BIOMATERIAL KERATIN UNTUK IMPLAN TULANG
TUGAS BIOMATERIAL
Oleh : Maria Destiani Wulandari
14/363542/TK/41645
Mita Kurniasari
14/353479/TK/41595
Saefullah Thaher
14/363470/TK/41587
DEPARTEMEN TEKNIK KIMIA FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS GADJAH MADA 2017
DAFTAR ISI
DAFTAR ISI ................................................ .............................................................
1
BAB I
LATAR BELAKANG ....................................... ......................................
2
BAB II
MATERIAL DAN METODE ............................................... ..................
4
A Ekstraksi Protein Keratin dari Rambut Manusia ............................................
4
B Pembuatan Scaffolds Keratin ............................................... ...........................
5
BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN ...............................................................
8
BAB IV
ALPIKASI PENGGUNAAN BIOMATERIAL KERATIN ...................
10
DAFTAR PUSTAKA ................................................. ...............................................
11
1
BAB I LATAR BELAKANG
Saat ini, ribuan operasi dilakukan setiap hari untuk menggantikan atau mengembalikan tulang yang rusak akibat kecelakaan atau suatu penyakit. Pengobatan dari permasalahan tersebut difokuskan pada transplantasi jaringan tulang dari satu tempat ke tempat lainnya. Ada berbagai bentuk transplantasi jaringan. Dalam beberapa kasus, tulang ditransplantasikan dari satu bagian tubuh yang lain pada pasien yang sama, yang disebut sebagai autograft. Ada pula kasus yang mentransplantasikan tulang dari satu orang ke orang lain yang disebut sebagai allograft. Sementara langkah ini dapat digunakan secara efektif hanya untuk mengobati masalah mendasar dan sering memiliki efek samping serta beberapa kekurangan. Salah satu keterbatasannya adalah biaya yang dihabiskan untuk melakukan autograft sangat mahal. Cara ini juga memberikan rasa sakit dan membutuhkan waktu pemulihan yang lama. Demikian pula dengan allograft, cara ini juga memiliki banyak keterbatasan, antara lain sulit untuk menemukan jumlah yang tepat dari jaringan tulang yang dibutuhkan, sistem kekebalan tubuh pasien juga mungkin menolak jaringan tulang dari donor. Permasalahan inilah yang saat ini sedang dicoba untuk diatasi melalui teknik rekayasa jaringan yang compatible dengan tubuh manusia. Dalam rekayasa ini, digunakan teknik regenerasi jaringan di mana sel-sel diambil dari dalam tubuh, dikombinasikan dengan bahan biomaterial di luar tubuh, dan dibentuk menjadi scaffold yang berpori. Bahan ini yang nantinya akan digunakan untuk membantu dalam pertumbuhan jaringan yang rusak di dalam tubuh. Banyak eksperimen yang telah dilakukan untuk mengidentifikasi bahan-bahan yang dapat digunakan dalam produksi scaffold tersebut. Dalam makalah ini secara khusus difokuskan pada evaluasi potensi keratin dari rambut manusia untuk dapat digunakan sebagai bahan dasar pembuatan scaffold tersebut. Sekitar 300.000 ton rambut per tahun di seluruh dunia dibuang sebagai limbah (Reichl, 2009). Sebagian besar dari rambut manusia mengandung keratin protein (KP) dan keratin associated protein (KAP). Keratin adalah salah satu protein yang ada di dalam rambut, tak berwarna, berserat, memiliki sifat keras, serta tak larut dalam air. Protein ini umumnya mengandung sulfur yang mengandung asam amino. Protein keratin terdiri dari unsur sistin (cystine) yaitu senyawa asam amino yang memiliki unsur sulfida. Banyaknya ikatan disulfida di dalam keratin menunjukkan kekuatan mekanik bahan tersebut. Tiap molekul keratin berukuran 10 nanometer. Keratin terdiri dari dua macam yaitu, alpha dan betakeratin. Alpha 2
keratin
lebih
lembut
dan
hanya
ditemukan
pada
mamalia,
sedangkan beta keratin ditemukan pada burung dan reptil. Keratin juga merupakan salah satu protein yang stuktur sekundernya telah benar-benar dipelajari, keratin banyak dijumpai pada bulu (fur dan feather). Tiap molekul protein dalam keratin mempunyai bentuk spiral, yang disebut spiral-α-kanan. Dalam pertengahan dasawarsa 1930 istilah “α” dikemukakan untuk membedakan pola sinar-X keratin dari pola beberapa protein lain. Dalam keratin, tiap putaran spiral mengandung 3,6 residu asam amino. Jarak dari satu kumparan ke kumparan berikutnya adalah
5,4Ӑ. Bentuk sp iral itu tidak berubah terutama dengan adanya ikatan-ikatan hydrogen antara satu gugus amida-karbonil dan suatu gugus NH yang jaraknya 3,6 satuan asam amino. Bentuk spiral ini mengahasilkan produk yang kuat, lunak (lentur) dan bersifat serat. Struktur berserat dari keratin cukup teratur untuk menyebarkan sinar x dengan cara yang mengungkapkan keteraturan lipat. Mengukur intensitas dan posisi bintik-bintik pada pola difraksi sinar x yang dihasilkan memberikan perkiraan jarak antara kemampuan mengulang teratur dari pola lipat. Linus Pauling dan Robert Corey pertama kali menyadari bahwa ikatan peptida adalah planar dan kaku. Dengan pembatasan struktural, jumlah pola lipat yang tersedia untuk protein terbatas pada dua bentuk dasar. Salah satunya berhubungan dengan pola α, sebuah
pola difraksi sinar x diamati dengan keratin dari rambut, yang lain berhubungan dengan pola β, diamati dengan serat sutra, protein berserat sutra, dan dengan keratin yang telah ditarik. Karakteristik yang disebutkan di atas membuat keratin yang terdapat dalam rambut manusia merupakan molekul protein yang ideal untuk digunakan dalam produksi scaffold pada tulang.
