MANUAL DE LABORATORIO virología

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO

FACULTAD DE QUÍMICA

PROGRAMA EDUCATIVO QUÌMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO

UNIDAD DE APRENDIZAJE VIROLOGÍA

MANUAL DE LABORATORIO

ELABORARON: QFB MARTHA HILDA RUIZ MENDOZA M. en C. JONNATHAN GUADALUPE SANTILLÁN BENÍTEZ D. en C. ENRIQUE MORALES AVILA Septiembre 2012

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Contenido

Introducción. Formato de la práctica y simbología Evaluación del curso. Reglamento de laboratorio de Virología. Introducción....................................................................................................................................... 3 Congruencias con el contenido programático de la unidad de aprendizaje ................................ 4 Formato de la práctica y simbología ............................................................................................... 5 Evaluación del curso ......................................................................................................................... 6 Reglamento del laboratorio de Virología ........................................................................................ 7 Manejo de residuos peligrosos ......................................................................................................... 8 Práctica 1. Constitución de un laboratorio de virología de investigación o diagnóstico. ............ 9 Práctica 2. Huevo fértil de ave como modelo biológico para el cultivo e identificación de virus. ........................................................................................................................................................... 13 Práctica 3. Inoculación de huevo embrionado en saco vitelino y cavidad alantoidea. .............. 18 Práctica 4. Replicación del virus de la bronquitis infecciosa aviar en huevo fértil de pollo (1ª parte) titulación del virus de la bronquitis infecciosa aviar (DI50) en huevo fértil de pollo (2ª parte). ............................................................................................................................................... 25 Práctica 5. Hemaglutinación .................................................................................................... 29 Práctica 6. Inhibición de la Hemaglutinación ............................................................................... 33 Práctica 7. Inoculación intracerebral de ratón lactante .............................................................. 38 Práctica 8. Diagnóstico rápido de virus rábico (tinción de Sellers) ............................................ 42 Práctica 9. Cultivo Celular (parte 1) ............................................................................................. 46 Práctica 10. Cultivo Celular (parte 2) ........................................................................................... 51 Práctica 11. Conteo Celular............................................................................................................ 55 Práctica 12. Titulación Viral .......................................................................................................... 58 Práctica 13. Determinación de anticuerpos IgM anti-Rubéola ................................................... 62 Práctica 14. Determinación de anticuerpos IgG Anti-Citomegalovirus ..................................... 65

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Introducción El término virus viene del latín veneno, se utilizó a finales del siglo XIX para describir a los agentes más pequeños que las bacterias causantes de enfermedades. En 1940 el desarrollo del microscopio electrónico posibilitó por primera vez, la visualización de los virus, años después la centrifuga de alta velocidad permitió concentrarlos y purificarlos. En la década de los 50’s con el desarrollo del cultivo celular, actual soporte de la replicación viral, junto con la inoculación de huevos embrionado y el uso de algunos animales de laboratorio, se descubren nuevos virus, la mayoría de los cuales fueron analizados en la década de los 60’s y 70’s con el fin de determinar sus características físicas, químicas y antigénicas para poder establecer las metodologías apropiadas para diagnosticarlos por el laboratorio. El diagnóstico de la etiología viral de las infecciones se ha ido generalizando gracias al desarrollo tecnológico que ha permitido disponer de métodos cada vez más sencillos, rápidos y económicos como las técnicas de biología molecular (PCR y RT-PCR). Se debe eliminar la antigua creencia de que el diagnostico viral es costoso, sumamente tardío y de interés puramente académico o epidemiológicos. Es necesario crear en los profesionales de la salud la conciencia de la utilidad del diagnóstico virológico rápido y de la disponibilidad de nuevos fármacos antivirales, las infecciones virales impactan la calidad de vida de quienes la padecen, por lo tanto, un resultado correcto y oportuno emitido por el laboratorio, permite contribuir al diagnóstico y seguimiento del paciente. Este manual está dirigido a los estudiantes del noveno semestre de la licenciatura de Químico Farmacéutico Biólogo de la facultad de química de la UAEM y pretende proporcionar a los alumnos los conocimientos y habilidades básicas para el manejo de las principales técnicas diagnósticas de laboratorio relacionadas con las infecciones virales humanas.

El programa de prácticas está integrado por cuatro secciones: 1. 2. 3. 4.

Inoculación en embrión de pollo Animales de laboratorio Cultivo celular Diagnóstico Inmuno virológico

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Congruencias con el contenido programático de la unidad de aprendizaje

Práctica Nombre de práctica Sesiones 1 Constitución de un laboratorio de virología de investigación o 1 diagnóstico. 2 Huevo fértil de ave como modelo 1 biológico para el cultivo e identificación de virus. 3 Inoculación de huevo embrionado 2 en saco vitelino y cavidad 1.3. alantoidea. 4 2 Replicación del virus de la 2.2. bronquitis infecciosa aviar en huevo fértil de pollo (1ª parte) titulación del virus de la bronquitis infecciosa aviar (DI50) en huevo fértil de pollo (2ª parte) 5 Hemaglutinación 1 1.1. 6 Inhibición de hemaglutinación 7 Inoculación intracerebral de ratón 1 3.7. lactante. 8 Diagnostico rápido de virus rábico 1 1.3. (tinción de Sellers) 9 Cultivo celular (primera parte) 2 3.4. 10 Cultivo celular (segunda parte) 11 Conteo celular 1 3.1

12 9 13 14

Titulación viral Inhibición de la Hemaglutinación Determinación de anticuerpos IgM anti-rubeola Determinación de anticuerpos IgG anti-citomegalovirus

Tema

Métodos de identificación y purificación.

Relación virus huésped

Relación virus célula. Manejo de animales de laboratorio Métodos de identificación.

1 1 1

3.0 4.1. 4.3.

Nutrientes necesarios para la replicación viral Preparación de medios de cultivo de crecimiento y mantenimiento viral Replicación viral Métodos citológicos directos Métodos inmunoserológicos

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4.3.

Métodos inmunoserológicos

Nota: el manual de laboratorio se realizó tomando en cuenta los conocimientos que se generan en una práctica y son necesarios en la mayor parte de los casos para el desarrollo de prácticas posteriores, además los materiales obtenidos en algunas prácticas se reutilizan en las practicas consecutivas, tal es el caso de la práctica 2, de donde se obtienen productos útiles en la prácticas 3, 6 y 9. 4

Formato de la práctica y simbología

Introducción Objetivo Fundamento teórico Aspectos de seguridad e higiene Materiales y reactivos Procedimiento. Este puede ser considerado como actividad o ejercicios demostrativos. Actividades de comprobación o evaluación Observaciones Bibliografía

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Evaluación del curso Evaluación de laboratorio

Reportes Procedimiento normalizado de operación 1. Introducción (no más de ½ cuartilla) 2. Objetivo 3. Alcance 4. Responsabilidades 5. Material y equipo 6. Procedimiento 7. Anexos I y II 7.1. Resultados 7.2. Discusión, conclusiones, cuestionario y referencias Total

Desempeño en laboratorio Aspecto Conocimiento de la metodología Desarrollo de la práctica Total

Calificación final de Laboratorio Reportes Desempeño en laboratorio Examen (un examen por parcial) Total

Valor 10 10

5 25 50 (25) (25) 100

Valor 30 70 100

Valor 50 30 20 100

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Reglamento del laboratorio de Virología

1. Uso obligatorio de bata blanca de manga larga y abotonada, sin bolsas y en cada área usar batas desechables sobre la blanca. 2. Uso obligatorio de guantes en el manejo de animales y muestras clínicas. 3. Usar cubre bocas o careta en el caso de prácticas de mayor riesgo. 4. Limpiar las mesas de trabajo con solución antiséptica (benzal o hipoclorito de sodio al 1 % al inicio y al finalizar la práctica. 5. No abandonar el laboratorio una vez que ha iniciado la práctica, salvo emergencia justificada. 6. No correr en el laboratorio. 7. Contar con gasas o papel adsorbente en cada mesa de trabajo. 8. Prohibido tomar alimentos dentro del laboratorio. 9. Evitar corrientes de aire en el laboratorio. 10. Disponer de recipiente con agua clorada para inactivar las puntas de las micropipetas, material contaminado con reactivos y/o muestras biológicas. 11. Utilizar jabón líquido para aseo de las manos antes de abandonar el laboratorio al término de la sesión. 12. Esterilizar en autoclave el material que así lo requiera. 13. En caso de algún accidente o percance avisar al profesor de la práctica. 14. Respetar las normas internacionales de bioseguridad en los laboratorios para trabajar virus.

LA REGLA DE ORO Toda muestra: sangre, suero, cultivos bacterianos, cultivos celulares y virus deben manipularse con extremo cuidado, como si fuesen muestras potencialmente patógenas.

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Manejo de residuos peligrosos Los residuos peligrosos son aquellos residuos producidos por el generador con algunas de las siguientes

características:

infecciosas,

combustibles,

inflamables,

explosivas,

reactivas,

radioactivas, volátiles, corrosivas y/o tóxicas, que pueden causar daño a la salud humana y/o al medio ambiente. Así mismo se consideran peligrosos los envases, empaques y embalajes que hayan estado en contacto con ellos. Al final de cada práctica se presentará una propuesta de clasificación, registro y recolección de los residuos químicos, para su posterior almacenamiento y confinamiento.

Los residuos peligrosos biológico infecciosos (R.P.B.I.) deben clasificarse y recolectarse de acuerdo a la norma NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, que considera como R.P.B.I. los siguientes: Los cultivos y cepas almacenados de agentes infecciosos. Los cultivos generados en los procedimientos diagnósticos y de investigación, asi como los generados en la producción de agentes biológicos. Su activación y tratamiento se lleva a cabo entre otros, por métodos químicos o térmicos, es el caso de la desinfección con hipoclorito de sodio y esterilización por calor seco o calór húmedo frecuentemente utilizados en las áreas de microbiología.

Fuente: Guía para el manejo de residuos peligrosos de la UAEM (julio, 2006).

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA PROGRAMA EDUCATIVO: Químico Farmacéutico Biólogo UNIDAD DE APRENDIZAJE: Virología

Práctica 1. Constitución de un laboratorio de virología de investigación o diagnóstico. Introducción El material y equipo de un laboratorio de virología es muy parecido a muchos laboratorios, aunque para muchas metodologías diagnósticas y de investigación se precisa de equipo especializado como las cámaras de flujo laminar, incubadoras de CO2, instrumentos ópticos de observación como el microscopio de epifluorescencia y el microscopio invertido, congeladores e instalaciones de criogénia como el tanque de nitrógeno líquido, refrigeradores de -20 °C, centrifuga refrigerada, autoclave, micropipetas multicanal, microdilutores. Un laboratorio de virología debe tener las paredes pintadas con pintura epóxica, las esquinas redondeadas y tener un flujo de aire positivo en las puertas para evitar que el aire externo entre, además debe cumplir con la normatividad vigente así como tener un control de calidad externo.

Objetivo El alumno investigará y conocerá el equipo y características fundamentales de un laboratorio de virología y conocerá las diferencias que tiene respecto a otros laboratorios biológicos.

