MAKALAH BIOTEKNOLOGI NORTHERN BLOT
Guna Melengkapi Tugas Bioteknologi Farmasi Dosen Pengampu: “ Endah Puspitasari, S.Farm., M.Sc., Apt.”
Disusun oleh: Maulidya Barikatul Iftitah
(152210101015)
Lilis Sapta Eka Lestari
(152210101017)
Irawati Firdiyansari
(152210101018)
Livia Primarahayu
(152210101020)
Weka Agustin Pratesya
(152210101021)
Fitri Nurussani Aulia
(152210101023)
Khusnul Khotimah
(152210101025)
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS JEMBER 2017
Page | 1
KATA PENGANTAR
Puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas rahmat dan hidayah-Nya yang telah diberikan kepada penulis, sehingga dapat menyelesaikan makalah yang berjudul “Northern Blot” ini sesuai dengan yang direncanakan. Penyusunan
makalah ini digunakan untuk melengkapi tugas mata kuliah
Bioteknologi. Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penulisan makalah ini.
Oleh karena itu, semua bentuk saran dan kritik yang membangun
senantiasa penulis harapkan. Penulis mengucapkan banyak terima kasih kepada bu Endah Pupitasari, S.Farm., M.Sc., Apt. dan pihak-pihak yang memberikan bantuan baik secara langsung maupun tidak langsung selama proses penyusunan makalah ini. Akhirnya, penulis berharap semoga penyusunan makalah ini banyak membawa manfaat bagi pihak-pihak yang terkait.
Jember, 25 Februari 2017
Penulis
Page | 2
DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL ..................................................................................................................i KATA PENGANTAR ..............................................................................................................ii DAFTAR ISI ............................................................................................................................iii BAB I. PENDAHULUAN ...........................................................................................................1 1.1 Latar Belakang ......................................................................................................................1 1.2 Rumusan Masalah ................................................................................................................2 1.3 Tujuan ..................................................................................................................................2 BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ...............................................................................................3 2.1 Deskripsi Blotting ................................................................................................................ 3 2.1.1Macam-macam Blotting...................................................................................................... 3 2.2 Perbedaan Masing-Masing Blotting ................................................................................... 6 BAB III. PEMBAHASAN ........................................................................................................ 8 3.1Deskripsi Northern Blot..........................................................................................................8 3.2Prinsip dan Tujuan Teknik Northern Blot............................................................................... 9 3.3Tata Laksana Teknik Northern Blot...................................................................................... 10 BAB IV. KESIMPULAN DAN SARAN................................................................................ 16 4.1Kesimpulan.......................................................................................................................... 16 4.2 Saran.......................................................................................................................... 16 DAFTAR PUSTAKA................................................................................................................xvi
Page | 3
BAB I PENDAHULUAN 1.1 LATAR BELAKANG Protein merupakan suatu zat yang terdapat di dalam makanan yang sangat penting bagi tubuh,karena berfungsi sebagai zat pembangun dan pengatur. Juga sebagai sumber asam amino yang mengandung unsur C,H,O dan N yang tidak dimiliki oleh lemak maupun karbohidrat. Protein memiliki rantai panjang dan dapat mengalami cross linking. Sehingga protein juga berperan dalam biokatalis suatu reaksi-reaksi kimia dalam makluk hidup. Berhubungan dengan hal tersebut, jika terjadi suatu kelainan dalam biokatalis suatu makhluk hidup maka akan terlihat dengan jelas dengan kelainan proteinnya. Sehingga diperlukan beberapa uji yang dibutuhkan untuk mengetahuinya. Salah satunya adalah dengan uji Western Blotting untuk mengetahui jenis dan berat molekul suatu protein. Namun sebelum dilakukan uji diatas harus diterapkan isolasi protein terhadap sampel yang diambil. Agar protein murni dari sampel bisa didapat sehingga uji tersebut bisa dilakukan dengan baik dan benar. Bioteknologi adalah cabang ilmu yang mempelajari pemanfaatan makhluk hidup (bakteri, fungi, virus, dan lain-lain) maupun produk dari makhluk hidup (enzim, alkohol) dalam proses produksi untuk menghasilkan barang dan jasa. Dewasa ini, perkembangan bioteknologi tidak hanya didasari pada biologi semata, tetapi juga pada ilmu-ilmu terapan dan murni lain, seperti biokimia, komputer, biologi molekular, mikrobiologi, genetika, kimia, matematika, dan lain sebagainya. Dengan kata lain, bioteknologi adalah ilmu terapan yang menggabungkan berbagai cabang ilmu dalam proses produksi barang dan jasa. Blotting adalah suatu teknik memindahkan atau mentransfer DNA, RNA, atau protein ke lembaran tipis atau matriks membran sehingga DNA, RNA, atau protein tersebut dapat dipisahkan. Teknik ini berupa lanjutan dari penggunaan elektroforesis gel. Blotting terdiri atas berbagai macam diantaranya western blot, northern blot, dan southern blot. Northern Blot digunakan untuk mempelajari pola ekspresi dari jenis tertentu molekul RNA sebagai perbandingan relatif antara set sampel yang berbeda dari RNA. Perkembangan bioteknologi ini semakin pesat dan semakin cangkih sehingga perlu dipelajari lebih lanjut mengenai bioteknologi, khususnya dalam bidang kesehatan.
