MANUAL DE METODOS DE DIAGNOSTICO CON ESPECIAL REFERENCIA A LOS SALMONIDOS
EN
ICTIOPATOLOGIA,
FAO/PROGRAMA COOPERATIVO GUBERNAMENTAL
APOYO A LAS ACTIVIDADES REGIONALES DE ACUICULTURA PARA AMERICA LATINA Y EL CARIBE por D.A. CONROY y G. ARMAS DE CONROY ORGANIZACION DE LAS NACIONES UNIDAS PARA LA AGRICULTURA Y LA ALIMENTACION Brasilia, Julio/1987
Brasil
Las denominaciones empleadas en esta publicación y la forma en que aparecen presentados los datos que contiene no implican, de parte de la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación, juicio alguno sobre la condición jurídica de países, territorios, ciudades o zonas, o de sus autoridades, ni respecto de la delimitación de sus fronteras o límites. Este libro es propiedad de la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación, y no podrá ser reproducido, ni en su totalidad ni en parte, por cualquier método o procedimiento, sin una autorización por escrito del titular de los derechos del autor. Las peticiones para tal autorización especificando la extensión de lo que se desea reproducir y el propósito que con ello se persigue, deberán enviarse al Director del Proyecto GCP/RLA/075/ITA, c/o FAOR, C.P. 07-1058, Brasilia 70333, D.F., Brasil. PREPARACION DE ESTE DOCUMENTO Este Manual ha sido preparado como parte de las actividades del “Trust Fund” de la FAO Proyecto GCP/RLA/075/ITA, Apoyo a las Actividades Regionales de Acuicultura para América Latina y el Caribe. Es un compendio de algunas de las clases teóricas y prácticas servidas a los alumnos del curso multidisciplinario de acuicultura para profesionales de nivel superior (senior) llevado a cabo en el Centro Regional Latinoamericano de Aquicultura (CERLA) y posteriormente denominado Centro de Pesquisa e Treinamento em Aquicultura (CEPTA) de la Superintendencia do Desenvolvimiento de Pesca (SUDEPE), en Pirassununga, SP, Brasil en el período comprendido entre 1981 a 1986. Se enfoca fundamentalmente las enfermades que más afectan a los salmónidos, con especial énfasis a las truchas por ser peces que se cultivan en gran escala, en lugares altos andinos. El Página 1 de 54
cultivo de salmónidos viene adquiriendo mucho interés y dedicación en los países de la Región por lo que resulta apremiante la prevención y control de las enfermedades que son más frecuentes en tales peces. La obra que se presenta ha sido compilada y revisada por los profesores J.E. Vinatea y F.A. Pagán-Font, Asesores Principales de Capacitación y de Investigación, respectivamente, de los Proyectos PNUD/FAO-RLA/76/010 y GCP/RLA/075/ITA. Los autores agradecen al Proyecto GCP/RLA/075/ITA por su apoyo para la publicación de esta obra, y al Sr. Manuel Martínez Espinoza, Oficial de Recursos Pesqueros por la revisión del trabajo. El Dr. D.A. Conroy es Profesor Titular de Ictiopatología de la FFacultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Central de Venezuela. La M. Sc. G. Armas de Conroy es coinvestigadora de la Sección Ictiopatología de la misma Facultad y Universidad. RESUMEN En este documento se desarrollan las técnicas de muestreo de peces silvestres y de cultivo; técnicas de anamnesis y envío de muestras; los métodos de diagnóstico y la diversidad de exámenes. Los hiperenlances que remiten a sitios Internet distintos de los de la FAO no implican, de parte de la Organización, ratificación oficial o responsabilidad respecto a opiniones, ideas, datos o productos presentados en dichos sitios, o una garantía de validez acerca de las informaciones que contienen. El único propósito de los enlaces a sitios distintos de los de la FAO es proporcionar otras informaciones disponibles sobre asuntos conexos. La presente versión electrónica de este documento ha sido preparada utilizando programas de reconocimiento óptico de texto (OCR). La FAO declina cualquier responsabilidad por las eventuales diferencias que puedan existir entre esta versión y la versión original impresa.