Fundamento teórico La esencia de un laboratorio de virología son el equipo y la asepsia, tanto de las instalaciones como del aire. El aire se debe mantener bajo presión positiva, después de ser pasado por un filtro, esta presión positiva creará condiciones para que el polvo y los microorganismos sean arrastrados hacia fuera. Debe existir un área para el cultivo de tejidos, instalada en la zona alejada de las vías de paso. Las cámaras de flujo laminar

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reducen las necesidades del aislamiento del área, pero aun así es necesario mantener un gradiente de esterilidad, lo ideal es disponer de una habitación aislada. A continuación se describen los instrumentos de un laboratorio de cultivo celular. 1. Campana de flujo laminar. Su función es mantener un área libre de contaminantes, esto se consigue mediante un dispositivo mecánico que fuerza el paso del aire a través de un filtro superficial (HEPA). 2. Incubadora de CO2. Son estufas que regulan la temperatura a 37 °C, ya que las células en cultivo no pueden sobrevivir a temperaturas superiores a 39 ° C, además se regula la presión de CO2 esto controla el pH que hay en el interior de la incubadora, regulan también la humedad, teniendo todas estas condiciones ideales, se augura un buen desarrollo y crecimiento de las células. 3. Microscopio de contraste de fases invertido. Permite monitorear el desarrollo morfológico del cultivo, el hecho de que las muestras observadas se encuentren en recipientes anchos, precisa el uso del invertoscopio, cuya fuente de luz y objetivos se encuentran invertidos respecto a un microscopio óptico convencional. Como las muestras no presentan color, el microscopio está equipado con un dispositivo de contraste de fases que permite obtener imágenes de calidad. 4. Congeladores y equipo de criogénia. Es el sistema que permite guardar las células durante años a la temperatura del nitrógeno líquido (-196 °C). 5. Equipo de filtración, muchas soluciones y medios de cultivo que se utilizan para hacer crecer a las células necesitan ser esterilizadas por filtración a través de un dispositivo de filtración de 0.22 micrómetros de poro. 6. Equipo de esterilización o autoclave. Es un sistema que permite la esterilización por calor tanto de sólidos (material e instrumentos) como de líquidos (medios de cultivo). La esterilización habitualmente se realiza a 121 °C y 2 atmosferas de presión durante 20 minutos. 7. Centrífugas. Deben ser refrigeradas preferentemente con posibilidades de usar en ellas tubos con volúmenes de 1 a 2 mL, hasta botellas de 250 a 500 mL, deben instalarse lejos de las campanas de flujo laminar para evitar las turbulencias de aire que generan. 8. Contador electrónico de células. Este instrumento es capaz de medir y contar partículas en suspensión, consta de 2 electrodos que transmiten al equipo de amplificación y análisis los cambios de resistencia que detectan, cada vez que una célula en suspensión los atraviesa.

Aspectos de seguridad e higiene 1. Durante la visita al Laboratorio de Biología Molecular del CICMED será necesario el uso de equipo de protección básico como la bata blanca de manga larga y abotonada. 10

2. Conducirse con compostura dentro del laboratorio y seguir las indicaciones del coordinador. Procedimiento

1. Se realizará una visita al laboratorio de Biología Molecular del CICMED UAEMéx

2. El alumno elaborará un trabajo de investigación documental describiendo el equipo y los aspectos más importantes de un laboratorio de virología.

3. Investigará la normatividad que debe cuidarse para el buen funcionamiento de un laboratorio de virología

Actividades de comprobación o evaluación

1. ¿Cuáles son los usos del tanque de nitrógeno líquido y que temperatura alcanzan? 2. Describe las características de las campanas de seguridad biológica o campanas de flujo laminar. 3. Describe las diferencias que hay entre los microscopios de epifluorescencia, de luz ordinaria y el invertoscopio. 4. Describe las diferencias elementales entre una centrifuga ordinaria y una centrifuga refrigerada. Observaciones

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Bibliografía 1. Fenner-Whitte (1998). Virología Médica. Ed. Prensa Medica 2. InDRE (1995). Manual de técnicas de laboratorio de virología y bacteriología médica Vol. 1 3. Carballa IG., Oubiña J. (1998). Virología Médica. Ed. El ateneo, Argentina 4. Díaz R., Gamazo C. y López Goñi (1999). Manual práctico de virología. 2da Edición. Editorial Masson. S.A. Barcelona. 5. http://www.virology.net/

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Práctica 2. Huevo fértil de ave como modelo biológico para el cultivo e identificación de virus. Introducción Los embriones se han utilizado como el huésped natural para el crecimiento de los virus, propagación y caracterización de los virus aviares y para la producción de vacunas virales.

Objetivo Que el alumno conozca la importancia diagnóstica y usos de los huevos embrionados así como su anatomía, técnicas de inoculación y la susceptibilidad viral al cultivarse en las diferentes cavidades y observando los efectos citopáticos que producen ciertos virus humanos.

Fundamento teórico El embrión y sus membranas ayudan a proveer la diversidad de células necesarias para el cultivo de diferentes tipos de virus, depende sobre todo de varias condiciones: 1. Vía de inoculación 2. Edad del embrión 3. Periodo de tiempo de incubación 4. Volumen y dilución del inóculo utilizado 5. Temperatura de incubación 6. El estado inmune de la parvada por el cual los embriones son obtenidos Manejos preliminares. La utilización de huevo fértil en el laboratorio, no debe ser obtenida de parvadas infectadas con agentes virales conocidos u otros agentes microbianos. Después de 4 a 5 días de incubación cuando el embrión puede ser observado fácilmente, estos son evaluados para determinar cuáles son fértiles. La incubación es alrededor de 37° C y una humedad de 60 a 70% (un alto exceso de humedad permite un subdesarrollo de la cámara de aire, por lo tanto una baja de humedad permitirá que haya un desarrollo menor). Los embriones deben estar

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en movimiento varias veces al día, ya sea automáticamente o manualmente, el periodo de incubación antes de la inoculación depende sobre todo de la vía de inoculación. Ovoscopia. La ovoscopia consiste en revisar los huevos embrionados contra una fuente de luz intensa en un ovoscopio, de esta manera mostrara el embrión, las membranas asociadas y las cavidades del embrión se observan fácilmente. 1. En un cuarto obscuro, colocar el huevo embrionado al ovoscopio y observar el movimiento, las condiciones de las venas de sangre y el estado del embrión. Notar las diferencias con los embriones de diferentes edades. 2. Con un lápiz, marcar la posición del embrión y la cámara de aire (esta área es mantenida arriba en el ovoscopio). 3. Comparar los embriones fértiles y los embriones muertos de varias edades, descartar los embriones infértiles y muertos. Estructura del huevo embrionado. Justo bajo el cascarón se encuentra una membrana fibrosa que se disemina a través de la superficie interna del embrión y forma la cámara de aire en el extremo ancho del huevo. Esta membrana en conjunto con el cascarón ayuda al intercambio de gases en el huevo. Esta distribución de gases se facilita por la membrana corioalantoidea altamente vascularizada que sirve como órgano respiratorio del embrión. Esta membrana se forma de manera adyacente a la membrana del cascarón y forma una cavidad conocida como saco alantoideo que contiene entre 5 a 10 ml de fluido alantoideo. El embrión se encuentra envuelto por la membrana amniótica formando el saco amniótico que contiene entre 1 y 2 ml de fluido amniótico. El embrión se encuentra unido al saco vitelino que es su fuente de nutrientes y se encuentra localizado aproximadamente al centro del huevo. Técnicas y/o vías de inoculación. Las cuatro vías más comunes para la inoculación del huevo embrionado fértil son: La vía de saco alantoideo La vía de saco vitelino La vía de membrana corioalantoidea (MCA) La vía de saco amniótico. En situaciones de diagnóstico donde hay un agente no especifico que es sospechoso, es conveniente utilizar muchas vías como sean posibles. Si una elección ha sido hecha, la vía MCA es preferida a causa de su sensibilidad a un gran número de virus y porque es menos probable para afectarse por contaminación bacteriana. Saco vitelino. La inoculación en saco vitelino es utilizada para el aislamiento y propagación del virus de encefalomielitis aviar. Los embriones inoculados por esta vía, son generalmente incubados de 10 a 13 días postinoculación. 14

Las lesiones que normalmente se presentan en los embriones al término del periodo de incubación es parálisis de patas. Si los embriones se dejan nacer, a partir del tercer día de nacidos se pueden observar pollos que se sientan en las patas, no se mueven bien y algunos caen hacia los lados. Aparece un ligero pero rápido temblor del cuello y de la cabeza, que especialmente se nota cuando los pollitos afectados se mantienen en la mano. Cavidad alantoidea. La inoculación de embriones en saco alantoideo es utilizada para el aislamiento y propagación de los Paramyxovirus, Myxovirus y Coronavirus. Los embriones inoculados por esta vía, son generalmente incubados de 4 a 7 días postinoculación. Las lesiones que se presentan en los embriones por los Paramyxovirus y los Myxovirus es que pueden llegar a causar la muerte de los embriones, siempre y cuando se trate de cepas altamente patógenas, pero tanto los Paramyxovirus como los Myxovirus normalmente se evalua a través de fluido alantoideo de los embriones y no tanto por las lesiones. En el fluido alantoideo lo que se tiene que hacer es una prueba de hemoaglutinación con glóbulos rojos de ave al 5 % para determinar la presencia de hemoaglutininas en dicho fluido, que no es otra cosa más que la formación de grumos de color rojo rodeados por espacios transparentes fácilmente visible. Las lesiones que normalmente se presentan en los embriones por los Coronavirus son enanismo, encorvamiento, desarrollo anormal de la pluma y depósitos de uratos en riñones. Membrana corioalantoidea (MCA). La inoculación de embriones en MCA es utilizada para el aislamiento y pases de Poxvirus y virus Herpes. Los embriones inoculados por esta vía son incubados durante 7 días postinoculación. Las lesiones que presentan los embriones por los virus Herpes y Poxvirus es principalmente en la membrana. Presencia de áreas focales (pústulas) engrosadas con necrosis o un engrosamiento generalizado de la membrana. Saco amniótico. La inoculación de embriones en saco amniótico es utilizada para el aislamiento inicial de los Myxovirus. Los embriones inoculados por esta vía, son generalmente incubados de 4 a 7 días postinoculación. Las lesiones que se presentan en los embriones por los Myxovirus son hemorragias generalizadas en todo el embrión y pueden llegar a causar la muerte, siempre y cuando se trate de cepas altamente patógenas, pero también se evalúa por la presencia de hemoaglutininas que se encuentran en el fluido alantoideo del embrión. Intravenosa. La inoculación por esta vía no tiene aplicación amplia para el estudio de infecciones experimentales en embriones de pollo. El procedimiento es generalmente empleado para estudios hematológicos. Embriones de 10 a 15 días de edad son los más adecuados para esta vía. La cantidad de inóculo puede variar de 0.2 a 0.5 ml. Intracerebral. La inoculación puede ser realizada con embriones de 8 a 14 días de edad y el inóculo es de 0.1.a 0.2 ml. Esta vía puede ser empleada en estudios de alteraciones patológicas del cerebro. Los virus de herpes simple y rabia pueden ser cultivados por esta vía. 15

Aspectos de higiene y seguridad El riesgo de infección en el caso de inoculación de pollo y animales se asocia con el peligro inherente al manejo de agujas y jeringas, las cuales deben purgarse usando un tubo que contenga un material absorbente para evitar salpicaduras o aerosoles, después de su uso desecharlas en recipientes rígidos para residuos peligrosos biológico infecciosos (RPBI), o en el contenedor de punzocortantes, jamás re-encapuchar. La cosecha de líquidos y/o tejidos de los embriones debe realizarse de manera cuidadosa, depositando los residuos en una bolsa amarilla de RPBI’s. Materiales y reactivos 3 Huevos no embrionados Ovoscopio 1 Jeringas de 3 mL 2 jeringas de insulina (de aguja desmontable) Gasas y torundas Alcohol al 70 % Barniz para uñas o pegamento liquido blanco Cajas petri Azul de metileno al 2 % Solución de alcohol-benzal (1:1) Procedimiento A. Metodología de ensayo de inoculación 1. Revisar características de los huevos, A. las Inoculación. para verificar que se encuentren en condiciones satisfactorias para su uso, deben tener el cascaron completo, sin áreas frágiles o fracturadas.

2. Con ayuda del ovoscopio identificar las estructuras del huevo (ver anexo 1).

4. Inocular 100 μL de colorante en las diferentes cavidades.

3. Encontrar y marcar el saco o cámara de aire en la parte superior del huevo.

5. Romper los huevos en las cajas petri y evaluar la correcta inoculación.

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Anexo 1

Actividades de comprobación o evaluación 1. Realiza un modelado de las estructura del huevo embrionado (puedes usar los materiales que desees), tu trabajo se presentara la siguiente sesión de laboratorio.

Observaciones

Bibliografía. 1. Fenner-Whitte (1998). Virología Médica. Ed. Prensa Medica 2. InDRE (1995). Manual de técnicas de laboratorio de virología y bacteriología médica Vol. 1 3. Carballa IG., Oubiña J. (1998). Virología Médica. Ed. El ateneo, Argentina 4. Díaz R., Gamazo C. y López Goñi (1999). Manual práctico de virología. 2da Edición. Editorail Masson. S.A. Barcelona. 17


Práctica 3. Inoculación de huevo embrionado en saco vitelino y cavidad alantoidea. Introducción Los huevos embrionados se usan de manera limitada en la actualidad para el diagnóstico viral, pues son baratos, de fácil manipulación, estériles y contienen varias cavidades que permiten inocular varios virus a la vez. Este sistema biológico ha sido utilizado para la investigación viral en el laboratorio, además en la producción de ciertas vacunas.

