LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI UMUM
PENGUKURAN DAN PERHITUNGAN SEL PEMBUIAKAN DAN PERTUMBUHAN MIKROORGANISME
Oleh : MELYSA NUR FAJRIN 0910910010 5 (Lima)
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2011
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Seluruh organisme melakukan reproduksi, termasuk mikroba. Mikroba biasanya bereproduksi dengan cara pembelahan biner, dan beberapa jenis yang lain dengan cara budding (Ingraham dan Ingraham, 2004). Pertumbuhan mikroba didefinisikan sebagai peningkatan jumlah sel akibat pembelahan biner menjadi dua individu (Black, 2005). Pertumbuhan bakteri dapat dimanipulasi dan dikendalikan dengan berbagai cara yang memudahkan untuk menyelidiki fenomena dasar yang berkaitan dengan proses-proses kehidupan. Sel dapat dipelajari dalam usaha untuk mengkorelasikan substansi yang disintesis selama pertumbuhan. Pertumbuhan bakteri juga dapat dijadikan acuan untuk penilaian memadai tidaknya suatu medium tertentu untuk menunjang pertumbuhan (Pelczar dan Chan, 2005). Menurut Benson (2002), perhitungan langsung dapat dilakukan dengan Haemocytometer yang berfungsi untuk perhitungan sel darah merah, perhitungan bakteri dalam seluler vaccines. Perhitungan secara tidak langsung berupa turbiditas yang diaplikasikan dalam mengestimasikan bakteri dalam jumlah besar pada media broth dann media cair jernih.Praktikum tentang pertumbuhan mikroba penting dilakukan untuk dapat menentukan medium yang memadai untuk menumbuhkan mikroba tertentu dan digunakan untuk dasar aspek produksi substansi yang dihasilkan oleh mikroba, misalnya fermentasi.
1.2 Rumusan Masalah Permasalahan yang akan dipecahkan dalam praktikum ini adalah :
Bagaimana fase-fase pertumbuhan bakteri atau khamir dalam sistem fermentasi tertutup?
Bagaimana cara menghitung secara langsung jumlah sel bakteri menggunakan Hemositometer.
1.3 Tujuan Praktikum ini bertujuan untuk :
Mengetahui fase-fase pertumbuhan bakteri atau khamir dalam sistem fermentasi tertutup.
Menghitung secara langsung jumlah sel bakteri menggunakan Hemositometer.
1.4 Manfaat Manfaat praktikum ini adalah dapat menilai memadai tidaknya suatu medium bagi suatu mikroba tertentu dan pengetahuan tentang fase pertumbuhan dapat digunakan dalam produksi barang yang melibatkan bantuan mikroba serta pencegahan atau pengobatan terhadap suatu penyakit yang disebabkan oleh mikroba.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
Metode pengukuran massa sel terdiri atas dua teknik, yaitu teknik secara langsung dan teknik secara tidak langsung. Metode tersebut meliputi pengukuran fisika secara tidak langsung dari berat kering, berat basah, atau volume sel setelah disentrifugasi. Pengukuran kimia secara langsung dari beberapa komponen kimia sel antara lain total nitrogen, total protein, atau total kandungan DNA. Pengukuran aktivitas kimia secara tidak langsung meliputi laju hasil dan penggunaan oksigen, pengukuran turbiditas untuk mendeterminasi jumlah dan dihamburkannya cahaya oleh suspensi sel. Teknik pengukuran meliputi perhitungan sel secara visual atau menggunakan alat dan perhitungan sel secara tidak langsung (Atlas, 1989). Menurut Benson (2002), perhitungan langsung dapat dilakukan dengan Haemocytometer yang berfungsi untuk perhitungan sel darah merah, perhitungan bakteri dalam seluler vaccines. Perhitungan secara tidak langsung berupa turbiditas yang diaplikasikan dalam mengestimasikan bakteri dalam jumlah besar pada media broth dann media cair jernih. Cara lain yang digunakan untuk menentukan jumlah sel adalah dengan menyaring suatu sampel dengan suatu saringan membran. Saringan tersebut diinkubasi pada permukaan media yang sesuai. Mikroorganisme yang tertahan pada permukaan saringan menyerap nitrisi dari media dan menghasilkan koloni. Koloni-koloni tersebut berasal dari satu sel tunggal yang dapat hidup dengan baik (Hadioetomo, 1990). Total Cell Count merupakan metode perhitungan langsung sel bakteri dengan meletakkan suspensi sel bakteri ke dalam alat khusus yang disebut Haemocytometer. Alat ini terdiri atas beberapa kotak yang telah diketahui luas dan volumenya. Sel yang dilihat dan dihitung dengan mikroskop adalah sel yang terletak di dalam kotaak sehingga dapat diketahui jumlah sel setiap volume Haemocytometer. Hasil yang diperoleh dikonversi ke dalam satuan jumlah sel permililiter suspensi. Metode ini relatif cepat, namun mempunyai kekurangan antara lain tidak digunakan untuk mengamati sel yang berukuran sangat kecil, tingkat validitas yang rendah, dan sulit untuk membedakan antara sel hidup dengan sel yang mati (Mardigan, et al, 2003) Seperti organisme yang lainnya, mikroba pun juga memiliki kespesifikan lingkungan, nutrisi dalam pertumbuhannya. Oleh karena itu ada beberapa karakteristik atau persyaratan dalam menunjang pertumbuhan mikroba seperti yang terangkum dalam tabel di bawah ini (Lim, 2002) : Tabel 1. Klasifikasi Media Pertumbuhan Mikrobial KLASIFIKASI NAMA/SEBUTAN CONTOH Sumber Nutrien Alamiah Susu, kaldu Buatan/Artifisial Campuran zat kimia Keadaan Fisik Padat-Ireversibel Serum darah terkoagulasi Padat-Reversibel Agar nutrien
Komponen Kimiawi penyusun
Persyaratan nutrisi bakteri
Setengah padat Cair Kompleks (komposisi “unknown”) Kimiawi-Sintetik (komposisi “known”) Enrichment Media (media diperkaya) Differential media (Media diferensial) Selected Media (media terpilih) Test Media (media uji)
Agar lunak Kaldu nutrien Agar nutrien Amonium sulfat, medium garam, glukosa. Kaldu Infusi Jantung Agar Eosin-biru metilen Agar deoksikolat Media uji Vit B12
Keterangan : 1. Ireversibel yaitu sifat yang tidak dapat kembali lagi ke fase semula. Contohnya darah yang telah berkoagulasi (menggumpal) tidak dapat lagi kembali menjadi darah cair. 2. Reversibel yaitu sifat yang dapat kembali ke fase semula setelah perubahannya. Contohnya agar yang dapat memadat apabila didinginkan dan dapat mencair kembali apabila dipanaskan lagi. 3. Enrichment Media yaitu media yang dapat menunjang pertumbuhan bakteri yang memiliki persyaratan untuk tumbuh yang rumit. Bakteri ini tidak dapat tumbuh pada media biasa karena membutuhkan beberapa nutrisi khusus yang dapat menyokong pertumbuhannya. 4. Differential Media yaitu media yang digunakan untuk membedakan bentuk dan karakter koloni bakteri yang tumbuh. Beberapa bakteri dapat tumbuh di dalam media ini, maka hanya beberapa jenis saja yang memiliki pertumbuhan yang khas. Media ini berguna untuk isolasi dan identifikasi bakteri. 5.
Selected Media yaitu media pertumbuhan yang terpilih dan khusus, maksudnya media ini dapat menghambat pertumbuhan tipe mikroba lain namun membiarkan tipe mikroba lain dapat tumbuh. Media ini sangat berguna untuk identifikasi.