Page | 4
Oleh karena itu, metode dan berbagai cara analisis asam nukleat dan protein dipelajari dan perlu pembahasan lebih lanjut. 1.2 Rumusan Masalah Berdasarkan latar belakang di atas, dapat dirumuskan beberapa masalah sebagai berikut : 1.2.1 Bagaimana pengertian dari analisis berbasis asam nukleat dan protein dengan metode Northern Blot? 1.2.2 Bagaimana prinsip dasar analisis berbasis asam nukleat dan protein dengan metode Northern Blot? 1.2.3 Bagaimana tata laksana kerja dari metode Northern Blot? 1.2.4 Bagaimana perbedaan metode Northern Blot dengan metode analisis berbasis asam nukleat dan protein yang lain? 1.3 Tujuan Berdasarkan rumusan masalah tersebut, dapat dirumuskan beberapa tujuan sebagai berikut: 1.3.1 Mengetahui pengertian dari analisis berbasis asam nukleat dan protein dengan metode Northern Blot. 1.3.2 Mengetahui prinsip dasar analisis berbasis asam nukleat dan protein dengan metode Northern Blot. 1.3.3 Mengetahui tata laksana kerja dari metode Northern Blot. 1.3.4 Mengetahui perbedaan metode Northern Blot dengan metode analisis berbasis asam nukleat dan protein yang lain.
Page | 5
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Pengertian Blotting Blotting adalah suatu teknik memindahkan atau mentransfer DNA, RNA, atau protein ke lembaran tipis atau matriks membran sehingga DNA, RNA, atau protein tersebut dapat dipisahkan. Teknik ini berupa lanjutan dari penggunaan elektroforesis gel. Matriks yang biasa dipakai dapat berupa nitroselulosa (NC). Namun NC juga memiliki kekurangan, yaitu beberapa komponen yang memiliki afinitas lemah dapat hilang selama pemrosesan. Matriks lain yang dapat digunakan untuk menutupi kekurangannya yaitu kertas diazobenzyloxymethyl (DBM). Ada pula kertas lain, yaitu iazophenylthioeter (DPT). Keuntungan Teknik Blot: -
Akses yang lebih besar kepada molekul yang telah terikat ke permukaan lembaran dibandingkan kepada molekul yang masih berada di dalam gel atau
-
matriks. Reagen yang dibutuhkan lebih sedikit. Waktu untuk melakukan staining dna destaining, inkubasi, mencuci, dll dapat
-
lebih singkat. Pola yang terbentuk dapat dikeringkan dan disimpan berbulan-bulan sebelum
-
dianalisis. Dapat dibuat banyak replika pola tersebut untuk memungkinkan banyak metode
analisis yang dipakai. 2.2 Macam-macam Teknik Blotting dan Penjelasannya 2.2.1 Southern Blot Southern blot pertama kali dikemukakan oleh Southern (1975). Teknik ini mentransfer DNA ke kertas NC dengan menggunakan prosedur aliran pelarut. Caranya yaitu dengan menempatkan gel elektroforesis ke kertas matriks yang direndam buffer dan berada di atas sesuatu seperti spons yang telah dibasahi dengan buffer. Membran tersebut diletakkan di atas gel dan ditumpuk pula beberapa kertas peresap di atasnya. Buffer kemudian akan mengalir pelan-pelan ke membran, demikian pula dengan gel yang membawa molekul ke kertas membran, sementara gelnya diserap oleh kertas peresap. Fragmen DNA yang spesifik dideteksi dengan menggunakan pelacak. Pelacak biasanya merupakan DNA yang dimurnikan dan bisa ditandai dengan aktifitas spesifik
Page | 6
radionukletida. Lokasi sinyal yang terlihat setelah autradiografi membuat kita dapat menentukan ukuran dari fragmen DNA tersebut.