Objetivo Que el alumno conozca la importancia diagnóstica y usos de los huevos embrionados así como su anatomía, técnicas de inoculación y la susceptibilidad viral al cultivarse en las diferentes cavidades y observando los efectos citopáticos que producen ciertos virus humanos.

Fundamento teórico El huevo fértil de ave es una fuente de tejido vivo empleado como un sistema sensible para el cultivo, titulación e identificación de virus. En comparación con los animales de laboratorio empleados en los ensayos virales, el modelo de huevo fértil ofrece diversas ventajas tales como:    

Son estériles. No tienen funciones inmunológicas desarrolladas. No son costosos. Son accesibles y no requieren para su manejo de tanta destreza técnica

en comparación con otros sistemas biológicos, tales como el mantenimiento y reproducción de Cultivos Celulares. El huevo fértil empleado para el cultivo de virus, debe obtenerse de aves sanas ALPES, aves libres de patógenos específicos o SPF por sus siglas en inglés, para de esta manera eliminar la presencia de virus que comúnmente afectan a las aves como Adenovirus o Bronquitis Infecciosa Aviar, etc.

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Para la propagación, cultivo y titulación de virus, es indispensable determinar la viabilidad del embrión, así como dominar las técnicas para las diferentes vías de inoculación debido a la especificidad que presentan algunos viriones por determinadas células o tejidos. En la figura 3 se presenta en esquema de las diferentes zonas que conforman a un huevo fértil. Una vez realizado el ensayo de la inoculación, deberá observarse el conjunto del huevo fértil para reconocer las cavidades y fluidos que constituyen al sistema biológico empleado. Los virus pueden inocularse en las diferentes estructuras de los huevos embrionados de pollo o pato, los huevos se inoculan entre los 5 a los 14 días post-fertilización, dependiendo del estado de desarrollo de la membrana o cavidad que se desee infectar, el sitio de inoculación se elige según el tropismo viral y puede ser: a. b. c. d. e. f.

En la superficie de la membrana corioalantoidea En la cavidad corioalantoidea En el saco vitelino En el saco amniótico En el sistema vascular (vena corioalantoidea) En el propio embrión (intracerebral)

Para la inoculación del embrión (7-14 días) se practica un pequeño orificio en el cascarón del huevo, previa asepsia y se inyecta el inoculo, se incuba a 37 ° C, la replicación viral puede producir la muerte del embrión, lesiones características o la manifestación de antígenos virales por ejemplo las hemaglutininas. Los huevos embrionados presentan la ventaja de ser bacteriológicamente estériles y de fácil manipulación, actualmente su uso está restringido al aislamiento, propagación y elaboración de vacunas mixovirus, paramixovirus y poxvirus.

Vías de inoculación de huevo hembrionado

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Materiales y reactivos Embriones de pollo libres de patógenos de 9 a 11 días de incubación. Virus de New Castle. Solución de azul de metileno al 2 %. Solución de alcohol-benzal (1:1) Solución salina fisiológica. Jeringas para insulina estériles. Gasas y torundas. Tubos de ensayo. Vasos de pp de 100mL. Lápiz y marcador. Esmalte para uñas o pegamento blanco. Cajas petri. Equipo de disección (pinzas y tijeras de punta fina). Ovoscopio. Estufa a 37 °C. Recipiente de desechos de RPBI. 3 jeringas de insulina con aguja No. 22 Procedimiento a. Metodología de inoculación 1. Al llegar los embriones al laboratorio, B. Inoculación. revisar que se encuentren en condiciones satisfactorias para su uso en la inoculación de virus, deben tener el cascaron completo, sin áreas frágiles o fracturadas (ver anexo 1).

2. Con ayuda del ovoscopio verificar que cada huevo tenga un embrión vivo, de tamaño adecuado al desarrollo normal de 7-9 días de incubación.

3. Con el ovoscopio marcar con un lápiz sobre el cascarón la membrana que separa al embrión de la cámara de aire.

4. Encontrar y marcar el saco o cámara de aire en la parte superior del huevo.

5. Antes de inocular, limpiar el área y asegurarse que todos los implementos de trabajo estén a la mano.

6. Desinfectar la superficie marcada en el cascarón con la solución alcohol-benzal o de lugol.

8. Usando el ovoscopio localizar la porción del embrión para inocular en el saco amniótico y alantoideo.

7. Con ayuda de la jeringa hipodérmica hacer una punción en el centro de la cámara de aire (ver anexo 2 y figura 1).

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9.

A través del orificio hecho en el cascaron y con Angulo de 10 a 20° introducir cuidadosamente la aguja dirigiéndola a un lado del embrión. Tratando de no lastimarlo e inocular 0.1 mL de la muestra.

10. Retirar la aguja de la región amniótica, aproximadamente 1 cm, para situarla en la cavidad alantoidea e inocular 0.1 mL de muestra.

12. Los testigos no reciben ningún tratamiento, y se incuban en las mismas condiciones que los inoculados.

11. Sellar el orificio del cascarón con parafina, pegamento blanco o esmalte de uñas e incubar a 34 ° C por 72 h.

13. Al terminar, limpiar y desinfectar perfectamente el área de trabajo.

Anexo 1: CONFIRMACIÓN DE LA VIABILIDAD DEL EMBRIÓN Trasluminar cada embrión colocando el extremo romo en la ventana del ovoscopio. Un embrión no viable puede reconocerse a través de:    

Desprendimiento de la membrana corioalantoidea de la parte interna de la cutícula. Falta de irrigación. Falta de movimiento. Cualquier coloración de verde a negra que indica por lo general contaminación bacteriana. Anexo 2: b. Otra formas de inoculación

Inoculación en el Saco Vitelino: 1. El saco vitelino se encuentra en posición contraria al embrión. 2. Observar al ovoscopio y marcar el límite de la cámara de aire, marcando la posición del embrión. La cámara de aire debe estar en el polo. 3. Realizar un pequeño agujero en el límite de las ¾ partes del huevo. 4. Tomar el inoculo con aguja de inoculación No. 22 con una jeringa de insulina. 5. Inocular en el agujero hecho en posición directa al embrión con ángulo de 90°. Inoculación en la Cavidad Alantoidea: 1. Colocar el huevo con posición vertical y con un taladro hacer un orificio en posición directa del embrión. 2. Con aguja N° 22 pinchar en forma oblicua formando un ángulo de 45° en el borde (en relación al polo de la cámara de aire); introducir las 1½ pulgadas.

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3 . Otra forma es marcar la cámara de aire, a 0.5 cm de la marca hacer un agujero e inocular 0.3 mL del inoculo con un aguja número 26 ó 27 de insulina. 4 . Hacer un agujero por encima de la cámara de aire y en posición contraria al embrión e inocular. Inoculación en la Cavidad Amniótica: 1. Practicar un agujero en posición directa al embrión; con aguja 22 de 1½pulgadas. Inocular directamente al embrión, introduciendo toda la aguja. 2. Podemos también abrir toda la cámara, añadir 1 gota de solución salina fisiológica o agua destilada, para que la membrana fárfara, que inicialmente es blanca se haga transparente. 3. Introducir la pinza y levantar la membrana de la cavidad amniótica, observar el embrión e inocular. Inoculación en la Cavidad Coriolantoidea: 1. Se práctica un agujero en el polo más ensanchado del huevo 2. Para inocular: Utilizando la cámara natural: inoculando por debajo de fárfara que cubre, depositando el líquido sobre la membrana corioalantoidea, usando jeringa de insulina y aguja 26 ó 27. Fabricando una cámara de aire artificial: practicar dos agujeros; uno en el polo más ensanchado y otro en uno de los costados del huevo en posición contraria al embrión. Colocar una jeringa en la el agujero y obtener el aire del polo más ensanchado (cuando sale el aire). La membrana corioalantoidea baja; es decir este se separa más de la cáscara. 3. Evitar abrir demasiado para que no se contamine. 4. Se inocula con ayuda de una jeringa de 25 o 27 x 1 ó ½ de pulgada. 5. Para inocular se introduce la aguja y enseguida se inocula el fluido, en la inoculación puede girar la jeringa para que el líquido, quede depositado en la membrana. 6. Después de realizadas las inoculaciones, los agujeros son cubiertos con parafina cera. c. Cosecha del virus 1. Cortar con las tijeras la cáscara a nivel del límite de la cámara de aire. 4. En caso de no haber líquido, hacer un lavado con suero fisiológico estéril (1mL) y luego se colecta este líquido.

2. Con ayuda de una jeringa retirar el líquido alantoideo. 3. Extraer con pipeta Pasteur el líquido amniótico.

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Figura 1. Rutas de inoculación de virus en los huevos embrionados. 1. En la cavidad alantoidea, 2. En la cavidad amniótica, 3. En el saco vitelino, 4. En la membrana corioalantoidea.


1. Menciona tres usos de los huevos embrionados en el laboratorio de virología. 2. Esquematiza un huevo embrionado, señalando cada una de las cavidades que los caracterizan. 3. ¿En qué cavidad es susceptible inocular un herpes virus? 4. Los poxvirus ¿en qué cavidad se inoculan? 5. ¿Qué efecto produce el herpes virus en el embrión? Identifica las partes de los huevos embrionados.

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Observaciones

Bibliografía. 1. Fenner-Whitte (1998). Virología Médica. Ed. Prensa Medica 2. InDRE (1995). Manual de técnicas de laboratorio de virología y bacteriología médica Vol. 1 3. Carballa IG., Oubiña J. (1998). Virología Médica. Ed. El ateneo, Argentina 4. Díaz R., Gamazo C. y López Goñi (1999). Manual práctico de virología. 2da Edición. Editorail Masson. S.A. Barcelona.

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Práctica 4. Replicación del virus de la bronquitis infecciosa aviar en huevo fértil de pollo (1ª parte) titulación del virus de la bronquitis infecciosa aviar (DI50) en huevo fértil de pollo (2ª parte).

Objetivos El alumno dominara las técnicas para propagar y titular una cepa vacunal de virus. El alumno determinará la DLEP50 para la vacuna del Virus de la Bronquitis Aviar (VBA), calculando sus concentraciónes por unidad de volumen. Introducción Existen diversos agentes infecciosos que provocan en el humano y otros mamíferos daños severos e incluso la muerte. En el mejor de los casos lo deseable es que esta interacción induzca una protección inmunológica al individuo como consecuencia del reconocimiento de antígenos específicos tanto en forma natural como artificial. En el caso de medidas profilácticas, con el empleo de vacunas se procura inducir una Inmunidad Adquirida Activa Artificial. Para obtener resultados satisfactorios, es indispensable evaluar la calidad de la vacuna. Para las vacunas elaboradas con virus atenuados, la valoración se puede efectuar en sistemas biológicos tales como huevos fértiles de ave que pueden responder a la infección viral dando lesiones características del virión inoculado que afecte directamente al embrión y le produce signos tales como músculos distróficos, enanismo o muerte, o bien, afectan estructuras y líquidos extraembrionarios donde se pueden observar hemorragias, formación de placas o pústulas así como determinar la presencia de hemaglutininas virales. Los virus vacunales o de campo pueden titularse en conjunto de huevos fértiles de ave huando producen su muerte calculando entonces una Dosis Letal al 50% (DLEP50) o en el caso de virus hemaglutinantes calculando Dosis Infectivas al 50% (DIEP50) empleando la reacción de Hemaglutinación de los fluidos cosechados. Aspectos de higiene y seguridad El riesgo de infección en el caso de inoculación de pollo y animales se asocia con el peligro inherente al manejo de agujas y jeringas, las cuales deben purgarse usando un tubo que contenga un material absorbente para evitar salpicaduras o aerosoles, después de su uso desecharlas en recipientes rígidos para residuos peligrosos biológico infecciosos (RPBI), o 25

en el contenedor de punzocortantes, jamás re-encapuchar. La cosecha de líquidos y/o tejidos de los embriones debe realizarse de manera cuidadosa, depositando los residuos en una bolsa amarilla de RPBI’s.