6. Test Media yaitu media yang digunakan untuk mengukur secara kuantitatif suatu vitamin maupun antibiotik Ada beberapa jenis media yang langsung digunakan instant karena sudah tersedia dalam bentuk serbuk, seperti Plate Count Agar (Merck), Nutrient Agar Dehydrated (Dafco Laboratories), Tryptic Soy Broth (Merck), Tryptic Soy Agar (Merck), BactoTM Peptone (Difco-Becton Dickinson) (Rachdie, 2008). Keberhasilan dalam menumbuhkan mikroorganisme tergantung dari pemenuhan kebutuhan dasarnya kemudian memformulasikan suatu medium atau bahan yang akan digunakan. Air sangat penting bagi organisme bersel tunggal sebagai komponen utama protoplasmanya serta untuk masuknya nutrien ke dalam sel. Air sadah atau air suling umumnya mengandung ion kalsium dan magnesium yang tinggi. Pada medium yang mengandung pepton dan ektrak daging, air dengan kualitas air sadah sudah dapat menyebabkan terbentuknya endapan fosfat dan magnesium fosfat (Hadioetomo, 1993).
Formulasi suatu medium atau bahan yang akan digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme di dalamnya harus memperhatikan berbagai factor, yaitu kebutuhan air
untuk
organisme bersel tunggal yang merupakan komponen penting protoplasmanya serta sebagai media masuknya nutrien ke dalam sel. Pembuatan medium agar padat pada umumnya menggunakan agaragar, gelatin atau gel silika. Bahan agar yang utama adalah galaktan (komplek karbohidrat yang diekstrak dari alga genus Gelidium). Agar akan larut atau cair pada suhu hampir 100oC dan akan cair apabila kurang lebih 43oC (Hadioetomo, 1993). Menurut Schlegel (1993) agar merupakan media tumbuh yang ideal yang diperkenalkan melalui metode Bacteriaological. Pertumbuhan bakteri selain memerlukan nutrisi, juga memerlukan pH yang tepat. Pada umumnya bakteri tidak dapat tumbuh pada kondisi yang terlalu basa, kecuali Vibrio cholerae yang dapat hidup pada pH lebih dari 8. Suhu juga merupakan variabel yang perlu dikendalikan. Kelompok terbesar yaitu mesofil, suhu optimum untuk pertumbuhannya 20-40oC (Hadioetomo, 1993). Kemampuan mikroorganisme untuk tumbuh dan tetap hidup merupakan suatu hal yang penting untuk diketahui. Pengetahuan tentang faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan mikroba sangat penting di dalam mengendalikan mikroba. Berikut ini faktor-faktor penting yang mempengaruhi pertumbuhan mikroba : a. Suplai Nutrisi Mikroba sama dengan makhluk hidup lainnya, memerlukan suplai nutrisi sebagai sumber energi dan pertumbuhan selnya. Unsur-unsur dasar tersebut adalah : karbon, nitrogen, hidrogen, oksigen, sulfur, fosfor, zat besi dan sejumlah kecil logam lainnya. Ketiadaan atau kekurangan sumber-sumber nutrisi ini dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroba hingga pada akhirnya dapat menyebabkan kematian. Kondisi tidak bersih dan higinis pada lingkungan adalah kondisi yang menyediakan sumber nutrisi bagi pertumbuhan mikroba sehingga mikroba dapat tumbuh berkembang di lingkungan seperti ini. Oleh karena itu, prinsip daripada menciptakan lingkungan bersih dan higinis adalah untuk mengeliminir dan meminimalisir sumber nutrisi bagi mikroba agar pertumbuhannya terkendali (Dhanang, 2008). b. Suhu Suhu merupakan salah satu faktor penting di dalam mempengaruhi dan pertumbuhan mikroorganisme. Suhu dapat mempengaruhi mikroba dalam dua cara yang berlawanan (Dhanang, 2008): 1)
:
Apabila suhu naik maka kecepatan metabolisme naik dan pertumbuhan dipercepat. Sebaliknya apabila suhu turun, maka kecepatan metabolisme akan menurun dan pertumbuhan diperlambat.
2)
Apabila suhu naik atau turun secara drastis, tingkat pertumbuhan akan terhenti, kompenen sel menjadi tidak aktif dan rusak, sehingga sel-sel menjadi mati.
Berdasarkan hal di atas, maka suhu yang berkaitan dengan pertumbuhan mikroorganisme digolongkan menjadi tiga, yaitu (Dhanang.2008):. 1) Suhu minimum yaitu suhu yang apabila berada di bawahnya maka pertumbuhan terhenti. 2)
Suhu optimum yaitu suhu dimana pertumbuhan berlangsung paling cepat dan optimum. (Disebut juga suhu inkubasi)
3) Suhu maksimum yaitu suhu yang apabila berada di atasnya maka pertumbuhan tidak terjadi. Tabel 2. Penggolongan Bakteri Berdasarkan Ketahanan Terhadap Suhu (Massofa. 2008) Kelompok Psikrofil Psikrotrof Mesofil Thermofil Thermotrof
Suhu Minimum - 15o C. - 1o C. 5 – 10o C. 40o C. 15o C.
Suhu Optimum 10o C. 25o C. 30 – 37o C. 45 – 55o C. 42 – 46o C.
Suhu Maksimum 20o C. 35o C. 40o C. 60 – 80o C. 50o C.
Selain itu ada pula pengelompokan bakteri berdasarkan ketahanannya pada panas yaitu : 1)
Peka terhadap panas, apabila semua sel rusak apabila dipanaskan pada suhu 60oC selama 10-20 menit.
2) Tahan terhadap panas, apabila dibutuhkan suhu 100oC selama 10 menit untuk mematikan sel. 3)
Thermodurik, dimana dibutuhkan suhu lebih dari 60oC selama 10-20 menit tapi kurang dari 100oC selama 10 menit untuk mematikan sel.
c. Derajat Keasaman Setiap organisme memiliki kisaran pH masing-masing dan memiliki pH optimum yang berbedabeda. Pada umumnya mikroorganisme dapat tumbuh pada kisaran ph 8,0 – 8,0 dan nilai pH di luar kisaran 2,0 sampai 10,0 biasanya bersifat merusak (Dhanang, 2008).
d. Ketersediaan Oksigen Mikroorganisme memiliki karakteristik sendiri-sendiri di dalam kebutuhannya akan oksigen. Ada beberapa organisme yang digolongkan sebagai aerobic fakultatif, anaerobic fakultatif dan aerobic obligat (Dhanang, 2008). Kurva pertumbuhan bakteri sangat penting untuk menggambarkan karakteristik pertumbuhan bakteri, sehingga akan mempermudah di dalam kultivasi (menumbuhkan) bakteri ke dalam suatu media, penyimpanan kultivasi dan penggantian media (Massofa, 2008).
Gambar 3. Kurva Perumbuhan Bakteri (Massofa. 2008) Ada empat fase pada pertumbuhan bakteri sebagaimana tampak pada kurva, yaitu : Tabel 4. Ciri dan Fase pada Kurva Pertumbuhan (Massofa. 2008) Fase Pertumbuhan Lag (lambat)
Ciri Tidak ada pertumbuhan populasi karena sel mengalami perubahan komposisi kimiawi dan ukuran serta bertambahnya substansi intraseluler sehingga siap untuk membelah diri.
Logaritma atau eksponensial
Sel membela diri dengan laju yang konstan, massa menjadi dua kali lipat, keadaan pertumbuhan seimbang.
Stationary (stasioner/tetap)
Terjadinya penumpukan racun akibat metabolisme sel dan kandungan nutrien mulai habis, akibatnya terjadi kompetisi nutrisi sehingga beberapa sel mati dan lainnya tetap tumbuh. Jumlah sel menjadi konstan.
Death (kematian)
Sel menjadi mati akibat penumpukan racun dan habisnya nutrisi, menyebabkan jumlah sel yang mati lebih banyak sehingga mengalami penurunan jumlah sel secara eksponensial.