2.2.2 Northern Blot Nothern Blot merupakan teknik yang sama dengan Southern Blot, namun menggunakan kertas DBM dan biasanya mendeteksi RNA. Dalam proses ini RNA dipisahkan berdasarkan ukuran dan kemudian ditransfer ke membran yang kemudian diperiksa dengan pelengkap berlabel urutan kepentingan. Hasilnya dapat digambarkan melalui berbagai cara tergantung pada label yang digunakan, namun hasil yang paling dalam penyataan band yang mewakili ukuran RNA terdeteksi dalam sampel. Intensitas band-band ini berkaitan dengan jumlah RNA target dalam sampel yang dianalisis. Prosedur ini umumnya digunakan untuk mempelajari kapan dan berapa banyak ekspresi gen yang terjadi dengan mengukur berapa banyak bahwa RNA hadir dalam sampel yang berbeda. Ini adalah salah satu alat yang paling dasar untuk menentukan pada waktu apa, dan dalam kondisi apa, gen-gen tertentu yang dinyatakan dalam jaringan hidup.
Page | 7
2.2.3 Eastern Blot Eastern Blot merupakan teknik yang ditemukan oleh Reinhard dan Malamud (1982), adalah proses transfer bidirectional dengan menggunakan aliran pelarut protein dari gel ke NC berdasarkan titik isoelektrik. Teknik Timur blotting adalah untuk mendeteksi modifikasi pasca-translasi protein. Protein dihapuskan ke PVDF atau membran nitroselulosa yang diperiksa untuk modifikasi menggunakan substrat tertentu. 2.2.4 Western Blot Teknik ini pertama kali dibuat oleh W. Neal Burnette dan dinamai Western blot untuk mengikuti teknik Southern blot yang pertama kali ditemukan. Western blot adalah proses pemindahan protein dari gel hasil elektroforesis ke membran. Membran ini dapat diperlakukan lebih fleksibel daripada gel sehingga protein yang terblot pada membran dapat dideteksi dengan cara visual maupun fluoresensi. Deteksi ekspresi protein pada organisme dilakukan dengan prinsip imunologi menggunakan antibodi primer dan antibodi sekunder. Setelah pemberian antibodi sekunder, deteksi dilakukan secara visual dengan pemberian kromogen atau secara fluoresensi. Pada deteksi secara fluoresensi, reaksi antara antibodi primer dengan antibodi sekunder akan memberikan hasil fluoresens yang selanjutnya akan membakar film X-ray, deteksi ini dilakukan di kamar gelap.