Materiales y reactivos Huevo fértil de ave de 10 dias de incubación (+/- 1 dia) calidad ALPES. Vacuna de VBA. INTERVET Solucion salina de Dulbecco Lápiz, pegamento blanco y perforadores Hisopos estériles, tintura de yodo. Estufa a 37°C. Ovoscopio. Jeringas de insulina. Mechero. Recipiente para desechos. Procedimiento 1. Realizar con solución salina de Dulbecco diluciones seriadas de la vacuna viral desde 10-1 hasta 10-6 a partir de una suspensión concentrada. 2. Trasluminar el huevo fértil de ave y seguir la técnica de inoculación para cavidad alantoidea 3. Desinfectar el sitio marcado con el punto o cruz de inoculación con tintura de yodo antes y después de perforar 4. Inocular 0.1 ml de las cuatro últimas diluciones en cada uno de 5 embriones de 9 a 11 días de incubación (20 embriones en total), vía cavidad alantoidea. 5. Desinfectar nuevamente y sellar la perforación con una gota de pegamento blanco 6. Marcar con lápiz sobre cada embrión la dilución y vacuna inoculadas 7. Incubar a 37°C durante 7 dias, revisando diariamente la viabilidad de los embriones al ovoscopio, señalando en el primer dia los embriones que resulten muertos por traumatismo 8. Al termino de la incubación, trasluminar los embriones al ovoscopio y realizar un recuento de embriones vivos y muertos. 9. Anotar los resultados obtenidos y realizar los cálculos para determinar la DLEP50 / 0.1 ml empleando el método de Reed & Muench, con base en el siguiente ejemplo:

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Para una mejor explicación, se desgloza a continuación la realización de los cálculos para cada columna: 1. Realizar la suma acumulada de embriones muertos desde la dilución más alta hasta la más baja. 2. Realizar la suma acumulada de embriones vivos desde la dilución más baja a la más alta. 3. Calcular el cociente dado por los acumulados muertos sobre la suma de acumulados muertos más acumulados vivos de cada dilución. CALCULAR EL VALOR DE INTERPOLACIÓN (V.I.)

Localizar las diluciones entre las que se encuentra el 50% de mortalidad En el ejemplo: 104 y 10-5. Estimar la DLEP50 sumando el V.I.C. al exponente de la dilución que presente mayor al 50% de efecto. En el ejemplo : 10-4 + (-0.49) = 10-4.49 = DLEP50 El titulo se obtiene con el inverso de la DLEP50. Finalmente: Titulo = 104.49

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Actividades de evaluación 1. Además de la titulación viral, que otras pruebas se deben realizar a un lote vacunal antes de salir al mercado. 2. Mencione otras dosis al 50% que se pueden calcular para titular una muestra viral.

Observaciones

Bibliografía 1. Fenner-Whitte (1998). Virología Médica. Ed. Prensa Medica 2. InDRE (1995). Manual de técnicas de laboratorio de virología y bacteriología médica Vol. 1 3. Carballa IG., Oubiña J. (1998). Virología Médica. Ed. El ateneo, Argentina 4. Díaz R., Gamazo C. y López Goñi (1999). Manual práctico de virología. 2da Edición. Editorail Masson. S.A. Barcelona.

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Práctica 5. Hemaglutinación Introducción: La hemoaglutinación es un método donde no se mide la capacidad infecciosa de las partículas virales. Es una técnica indirecta para medir partículas virales, pues en realidad mediante esta técnica se mide la cantidad de partículas hemaglutinantes (proteínas virales) independientemente si estas están incluidas en la partícula viral o libres como antígeno.

Objetivo Se realizará el reconocimiento del virus de New Castle mediante la Hemoaglutinación Directa, por su acción sobre los glóbulos rojos de pollo.

Fundamento teórico La hemoaglutinación es uno de los métodos indirectos más comunes para cuantificar partículas virales y/o antígenos virales hemaglutinantes en suspensión. En esta los eritrocitos se pueden sensibilizar con diversos antígenos y se pueden usar como un sistema indicador. Así, si se descubren los anticuerpos, la reacción se revelará como una hemoaglutinación que se puede advertir a simple vista. Existe una gran cantidad de antígenos que se pueden unir a los glóbulos rojos, entre ellos los carbohidratos que se adhieren con rapidez. En el caso de las proteínas se requiere un proceso de pre-tratamiento con ácido tánico o con cloruro de cromo. Este sistema se usa para demostrar anticuerpos contra toxinas como la de la difteria o del tétanos. También para descubrir anticuerpos contra el virus de la fiebre amarilla, VZV, influenza, parainfluenza y dengue. Un virus hemaglutinante es aquel capaz de aglutinar glóbulos rojos de determinada especie animal, p.ej. los virus ya mencionados anteriormente. El título de una hemoaglutinación está determinado por la última dilución de una serie, en donde se observa, macroscópicamente, una malla formada por la unión del virus y/o antígeno libre a receptores en la membrana de los glóbulos rojos y en la siguiente dilución un sedimento o “botón” de glóbulos rojos.

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Aspectos de seguridad e higiene 1. 2. 3. 4.

Desinfectar el área de trabajo al inicio y al final de la práctica. Uso de protección personal. Adecuada disposición de los residuos en una bolsa amarilla de RPBI’s. Tratamiento químico adecuado para la desinfección del material que tuvo contacto con los productos biológicos.

Materiales y reactivos Virus New Castle. Glóbulos Rojos de pollo lavados. Para el caso de seres humanos: usar grupo sanguíneo “O”. Solución Salina Fisiológica. Gradillas. Tubos de ensayo. Pipetas. Espejo. Centrífuga. Procedimiento: Preparación de Glóbulos Rojos Lavados: 1. Extraer la sangre de pollo (previamente vacunado); y conservarla en un tubo con anticoagulante.

2. Centrifugar a 1500 rpm por 5 min.

3. Eliminamos el sobrenadante (plasma).

4. Extraer la sangre de pollo (previamente vacunado); y conservarla en un tubo con anticoagulante.

5. Agregar al tubo (Paquete Celular) solución salina fisiológica y mezclar.

6. Volver a centrifugar a 1500 rpm por 5 min.

7. Luego, tomamos de 0.7 ml. de glóbulos rojos del paquete celular y lo suspendemos en 100 ml. de SSF, para obtener el 0.7 % de glóbulos rojos lavados.

8. Eliminamos el sobrenadante y volvemos a repetir el proceso de lavado 2 – 3 veces más.

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Reacción de Hemoaglutinación: 1. Colocamos 8 tubos en un gradilla, colocándole al primero 180 μl. de SSF y del tubo 2 al 8 añadir 100 μl. de Suero Fisiológico.

2. Con una pipeta tomar 20 μl. de cepa de Newcastle y depositarla en el tubo No. 1 (dilución 1/5).

3. Repetir hasta obtener las diluciones 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320, 1/640, 1/1280 (el tubo N° 09 es el control se le añadirá 0.5 ml. de la cepa New Castle).

4. Tomamos 100 μl. del tubo 01 y lo depositarnos en el tubo Nº 02, (dilución 1/10).

5. A cada tubo colocamos 100 μl. de los glóbulos rojos lavados al 1 % (incluyendo el tubo control).

8. La última dilución en la cual aparece HA es el título del virus (este es el inverso de dicha dilución).

6. Dejamos reposar al medio ambiente por 15 a 20 minutos.

7. Pasado el tiempo, colocamos debajo de la gradilla un espejo, para observar si hay “hemaglutinación positiva” (formación de una malla delgada, gris) o hemoaglutinación negativa (se observa un punto rojo).

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Actividades de comprobación o evaluación 1. 2. 3. 4.

Describe el fenómeno de hemaglutinación ¿Cuál es la diferencia entre aglutinación directa e indirecta? ¿Cuál es la utilidad de la técnica de hemaglutinación por virus? Mencione tres ejemplos de virus que puedan ser analizados mediante la prueba de HA. 5. Cite dos causas por las que se puedan obtener resultados falsos negativos en la prueba de HA. 6. Porqué es importante determinar la dilución que contiene 4 UHA.

Observaciones

Bibliografía. 1. Fenner-Whitte (1998). Virología Médica. Ed. Prensa Medica 2. InDRE (1995). Manual de técnicas de laboratorio de virología y bacteriología médica Vol. 1 3. Carballa IG., Oubiña J. (1998). Virología Médica. Ed. El ateneo, Argentina 4. Díaz R., Gamazo C. y López Goñi (1999). Manual práctico de virología. 2da Edición. Editorial Masson. S.A. Barcelona.

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Práctica 6. Inhibición de la Hemaglutinación

Introducción. La prueba de Hemaglutinación es un diagnóstico presuntivo más no específico de infección por virus del Newcastle, de manera que de resultar positiva no nos permite asegurar que este virus sea el agente causal. La prueba de hemaglutinación se basa en una característica inherente de la estructura de ciertos virus como lo de la influenza y rubéola, los cuales contienen en su superficie componentes que se asocian a moléculas de superficie de los eritrocitos y los aglutinan. El virus hemaglutinante forma puentes entre los eritrocitos y cambia su patrón normal de asentamiento, este fenómeno se llama hemaglutinación, el bloqueo de este fenómeno es conocido como inhibición de la hemaglutinación.

Objetivo. Que el alumno conozca el fundamento de la técnica de la inhibición de la hemaglutinación (IHA) y su aplicación en el diagnóstico, así como determinar si están protegidos contra la rubéola de acuerdo al título de anticuerpos presentes en suero y principalmente en alumnas.

Fundamento teórico Para realizar un diagnóstico definitivo se debe realizar una prueba que demuestre una respuesta específica del huésped hacia este virus, dicha respuesta está representada por la presencia de anticuerpos y la prueba empleada para ello se conoce como Inhibición de la Hemaglutinación (IHA). Esta prueba se basa en la unión de un anticuerpo específico hacia la hemaglutinina del virión que impida la formación de puentes entre el ligando viral y el receptor celular. Este hecho permite identificar plenamente al virus y se conoce como neutralización vírica. Muchas de las familias de virus poseen la capacidad de aglutinar eritrocitos de diversas especies animales (pollos, patos, bovinos, etc) Esta propiedad fue descubierta en 1941 por Hirst y McClelland en virus de la gripe.

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El fenómeno básico se da por la unión de hemaglutininas virales (proteínas de la membrana de los virus) con los receptores mucoproteicos presentes en las membranas de muchas células y que son especialmente abundantes en los eritrocitos. Si la concentración de viriones es suficiente, se formarán múltiples puentes entre ellos y los eritrocitos, depositándose en el fondo del tubo en forma de retículos, los eritrocitos que no fueron aglutinados, se depositarán en el fondo del tubo en forma de botón. Los anticuerpos presentes en el suero pueden inhibir la hemaglutinación originada por ciertos virus. Si se hace reaccionar a un virus con capacidad de hemaglutinación con su anticuerpo específico, este anulará su capacidad de hemaglutinación por bloqueo de las hemaglutininas presentes en la envoltura del virión. La inhibición de la hemaglutinación es un método diagnóstico utilizado con frecuencia, tanto para identificar virus, como para determinar la presencia de anticuerpos específicos. Es necesario tratar los sueros para eliminar inhibidores específicos de la hemaglutinación. Aspectos de seguridad e higiene Uso de aditamentos de protección son la bata, guantes, mascarilla y/o anteojos. Se debe desinfectar el área de trabajo antes de iniciar y al concluir la práctica. La succión y vaciado de líquidos se realiza utilizando pipetas con bulbos o pipeteadores automáticos. Nunca pipetear con la boca. Las puntas y pipetas contaminadas deberán colocarse dentro de recipientes que contengan hipoclorito de sodio al 1%. Evitar derrames o salpicaduras del material biológico. Esterilizar o desechar adecuadamente las muestras.

Materiales y reactivos Equipo de microtitulación Microplacas de 96 pozos de fondo en U Microdilutores de 25 L Pipeta automática multicanal con rango de 25 a 100 L Puntas para pipeta automática estériles Suero Humano tratado Eritrocitos en solución de PBS al 85% (pollo, cobayo o de pato) Vacuna viral (viriones atenuados New Castle, cepa La Sota, INTERVET ) Solución salina de fosfatos pH 7.2 (PBS) Solución de hipoclorito de sodio. Alcohol y algodón. Recipiente para recolección de desechos.