Pertumbuhan dapat diamati dari meningkatnya jumlah sel atau massa sel (berat kering sel). Pada umumnya bakteri dapat memperbanyak diri dengan pembelahan biner,yaitu dari satu sel membelah menjadi 2 sel baru, maka pertumbuhan dapat diukur dari bertambahnya jumlah sel. Waktu yang diperlukan untuk membelah diri dari satu sel menjadi dua sel sempurna disebut waktu generasi. Waktu yang diperlukan oleh sejumlah sel atau massa sel menjadi dua kali jumlah/massa sel semula disebut doubling time atau waktu penggandaan. Waktu penggandaan tidak sama antara berbagai mikrobia, dari
beberapa menit, beberapa jam sampai beberapa hari tergantung kecepatan pertumbuhannya. Kecepatan pertumbuhan merupakan perubahan jumlah atau massa sel per unit waktu (Sumarsih, 2003). Usaha pengendalian mikroorganisme dapat dilaksanakan apabila faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan atau perkembangbiakan mikroorganisme telah diketahui sebelumnya. Faktor-faktor yang mempengaruhi tersebut umumnya dibagi ke dalam lima bahasan yaitu (Yudhabuntara, 2003) :
Faktor intrinsik
Faktor intrinsik meliputi pH, aktivitas air (activity of water, aw), kemampuan mengoksidasireduksi (redoxpotential, Eh), kandungan nutrien, bahan antimikroba dan struktur bahan makanan. Ukuran keasaman atau pH adalah log10 konsentrasi ion hidrogen. Lazimnya bakteri tumbuh pada pH sekitar netral (6,5 – 7,5) sedangkan kapang dan ragi pada pH 4,0-6,5. Aktivitas air (aw) adalah jumlah air yang tersedia untuk pertumbuhan mikrobia dalam pangan. Kemampuan mengoksidasi-reduksi (redoxpotential, Eh) adalah perbandingan total daya mengoksidasi (menerima elektron) dengan daya mereduksi (memberi elektron). Pertumbuhan mikroorganisme memerlukan air, energi, nitrogen, vitamin dan faktor pertumbuhan, mineral. Air yang tersedia untuk pertumbuhan mikroorganisme ditentukan oleh aw bahan makanan. Sebagai sumber energi, mikroorganisme memanfaatkan karbohidrat, alkohol dan asam amino yang terdapat dalam bahan makanan. Faktor pertumbuhan yang diperlukan adalah asam amino, purin dan pirimidin, serta vitamin. Struktur bahan makanan yang dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroorganisme misalnya lemak karkas dan kulit pada karkas unggas dan karkas babi dapat melindungi daging dari kontaminasi mikroorganisme.
Faktor ekstrinsik,
Faktor ekstrinsik yang mempengaruhi pertumbuhan mikroorganisme adalah suhu penyimpanan dan faktor luar lainnya yang pada prinsipnya berhubungan dengan pengaruh atmosferik seperti kelembaban, tekanan gas/keberadaan gas, juga cahaya dan pengaruh sinar ultraviolet.
Faktor proses,
Semua proses teknologi pengolahan bahan makanan mengubah lingkungan mikro bahan makanan tersebut. Proses tersebut dapat berupa pemanasan, pengeringan, modifikasi pH, penggaraman, curing, pengasapan, iradiasi, tekanan tinggi, pemakaian medan listrik dan pemberian bahan imbuhan pangan.
Faktor implicit
Faktor lain yang berperan adalah faktor implisit yaitu adanya sinergisme atau antagonisme di antara mikroorganisme yang ada dalam “lingkungan” bahan makanan. Ketika mikroorganisme tumbuh pada bahan makanan dia akan bersaing untuk memperoleh ruang dan nutrien. Dengan demikian akan terjadi interaksi di antara mikroorganisme yang berbeda. Interaksi ini dapat saling mendukung maupun saling menghambat (terjadi sinergisme atau antagonisme). Bakteri merupakan organisme kosmopolit yang dapat kita jumpai di berbagai tempat dengan berbagai kondisi di alam ini. Mulai dari padang pasir yang panas, sampai kutub utara yang beku kita masih dapat menjumpai bakteri. Namun bakteri
juga memiliki batasan suhu tertentu dia bisa tetap bertahan hidup, ada tiga jenis bakteri berdasarkan tingkat toleransinya terhadap suhu lingkungannya: 1. Mikroorganisme psikrofil yaitu mikroorganisme yang suka hidup pada suhu yang dingin, dapat tumbuh paling baik pada suhu optimum dibawah 20oC. 2. Mikroorganisme mesofil, yaitu mikroorganisme yang dapat hidup secara maksimal pada suhu yang sedang, mempunyai suhu optimum di antara 20oC sampai 50oC. 3. Mikroorganisme termofil, yaitu mikroorganisme yang tumbuh optimal atau suka pada suhu yang tinggi, mikroorganisme ini sering tumbuh pada suhu diatas 40oC, bakteri jenis ini dapat hidup di tempat-tempat yang panas bahkan di sumber-sumber mata air panas bakteri tipe ini dapat ditemukan, pada tahun 1967 di yellow stone park ditemukan bakteri yang hidup dalam sumber air panas bersuhu 93-94oC.
Dalam pertumbuhannya bakteri memiliki suhu optimum dimana pada suihu tersebut pertumbuhan bakteri menjadi maksimal. Dengan membuat grafik pertumbuhan suatu mikroorganisme, maka dapat dilihat bahwa suhu optimum biasanya dekat puncak range suhu. Di atas suhu ini kecepatan tumbuh mikroorganisme akan berkurang. diperlukan suatu metode. Metode pengukuran pertumbuhan yang sering digunakan adalah dengan menentukan jumlah sel yang hidup dengan jalan menghitung koloni pada pelat agar dan menentukan jumlah total sel/jumlah massa sel. Selain itu dapat dilakukan dengan cara metode langsung dan metode tidak langsung. Dalam menentukan jumlah sel yang hidup dapat dilakukan penghitungan langsung sel secara mikroskopik, melalui 3 jenis metode yaitu metode: pelat sebar, pelat tuang dan most-probable number (MPN). Sedang untuk menentukan jumlah total sel dapat menggunakan alat yang khusus yaitu bejana Petrof-Hausser atau hemositometer. Penentuan jumlah total sel juga dapat dilakukan dengan metode turbidimetri yang menentukan: Volume sel mampat, berat sel, besarnya sel atau koloni, dan satu atau lebih produk metabolit. Penentuan kuantitatif metabolit ini dapat dilakukan dengan metode Kjeldahl (Iqbalali, 2008).
BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Praktikum mikrobiologi umum dengan topik “Pengukuran dan Perhitungan Sel, Pembiakan dan Pertumbuhan Mikroorganisme” ini dilaksanakan pada hari Rabu tanggal 6 sampai 11 Mei 2011, bertempat di Laboratorium Mikrobiologi, jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang.