Page | 8
2.3
Perbedaan Teknik blothing berdasarkan DNA, RNA, dan Protein 2.3.1
Blotting berbasis DNA Teknik
blotting
berbasis
DNA
menggunakan
tenik
Southern
Blot.Keuntungan teknik ini adalah selain dapat menunjukkan integrasi gen juga dapat mengetahui jumlah salinan DNA yang terintegrasi. Analisa Southern Blot dapat digunakan untuk mengetahui sejumlah salinan gen dan kejadian transformasi yang berbeda serta membedakan integrasi ekstra kromosomal dan kromosomal. Kelemahan metode ini adalah membutuhkan DNA dalam jumlah banyak dengan kemurnian tinggi serta waktu yang lama. 2.3.2
Blotting berbasis RNA Hibridasi Northern merupakan suatu prosedur yang digunakan untuk
identifikasi dan transkrip RNA. RNA tidak dapat berikatan secara efisien pada membrane, sehingga pada analisis northern digunakan suatu membrane spesifik dimana RNA dapat berikatan secara kovalen. Dalam analisis northern , sekuen RNA spesifik dideteksi menggunakan teknik bloting yaitu RNA ditransfer dari agarose ke membrane. Hasil bloting dianalisis melalui proses hibridisasi dengan probe RNA. RNA mempunyai bentuk utas tunggal, sehingga dapat membentuk struktur sekunder melalui pasangan basa intramolekul, sehingga harus dielektroforasi di bawah kondisi denaturasi.Denaturasi dilakukan dengan penambahan formaldehid ke gel maupun loading buffer, atau perlakuan glyoxal dan dimethyl sulfoxide (DMSO) pada loading buffer. 2.3.3
Bloting berbasis protein Dalam blotting berbasis protein teknik analysis yang digunakan adalah
western blot yang merupakan metode untuk mendeteksi DNA-binding protein. Dalam metode ini protein dipisahkan dengan elektroforesis dan ditransfer ke suatu membrane sehingga protein akan terikat secara kovalen. Perinsip dasar western blot adalah identifikasi pemisahan protein tidak berlabel dengan SDS gel elektroforesis
polyacrylamide
(PAGE)
yang
didasarkan
pada
immunoradioaktivitasnya dengan menggunakan antibody monoclonal. Kemudian protein ditransferke membaran dan diberi perlakuan awal untuk mereduksi ikatan non spesifik dari antiserum ke membrane. Inkubasi membrane dilakukan denagn
Page | 9
antiserum spesifik, kemudian diinkubasi dengan antibody yang berkonjugasi dengan reagen pendeteksi dan berikatan pada antiserum primer. Setelah itu diikuti deteksi dari immunoreaksi diantara antiserum primer dan target protein spesifik.
Page | 10
BAB III PEMBAHASAN
3.1
Pengertian Northern Blot
Northern Blot merupakan suatu metode yang digunakan untuk mengetahui konstruksi RNA yang mempunyai barat molekul lebih basar. Analisa dilakukan dengan cara isolasi RNA dari jaringan yang mempunyai ekspresi gen yang paling tinggi. Untuk mendapatkan
RNA
dilakukan
dengan
denaturasi
protein
oleh
guanidinium
isothiocyanat. Elektroforesis RNA dilakukan dengan gel agarose atau ditreatment dengan Dimethylsulfoxide (DMSO) kemudian ditransfer pada nitroselulosa atau saringan nilon ,dan selanjutnya sama dengan pengamatan pada Southern Blot Analysis. Pembanding yang digunakan primer yang mengadung jumlah, struktur dan rataan dari sintesis RNA S1 nuklease. Blot utara digunakan untuk mempelajari pola ekspresi dari jenis tertentu molekul RNA sebagai perbandingan relatif antara set sampel yang berbeda dari RNA. Ini pada dasarnya adalah kombinasi dari denaturasi RNA elektroforesis gel, dan sebuah noda. Dalam proses ini RNA dipisahkan berdasarkan ukuran dan kemudian ditransfer ke membran yang kemudian diperiksa dengan pelengkap berlabel urutan kepentingan. Hasilnya dapat digambarkan melalui berbagai cara tergantung pada label yang digunakan, namun hasil yang paling dalam penyataan band yang mewakili ukuran RNA terdeteksi dalam sampel. Intensitas band-band ini berkaitan dengan jumlah RNA target