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Procedimiento 1. Estandarizacíón de los eritrocitos. Con base en los resultados de la práctica anterior, preparar en un tubo una dilución del virus del Newcastle que contenga 4 UHA en un volumen suficiente para realizar la prueba de IHA (ver ejemplo).

2. Hacer diluciones al doble problema, desde 1:2 hasta acuerdo al esquema de la incluir un pozo control contendrá antisuero ni virus.

4. Colocar en el pozo 1 75 μl del suero

3. Agregar 75 μl de SSI a los pozos del

problema y mezclar por aspersión y dispersión de dos a tres veces obteniendo así la dilución 1:2.

1 al 9 de la microplaca.

5. Transferir 75 μl de ésta dilución al pozo 2 y mezclar homogéneamente.

6.

NOTA IMPORTANTE: No se debe agregar dilución del suero al pozo No. 9 que sirve como control.

8. Agregar a cada uno de los 8 pozos con suero problema, 4 UHA del antígeno viral en un volumen de 75 μl.

del suero 1:256 de figura 1; que no

Repetir sucesivamente este procedimiento hasta el pozo No. 8 que corresponderá a la dilución 1:256.

7. Desechar del pozo 8 75 μl en el

recipiente desechos.

para

recolección

de

9. Agitar la microplaca para que

reaccionen los sustratos y dejar en reposo durante 10 min.

10. Agregar 75 μl de la suspensión de 11. Determinar el título del antisuero

identificando la última dilución que presenta IHA. En la hemaglutinación se observa una agregación de las células sanguíneas sobre la superficie del pozo, formando una especie de red.

glóbulos rojos a todos y cada uno de los pozos, agitar y colocar la microplaca a temperatura ambiente hasta que los glóbulos rojos del pozo que no contiene antisuero y sirve como control haya sedimentado.

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1. Cita 3 virus con capacidad hemaglutinante diferentes a los que se mencionan en esta práctica 2. ¿Qué diferencia macroscópica hay entre una sedimentación eritrocitaria y una hemaglutinación? 3. ¿Por qué se utilizan los glóbulos rojos tipo O? Ejemplo de estandarización de eritrocitos: a Resultado de la práctica de HA: Dilución 1:20 de la vacuna viral = 4 UHA b Volumen suficiente para realizar IHA= 2ml Entonces..... Vacuna viral concentrada + SSI Volúmen final

100 μl 1900 μl _________ 2000 μl de dilución con 4 UHA

PATRONES DE SEDIMENTACIÓN: PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA

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Actividades de comprobación o evaluación 1. ¿Cuál es la interpretación diagnóstica de un resultado negativa en la prueba de IHA? 2. ¿Cuál es la interpretación diagnóstica de un resultado positivo en la prueba de IHA? 3. Conjuntando las pruebas de HA e IHA, ¿Cómo explica un resultado negativo en la prueba de HA con uno positivo en la prueba de IHA? y ¿Cuál es el diagnóstico final que daría después de analizar ambas pruebas? Observaciones

Bibliografía 1. Fenner-Whitte (1998). Virología Médica. Ed. Prensa Medica 2. InDRE (1995). Manual de técnicas de laboratorio de virología y bacteriología médica Vol. 1 3. Carballal G., Oubiña J. (1998). Virología Médica. Ed. El ateneo, Argentina 4. Díaz R., Gamazo C. y López Goñi (1999). Manual práctico de virología. 2da Edición. Editorial Masson. S.A. Barcelona. 37


Práctica 7. Inoculación intracerebral de ratón lactante Introducción La primer técnica emplead en el aislamiento de los virus fue la inoculación en animales de experimentación. La prueba de infección se lograba si él animal moría o si se observaban síntomas o lesiones. La aplicación de este método es limitado, los animales son caros así como su mantenimiento, no todos los animales son susceptibles a las enfermedades que atacan al hombre, a pesar de estas dificultades, son esenciales para el aislamiento de algunos virus que causan enfermedades del sistema nervioso central como los arbovirus, enterovirus, coxsackievirus y rabdovirus.

Objetivo Que el alumno aprenda a realizar la correcta inoculación de ratones por las vías intracerebral, intraperitoneal, subcutánea y oral.

Fundamento teórico Los animales habitualmente utilizados en el laboratorio son ratones lactantes o adultos, cobayos, conejos y en algunos casos primates, numerosos virus pueden aislarse y cultivarse en animales de experimentación, resultan indispensables en la investigación de la patogénesis e inmunidad de las enfermedades virales, en el ensayo de vacunas, en el estudio de los virus oncogénicos y de la preparación de antisueros con fines diagnósticos. Debido a la legislación en cuanto a su uso, el alto costo de mantenimiento, a la complejidad de las instalaciones y al riesgo de manipulación de animales infectados, se utilizan de manera cada vez más restringida. La inoculación en animales es el método más antiguo para aislar y conservar virus, dependiendo del virus por aislar se elige el animal, la vía de inoculación que asegure que el virus alcance el tejido u órgano donde se multiplique con mayor facilidad, es importante seguir las precauciones de esterilidad necesarias para que la muestra no se contamine con microorganismos que enmascaren el desarrollo viral. Los ratones y hámsteres recién nacidos de menos de 48 horas son especialmente susceptibles a 38

los enterovirus, cocksakievirus y rabdovirus, pueden ser inoculados por vía intracerebral o intraperitoneal, en cambio los ratones adultos son susceptibles a la rabia, la fiebre amarilla y linfogranuloma, la inoculación se hace por vía intracerebral y los síntomas principales son la falta de coordinación y ataxia. Aspectos de seguridad e higiene 1. Purgar las jeringas usando un tubo que contenga material absorbente para evitar aerosoles. 2. Asegurar que el animal este completamente sedado antes de inocularlo. 3. Aplicar correctamente las técnicas de inoculación y sujetar firmemente al animal para evitar autoinoculaciones. 4. Las jeringas usadas, jamás se re-encapuchan, desechar en el recipiente rígido para RPBI o en el contenedor de punzocortantes. 5. Los animales que quedan vivos al final de la práctica los animales muertos se colocan en una bolsa amarilla para RPBI, la cual será refrigerada antes de su destino final. Material y equipo Ratón joven de 30 días y ratón lactante de 2-3 días de nacido. Jeringas para insulina. Torundas y gasas. Equipo de disección. Ampolleta de agua inyectable estéril. Solución de alcohol-yodo (1:1) Solución de azul de metileno al 2 %. Éter Vaso de precipitado de 100 y 250 mL Recipiente rígido para RPBI’s y bolsa amarilla de RPBI.

Procedimiento Inoculación intracerebral. En el lactante se pueden observar los huesos y las estructuras cerebrales por la transparencia de la piel. 1. Anestesiar al ratón en un frasco que contenga torunda humedecidas con éter.

4. Se carga la jeringa con 0.01 mL para ratón lactante y de 0.05 mL para ratón adulto con agua destilada estéril.

2. Colocar el ratón de cúbito ventral sobre la mesa, se selecciona el sitio de inoculación entre el conducto auditivo externo y el ojo, a un lado de la línea media. 3. Se desinfecta el área, evitando introducir desinfectante al ojo.

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La aguja debe penetrar el cráneo en forma perpendicular para evitar que la punta resbale.

6. Sentir como la aguja penetra el hueso, controlar la presión que se ejerce, la aguja solo debe penetrar de 1 – 2 mm.

8. El ratón lactante es difícil de anestesiar por lo que se realiza la inoculación rápido y sin anestesia.

7. Se realiza la inoculación, se retira la aguja y se desinfecta nuevamente.

5.

Inoculación oral 2. Se carga la jeringa con 0.05 mL de solución de azul de metileno.

1. Se carga la jeringa con 0.05 mL de solución de azul de metileno.

4. Se acerca la jeringa a la boca y se deposita el inoculo.

3. Se toma al ratón en posición dorsal.

5. Se puede seguir la trayectoria del inoculo por la transparencia de la piel.

Actividades de comprobación o evaluación 1. 2. 3. 4. 5.

Menciona tres usos de los ratones en el laboratorio de virología Cita 3 vías de inoculación en animales Que precauciones debes tomar en cuenta al realizar una inoculación. Esquematiza la anatomía abdominal del ratón. Para qué tipo de aislamiento viral es útil la inoculación intracerebral.

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Observaciones

Bibliografía 1. Fenner-Whitte (1998). Virología Médica. Ed. Prensa Medica 2. InDRE (1995). Manual de técnicas de laboratorio de virología y bacteriología médica Vol.1 3. Carballa IG., Oubiña J. (1998). Virología Médica. Ed. El ateneo, Argentina 4. Díaz R., Gamazo C. y López Goñi (1999). Manual práctico de virología. 2da Edición. Editorial Masson. S.A. Barcelona.

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Práctica 8. Diagnóstico rápido de virus rábico (tinción de Sellers)

Introducción. Los métodos para el diagnóstico de la rabia deben ofrecer condiciones óptimas de precisión, rapidez y economía. Dentro de estas técnicas está la investigación microscópica de los corpúsculos de Negri, que se realizan en un frótis de tejido encefálico infectado con el virus rábico y es teñido por la técnica de Sellers.

Objetivo. Aprender a efectuar el diagnóstico rápido del virus rábico usando la técnica de Seller (simulando que el ratón está inoculado o infectado con este virus).

Fundamento teórico El virus rábico pertenece a la familia Rhabdoviridae, es un RNA virus de una sola cadena, tiene forma de bala. La rabia se transmite por mordedura o contacto directo de las mucosas o heridas con la saliva del animal infectado, es la zoonosis más antigua, cuya importancia radica en su letalidad cercana al 100 %. La rabia se caracteriza por un cuadro encefálico cuyo diagnóstico diferencial con otras encefalitis es difícil y solo el examen del laboratorio permitió establecer un diagnostico seguro. El diagnóstico clínico de la rabia en un animal justifica el inicio del tratamiento antirrábico de la persona que estuvo en contacto con el virus y el diagnostico posterior permite continuarlo o interrumpirlo. Sin embargo las pruebas de laboratorio son adecuadas cuando se cumplen ciertos requisitos:  Buena calidad de la muestra  Condiciones de transporte correctos 42

 Rapidez con la que se obtiene resultado  Notificación inmediata de los resultados La tinción de Sellers es una técnica sencilla, rápida y de bajo costo para el diagnóstico de la rabia, que es una de las infecciones virales de notificación obligatoria para el sector salud. Esta tinción pone de manifiesto los corpúsculos de Negri en el cerebro del animal infectado o que se sospecha tenia rabia. Se ha observado que los corpúsculos de Negri son especialmente visibles en el asta de Ammon, en las células piramidales de la corteza cerebral y en las células de Purkinje en el cerebro. El colorante de Sellers tiñe los corpúsculos de Negri de color rojo violaceo o rojo ladrillo, con inclusiones basófilas de color azul oscuro a negro. Dejándolos claramente diferenciados de las células nerviosas y del tejido intersticial que se tiñe de azul claro y rosa respectivamente. Los corpúsculos de Negri están constituidos por partículas virales y constituyentes celulares rodeados de una matriz citoplasmática, contienen DNA (sustrato eosinófilo) y RNA (granulaciones basófilas).

Aspectos de seguridad e higiene 5. 6. 7. 8.

Uso de protección personal. Asegurarse que el ratón está completamente sedado antes de sacrificarlo. Sujetar firmemente al ratón para evitar accidentes. Realizar los cortes con el bisturí sujeto del mango (evitar manejar el bisturí directamente con la mano). 9. Los restos del ratón serán colocados en una bolsa amarilla para RPBI la cual deberá ser refrigerada. Materiales y reactivos Estuche de disección Abate lenguas Papel filtro Colorante de Sellers Puente y charola de tinción Solución amortiguadora de fosfatos pH 7.5 Cronómetro Microscopio Ratones de 3 -5 semanas de nacidos

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Procedimiento 1. Con ayuda del equipo de disección y de las tijeras de punta fina se realizará un corte entre ambas fosas orbitales del ratón.

2. Se levanta la piel y músculos de la cara y cabeza para exponer el cráneo.

4. Se inserta la punta de una tijera para cortar el hueso y se corta la bóveda hasta exponer el cerebro.

3. Se dobla el cuello del ratón para exponer el agujero magno.

5. Se saca integro el cerebro desprendiéndolo de la base del cráneo (incluyendo cerebelo y parte de la medula).

6. Se saca integro el cerebro desprendiéndolo de la base del cráneo (incluyendo cerebelo y parte de la medula).

7. Con el bisturí se hace una sección transversal tomando un fragmento del cerebro que contenga el asta de Ammon o cuerpo de Ammon del hipocampo donde los corpúsculos de Negri son especialmente visibles.