3.2 Cara Kerja
3.2.1. Pembuatan Kurva Standar Pembuatan kurva standar diawali dengan membuat perbandingan antara kultur bakteri dari stock inokulum dengan larutan pengencer, pada praktikum ini digunakan perbandingan komposisi kultur bakteri dan media steril sebagai berikut: Tabel 5. Perbandingan komposisi kultur bakteri dan media steril Perbandingan
Inokulum (ml)
Media Steril (ml)
1:0
5
0
1:1
2,5
2,5
1:2
1,7
3,3
1:3
1,3
3,7
1:4
1
4
1:5
0,8
4,2
1: 6
0,7
4,3
1:7
0,6
4,4
∑
15
25
Suspensi kultur dengan perbandingan komposisi masing-masing dimasukkan ke dalam botol film, kemudian dilakukan penghitungan jumlah sel dengan menggunakan hemositometer. Perhitungan sel dengan menggunakan hemositometer dilakukan dengan cara sebagai berikut: permukaan hemositometer dibersihkan dengan kertas lensa yang telah dibasahi dengan alkohol 70%. Kaca penutup diletakkan dengan hati-hati di atas permukaan hemositometer. Hemositometer diamati menggunakan mikroskop pada perbesaran 400x untuk menentukan kotak-kotak di dalam hemositometer. Suspensi sel bakteri diambil dengan menggunakan mikropipet dan ditaruh ujung pipet pada tepi kaca penutup disisi ruang hitung. Suspensi bakteri selanjutnya dialirkan secara perlahan sampai memenuhi seluruh ruang hitung dan diamati dengan menggunakan mikroskop pada perbesaran 400x dan jumlah sel dihitung pada masing-masing lima kotak medium untuk mendapatkan rata-rata jumlah sel dalam setiap kotak. Lima kotak medium tersebut adalah empat kotak di pojok kotak kotak besar dan satu kotak medium di tengah kotak besar. Jumlah sel dapat ditentukan dengan menggunakan rumus : Jumlah sel yang terhitung x Faktor pengencer Jumlah kotak medium yang diamati x 4 x 10-6 cm3 Selain dilakukan perhitungan jumlah sel dengan menggunakan hemasitometer, dilakukan pula pengukuran Optical Density (OD) dengan menggunakan spektrofotometer. Setelah didapatkan jumlah sel dan nilai OD dari masing-masing suspensi kultur, kemudian dibuat kurva regresi linear hubungan
antara jumlah sel (sebagai sumbu x) dan nilai OD (sebagai sumbu y) sebagai kurva standar dari isolat serta ditentukan nilai regresi linear (r) dan persamaan regresinya. 3.2.2. Perhitungan Sel dengan Hemositometer Permukaan Hemositometer dibersihkan menggunakan kertas lensa yang telah dibasahi sebelumnya dengan akuades. Kaca penutup diletakkan dengan hati-hati di atas permukaan Hemositometer. Suspensi biakan diambil dengan menggunakan pipet tetes secukupnya, lalu ujung pipet tetes yang telah berisi suspensi biakan diletakkan pada tepi kaca penutup di sisi ruang hitung dan dialirkan suspensi secara perlahan hingga memenuhi seluruh ruang hitung. Hemositometer diamati dengan menggunakan mikroskop perbesaran 400 X. Jumlah sel yang ada pada 5 kotak medium dihitung dengan bantuan handy taller. Namun jumlah sel juga dapat ditentukan dengan menggunakan rumus : Jumlah sel yang terhitung Jumlah kotak medium yang diamati x Volume per kotak (cm3) 3.3.3. Pengukuran Nilai Absorbansi Massa Sel dengan Spektrofotometri Setiap jam pengamatan, diambil sebanyak 5ml suspensi kultur yang dimasukkan kedalam botol film. Selanjutnya Suspensi larutan stock serial dilusi dihitung nilai Optical Density (OD) nya dengan spektrofotometer. Ukur nilai absorbansi pada panjang gelombang tertentu dengan menekan tombol pada alat spektofotometer. Jumlah sel dihitung dari nilai persamaan regresi linier kurva standart yang dibuat. Langkah terakhir yaitu digambar bentuk kurva dan ditentukan waktu generasi dan fase logaritmiknya. 3.3.4. Pengukuran Sel Mikroba Pengukuran sel mikrobia dilakukan dengan menggunakan mikrometer obyektif dan mikrometer okuler yang diamati pada perbesaran sedang. Pengamatan dilakukan dengan mengkalibrasikan mikrometer terlebih dahulu. Kalibrasi dilakukan dengan mensejajarkan skala mikrometer okuler dan mikrometer objektif sehingga dapat diketahui berapa skala kalibrasi diantara dua garis himpit yang dihasilkan dari kedua mikrometer. Setelah itu diganti mikrometer obyektif dengan preparat, kemudian diamati ukuran sel dalam proparat dan ditentukan ukuran mikroba berdasarkan skala mikrometer okuler. Pengukuran mikrobia yang sebenarnya dapat ditentukan dengan mengkalikan nilai ukuran hasil kalibrasi mikrometer objektif dengan mikrometer okuler dengan ukuran mikrobia yang diamati dibawah mikroskop berdasarkan ukuran mikrometer okuler.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Analisis Prosedur Kurva Pertumbuhan menggunakan isolat bakteri bertujuan untuk membandingkan kurva pertumbuhan kedua bakteri tersebut. Pembuatan starter bertujuan sebagai awal pembuatan media yang akan diambil untuk pembuatan stok inokulum. Pembuatan stok bertujuan sebagai persediaan dalam pembuatan kurva pertumbuhan dan kurva standar. Stok diambil 10 % dari volume stok total karena volume maksimal stok inokulum yang biasa digunakan adalah 10-15 % dari volume total, apabila lebih dari 10 % sel yang tua lebih banyak. Pembuatan fermentor dengan volume stok 10 % dari volume fermentor total bertujuan untuk mengetahui volume stok yang dibutuhkan dalam pembuatan kurva pertumbuhan. Isolat Bakteri Bacillus subtilis dan AK3 digunakan karena kedua jenis bakteri ini dapat tumbuh dalam waktu yang cepat sehingga dapat diamati fase-fase pertumbuhan dan dihitung jumlah selnya. Media steril digunakan karena merupakan media cair steril yang cocok untuk kultur bakteri. 1 oose isolat diinokulasikan ke dalam media steril untuk menumbuhkan bakteri, setelah itu diinkubasi selama 24 jam. Setelah bakteri ditumbuhkan dalam media steril, diambil 5 ml (10% dari stok starter yang akan dibentuk) dituangkan dalam larutan steril lain dengan volume 45 ml untuk membentuk starter sebanyak 50 ml. Starter dikocok dengan menggunakan shaker dengan putaran 120 rpm, pada suhu 30°C dan diinkubasi selama 24 jam agar terbentuk suspensi kultur yang homogen dan dibuat perbandingan (1 : 0, 1 : 1, 1 : 2. 1 : 3, 1 : 4, 1 : 5, 1 : 6, 1 : 7) antara kultur bakteri dari stock inokulum dengan larutan pengencer (media Steril). Pengenceran dilakukan agar suspensi kultur semakin encer sehingga jumlah sel pada setiap pengenceran mudah dihitung dengan menggunakan hemasitometer dan didapatkan jumlah sel yang benar-benar akurat, di mana jumlah sel tersebut dapat dipantau dari nilai absorbansinya . Perhitungan jumlah sel bakteri dilakukan dengan dimasukkan 1 ml suspensi kultur bakteri ke dalam botol film dan ditambahkan 9 ml larutan pengencer untuk didapatkan 10x pengenceran. Selanjutnya dari pengenceran pertama diambil 1 ml dan dimasukkan dalam botol film dan ditambahkan 9 ml larutan pengencer untuk didapatkan pengenceran 102. Pengenceran dilakukan hingga 107. Setiap pengenceran dilakukan penghitungan dengan hemositometer. Hemasitometer digunakan untuk menghitung jumlah sel karena praktis (tidak memerlukan banyak peralatan) dan pelaksanaannya cepat. Permukaan hemositometer dibersihkan dengan kertas lensa yang telah dibasahi dengan alkohol 70% untuk menghilangkan kotoran yang dapat mengganggu pengamatan. Suspensi bakteri dihitung jumlah sel mendapatkan gambaran keadaan jumlah sel yang sebenarnya. Suspensi bakteri selanjutnya dialirkan secara perlahan agar suspensi bakteri memenuhi ruang kotak dalam hemositometer sehingga jumlah sel yang dihitung representatif. Hemositometer diamati menggunakan