Page | 11
dalam sampel yang dianalisis. Prosedur ini umumnya digunakan untuk mempelajari kapan dan berapa banyak ekspresi gen yang terjadi dengan mengukur berapa banyak bahwa RNA hadir dalam sampel yang berbeda. Ini adalah salah satu alat yang paling dasar untuk menentukan pada waktu apa, dan dalam kondisi apa, gen-gen tertentu yang dinyatakan dalam jaringan hidup. 3.2
Prinsip dan Tujuan Teknik Northern Blot Northern blot adalah suatu teknik untuk mendapatkan informasi mengenai
identitas, ukuran dan kelimpaham RNA. Prinsip Nothern blot adalah memisahkan RNA berdasarkan ukuran dan terdeteksi pada membrane menggunakan probe hibridisasi dengan urutan basa komplementer untuk semua atau sebagian dari urutan basa mRNA target. Teknik ini pada dasarnya hibridisasi asam nukleat, perbedaannya pada RNA sebagai target. Probe sama dengan southern blot dengan target adalah mRNA. Didalam eukariot pemilihan mRNA lebih efisien karena genomic DNA tidak mempunyai intron yang mungkin interference yang mengikat probe untuk mengoreksi sekuen. Dasarnya, teknik ini menggunakan mRNA sehingga pada agarose gel tidak menggunakan perlakuan denaturasi dengan asam kuat. Tahapan yang digunakan dalam metode ini yaitu: pemisahan mRNA dengan elektroforesis, dipindahkan kedalam membrane nylon dan diinkubasi dengan probe yang utas tunggal. Probe yang sebelumnya dilabel dengan biotin atau digoxigenin atau radioaktif. Membran kemudian diperlihatkan difilem atau substrad kromegenic. Variasi dari hibridisasi nortnblot adalah dengan teknik blot titik dimana sampel tidak diseparasi berdasarkan ukuran. Melalui teknik ini mudah dilakukan hanya dengan membrane ditetesi dengn mRNA dan probe. Sepertihalnya sourthern blot DNA harus dibuat utas tunggal sebelum dblot. Sebelum ditetesi dengan DNA sampel maka probe terlebih dahulu untuk menghibridisasi probe. Kemudian membrane difisualisasikan di filem. Jika probe dan DNA atau RNA target mirip maka filem akan berwarna hitam.
Page | 12
3.1 1
Tata Laksana Northern Blot Menyiapkan sampel RNA a Menambahkan 10-20 µg RNA dalam tabung eppendorf steril b Menambahkan formamida Tujuannya adalah formamide akan menurunkan suhu pendinginan dari interaksi probe-RNA, dan mencegah degradasi RNA oleh suhu tinggi. c Menambahkan formaldehyde (2.2 M) Formaldehida digunakan untuk denaturasi agen RNA untuk membatasi struktur sekunder d Menambahkan MOPS MOPS adalah buffer yang paling umum digunakan untuk gel RNA karena
2
kapasitas buffernya pada pH 7,0. e Menambahkan pemuat dye f Memipet larutan Mengisi sampel dalam sumur dan alat dinyalakan pada 100 volt selama 2 jam. - Sampel RNA yang paling sering dipisahkan pada gel agarosa adalah sampel yang mengandung formaldehid yang digunakan sebagai agen denaturasi untuk RNA untuk membatasi struktur sekunder
Page | 13
3
Visualisasi integritas dari RNA menggunakan UV atau dengan pewarnaan EtBr Gel dapat diwarnai dengan ethidium bromide (EtBr) dan dilihat di bawah sinar UV untuk mengamati kualitas dan kuantitas RNA sebelum blotting.