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INDICE DE MATERIAS 1. INTRODUCCION 2. TECNICAS DE MUESTREO 2.1 Peces de cultivo 2.1.1 Muestreos para la detección de virus 2.1.1.1 Peces de producción 2.1.1.2 Reproductores 2.1.2 Muestreos para la detección de bacterias 2.1.2.1 Peces de producción 2.1.2.2 Reproductores 2.1.3 Muestreos para la detección de mixosporidios 2.1.3.1 Peces de producción 2.1.3.1.1 Myxobolus cerebralis 2.1.3.1.2 Ceratomyxa shasta 2.2 Peces silvestres 2.2.1 Peces sexualmente inmaduros 2.2.2 Peces sexualmente maduros 2.2.3 Huevos fertilizados 2.3 Período de muestreo 2.3.1 Peces de producción 2.3.2 Reproductores 3. TECNICAS DE ANAMNESIS 4. ENVIO DE MUESTRAS 4.1 Envío de ejemplares vivos 4.2 Envío de ejemplares moribundos 4.3 Envío de muestras congeladas 4.4 Envío de muestras preservadas 4.5 Envío de muestras de productos sexuales, heces, etc. 5. PROCEDIMIENTOS DE AUTOPSIA 5.1 Caracteres morfológicos externos del salmónido 5.2 Caracteres morfológicos internos del salmónido 5.3 Técnica de autopsia 5.3.1 Examen externo 5.3.2 Examen interno 6. METODOS DE DIAGNOSTICO 6.1 Exámenes bacteriológicos 6.2 Exámenes micológicos 6.3 Exámenes parasitológicos 6.3.1 Técnicas para el diagnóstico de Myxobolus cerebralis (enfermedad del torneo) 6.3.1.1 Procedimiento de diagnóstico para situaciones de enfermedad Página 3 de 54
6.3.1.2 Procedimiento para la detección de infecciones asintomáticas 6.3.1.2.1 Método de digestión 6.3.1.2.2 Método de inmunofluorescencia 6.3.2 Técnicas para el diagnóstico de ceratomixosis 6.3.3 Técnicas para la coloración de frotis sanguíneos 6.3.3.1 Técnica de Leishman 6.3.3.2 Técnica de Giemsa 6.3.4 Técnicas para la coloración de protozoos 6.3.4.1 Método de Klein modificado (impregnación de plata para tricodínidos) 6.3.4.2 Técnicas para la fijación y coloración de helmintos 6.3.4.2.1 Trematodos 6.3.4.2.1.1 Fijación de Trematodos 6.3.4.2.1.2 Coloración de Trematodos 6.3.4.3 Cestodos 6.3.4.4 Nemátodos 6.3.4.5 Acantocéfalos 6.3.5 Piel y aletas 6.3.6 Branquias 6.3.7 Ojos 6.3.8 Musculatura 6.3.9 Hígado 6.3.10 Vesícula biliar 6.3.11 Tracto gastro-intestinal 6.3.12 Cerebro y cápsula creaneana 6.3.13 Riñón 6.3.14 Bazo 6.3.15 Corazón 6.3.16 Sangre 6.4 Exámenes histopatológicos 6.4.1 Técnicas de coloración en histología 6.4.1.1 Técnica de hematoxilina y eosina 6.4.1.2 Técnica de coloración tricrómica de Mallory 6.4.1.3 Técnica de coloración de Van Gieson 6.4.1.4 Técnica de coloración de Giemsa 6.5 Exámenes hematológicos 6.5.1 Obtención de las muestras 6.5.1.1 Dedinos y ejemplares pequeños 6.5.1.2 Ejemplares grandes y adultos 6.5.2 Hemoglobinometría 6.5.2.1 Patrón artificial 6.5.2.2 Curva standard 6.5.3 Recuento eritrocitario 6.5.4 Hematrocrito 6.5.5 Indices hematológicos 6.5.5.1 Volumen corpuscular medio (V.C.M.) 6.5.5.2 Hemoglobina corpuscular media (H.C.M.) 6.5.5.3 Concentración corpuscular media de hemoglobina (C.C.M.H.) 6.5.6 Preparación y coloración de frotis sanguíneos 6.6 Exámenes virológicos
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1. INTRODUCCION El contenido del presente Manual ha sido elaborado por los autores en base a material de apoyo preparado y distribuido durante el desarrollo de cursos de post-grado y de Maestría dictados en el Centro de Pesquisa e Treinamento en Aquicultura (CEPTA, Pirassununga, Brasil), la Universidad Central de Venezuela (UCV, Maracay, Venezuela), la Universidad Nacional de Trujillo (UNT, Trujillo Perú) y la Pontificia Universidad Javeriana (PUJ, Bogotá, Colombia). El propósito fundamental de este documento es el de poner al alcance de los acuicultores, biólogos, médicos veterinarios y otros profesionales hispanoparlantes una guía práctica que permita la realización de los correspondientes procedimientos de laboratorio a fin de diagnosticar debidamente algunos de los más importantes problemas patológicos que puedan presentarse en operaciones de acuicultura continental y marina. En este sentido se ha seleccionado una metodología básica que se aplica directamente a los salmónidos, por ser los mismos de creciente interés e importancia para fines de cultivo en muchos de los países