3
BAB II MATERIAL DAN METODE
A. Ekstraksi Protein Keratin dari Rambut Manusia
1. Pembersihan dan proses delipitizing (proses pembersihan dari lemak) Rambut manusia (wanita Kaukasus) dikumpulkan dari toko salon lokal, dicuci dengan etanol dan air beberapa kali untuk menghilangkan kotoran dari permukaan rambut. Rambut yang sudah bersih diletakkan di kloroform (Sigma-Aldrich) dan larutan metanol (2:!) v/v selama 24 jam dengan tujuan untuk menghilangkan dari segala jenis lemak pada permukaan rambut. Rambut yang sudah bebas dari lemak dicuci dan dibiarkan di udara terbuka semalaman untuk menguapkan kloroform dan metanol. 2. Penyiapan larutan penyangga Larutan penyangga untuk ekstraksi protein keratin disiapkan dengan menambah 3,025 gram Tris (hidroksimetil) aminometana atau Tris-basa ( Fisher ), yang digunakan sebagai larutan penyangga, 197,9 g thiourea (Sigma-Aldrich), 300 g urea ( Fisher ), dan 50 mL 2-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) dalam 1000 mL air deionisasi. pH ditentukan dengan 8M HCl (Sigma-Aldrich) sampai 8,5. Tris-HCl digunakan untuk menjaga larutan buffer ekstraksi keratin pada pH 8,5. Thiourea dan urea digunakan untuk memutuskan ikatan non-kovalen yang ditemukan antara rantai polipeptida pada asam amino. Sebagai tambahan, 2-mercaptoethanol digunakan untuk mengurangi ikatan disulfida yang ditemukan antara cysteine. 3. Ekstraksi protein Rambut yang sudah melewati proses delipitizing (60 g) dipotong menjadi bagian yang lebih kecil dengan panjang rata-rata sekitar 1mm, diikuti dengan proses pencampuran larutan buffer 1L yang telah dideskripsikan di atas. Larutan diguncangkan dengan menggunakan tangan selama 3 menit, dan dipanaskan dengan oven pada suhu 50°C selama 3 hari; larutan diguncangkan dengan menggunakan tangan setiap 12 jam.
4
Kertas saring Whatman dengan ukuran 2µm digunakan untuk memisahkan larutan yang
mengandung
protein
dari
residu
berupa cuticle-cortex.
Lalu,
filtrat
disentrifugasi pada kondisi 15000xg (TOMY MX-305) selama 20 menit pada suhu ruangan menggunakan centrifuging vial ( Flacon) 50 mL, dengan tujuan untuk memisahkan fragmen-fragmen kecil dari residu rambut. Supernatant yang diperoleh kemudian didialisis pada air deionisasi menggunakan SnakeSkin dialysis tubing . Selama dialisis, air bagian luar digantikan dengan air deionisasi dua kali sehari selama empat hari. Selanjutnya, larutan yang mengandung protein mulai berubah warna menjadi warna susu karena protein mulai membentuk agregat dan mengalami polimerisasi. Lalu larutan proten dialisis yang memiliki warna susu disimpan dalam refrigerator pada suhu -80°C selama 48 jam. Larutan protein yang sudah beku disimpan dalam suatu lyophilizer pada tekanan 3,5Pa dan suhu -48°C dengan kondisi operasi selama 48 jam. Akhirnya, bubuk protein keratin diperoleh sebanyak 17 g. 4. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) Konfirmasi berat molekul protein digunakan gel electrophoresis dengan 4-20% gradient Tris-HEPES-SDS (Pierce) gel. Sampel dipersiapan dalam larutan penyangga yang mengandung 1% SDS dan dipanaskan sampai 90°C selama 5 menit. Lalu, sampel dimasukkan ke dalam gel dan ke Bio Rad Mini Protean 3 gel box pada 90V sampai selesai. Pewarnaan (staining ) digunakan gelcode blue reagent (Pierce) selama 2 jam lalu dilakukan proses de-staining semalaman dengan air RO.
