menurut kami peak 1 merupakan parasetamol dan peak 2 merupakan kofein. Sedangkan untuk uji kuantitatifnya, kadar parasetamol pada sampel campuran didapat sebesar 13,122 ppm dan kofein sebesar 16,252 ppm. Pada percobaan kali ini masih terdapat perbedaan waktu retensi standard yang diperoleh dengan waktu retensi sampel, hal ini kemungkinan terjadi karena adanya reaksi antara komponen sampel dengan campuran eluen yang didukung dengan kondisi sistem saat dilakukan analisis, selain itu ketidakstabilan temperature kolom juga dapat mempengaruhi waktu retensi, dan begitupula halnya dengan terjadinya human error.
Saran Lakukanlah pengoptimalan instrumen terlebih dahulu sebelum melakukan percobaan, dan lakukanlah percobaan secara hati-hati dan teliti untuk menghindari terjadinya human error.
Daftar Pustaka
Meyer, F.R., 2004, Practical High-Performance Liquid Chromatography, 4thEd., John Wiley &
Sons, New York. Kealey, D and Haines, P.J., 2002, Instant Notes: Analytical Chemistry, BIOS Scientific Publishers Limited, New York.
Sani Ali, Audu. et all 2012. Analysis of Different Brands of Paracetamol 500mg Tablets Used In Maiduguri,. Using Ultra Violet Spectrophotometric and High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Methods. Nigeria ; IRJP Tjay, T.H. 2000. Obat-obat Penting. Edisi kelima. Cetakan Pertama.
Jakarta ; PT. Elex Media Computindo Anonim, 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV. Jakarta ; Departemen Kesehatan Republik Indonesia