mikroskop pada perbesaran 400x karena pengamatan hanya bertujuan untuk menghitung jumlah sel, bukan mengamati struktur selnya. Spektrofotometer digunakan untuk mengukur Optical Density (OD) karena sel bakteri dapat menyerap cahaya, sehingga jika semakin banyak cahaya spektrofotometer yang diserap maka semakin tinggi nilai OD, yang berarti semakin banyak jumlah sel bakteri tersebut. Setelah didapatkan jumlah sel dan nilai OD, kemudian dibuat kurva regresi linear hubungan antara jumlah sel (sebagai sumbu x) dan nilai OD (sebagai sumbu y) sebagai kurva standar, serta ditentukan nilai regresi linear (r) dan persamaan regresinya. Pembuatan kurva standar bertujuan sebagai acuan untuk kurva pertumbuhan, karena persamaan regresi pada kurva standar dapat digunakan untuk menghitung jumlah sel pada kurva pertumbuhan. Nilai regresi linear (r) yang semakin mendekati 1 menunjukkan bahwa kurva tersebut semakin valid. Pembuatan kurva pertumbuhan dimulai dengan membuat fermentor yang komposisinya adalah 15 ml stock starter inokulum disuspensikan dalam 135 ml media steril untuk menghasilkan stock fermentor sebanyak 150. Pembuatan fermentor bertujuan untuk mengencerkan suspensi kultur dari stock sehingga dapat diukur nilai OD-nya (nilai OD tidak terlalu besar), serta agar didapatkan suspensi kultur yang keadaan awalnya seragam sehingga pertumbuhan sel yang terjadi dapat dipantau melaui nilai OD. semakin besar jumlah sel maka nilai OD semakin tinggi dan sebaliknya semakin kecil jumlah sel maka nilai OD yang dihasilkan akan semakin rendah (Mardigan, 2003). Penghitungan OD stock fermentor dilakukan dengan dimasukkannya 5 ml stock fermentor tiap jam dari jam ke-0 hingga jam ke-24. Setiap kali setelah melakukan sampling, hasil sampling diletakkan didalam freezer agar tidak terjadi pertumbuhan bakteri, sedangkan sisanya diletakkan dalam shaker dengan putaran 120 rpm, pada suhu 30°C agar suspensi kultur keadaannya homogen. Penghitungan OD baru dilakukan saat semua sampling/jamnya telah selesai. Hal ini dikarenakan agar penghitungan OD lebih praktis. Pembuatan kurva regresi linear hubungan antara waktu (jam) dan nilai OD (nm) sebagai kurva pertumbuhan bertujuan untuk mengetahui fase logaritmik pertumbuhan bakteri dan agar jumlah sel pada setiap waktunya dapat dihitung dari persamaan regresi linear kurva standar. Pengukuran sel mikrobia dilakukan dengan menggunakan mikrometer obyektif dan mikrometer okuler yang diamati pada perbesaran sedang. Pengamatan dilakukan dengan mengkalibrasikan mikrometer terlebih dahulu. Kalibrasi dilakukan agar mengetahui ukuran mikrobia yang diamati dengan benar, sehingga datanya bisa lebih valid. Kalibrasi dilakukan dengan mensejajarkan skala mikrometer okuler dan mikrometer objektif sehingga dapat diketahui berapa skala kalibrasi diantara dua garis himpit yang dihasilkan dari kedua mikrometer. Pengukuran mikrobia dilakukan dengan mengganti mikrometer obyektif dengan preparat. Pengukuran mikrobia yang sebenarnya dapat ditentukan dengan mengkalikan nilai ukuran hasil kalibrasi mikrometer objektif dengan mikrometer okuler dengan ukuran mikrobia yang diamati dibawah mikroskop berdasarkan ukuran mikrometer okuler.
4.2 Analisis Hasil Pengamatan dilakukan pada isolat Bacillus subtilis dan AK3 dengan menggunakan Kurva Standart (KS) dan Kurva Pertumbuhan (KP) dapat dilakukan melalui metode pengukuran dan perhitungan secara langsung (haemocytometer). Pengukuran ini dilakukan dengan melakukan penghitungan jumlah sel bakteri yang terdapat pada kotak haemocytometer. Haemocytometer memiliki 25 kotak kecil, 16 kotak sedang, dan 9 kotak besar, dengan volume yang berbeda-beda, yaitu : Kotak kecil
: 2,5. 10-9 mL
Kotak sedang
: 4. 10-6 mL
Kotak besar
: 10-4 mL
Perhitungan jumlah sel dalam setiap suspensi dengan menggunakan rumus sebagai berikut: ∑ sel/ml = ∑ sel x Faktor Pengenceran ∑ Kotak x 4. 10-6 Rumus diatas dapat digunakan untuk ditentukan jumlah sel setiap satu mililiter. Selain menghitung jumlah bakteri, dilakukan juga pengukuran nilai absorbansi setiap suspensi masingmasing perbandingan. Nilai absorbansi dan perhitungan jumlah sel/mL dapat dijadikan kurva standart untuk mengestimasi jumlah sel pada nilai absorbansi atau pada kerapatan tertentu. Pembuatan kurva standart penting untuk dilakukan karena merupakan acuan untuk dapat membaca nilai pada kurva pertumbuhan. Kurva standart dapat berisi data mengenai jumlah dan massa sel, untuk estimasi parameterparameter tersebut berasal dari pembacaan turbiditas (OD). Pembuatan kurva standart akan memudahkan dalam pembuatan kurva pertumbuhan. Kurva standart menunjukkan hubungan yang berbanding lurus antara jumlah sel dengan nilai OD, sehingga semakin besar jumlah sel maka nilai OD semakin tinggi dan sebaliknya semakin kecil jumlah sel maka nilai OD yang dihasilkan akan semakin rendah (Mardigan, 2003).
(a)
(b)
Gambar 6. (a) Grafik Kurva Standart Bakteri AK3, (b) Grafik Kurva Pertumbuhan isolat AK3
Hasil dari praktikum ini yaitu Kurva Standar dan Kurva Pertumbuhan. Kurva Standar ini dihasilkan dari penghitungan serta perbandingan antara nilai OD (Optical Density) dengan jumlah sel hasil penghitungan Hemositometer. Hasil kurva standar dari Bakteri AK3 adalah persamaan garis regresi y= 5E+08x-1E+08 dengan nilai korelasi R2= 0,915. Menurut Wallpole (2005), persamaan garis regresi berfungsi untuk menentukan model matematis yang digunakan untuk memprediksi satu variabel dari variabel lain sedangkan nilai korelasi menunjukkan adanya kekerabatan atau hubungan antar dua variabel yang dibandingkan, dan apabila nilai regresi tersebut antara 0,9-1 maka hubungan variabel tersebut adalah korelasi positif sempurna. Persamaan ini akan digunakan untuk mencari nilai jumlah sel Bakteri AK3 dalam kurva pertumbuhan. Nilai OD dari hasil sampling fermentor dimasukkan sebagai variabel y dalam persamaan tersebut, sehingga akan diperoleh nilai dari variebel x, yang merupakan jumlah sel mikroba. Kurva pertumbuhan dihasilkan dari perbandingan antar jumlah sel yang diperoleh dari persamaan kurva standar dengan waktu generasinya yaitu tiap satu jam. Hasilnya yaitu seperti ditunjukkan gambar 6, bahwa garis kurva menaik secara konstan sehingga bentuk kurvanya pun eksponensial. Dapat dilihat bahwa fase lag atau fase adapatasi terlihat yang diindikasikan dengan garis pada jam ke-0 yang mengalami penaikan secara bertahap pada jam ke-2, fase lag terjadi dengan adanya garis grafik yang tidak langsung menanjak pada jam ke-0 menuju jam ke-2 melainkan tetap konstan dalam jumlah mikrobanya. Asumsi dari kejadian ini adalah fase lag dari bakteri AK3 berlangsung sedikit lama dalam hitungan jam. Lambatnya fase lag ini menunjukkan bahwa proses adaptasi bakteri AK3 terhadap media barunya. Fase of accelerated growth dari bakteri AK3 diindikasikan berada pada jam ke-2 hingga jam ke-10. Dalam fase ini ditandai adanya pertumbuhan bakteri dengan kecepatan konstan tetapi pertumbuhannya tetap dalam konsini naik. Pengamatan pada jam ke-10 hingga ke-12 ditemukan fase log, dimana pertumbuhan bakteri meningkat secara signifikan. Jumlah bakteri pada pengamatan jam ke-10 yang semula diketahui berada dibawah 107 dan pada pengamatan jam ke 12 berada jauh diatas 107, dimana jumlah sel bakteri mendekati 6.107. Pengamatan laju pertumbuhan Bakteri AK3 ini tidak ditemukannya adanya fase death (fase kematian). Hal ini dikarenakan waktu yang digunakan dalam pengamatan tidak sampai pada waktu dimana bakteri mengalami fase kematian. Waktu yang digunakan untuk pengamatan hanya dilakukan selama 12 jam. Menurut Geocities (2011), Waktu yang dibutuhkan untuk penginkubasian antara bakteri dan jamur berbeda, yaitu lebih pendek waktu inkubasi pada bakteri karena siklus hidup pada bakteri lebih pendek daripada jamur dimana pertumbuhan pada bakteri membutuhkan waktu selama 24 jam, sedangkan jamur selama 3x24 jam.