B. Pembuatan Scaffolds Keratin
1. Penghancuran batang rambut menjadi fragmen-fragmen cuticle-cortex Rambut yang sudah bebas dari lipid (delipidized hair ) sebanyak 2,55g dipotong menjadi bagian yang lebih kecil dengan panjang rata-rata 1mm. Kemudian bagian kecil tersebut dicampur dengan NaOH 0,1M sebanyak 400mL pada pH 1,0. Natrium hidroksida digunakan untuk membuat batang rambut menjadi lembut dengan memutus ikatan ionik yang ditemukan antara rantai polipeptida pada asam amino. Ikatan ionik antara rantai polipeptida pada asam amino berperan dalam memberi kekuatan sektiar 30% pada batang rambut. Kemudian, larutan diinkubasi dalam oven 5
dengan proses preheating pada suhu 60°C selama 24 jam. Tahap ini diikuti dengan proses fragmentasi pada batang rambut yang sudah halus menjadi fragmen cuticlecortexi menggunakan ultrasonic probe (Fisher scientific, Sonic Dismembrator: probe diameter 2.7mm and output power 10watt). Selanjutnya, larutan difiltasi dengan saringan logam berukuran 112µm untuk memisahkan cuticle dan residu cortex dari larutan awal. Kemudian, residu cuticle-cortex dicuci dengan air selama beberapa menit sampai pH menjadi netral. Fragmen cortex dan cuticle yang diperoleh disimpan dalam refrigerator pada suhu 4°C. 2. Pembuatan scaffolds Larutan keratin 5% (w/v) dipersiapkan dengan menambah 50mg bubuk keratin ke dalam 1mL larutan penyangga ekstraksi keratin. Lalu, serat cuticle-cortex sebanyak 50mg diukur dan ditempatkan di gelas vials. Selanjutnya, larutan keratin 5% (w/v) sebanyak 0,1mL dimasukkan ke dalam vials yang berisi serat cuticle-cortex. Campuran tersebut diaduk rata dengan spatula selama 5 menit. Kemudian, precooled aseton (SigmaAldrich) sebanyak 0,1mL ditambahkan ke dalam larutan sedikit demi sedikit, dan seteleh selesai lansung diinkubasi dalam refrigerator pada suhu 20°C selama satu jam dan dimasukkan ke dalam refrigerator pada suhu 4°C selama 30 menit. Aseton digunakan untuk membuat protein menjadi bentuk agregat. Struktur 3D crosslinked berbentuk piringan (disk ) diperoleh. Struktur disc-shaped yang diperoleh kemudian dicuci beberapa kali dengan air RO dan dibiarkan semalaman di udara terbuka. Kemudian, scaffold didialisis terhadap air RO menggunakan snakeskin dialysis tubing (Thermo scientific, with a molecularweight cutoff of about 3.5kDa and diameter 16mm) selama 5 hari; air bagian luar diganti setiap hari dengan tujuan untuk memisahkan dari aseton dan semua bahan kimia yang ada di penyangga ekstraksi protein. Terakhir, scaffold hasil dialisis dikeringkan dan disimpan dibawah tudung (hood) dengan aliran laminer. 3. Coating the scaffold dengan Hydroxyapatite (HA) Larutan HA 1% (w/v) disiapkan dengan menambah bubuk HA (Sigma-Aldrich) sebanyak 0,2g dalam air RO sebanyak 20mL. Larutan dicampur dengan ultrasonic probe (Fisher scientific, Sonic Dismembrator: probe diameter 2.7mm and output power 10watt) selama 10 menit untuk membentuk koloid. Lalu, 3D keratin dan 6
scaffold komposit serat cuticle-cortex ditempatkan di saringan logam dengan ukuran pori sebesar 115µm dan larutan sebanyak 20mL dituangkan ke scaffold . Terakhir, scaffold dibiarkan semalaman di udara terbuka.
7
BAB III HASIL DAN PEMBAHASAN
Berdasarkan riset yang telah dilakukan oleh Samuel Siyum, diperoleh data bahwa sampel protein terekstrak memiliki berat molekul di antara 38-52 kDa. Berat molekul yang diukur melalui riset ini, telah sesuai dengan data-data yang telah dilaporkan sebelumnya.