Preparación de la impronta 1. En el extremo de un abate lenguas se coloca una banda de papel filtro y sobre este se pone el corte del cerebro del ratón. 3. Se realiza la tinción de Sellers de acuerdo al siguiente metodología:

2. Se toma un portaobjetos y se hacen de 3 a 4 impresiones del cerebro, tomando ligeramente y haciendo presión hasta que quede marcado en el porta objetos la silueta de la pieza de cerebro a estudiar.

a. Cubrir la impronta con el colorante de Sellers durante 15 segundos b. En seguida enjuagar con buffer pH = 7.5. c. Dejar secar al aire y observar al microscopio con objetivo de inmersión.

2. Observar y describir las células nerviosas, no se apreciarán los corpúsculos de Negri pues el riego de manejar virus rábico es muy alto (solo se simulará que el ratón está infectado)

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Figura 1. Corpúsculos de Negri en tejido neuronal Actividades de comprobación o evaluación

1. Mencione 3 técnicas para el diagnóstico de virus rábico. 2. Define en qué consiste un estudio histológico. 3. Realiza un esquema de la anatomía macroscópica y microscópica cerebral del ratón. 4. Cita el procedimiento para la preparación del colorante de Sellers. 5. ¿Cuál es el sustrato ideal para la obtención de vacuna antirrábica?

Observaciones

Bibliografía 1. Fenner-Whitte (1998). Virología Médica. Ed. Prensa Medica 2. InDRE (1995). Manual de técnicas de laboratorio de virología y bacteriología médica Vol. 1 3. Carballa IG., Oubiña J. (1998). Virología Médica. Ed. El ateneo, Argentina 4. Díaz R., Gamazo C. y López Goñi (1999). Manual práctico de virología. 2da Edición. Editorial Masson. S.A. Barcelona. 45


Práctica 9. Cultivo Celular (parte 1) Introducción. Debido a que los virus, como ocurre con los plásmidos, se replican solo de n t r o d e c é l u l a s v i v a s , l a i n v e s t i g a c i ó n s o b r e v i r u s r e q u i e r e e l u s o d e h ospedadores apropiados. Para el estudio de los virus bacterianos se u s a n cultivos axénicos en medio líquido o en medio semisólido con agar. Como la mayor parte de las bacterias son fáciles de cultivar, resulta relativamente simple estudiar los virus bacterianos y por esta razón se dispone de un crecimiento detallado de la multiplicación de estos virus. En lo que respecta a los virus de los animales, el hospedador inicial puede ser un animal susceptible al virus, pero a efectos de investigación es deseable disponer de hospedadores más manejables. En 1907 el biólogo estadounidense Ross Granville Harrison descubre que los tejidos vivos pueden cultivarse, es decir, pueden crecer fuera de su órgano original. Este fue el comienzo para el desarrollo d e l o s c u l t i v o s d e t e j i d o s y m á s a d e l a n t e e l d e l os c u l t i v o s c e l u l a r e s ( l í n e a s celulares).

Objetivo. 1. Obtener un cultivo celular primario (monocapa de células in Vitro). 2. Familiarizarse en el cultivo de tejidos.

Fundamento teórico Muchos virus animales pueden ser cultivados en cultivos de tejidos o c u l t i v o s celulares, y el uso de tales cultivos ha facilitado enormemente la investigación sobre los virus. Los virus son microorganismos intracelulares y para evidenciarlos, se deben utilizar sistemas basados en líneas celulares que permitan su desarrollo. Los cultivos celulares son un tipo de biosustrato empleados para la propagación de los virus, constituyen, desde 1950, el sistema más empleado para el aislamiento y propagación de la mayoría de los virus, consisten en un sistema formado por células provenientes de un órgano o un tejido, normal o tumoral, mantenidas en medios de c u l t i v o d e c o m p o s i c i ó n q u í m i c a d e f i n i d a y e n c o n d i c i o n e s d e t e m p e r a t u r a , p H , aireación y humedad controladas. Dentro de éstos, los más usados son los cultivos en monocapa, aunque hay otros sistemas 46

(cultivos en suspensión, explantos, cultivos de órganos, cultivos en microcarriers, etc). Los cultivos celulares en monocapa consisten en una capa de células que crecen adheridas a la superficie del recipiente que las contiene. Estos cultivos se preparan tratando el tejido original u otra monocapa con un agente que dispersa las células (una enzima o un agente quelante, o ambos combinados) para luego transferir la suspensión celular obtenida a un recipiente de vidrio o plástico en donde las células se adhieren y multiplican. La invasión viral se evidencia a través de un cambio celular o efecto citopático (EC) y mediante pruebas complementarias. No existe un cultivo celular susceptible a todos los virus, de modo que un laboratorio de diagnóstico viral debe disponer de distintos cultivos celulares. Por ejemplo, el virus herpes simplex crece bien in vitro en cultivos primarios, cepas y líneas celulares (MRC-5, RK, HEp-2, HeLa, Vero u otras); en cambio, otro virus de la misma familia, el citomegalovirus (CMV) sólo crece en cultivos primarios de pulmónfetal humano o bien en algunas cepas celulares derivadas del mismo órgano y especie (MRC-5). Por otro lado, una línea celular como HEp-2 puede ser bastante sensible a adenovirus, VRS, parainfluenza, herpes simples, poliovirus y otros, pero no permitir el crecimiento de CMV, rotavirus, influenza, etc; además, es posible que los pasajes sucesivos de una línea hagan disminuir su sensibilidad a algunos virus, como sucede con Hep-2 en relación a VRS Entre los sistemas de cultivo más utilizados tenemos: a) Cultivos primarios: S e c a r a c t e r i z a n p o r t e n e r v a r i o s t i p o s d e c é l u l a s . La m a yo r í a s o n d e c r e c i m i e n t o l i m i t a d o i n v i t r o , g e n e r a l m e n t e r e s i s t e n 5 a 1 0 subcultivos y son permisivas a un amplio rango de virus; p. e., células de riñónembrionario humano (REH). b) Cepas de células diploides: Derivadas de tejidos normales, se utilizan en la producción de vacunas, aislamiento viral y como sustratos para probar materiales tóxicos. Están constituidas por un tipo de células que retienen su n ú m e r o cromosómico diploide original; p.e., los fibroblastos de pulmón. c) Líneas celulares: Son células inmortalizadas en el laboratorio, resisten (n)número de pases y se caracterizan por derivarse de tejidos normales o de tumores malignos y se han pasado por los menos 70 veces in vitro; p.e., células Vero (riñónde mono verde africano), LLC -MK2 (riñón mono rhesus) y BSC-1 (también detejido normal de riñón de mono) y HeLa y HEp-2 derivadas de células humanasmalignas. Éstas generalmente tienen un número variable de cromosomas y aveces también son denominadas líneas celulares heteroploides. Otras líneas c e l u l a r e s e x i s t e n t e s s o n A 9 ( f i b r o b l a s t o s s u b c u t á n e o s d e r a t ó n ) , B H K 2 1 (fibroblastos de hámster), BRL3A (epitelio de hígado de rata), GHI, GH3 (epitelio de rata), L929, LS, S180 (fibroblastos de ratón), L1210, L5178Y, P388D1 (linfocitosde ratón), MCF7 (epitelio humano), 3T3-L1 (fibroblastos de ratón suizo), 3T3A31(fibroblastos de ratón BALB/c) y NRK49F (fibroblastos de riñón de rata). Algunos ejemplos de líneas celulares son: 47

HEP-2: C é l u l a s h e t e r o p l o i d e s h u m a n a s d e r i v a d a s d e c a r c i n o m a l a r í n ge o . Recomendadas para RSV y Adenovirus. MDCK: Línea celular diploide de riñón canino; para Influenza y ocasionalmente parainfluenza. LLC-MK2: Línea celular heteroploide de riñón de mono Rhesus. Se recomiendapara el aislamiento del virus parainfluenza. Requiere el agregado de tripsinacristalina al medio. MRC5: Línea celular diploide fibroblástica de pulmón embrionario humano. Serecomienda para el aislamiento de citomegalovirus, herpesvirus. Entre las líneas celulares que se emplean con más frecuencia están las células Hep-2, HeLa y Vero, en cuanto a células diploides las más utilizadas son las líneas de fibroblastos de pulmón (MRC5) que se usan para el aislamiento decitomegalovirus (CMV). El cultivo primario más utilizado es el riñón huma noembrionario (RHE) que es permisible a los virus de circulación frecuente como el herpes (HSV), adenovirus (ADV), enterovirus, virus sincicial respiratorio (RSV) etc. En todo caso la elección por una u otra línea celular dependerá del virus que se quiera evidenciar. Aspectos de seguridad e higiene 1. Uso de aditamentos de protección son la bata, guantes, mascarilla y/o anteojos. 2. Se debe desinfectar el área de trabajo antes de iniciar y al concluir la práctica. 3. La succión y vaciado de líquidos se realiza utilizando pipetas con bulbos o pipeteadores automáticos. Nunca pipetear con la boca. 4. Las puntas y pipetas contaminadas deberán colocarse dentro de recipientes que contengan hipoclorito de sodio al 1%. 5. Evitar derrames o salpicaduras del material biológico, es decir, del cultivo celular. 6. Esterilizar o desechar adecuadamente las muestras.

Materiales y reactivos Material Biológico: Huevos embrionados de 10 a 11 días. Material de Laboratorio: Estuche de Disección (estéril). Matraz Tripsinizador. Agar. Tripsina. Diversas Soluciones y Medios de Cultivo. Pipetas 48

Placas y frascos. Solución de Yodo alcohol. Ampolla de estreptomicina y ampicilina. Agitador magnético. Solución de Hanks Completo (750 ml): -Solución A: NaCl (80 g.), KCl (4 g.), CaCl2 (1.4 g.), MgSO2.7H2O (2g.): cada solución que se va pesando se va diluyendo en 450 ml. H2O. -Solución B: Na2PO4 ( 0 . 6 g . ) , K P O 4( 0 . 6 g . ) , g l u c o s a ( 1 0 g . ) , H 2O destilada (450 ml.). -Solución C: Rojo de Fenol 1% (16 ml.). Hidrolizado de Lactoalbumina 5% Suero fetal bovino. Solución Buffer Fosfato (PBS): NaCl: 8 g, KCl: 0.2 g, Na2PO4: 1.15 g, H2O bidestilada: 1000 ml. Procedimiento 1. Observar al Ovoscopio para descartar embriones muertos o defectuosos. 2. Colocar los huevos seleccionados sobre un porta huevos con la cámara de aire hacia arriba. 3. Llevar los huevos a la cámara de flujo laminar (en el caso de la práctica, entre dos mecheros). 4. Limpiar la cáscara en su mitad superior, primera solución de alcohol yodado y después con alcohol. 5. Colocar las pinzas y tijeras en un vaso con alcohol y agua hirviente. 6. Con la tijera larga punta curva estéril recortar el casquete o la cáscara correspondiente a la cámara de aire (las tijeras se enjuagan con el H 2O hirviente y vuelven al alcohol para volver a usarlas). 7. Coger las pinzas largas y con la punta retirar la cáscara rota así como la membrana de la cámara de aire (esterilizar las pinzas para volver a usar). 8. Con las pinzas curvas, tomar al embrión del cuello y llevarlo a una placa estéril (esta operación repetirla con todos los embriones). 9. Con una tijera (estéril) eliminar la cabeza, las alas y las patas; abrir el embrión con un corte en cruz y retirar las vísceras. 10. Lavar con solución buffer fosfato por un par de veces. 11. Luego, empezar a cortar lo que quede del embrión en pedazos cada vez más pequeños, hasta formar una especie de papilla. 12. Luego lavar los trozitos de carne en la placa por 2 veces con solución Buffer Fosfato (PBS). 13. Luego, llevar al matraz Tripsinizador y se agrega tripsina 25%: 4 ml. por embrión y se deja durante 10 minutos con movimientos giratorios, para esto se pone en un agitador magnético. Esto se puede repetir 2 veces. 14. T r a n s c u r r i d o e s t e t i e m p o e l s o b r e n a d a n t e s e v i e r t e a u n m a t r a z , s e guarda en refrigeración (previo agregar solución de PBS) . 15. Se vuelve a tripsinizar el sedimento, utilizando igual cantidad de tripsina. 49