(a) (b) Gambar 7. (a) Grafik Kurva Standart Bacillus subtilis, (b) Grafik Kurva Pertumbuhan isolat Bacillus subtilis Seperti halnya bakteri AK3, penghitungan kurva standar Bacillus subtilis juga berdasarkan perbandingan dan korelasi antar jumlah sel hasil penghitungan Hemositometer dengan nilai OD serial dilusi larutan stock. Hasil dari penghitungan ini adalah persamaan regresi y= 7E - 0.9x dengan nilai korelasi sebesar R2 = 0.742. Persamaan regresi ini merupakan model matematis bagi dua variabel yang dibandingkan (jumlah sel dan OD) sehingga model tersebut dapat digunakan sebagai patokan dalam penghitungan selanjutnya. Persamaan garis regresi berfungsi untuk menentukan model matematis yang digunakan untuk memprediksi satu variabel dari variabel lain sedangkan nilai korelasi menunjukkan adanya kekerabatan atau hubungan antar dua variabel yang dibandingkan, dan apabila nilai regresi tersebut antara 0,9-1 maka hubungan variabel tersebut adalah korelasi positif sempurna. Namun, berdasarkan persamaan garis regresi yang didapat dari hasil pengamatan pada praktikum, dapat dikatakan jauh dari kesempurnaan, karena didapatkan nilai regresi sebesar 0.742. Persamaan ini akan digunakan untuk mencari nilai jumlah sel mikroba yaitu Bacillus subtilis dan bakteri AK3 dalam kurva pertumbuhan. Nilai OD dari hasil sampling fermentor dimasukkan sebagai variabel y dalam persamaan tersebut, sehingga akan diperoleh nilai dari variebel x, yang merupakan jumlah sel mikroba. Kurva pertumbuhan Bacillus subtilis seperti halnya pada bakteri AK3 merupakan hasil perbandingan antar jumlah sel yang dihasilkan dari persamaan regresi kurva standar dengan nilai OD hasil sampling fermentor tiap satu jam. Hasilnya adalah bentuk kurva pertumbuhan bakteri S1 yang tidak seperti kurva pertumbuhan bakteri Yin A/S4 dimana laju dari fase lag dari Bacillus subtilis mengalami pertumbuhan yang sangat lambat sekali yang menuju generasi waktu ke-10. Fase lag terjadi dengan jumlah sel yang berubah-ubah tiap waktu generasinya, selain itu fase lag mengalami laju pertambahan jumlah sel yang tidak konstan. Penambahan massa sel terjadi secara cepat pada sel vegetatif, sel yang aktif mengadakan pembelahan, untuk membelah diri (Massafa, 2008).
Pada
generasi waktu ke 10-24, mulai terlihat perubahan fase dari fase lag menuju fase log. Pada waktu waktu tersebut grafik pertumbuhan Bacillus subtilis mulai menaik secara konstan, hal ini menunjukkan bahwa Bacillus subtilis sudah mengalami fase adaptasi dengan baik. Sama seperti halnya pada bakteri
AK3, pada bakteri Bacillus subtilis juga tidak ditemukannya adanya fase death (fase kematian). Hal ini dikarenakan waktu yang digunakan dalam pengamatan tidak sampai pada waktu dimana bakteri mengalami fase kematian. Waktu yang digunakan untuk pengamatan hanya dilakukan selama 24 jam. Perhitungan laju pertumbuhan dapat dilakukan dengan menggunakan rumus : Log Xt – Log Xo K= 0,301 x t Misal pada perhitungan hasil praktikum : - Xt : 108 pada jam ke-8 - Xt : 106 pada jam ke-4 Log Xt – Log Xo K= 0,301 x t Log 108 – Log 106 = 0,301 x (8-4) 8-4 = 0,301 x 4 2 =
= 1,66 generasi/jam 1,204
Untuk waktunya dapat diketahui dengan : 60 t = K 60 =
= 36,14 menit 1,66
Bakteri akan menunjukkan empat fase pertumbuhan, yaitu (Tortora dkk, 2002) : a. Lag phase Pada lag phase, jumlah organisme tidak meningkat secara signifikan tetapi aktif secara metabolik, ukurannya bertambah, terjadi sintesis enzim, dan penggabungan molekul-molekul bervariasi dari media. Selama fase ini organisme individual meningkat ukurannya, dan menghasilkan sejumlah besar energi dalam bentuk ATP. Lamanya lag phase ditentukan oleh karakteristik spesies bakteri dan kondisi media (baik media asal maupun media tempat bakteri ditransfer). Beberapa spesies beradaptasi pada media baru dalam waktu satu atau dua jam, sementara spesies lainnya membutuhkan waktu beberapa hari.
b. Log phase Sekali organisme beradaptasi pada suatu media, pertumbuhan populasi terjadi pada tingkat eksponensial atau logaritma (log). Saat skala sumbu vertikal adalah logaritma, pertumbuhan dalam log phase tampak dalam gambar sebagai garis diagonal lurus, yang menggambarkan ukuran populasi bakteri. Selama log phase, organisme membelah pada tingkat tercepatnya. Populasi organisme mengganda dalam setiap waktu generasi. Pertumbuhan demikian dikatakan eksponensial atau logaritma. c. Stationary phase Saat pembelahan sel menurun hingga titik di mana sel baru dihasilkan pada tingkat sama dengan sel tua yang mati, jumlah sel hidup akan tetap konstan. Kultur kemudian berada dalam stationery phase, digambarkan oleh garis lurus horizontal. Media mengandung jumlah nutrien terbatas dan mungkin mengandung racun dari materi sampah, suplai oksigen juga menjadi berkurang untuk organisme aerob, dan mungkin terjadi perubahan pH yang berbahaya. a. Death phase Kondisi media yang kurang mendukung pembelahan sel menyebabkan banyak sel kehilangan kemampuan utnuk membelah, dan karena itu sel mati. Pada death phase, jumlah sel hidup menurun pada tingkat logaritma, diindikasikan oleh garis diagonal lurus yang menurun. Selama death phase, banyak sel mengalami involusi, yaitu perubahan bentuk yang bervariasi yang membuat sel sulit diidentifikasi. Pada kultur organisme pembentuk spora, lebih banyak spora bertahan hidup daripada sel vegetatif. Lamanya fase ini lebih bervariasi daripada lamanya fase pertumbuhan logaritma.