Sementara struktur 3D scaffold memiliki ukuran pori pada kisaran 50-500 μm dengan persentasi komposisi unsur di dalamnya adalah 54% karbon, 27,2% oksigen, dan 18,6% nitrogen. Ukuran pori ini berhubungan dengan porositas optimal untuk adhesi, proliferasi, dan diferensiasi sel sebagaimana yang diebutkan dalam beberapa literatur. Ukuran pori juga sama seperti range ukuran pori yang ditemukan oleh Vema dan Xu untuk scaffold dari protein keratin.
8
Analisisi unsur untuk kedua scaffold menunjukkan bahwa unsur-unsur yang terdapat pada permukaan scaffold sama dengan unsur-unsur yang terdapata pada protein tulang. Secara umum dapat disimpulkan bahwa kekasaran permukaan berpera penting dalam fierensiasi, proliferai, dan adhesi sel tulang manusia. Sebuah studi yang dilakukan oleh Li dkk menunjukkan bahwa kekasaran permukaan HA lebih baik dalam perkembangbiakan dan peningkatan jumlah sel daripada permukaan yang lebih halus. Hasil juga menunjukkan bahwa adanya hidroxyapatite (HA) pada permukaan scaffold meningkatkan kekerasan scaffold . Scaffold mengembang sebesar 150% dalam kurun waktu 90 menit dan kedua xcaffold yang ditinjau memiliki porositas yang tinggi di atas 50%. Pengembangan ini menjadikan peningkatan ukuran pori, luar permukaan, membuat pergerakan sel dan nutrisi lebih mudah dalam scaffold serta mengembangkan adhesi. Meskipun kedua komposit scaffold menunjukkan compressive strength yang rendah dibandngkan bioscaffold lain dan tulang kompak alami, keduanya masih menjanjikan menjadi substrat untuk pertumbuhan sel dan regenerasi tulang semua sifat yang telah disebutkan sebelumnya. Selama belum diketahui luas scaffold biodegradabel yang dibutuhkan untuk meniru mechanical properties tulang alami, karena saat scaffold mengalami degradasi, tulang baru diharapkan tumbuh ke dalamnya dan menyediakan load bearing ability. Barangkali ini adalah alasan sebaran bahan dengan compressive strength berkisar 2-9 MPa diuji untuk scaffold tulang.
9
BAB IV APLIKASI PENGGUNAAN BIOMATERIAL KERATIN
1. Lapisan tipis keratin (keratin films) Pembuatan lapisan tipis protein dari ekstrak keratin bulu domba dan rambut manusia telah digunakan selama beberapa tahun untuk mengeksplor struktur dan sifat biologis keratin. Yamauchi dkk adalah yang pertama kali memulai investigasi sifat dari produk yang dibuat dari ekstrak keratin bulu domba dan dalam pelaksanaannya mendeskripsikan sifat fisiokimia dan biodegradasi dari lapisan tipis keratin. Seperti turunan biomaterial alam lainnya, penggunaan produk berbasis keratin dibatasi oleh lemahnya sifat mekanik dari bahan ini. Oleh karena itu, riset keratin film mulai bergeser kepada optimasi kekuatan fisis dan fleksibilitas film. Saat ini, Reich dkk melakukan
karakterisasi
dua
pendekatan
berbeda
untuk
substrat coating dan
mendemonstrasikan cara pertumbuhan 12 sell yang dikultur pada keratin film (Rouse, 2010). 2. Scaffold dan Sponge Kemampuan ekstrak protein keratin untuk membentuk polimer menjadi struktur 3D kompleks telah membawanya dikembangkan sebagai scaffold untuk rekayasa jaringan. Pabrikasi keratin scaffold dari bulu domba untuk penanaman sel diteliti pertama kali oleh Tachibana dkk pada tahun 2001. Beberapa penelitian yang pernah dilakukan untuk mengembangkan aplikasi keratin sebagai scaffold dan sponge adalah regulasi ukuran poros dan poroitas scaffold , biodegradasi keratin secara in vivo, serta konstruksi, karakterisasi, dan sitokompabilitas scaffold dari keratin rambut manusia untuk rekayasa jaringan secara in vitro. 3. Serat keratin Dalam beberapa tahun terakhir, riset electrospinning bahan polimer biocompatible meningkat tajam karena melimpahnya potensi aplikasi biomedikal untuk bahan serat nano. Saat ini, proses electropinning diperluas untuk mencakup regenerasi keratin yang diekstrak dari bulu domba dan rambut manusia. Karena lemahnya sifat mekanis dari keratin murni, para peneliti terpaksa menambah polimer alam ataupun buatan untuk meingkatkan kemampuan proses keratin untuk pembentukan serat. 10
DAFTAR PUSTAKA
Reichl, Stephan. "Films Based on Human Hair Keratin as Substrates for Cell Culture and Tissue Engineering." Biomaterials 30.36 (2009): 6854-866.
Rouse, Jullian G. 2010. “A Review of Kerati – Based Biomaterial for Biomedical Apllications”. Material journal ,3,999- 1014.
11