16. Lo q u e s e t i e n e e n r e f r i g e r a c i ó n , s e p a s a p o r f i l t r o ( c a p a d e g a s a y algodón) a otro matraz. 17. El filtrado se centrífuga a 1 000 rpm por 5 min. luego se refrigera. 18. Se elimina el sobrenadante y se queda el sedimento. 19. Lavar las células con PBS y luego centrifugar a 1 000 rpm por 2 veces más. 20. Se resuspende en el medio de multiplicación (previamente se cuenta células usando la cámara de New Bauer para obtener 2 x 10 células/ml). 21. Se recogen de 10 a 15 ml. y se lleva a una placa estéril, luego se agrega el suero de feto bovino (estimulará el crecimiento). 22. Incubamos a 37°C. 23. Las células caen al fondo en la placa, se multiplican por el medio y llenan los espacios vacíos y forma la monocapa. 24. Se elimina el medio de multiplicación. 25. Cuando se tiene la capa de células homogéneas, ya está listo para el cultivo y aquí se agrega se puede inocular el virus (cuando esta la monocapa recién se inocula el virus). Observaciones

Bibliografía 1. Fenner-Whitte (1998). Virología Médica. Ed. Prensa Medica 2. InDRE (1995). Manual de técnicas de laboratorio de virología y bacteriología médica Vol. 1 3. Carballa IG., Oubiña J. (1998). Virología Médica. Ed. El ateneo, Argentina 4. Díaz R., Gamazo C. y López Goñi (1999). Manual práctico de virología. 2da Edición. Editorail Masson. S.A. Barcelona. 5. ACTON, J. (1967) Virología. Edit. Interamericana. México D.F. 6. JAWETZ E., J. MELNICK, E. SDELBERG (1996) Microbiología Médica. 15ºedic. Edit. El Manual Moderno. México D.F.

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Práctica 10. Cultivo Celular (parte 2)

Introducción. Los cultivos celulares son actualmente una herramienta elemental en el laboratorio de Virología. El cultivo celular es un procedimiento “in vitro” en el que se cultivan las células disociadas que se pegan a una superficie de vidrio o plástico. Se les provee de nutrientes de acuerdo a sus exigencias para que puedan multiplicarse, el cultivo celular se maneja bajo estrictas condiciones de esterilidad. Básicamente hay tres tipos de cultivos celulares: 1. Cultivos primarios los cuales derivan de tejidos, se mantienen vivos por tiempo limitado y resistente a dos subcultivos 2. Cultivo de células diploides resisten entre 50 y 70 subcultivos 3. Líneas continuas provienen de células diploides transformadas o de tejidos neoplásicos como VERO, HeLa, Hep- 2 y KB que pueden ser cultivadas sin límite aparente.

Objetivo. El alumno realizará el subcultivo celular, con el conocimiento previo de las condiciones generales que requiere un cultivo celular.

Fundamento teórico Enders descubrió que los virus podrían desarrollarse en cultivo de células “in vitro” y esto constituyó un hito fundamental en el desarrollo de la Virología. Los cultivos celulares constituyen el método de elección para la replicación de la mayoría de los virus. El cultivo celular consiste en mantener vivas en botellas o tubos con medios nutritivos enriquecidos con sueros y antibióticos. Hay tres tipos de cultivos: 51

Cultivos primarios se obtienen por tratamiento con tripsina de pequeños fragmentos de tejido humano o animal. Las células disgregadas se lavan, se cuentan en cámaras de Neubauer o cuenta de eritrocitos y se siembran en tubos cónicos o botellas de Roux, adicionando medios nutritivos y antibióticos. Se incuban a 37°C, luego de pocas horas las células se adhieren a la superficie del recipiente y se multiplican formando islotes, que van cubriendo toda la superficie plástica hasta formar una monocapa. Estas células pueden usarse para replicar virus e identificarlos, o bien para replicarse las células y obtener nuevos cultivos. Esto se denomina pasaje o subcultivo. Los cultivos primarios son altamente sensibles a la replicación viral, su mayor inconveniente es que las células mueren después de pocos pases. Cultivo de células diploides. Provienen de células de cultivos primarios que se conserva intacta su morfología diploide, resiste hasta 70 pases, sin perder su alta sensibilidad a muchos virus y son aptas para la producción de vacunas. Las cepas más usadas son la MRC-5 (de riñon de mono Rhesus) y las WI-38 (de origen humano). Líneas Celulares. Denominadas líneas inmortales porque pueden replicarse de manera ilimitada. Las hay de origen normal como las células VERO provenientes de riñón de mono verde africano y las de origen neoplásico como las HeLa derivadas del carcinoma de cérvix o Hep-2 provinientes del carcinoma de laringe. Se usan para aislar el virus de la polio, Herpes, Rubéola, Sincitial Respiratorio, Adenovirus, etc. Sin embargo su sensibilidad es más limitada. Aspectos de seguridad e higiene 7. Uso de aditamentos de protección son la bata, guantes, mascarilla y/o anteojos. 8. Se debe desinfectar el área de trabajo antes de iniciar y al concluir la práctica. 9. La succión y vaciado de líquidos se realiza utilizando pipetas con bulbos o pipeteadores automáticos. Nunca pipetear con la boca. 10. Las puntas y pipetas contaminadas deberán colocarse dentro de recipientes que contengan hipoclorito de sodio al 1%. 11. Evitar derrames o salpicaduras del material biológico, es decir, del cultivo celular. 12. Esterilizar o desechar adecuadamente las muestras. Materiales y reactivos Botellas de Roux con células en cultivo de rabdomiosarcoma/ RD o de cáncer de garganta (Hep-2c), células de riñón de mono verde (VERO) Medio de Eagle 20X Agua tridestilada y desionizada estéril Suero fetal de ternera frasco de 100mL 52

Amortiguador de bicarbonato al 4.4% Matraces de Erlenmeyer y pipetas estériles Solución de antibióticos (penicilina/estreptomicina) Solución de fosfatos Microscopio invertido o invertoscopio Incubadora de CO2

Procedimiento 1. Prepara el medio de Eagle de crecimiento y el de mantenimiento

4. Observar en el microscopio invertido el porcentaje de células sedimentadas

5. Eliminar el medio y colocar nuevamente 10 mL e incubar toda la noche a 37°C

2. Descongelar y resuspender las células RD o Hep 2c en 5 mL de Medio 3. Incubar A 37°C por una hora

6. Observar el cultivo a las 24, 28 y 72 hrs hasta la formación de una monocapa confluente.

8. Posteriormente el cultivo celular se inoculará con un virus para demostrar el efecto citopático


1. ¿Qué condiciones fisicoquímicas son necesarias controlas en el desarrollo de un cultivo celular?

2. ¿Qué diferencia hay entre un medio de mantenimiento y uno de crecimiento? 3. ¿Cada cuánto debe cambiarse el medio nutritivo a un cultivo celular y por qué? 4. En un cultivo celular ¿A qué se le denomina inhibición por contacto?

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Observaciones

Bibliografía 7. Fenner-Whitte (1998). Virología Médica. Ed. Prensa Medica 8. InDRE (1995). Manual de técnicas de laboratorio de virología y bacteriología médica Vol. 1 9. Carballa IG., Oubiña J. (1998). Virología Médica. Ed. El ateneo, Argentina 10. Díaz R., Gamazo C. y López Goñi (1999). Manual práctico de virología. 2da Edición. Editorail Masson. S.A. Barcelona.

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Práctica 11. Conteo Celular

Introducción. Para obtener monoesteratos reproducibles, los tubos o frascos deberán ser sembrados con un número regulado de células o de una concentración celular determinada. Las células se deben contar con el hemocitómetro y usando un colorante vital se pueden diferenciar las células viables de las no viables. Objetivo. Realizar el conteo de células a partir de un subcultivo celular, determinando el número de células viables por mililitro.

Fundamento teórico Las propiedades de las células de adherirse a superficies adecuadas están condicionadas a la presencia de iones de Calcio (Ca) y Magnesio (Mg). En los subcultivos el monoesterato se puede desprender usando un agente quelante, el cual actúa retirando los iones Ca y Mg, con lo cual se liberan las células de la superficie a la cual se hallan adheridas. El monoesterato celular es dispersado con EDTA y tripsina, ya sea por agitación manual de la suspensión celular durante 10 minutos o usando un agitador magnético, procediendo al conteo celular. El cultivo celular permite realizar subcultivos para obtener nuevas generaciones de células disponibles para su uso inmediato o como reserva conservándolas en criogenia. De acuerdo al nivel y equipamiento con que cuenta el laboratorio, el conteo celular puede realizarse ya sea mediante un contador electrónico o de manera manual. El contador electrónico de células es un instrumento capaz de medir y contar partículas en suspensión, consta de dos electrodos que transmiten al equipo de amplificación y análisis, los cambios de resistencia que detectan, cada vez que una de las células en suspensión los cruza. La otra manera de realizarlo consiste en el uso de un hemocitómetro, usando un colorante que permite diferenciar las células viables de las no viables. 55

Aspectos de seguridad e higiene 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Uso de aditamentos de protección son la bata, guantes, mascarilla y/o anteojos. Se debe desinfectar el área de trabajo antes de iniciar y al concluir la práctica. La succión y vaciado de líquidos se realiza utilizando pipetas con bulbos o pipeteadores automáticos. Nunca pipetear con la boca. Las puntas y pipetas contaminadas deberán colocarse dentro de recipientes que contengan hipoclorito de sodio al 1%. Evitar derrames o salpicaduras del material biológico, es decir, del cultivo celular. Esterilizar o desechar adecuadamente las muestras. Materiales y reactivos

Botellas de Roux con células en cultivo de rabdomiosarcoma/ RD o de cáncer de garganta (Hep-2c), células de riñón de mono verde (VERO) Medio de Eagle 20X Colorante azul de Tripán EDTA Tripsina Pipetas Pasteur estériles Hemocitómetro o Cámara de Newbauer Campana de flujo laminar Mechero Contador de Colonias Procedimiento 1. Observar en el invertoscopio la botella con el monoestrato celular para verificar viabilidad y confluencia celular.

4. Observar periódicamente desprendimiento de la monocapa.

hasta

5. Adicionar 1 mL de medio por cada integrante que vaya a realizar la práctica.

2. En campana de flujo laminar y con mechero, abrir la botella y decantar el medio de cultivo. 3. Agregar 2 mL de la solución de tripsina- verseno a la botella e incubar a 37°C 6. Agitar vigorosamente con la pipeta para disgregar perfectamente las células

Nota. Este paso debe realizarse rápidamente y por una persona porque las células se unen formando coágulo y se pierden. 56

7. En un tubo estéril colocar 0.8 mL de suspensión celular y añadir 0.2 mL de azul de Tripán disuelto en soln. salina al 0.85% se Teñirán las células no viables 10. Realizar los cálculos necesarios

8. Dejar reposar 3 minutos y llenar la cámara de recuento.

9. Observar al microscopio y se cuentan los cuatro cuadrantes primarios de las esquinas de la cámara.


1. ¿Qué función desempeña la solución tripsina-verseno en el cultivo celular? 2. ¿Por qué se tiñen las células no viables? 3. ¿Qué Dimensiones tiene un hemocitómetro? Observaciones



Práctica 12. Titulación Viral

Introducción. El desarrollo de la replicación viral, es decir, la amplificación del virus inoculado en el cultivo, puede identificarse por diferentes procedimientos. Todos ellos tienden a detectar las modificaciones producidas en el cultivo por efecto de la replicación viral (efecto citopático). Muchos virus se replican produciendo alteraciones de la monocapa celular, que pueden observarse directamente en el microscopio invertido y estas alteraciones pueden ser las formación de sincitios o células gigantes multinucleadas, inclusiones en el núcleo y citoplasma, redondamiento de las células, lisis o necrosis.

Objetivo. Que el alumno utilice el cultivo celular como medio de multiplicación del virus de la poliomielitis y determine el título viral a través del efecto citopático generado.