4
Transfer menuju membrane nilon Membrane nilon yang paling efektif untuk digunakan dalam northern blotting adalah yang bermuatan positif karena memiliki afinitas tinggi. a Menyiapkan pemindahan RNA
Page | 14
b c d e f
Tempatkan pada kertas saring whattman berukuran 3mm Tambahkan buffer Rendam kertas saring tersebut Tempatkan kembali kertas saring yang telah direndam Hilangkan sisa-sisa gelembung udara yang ada
g
Tempatkan gel
h i j k l m
Tempatkan membrane nilon pada gel Aliri membrane nilon tersebut dengan larutan buffer Hilangkan gelembung-gelembung yang ada Tutup dengan menggunakan kertas saring whatman berukuran 3mm Tutup pula dengan plastic wrap Tumpuk kertas tersebut dengan menggunakan handuk diatas gel
Page | 15
5
6
n Tunggu hingga semalam Membongkar sistem transfer a Pindahkan handuk dan kertas saring b Menyiapkan RNA pada membrane nilon menggunakan crosslinker UV
Hibridisasi a Prehibridisasi membrane dalam prehibridisasi buffer b Inkubasi 2-4 jam
c Buang prehibridisasi buffer d Tambahkan hibridisasi buffer 7 Penambahan probe
Page | 16
Probe dari northern blot tersusun atas asam nukleat dengan sequence lengkap untuk semua atau bagian dari RNA tertentu, bisa DNA, RNA atau oligonukleotida dengan 25 basa lengkap untuk target sekuen. Perlakuan : a Inkubasi semalam dalam hibridisasi chamber b Setelah inkubasi, buang larutannya c Tambahkan larutan yang bersih d Inkubasi pada 52⁰C selama 30 menit dalam hibridisasi chamber
e
Pindahkan membrane
f
Membrane siap di film
Page | 17
BAB IV KESIMPULAN Blot adalah suatu teknik memindahkan bagian protein yang telah dipisahkan, RNA atau DNA dari gel ke lembaran tipis atau matriks membran agar bagian protein tersebut mengalami imobilisasi. Teknik ini berupa lanjutan dari penggunaan elektroforesis gel. Blotting terdiri atas berbagai macam diantaranya western blot, northern blot, dan southern blot. Perbedaan dari masing –masing Teknik blothing dilihat berdasarkan DNA, RNA, dan Protein. Southern blot substansi yang dapat dideteksi DNA dengan pemeriksaan melibatkan asam nukleat dan aplikasi utamanya denagn struktur gen, Northern blot pemeriksaannnya sama dengan Southern blot yaitu asam nuklet ,substansi yang dideteksi RNA denagn aplikasi utamnya ekspresi gen, western blot substansi yang diamati berupa protein dengan melibatkan antibodi dan aplikasi utamanya jumlah protein, southwestern blot substansi yang dideteksi protein dengan Page | 18
bantuan DNA menggunakan aplikasi utama berupa interaksi protein-DNA, sedangkan Farwestern substansi yang dideteksi berupa protein dan aplikasi utamanya deang menggunakan protein-protein. Northern Blot merupakan suatu metode yang digunakan untuk mengetahui konstruksi RNA yang mempunyai barat molekul lebih basar. Analisa dilakukan dengan cara isolasi RNA dari jaringan yang mempunyai ekspresi gen yang paling tinggi. Dasarnya, teknik ini menggunakan mRNA sehingga pada agarose gel tidak menggunakan perlakuan denaturasi dengan asam kuat. Tata laksana pada metode Northern Blot dengan Menyiapkan sampel RNA, Mengisi sampel dalam sumur dan alat dinyalakan pada 100 volt selama 2 jam, Visualisasi integritas dari RNA menggunakan UV atau dengan pewarnaan EtBr, Transfer menuju membrane nilon, Membongkar sistem transfer, Hibridisasi, Penambahan probe. SARAN Adapun saran dari penulis antara lain: -
Seirin denagn perkembangan zaman yang semakin pesat dan teknologi yang semakin canggih perlu dipelajari lebih dalam mengenai teknologi di bidang kesehatan, terutama dalam bidang bioteknologi guna memajukan ilmu
-
pengetahuan di bidang kesehatan . Sebagai mahasiswa kesehatan, sebaiknya kita terus mengikuti perkembangan dunia kesehantan yang semakin maju terutama dalam pbidang bioteknologi aanalisis berbasis asam nukleat dan protein.
Page | 19
DAFTAR PUSTAKA -
Bondioli,K.R, Biery, KA., Hill, KG., Jones, KB. and De Mayo, F.G., 1991. Production
-
of Transgenic Cattle by Pronuklear Injection in "Transgenic Animals. pp. 265 -273. Brown, T.A.1993. Recombination. In Genetics molecular approach. Chapman & Hall. London. :207-212
-
https://listonsiburian.wordpress.com/2012/03/28/southern-blotting-dan-northern-
-
blotting/ (diakses tanggal 03 maret 2016) http://www.webgentech.org/wgte/dokuman/enb.pdf (diaksese tanggal 03 maret 2016)
Page | 20