Gambar 8. Kurva Pertumbuhan Bakteri (Multilad, 2008) Metode perhitungan jumlah sel yang digunakan dalam pembuatan kurva standar pada praktikum
ini
adalah
metode penghitungan mikroskopik langsung dengan menggunakan
hemositometer. Kelebihan metode ini adalah pelaksanaannya cepat dan praktis (tidak membutuhkan
banyak peralatan). Kekurangan metode ini adalah sulit membedakan antara sel yang hidup dan sel yang mati sehingga jumlah sel yang terhitung adalah jumlah keseluruhan sel, sulit untuk menghitung bakteri yang berukuran sangat kecil, dan sulit untuk membedakan antara satu koloni dengan satu sel karena terkadang sel cenderung bergerombol. Menurut Madigan dkk (2003), perhitungan menggunakan hemositometer, Petrof Hauser Bacteria Counter atau alat-alat lain yang sejenis, memiliki dasar perhitungan sebagai berikut : menempatkan 1 tetes suspensi bahan atau biakan mikrobia pada alat tersebut, ditutup dengan gelas penutup kemudian diamati dengan mikroskop yang pembesarannya tergantung pada besar kecilnya mikroba. Dengan menentukan jumlah sel rata-rata tiap petak (ruangan) yang telah diketahui volumenya dari alat tersebut, maka dapat ditentukan jumlah sel mikroba tiap mililiternya.
Gambar 9. Bidang pandang hemositometer (Epa, 2007) Metode perhitungan jumlah sel yang digunakan dalam pembuatan kurva pertumbuhan pada praktikum ini adalah metode pengukuran pengeruhan biakan dengan menggunakan spektrofotometer. Nilai Optical Density yang didapatkan dari pengukuran menggunakan spektrofotometer tidak dapat menunjukkan jumlah sel secara pasti sehingga dibutuhkan kurva standar yang menyatakan hubungan antara kekeruhan biakan dengan jumlah sel, dimana kurva standar tersebut didapatkan dari metode penghitungan mikroskopik langsung terhadap penghitungan jumlah sel dari suspensi kultur yang telah diperlakukan dengan serangkaian pengenceran. Menurut Epa (2007), prinsip kerja dari spektrofotometer adalah adanya sumber cahaya yang memancarkan seberkas cahaya putih melalui lensa dan celah masuk ke kisi difraksi yang dapat menyebarkan cahaya menjadi berkas-berkas atau spektrum warna. Spektrum cahaya jatuh pada seberkas layar gelap yang dilengkapi dengan celah keluar. Cahaya yang mengenai sel-sel mikroba di dalam sampel suspensi akan dihamburkan, cahaya yang lolos akan diteruskan setelah melewati sampel dan akan mengaktivasi foto tabung dan mencatat persen transmitan pada galvanometer. Semakin sedikit jumlah sel di dalam susupensi, makin besar intensitas cahaya yang lolos, sehingga makin tinggi pula persen transmitan yang tercatat.
Sistim optik Spektrofotometer FTIR seperti pada gambar dibawah ini dilengkapi dengan cermin yang bergerak tegak lurus dan cermin yang diam. Dengan demikian radiasi infra merah akan menimbulkan perbedaan jarak yang ditempuh menuju cermin yang bergerak ( M ) dan jarak cermin yang diam ( F ). Perbedaan jarak tempuh radiasi tersebut adalah 2 yang selanjutnya disebut sebagai retardasi ( δ ). Hubungan antara intensitas radiasi IR yang diterima detektor terhadap retardasi disebut sebagai interferogram. Sedangkan sistim optik dari Spektrofotometer IR yang didasarkan atas bekerjanya
interferometer
disebut
sebagai
sistim
optik
Fourier
Transform
Infra
Red.
Pada sistim optik FTIR digunakan radiasi LASER (Light Amplification by Stimulated Emmission of Radiation) yang berfungsi sebagai radiasi yang diinterferensikan dengan radiasi infra merah agar sinyal radiasi infra merah yang diterima oleh detektor secara utuh dan lebih baik. Detektor yang digunakan dalam Spektrofotometer FTIR adalah TGS (Tetra Glycerine Sulphate) atau MCT (Mercury Cadmium Telluride). Detektor MCT lebih banyak digunakan karena memiliki beberapa kelebihan dibandingkan detektor TGS, yaitu memberikan respon yang lebih baik pada frekwensi modulasi tinggi, lebih sensitif, lebih cepat, tidak dipengaruhi oleh temperatur, sangat selektif terhadap energi vibrasi yang diterima dari radiasi infra merah.
Gambar 10. Spektrofotometer (Epa, 2007) Secara keseluruhan, analisis menggunakan Spektrofotometer FTIR memiliki dua kelebihan utama dibandingkan metoda konvensional lainnya, yaitu : 1. Dapat digunakan pada semua frekwensi dari sumber cahaya secara simultan sehingga analisis dapat dilakukan lebih cepat daripada menggunakan cara sekuensial atau scanning. 2. Sensitifitas dari metoda Spektrofotometri FTIR lebih besar daripada cara dispersi, sebab radiasi yang masuk ke sistim detektor lebih banyak karena tanpa harus melalui celah (slitless). Spektrofotometri Infra Red atau Infra Merah merupakan suatu metode yang mengamati interaksi molekul dengan radiasi elektromagnetik yang berada pada daerah panjang gelombang 0,75 – 1.000 µm atau pada Bilangan Gelombang 13.000 – 10 cm-1. Radiasi elektromagnetik dikemukakan pertama kali oleh James Clark Maxwell, yang menyatakan bahwa cahaya secara fisis merupakan gelombang elektromagnetik, artinya mempunyai vektor listrik dan vektor magnetik yang keduanya saling tegak lurus dengan arah rambatan. Saat ini telah dikenal berbagai macam gelombang
elektromagnetik dengan rentang panjang gelombang tertentu. Spektrum elektromagnetik merupakan kumpulan spektrum dari berbagai panjang gelombang. Pertumbuhan organisme uniseluler seperti bakteri dapat diukur dalam dua parameter berbeda, yaitu perubahan dalam hal massa sel dan perubahan dalam hal jumlah sel. Penjelasannya adalah sebagai berikut : a. Metode untuk pengukuran massa sel Metode untuk mengukur massa sel meliputi teknik langsung dan tak langsung. 1. Pengukuran langsung secara fisik dari berat kering, berat basah, atau volume sel setelah sentrfugasi. 2. Pengukuran langsung secara kimiawi dari beberapa komponen kimia sel seperti nitrogen, protein total atau kandungan DNA total. 3. Pengukuran tak langsung melalui aktivitas kimia seperti tingkat produksi atau konsumsi O2, tingkat produksi atau konsumsi CO2, dan sebagainya. 4. Pengukuran turbiditas, memerlukan berbagai instrumen untuk menentukan jumlah cahaya yang dihamburkan oleh suspensi sel. Obyek utama seperti bakteri menghamburkan cahaya dalam proporsi dengan jumlah sel. Turbiditas atau kerapatan optis dari suspensi sel secara langsung dihubungkan dengan massa sel atau jumlah sel, setelah konstruksi dan kalibrasi dari kurva standar. Metode ini sederhana dan tidak merusak, tetapi sensitivitasnya terbatas pada sekitar 107 sel per ml untuk sebagian besar bakteri.
b. Metode pengukuran jumlah sel Teknik pengukuran meliputi penghitungan langsung, baik secara visual atau menggunakan instrumen dan penghitungan sel tampak secara tidak langsung (Todar, 2007) : 1. Penghitungan mikroskopik langsung menggunakan slide istimewa yang diketahui sebagai ruang penghitungan. Sel mati tidak dapat dibedakan dengan sel yang hidup. Hanya suspensi padat yang dapat dihitung (>107 sel per ml), tetapi sampel dapat dikonsentratkan oleh sentrfugasi atau filtrasi untuk meningkatkan sensitivitas. 2. Ruang penghitungan elektronik, menghitung jumlah dan mengukur ukuran distribusi sel. Untuk ukuran sel bakteri, media suspensi harus sangat bersih. 3. Penghitungan sel yang tampak secara tidak langsung, juga disebut penghitungan cawan, meliputi penyebaran sampel dari kultur pada permukaan agar nutrien. Sampel atau suspensi sel dapat diencerkan dalam pengencer non-toksik (misalnya air atau larutan garam fisiologis) sebelum dicawankan. Jika dicawankan pada media yang sesuai, tiap unit yang tampak akan tumbuh dan membentuk koloni. Tiap koloni yang dapat dihitung disebut
colony forming unit (CFU) dan jumlah CFU dihubungkan dengan jumlah bakteri yang tampak dalam sampel.