Fundamento teórico La detección de los virus en cultivo celular y la replicación viral en un cultivo permite identificarlo por las alteraciones producidas en las células, el cual es denominado efecto citopático o acción citopatogénica, estos pueden ser observados en un microscopio invertido, sin necesidad de efectuar alguna otra coloración. Por ejemplo el virus de la poliomielitis y los herpesvirus producen redondamiento de las células y desprendimiento de la monocapa. Por otra parte existen virus que tienen en su envoltura proteínas de fusión como el virus de la influenza y el virus sincitial respiratorio los cuales inducen unión de las células vecinas formando sincitios (células gigantes multinucleadas). El efecto citopático también se manifiesta por cuerpos de inclusión que pueden ser intranucleares, intracitoplasmáticos o ambos. Algunos virus se replican en los cultivos celulares sin producir efecto citopático visible al microscopio, sin embargo como producto de la replicación liberan al medio de cultivo proteínas virales como las hemaglutininas, que pueden ser detectadas por otros 58

procedimientos. El recuento de placas en agarosa (plaqueo) también se puede emplear como técnica de identificación viral, ya que se pueden cuantificar los viriones presentes en el inóculo, por medio de unidades formadoras de placa. Para los virus replicables en cultivo celular, que no producen placas, se utilizan las pruebas de punto final o dilución, que permiten determinar en forma aproximada la cantidad de virus presentes en una muestra. Aspectos de seguridad e higiene 1. Uso de aditamentos de protección son la bata, guantes, mascarilla y/o anteojos. 2. Se debe desinfectar el área de trabajo antes de iniciar y al concluir la práctica. 3. La succión y vaciado de líquidos se realiza utilizando pipetas con bulbos o pipeteadores automáticos. Nunca pipetear con la boca. 4. Las puntas y pipetas contaminadas deberán colocarse dentro de recipientes que contengan hipoclorito de sodio al 1%. 5. Evitar derrames o salpicaduras del material biológico, es decir, del cultivo celular. 6. Esterilizar o desechar adecuadamente las muestras. Materiales y reactivos Equipo de microtitulación Microplacas de 96 pozos de fondo en U Microdilutores de 25 L Pipeta automática multicanal con rango de 25 a 100 L Puntas para pipeta automática estériles Antígeno (virus polio vacunal) Medio Eagle Botellas de Roux con monocapa confluente entre el 80 – 100% Solución de antibióticos (penicilina-estreptimicina) Invertoscopio Incubadora de CO2 Mechero Marcador de tinta indeleble

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Procedimiento 1. Con el cultivo de células RD o Hep 2c con el 100% de Confluencia

4. Realizar el conteo de células viables en cámara de Neubauer

5. En una microplaca de 96 pozos colocar 25 L del medio Eagle de crecimiento.

2. Desprender las tripsina-EDTA

células

con

4. Ajustar a 1000000 de células /mL

6. Adicionar 25 L de virus vacunal de polio en los primero tres pozos.

7. Realizar las diluciones seriadas del virus de arriba hacia abajo, es decir, de la fila A a la H con la pipeta multicanal ajustada a 25 L, se hacen las diluciones de la primera a la última hilera

8. Adicionar 25 L de la suspensión celular en cada pozo

9. Se cubre la palca y se incuba a 37°C

10. Observar a las 24,48 y 72 hrs. Las alteraciones citopatogénicas o efecto citopático en la monocapa.


¿Qué caracteriza a una línea celular definida?

4. Menciona tres líneas celulares usadas para el aislamiento viral diferentes a las que se mencionan en este manual. 5. ¿Qué significa en Virología Titulación? 60

Observaciones

Bibliografía 11. Fenner-Whitte (1998). Virología Médica. Ed. Prensa Medica 12. InDRE (1995). Manual de técnicas de laboratorio de virología y bacteriología médica Vol. 1 13. Carballal G., Oubiña J. (1998). Virología Médica. Ed. El ateneo, Argentina 14. Díaz R., Gamazo C. y López Goñi (1999). Manual práctico de virología. 2da Edición. Editorial Masson. S.A. Barcelona.

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Práctica 13. Determinación de anticuerpos IgM anti-Rubéola Introducción. La Rubéola es una enfermedad infantil de síntomas benignos, caracterizada por un exantema generalizado, sin embargo, la rubéola en pacientes gestantes, puede asociarse con graves complicaciones congénitas, como pueden ser ceguera, sordera, defectos cardíacos o retraso mental. La evidencia de infección puede fácilmente obtenerse por serología mediante la prueba ELISA específica.

Objetivo. Determinar anticuerpos del tipo IgG o IgM contra Rubéola mediante la aplicación de un inmunoensayo.

Fundamento teórico La inmunidad adquirida contra el virus de la Rubéola se mantiene durante un largo tiempo, frecuentemente durante toda la vida del individuo, ya que existe un solo serotipo. Las mujeres en edad fértil deben vacunarse al menos 3 meses antes de embarazarse contra este virus. Su control debe ser parte rutinaria de la asistencia prenatal, ya que el mayor riesgo de padecer alteraciones en el feto, es más común durante el primer trimestre de gestación. Las manifestaciones clásicas son: exantema maculopapular de inicio en cara, presencia de linfadenopatías de localización post auricular, que aparecen antes del exantema y perdura por más de una semana, febrícula y ocasionalmente aparecen complicaciones de vías respiratorias altas. En los adultos son frecuentes las manifestaciones articulares como las artralgias. Numerosos métodos se han desarrollado para realizar el diagnóstico, la inhibición de la hemaglutinación fue el primer método utilizado y es el considerado estándar por la Organización Mundial de la Salud, la prueba es fundamentada en que los antígenos glicoproteícos de superficie inducen anticuerpos inhibidores de la hemaglutinación. La evidencia de infección puede obtenerse por serología, mediante ELISA específicos el empleado en esta práctica es inmunensayo en fase sólida. En la madre infectada los 62

anticuerpos anti- Rubéola tipo IgM o IgG aparecen poco después del comienzo de los síntomas. En neonatos los anticuerpos IgM pueden persistir durante más de un año y son indicativos de infección congénita. Aspectos de seguridad e higiene 1. Uso de aditamentos de protección son la bata, guantes, y/o anteojos. 2. Se debe desinfectar el área de trabajo antes de iniciar y al concluir la práctica. 3. Las puntas y pipetas contaminadas deberán colocarse dentro de recipientes que contengan hipoclorito de sodio al 1%. 4. Evitar derrames o salpicaduras del material biológico, es decir, del suero de la paciente. 5. Esterilizar o desechar adecuadamente las muestras. Materiales y reactivos Micropipetas de volumen variable Puntas para micropipeta, Gradilla, Tubos de ensaye, Muestra de suero por equipo Kit comercial para detectar IgG anti- Rubéola el cual debe contener Controles positivo y negativo Amortiguador de dilución de la muestra Conjugado Cromógeno Solución de lavado Solución de paro Placa de reacción Si se determina por ELISA se empleará un lector de placas con dos filtros de 450 nm y 620 nm Procedimiento 1. El procedimiento dependerá del kit comercial que se disponga y la marca.

2. Cada integrante del equipo deberá anotar en su bitácora el procedimiento previo a la práctica.

4. Preparar los reactivos necesarios y solicitar las micropipetas adcuadas

3. Solicitar el inserto del kit al técnico del laboratorio.

5. Cada equipo deberá colocar su muestra de suero en un tubo rotulado en una gradilla.

6. Comparar los resultados obtenidos con la guía de referencia del kit y controles, anotar observaciones y concentración obtenida de anticuerpo anti- Rubéola. 63


1. Defina los siguientes términos Artralgia Artritis Enfermedad congénita Enfermedad teratógenica 2. ¿Qué tipo de inmunoglobulina se denomina de memoria?

Observaciones

Bibliografía 1. Fenner-Whitte (1998). Virología Médica. Ed. Prensa Medica 2. InDRE (1995). Manual de técnicas de laboratorio de virología y bacteriología médica Vol. 1 3. Carballal G., Oubiña J. (1998). Virología Médica. Ed. El ateneo, Argentina 4. Díaz R., Gamazo C. y López Goñi (1999). Manual práctico de virología. 2da Edición. Editorial Masson. S.A. Barcelona.

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Práctica 14. Determinación de anticuerpos IgG Anti-Citomegalovirus

Introducción. Los citomegalovirus (CMV) es un virus con ADN de la familia de los herpesvirus, son agentes infecciosos muy comunes en el humano ya que infecta a la mayoría de las personas en alguna fase de la vida, el 80% de la población adulta en todo el mundo cuenta con anticuerpos contra CMV, presentando una infección subclínica persistente, la infección es asintomática, pero puede causar serias complicaciones; infección en el primer trimestre del embarazo conduciendo a anormalidades en el feto y en pacientes inmunodeficientes.

Objetivo. Determinar anticuerpos del tipo IgG anti -CMV Rubéola mediante la aplicación de un inmunoensayo.

Fundamento teórico La infección por CMV es especialmente grave en dos tipos de casos: 1. En pacientes inmunocomprometidos o inmunosuprimidos ya que pueden presentar infecciones recurrentes, las cuales, se asociación con complicaciones como neumonías, hepatitis, corioretinitis, así como la co-infección con el VIH. 2. En los recién nacidos la infección por CMV es la causa más importante de malformación congénita, los neonatos infectados por vía transplacentaria, desarrollan infección de inclusión citomegálica que es la responsable del 1% de todas las muertes neonatales y la causa más importante de microcefalia. El diagnóstico para detectar CMV puede realizarse por aislamiento del virus a partir de orina y secreciones orales o genitales en cultivos de células diploides, el efecto citopático llega a retardarse entre una a tres semanas. La detección de antígenos virales mediante anticuerpos posibilita un diagnóstico rápido. El hallazgo de conversión serológica de los títulos de anticuerpos detectados por el método de ELISA indica infección reciente. La

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determinación de anticuerpos IgG anti CMV, es utilizada para establecer el contacto previo con CMV. Aspectos de seguridad e higiene 1. Uso de aditamentos de protección son la bata, guantes, y/o anteojos. 2. Se debe desinfectar el área de trabajo antes de iniciar y al concluir la práctica. 3. Las puntas y pipetas contaminadas deberán colocarse dentro de recipientes que contengan hipoclorito de sodio al 1%. 4. Evitar derrames o salpicaduras del material biológico, es decir, del suero de la paciente. 5. Esterilizar o desechar adecuadamente las muestras. Materiales y reactivos Micropipetas de volumen variable Puntas para micropipeta Gradilla Tubos de ensaye Muestra de suero por equipo Kit comercial para detectar IgG anti-CMV el cual debe contener Controles positivo y negativo Amortiguador de dilución de la muestra Conjugado Cromógeno Solución de lavado Solución de paro Charola de reacción Si se determina por ELISA se empleará un lector de placas con dos filtros de 450 y 620 nm Procedimiento inmunoensayo indirecto en fase sólida 1. Preincubar la charola de reacción 3 hrs. Antes de iniciar a temp. amb. o a 37°C durante 30 min.

2. Prediluir las muestras y controles (10 L de muestra o control + 100L de diluyente.

4. Insertar el peine en la fila A, agitar e incubar por 30 minutos, retirar el peine y absorber el líquido adherido a los dientes.

3. Agregar 25 L de muestra y controles prediluidos en la fila A de la charola y mezclar.

5. Perforar la línea B, insertar el peine, mezclar e incubar por 2 minutos, retirar el peine y absorber el líquido adherido a los dientes.

6. Perforar la línea C, insertar el peine, mezclar e incubar por 20 minutos, retirar el peine y absorber el líquido adherido a los dientes. 66

7. Perforar la línea D, insertar el peine, mezclar e incubar por 2 minutos, retirar el peine y absorber el líquido adherido a los dientes. 10. Incube el peine por 1 minuto en la línea E, y seque al aire.

11. Realice la lectura sensibilizadas del diente

en

las

áreas

8. Perforar la línea E, insertar el peine, mezclar e incubar por 2 minutos, retirar el peine y absorber el líquido adherido a los dientes. 9. Perforar la línea F, insertar el peine, mezclar e incubar por 10 minutos, retirar el peine y absorber el líquido adherido a los dientes. 12. Deseche correctamente los RPBI.

Actividades de comprobación o evaluación 1. Defina los siguientes términos Inmunoensayo indirecto Perinatal Postnatal Corioretinitis 2. ¿Qué tipo de inmunoensayos se pueden emplear para diagnóstico virológico? Observaciones


MANUAL DE LABORATORIO virología

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