Metode yang paling efektif untuk menghitung jumlah sel adalah kombinasi dari beberapa metode, karena setiap metode masih memiliki kekurangan sehingga diperlukan kombinasi beberapa metode agar kelebihan dari satu metode dapat menutupi kekurangan metode lainnya (metode yang digunakan saling mendukung) dan dihasilkan hasil penghitungan jumlah yang akurat. Contoh metode kombinasi yang dapat digunakan adalah metode penghitungan mikroskopik langsung dan metode pengukuran turbiditas. Aplikasi dari pembuatan kurva pertumbuhan adalah dalam hal kontrol kualitas, baik dalam bidang pangan maupun lingkungan, melalui penghitungan jumlah populasi mikroba, misalnya penghitungan bakteri dalam susu, makanan, vaksin seluler, air, kultur di laboratorium, dan lain-lain (Todar, 2007). Pengukuran sel bakteri pada saat praktikum menggunakan 4 jenis isolat, yaitu isolat BTB 2.1, isolat BTR 5.2, isolat 13 dan isolat 19. Isolat-isolat tersebut memiliki ukuran berturut-turut 9 µm, 7 µm, 5 µm dan 2,5 µm. Ukuran bakteri yang didapat ini telah dikalikan dengan hasil kalibrasi sebesar 3 µm. Hasil kalibrasi ini didapatkan dari : ∑ Unit Ob ∑ unit Ok
x 10 µm
Misal pada praktikum diketahui Ob : 7, sedangkan Ok 23 =
7 x 10 µm 23
= 3 µm Menurut Scribed (2010), Pengukuran sel bakteri yang sebenarnya dapat dilakukan dengan menggunakan mikrometer. penggunaan mikrometer harus dilakukan dengan mengkalibrasikan kedua jenis mikrometer, yaitu mikrometer objektif dan mikrometer okuler. Kalibrasi mikroskop dilakukan sebelum pengamatan isolat bakteri. Kalibrasi dilakukan dengan menghimpitkan skala mikrometer objektif dan okuler pada perbesaran yang diinginkan. Skala ke nol (garis pertama) kedua mikrometer disimpulkan menjadi 1 garis kemudian dilihat pada skala ke berapa kedua jenis mikrometer tersebut bertemu/berhimpit kembali. Dari hasil tersebut dapat diketahui satu satuan panjang pada skala mikrometer okuler itu berdasarkan beberapa jumlah skala kecil mikrometer objektif yang berada di antara garis yang berhimpit tadi.
Gambar 11. Rumus untuk menentukan besarnya ukuran mikrobia (Scribed, 2010).
Misal : jika skala ke 0 mikrometer okuler berhimpit dengan skala ke 0 mikrometer objektif lalu skala ke 13 mikrometer okuler berhimpit dengan skala ke 2 mikrometer objektif maka beberapa 1 skala okuler.
Gambar 12. Contoh penentuan ukuran dalam kalibrasi micrometer (Scribed, 2010).
Gambar 13. Pengkalibrasian kedua jenis micrometer (Scribed, 2010).
Cara Kerja pengkalibrasian (Scribed, 2010): Mikrometer objektif diletakkan pada meja benda dan pasang mikrometer okuler pada tabung lensa okuler.dilakukan penentuan perbesaran yang digunakan, (misalnya 40 X 10), kemudian cari gambar perbesaran dari skala mikrometer objektif. Setelah fokus didapat, kemudian selanjutnya skala ke nol mikrometer objektif dan okuler dihimpitkan. Skala ke berapa antara mikrometer objektif dan okuler yang berhimpit·dicari dengan teliti. Lalu dihitung besarnya skala okuler dengan rumus di atas.
BAB V PENUTUP
5.1 Kesimpulan Berdasarkan hasil di atas dapat disimpulkan bahwa isolat Bacteri AK3 dan Bacillus subtilis memiliki rentang waktu yang tidak sama dalam tiap fase pertumbuhannya, hal ini dapat dikarenakan jenis bakteri yang digunakan berbeda, dimana setiap bakteri membutuhkan waktu tumbuh yang
berbeda sehingga lamanya fase pertumbuhan juga berbeda. Perhitungan jumlah sel bakteri secara langsung dengan menggunakan hemositometer pada prinsipnya adalah menghitung sel baktreri yang representatif pada kotak medium kaca obyek hemositometer. Penggunaan spektrofotometer memiliki prinsip semakin sedikit jumlah sel di dalam suspensi, makin besar intensitas cahaya yang lolos, makin tinggi pula persen transmitan yang tercatat. Kurva standar dan kurva pertumbuhan bakteri dapat menggambarkan pertumbuhan bakteri secara keseluruhan yang membandingkan jumlah sel dengan nilai optical density (pada kurva standar) serta lama waktu tumbuh (jam) dengan nilai optical density (pada kurva pertumbuhan). 5.2 Saran Sebaiknya pada praktikum selanjutnya, pengamatan pertumbuhan bakteri dilakukan dalam waktu yang lebih panjang agar praktikan dapay mengetahui pertumbuhan bakteri hingga pada fase kematiannya.
DAFTAR PUSTAKA Benson,H.J. 2002. Microbiological Applications Laboratory Manual In General Microbiology, 8th edition. McGraw Hill Co,Inc. Black, Y.G. 2005. Microbiology Principles and Explorations Sixth Edition. John Willey&Sons. Virginia. Dhanang.2008. Pertumbuhan Sel Bakteri.http://dhave29.multiply.com/reviews/item/4. Tanggal akses 17 Mei 2011. Epa. 2007. Cell Counts. http://www.epa.gov/Tanggal akses 16 Mei 2011. Geocities. 2011. Pupuk Organik. http://www.geocities.com/pupukorganik/index. htm. Tanggal akses 05 April 2011 Hadioetomo, R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia, Jakarta. Ingraham, J.L. dan C.A. Ingraham. 2004. Introduction to Microbiology Third Edition. Thomson Learnig, Inc. San Fransisco. Iqbalali., 2008, Pertumbuhan Bakteri dan Suhu. http://i q b a l a l i . c o m /Pertumbuhan-Bakteri-danSuhu.mht. diakses pada tanggal 18 Mei 2011. Lim,D. 2002. Microbiology, 2nd Edition. McGrow-hill book, New York. Madigan, M. T., J. M. Martinko, dan J. Parker. 2003. Brock Biology of Microorganism, International Edition. Pearson Education, Inc. New Jersey Massofa. 2008. Isolasi Mikroba. http://massofa.wordpress.com/2008/02/05/mikroorganisme-bakteridan-virus/. Tanggal akses 17 Mei 2011.
Multilad. 2008. Culture Media. http://www.multilab.biz/laboratory/lc/dcmbs/dehydrated culture media Y2.htm. Tanggal akses 16 Mei 2011. Pelczar, M.J. dan E.C.S. Chan. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi II. UI-Press. Jakarta. Rachdie. 2008. Mengenal Media Pertumbuhan Mikrobial. http://rachdie.blogsome.com/mengenalmedia-pertumbuhan-mikrobial/. Tanggal akses 17 Mei 2011. Scribed. 2010. Mikro-Banget. http://www.scribd.com/doc/34676115/Bab-8-Penghitungan-Mikroba. Tanggal akses 27 oktober 2010. Todar, K. 2007. Growth of Bacterial Populations. http://www.textbookofbacteriology.net/. Tanggal akses 17 Mei 2011. Tortora, G. J., Berdell R. Funke, and Christine L. Case. 2002. Microbiology, An Introduction. Pearson Eduation, Inc. San Francisco Wallpole, R. 2005. Metode Statisitka. Penerbit ITB. Bandung.