de América Latina. De igual manera, los salmónidos constituyen especies de singular utilidad en cuanto a la enseñanza de la ictiopatología. Asimismo, ha sido factible incorporar en el presente Manual una metodología básica de muestreos e investigación tal como ha sido establecida y acordada internacionalmente a través de la elaboración, por una comisión de especialistas en la materia, de los Anexos Técnicos de la Convención Internacional para Controlar la Propagación de las Principales Enfermedades Transmisibles de los Peces, los cuales han sido dados a conocer conjuntamente por la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) y la Oficina Internacional de Epizootias (OIE). 2. TECNICAS DE MUESTREO Cualquier muestreo de salmónidos para fines de la certificación ictiosanitaria debe efectuarse bajo la supervisión directa del Inspector Ictiosanitario, de manera tal que permita garantizar la detección del agente etiológico de cualquiera de las enfermedades transmisibles cuya presencia es notificable y/o certificable. Al seleccionarse los peces para el muestreo, deben tomarse primero peces moribundos y visiblemente enfermos, complementando el muestreo con peces aparentemente sanos procedentes de la misma población. Si una población es mantenida en dos o más estanques, piletas u otra facilidad, la muestra constará de ejemplares tomados de cada estanque, pileta u otra facilidad en proporciones tales como para que equivalga aproximadamente a la distribución de la población en dichos estanques, piletas u otra facilidad. Los órganos o tejidos (cuando corresponda) de peces en las muestras pueden mezclarse antes de efectuarse exámenes virológicos y parasitológicos (Myxobolus cerebralis, Ceratomyxa shasta). Sin embargo, esa parte de la muestra que reune peces moribundos o visiblemente enfermos EN NINGUN MOMENTO debe ser mezclada con la parte correspondiente a peces aparentemente sanos. Hasta diez peces individuales (u órganos o tejidos de los mismos) con una longitud estándar de cuatro centímetros o menos pueden mezclarse para constituir una sola muestra para los fines de los correspondientes exámenes de laboratorio posteriores. En situaciones donde se sospecha la presencia de una enfermedad transmisible, o donde los resultados de los exámenes de laboratorio practicados son de dudosa interpretación, se requieren mayores muestras; por ese motivo, deberán tomarse muestras mayores para los exámenes correspondientes.
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Para fines de poder efectuar las correspondientes investigaciones virológicas, como regla general se recomiendan los procedimientos que a continuación se detallan: a. alevines: se emplean alevines in toto; b. dedinos hasta 4 cm de longitud estándar llevar a cabo las investigaciones con vísceras totales debidamente extirpadas de los peces, una vez que los mismos hayan sido disectados; c. ejemplares juveniles entre 4–10 cm de longitud estándar: llevar a cabo las investigaciones con vísceras (incluyendo el riñón) después de haberse disectado; d. ejemplares adultos y de una longitud estándar mayor que 10 cm: llevar a cabo la investigación con una mezcla de bazo, ciegos pilóricos y páncreas, y riñón en proporciones correspondientes a 1:1:3; asegurar que la muestra del riñón se compone de partes iguales del riñón anterior, riñón medio, y riñón posterior respectivamente. Todo muestreo de poblaciones de salmónidos será basado en lotes. Un lote se define como sigue: a. cuando se efectúan muestreos para todas las enfermedades infecto-contagiosas incluidas en la Convención Internacional FAO/OIE para Controlar la Propagación de las Principales Enfermedades Transmisibles de los Peces MENOS la enfermedad del torneo (Myxobolus cerebralis), un lote se define de acuerdo con la edad, origen y cepa, siempre y cuando haya compartido el mismo cuerpo de agua; los peces que tuvieron su origen en huevos de la misma cepa de reproductores, pero que eclosionaron en diferentes fechas, no constituyen lotes diferentes salvo en los casos donde el desove queda separado por una estación (por ejemplo: dos envíos de huevos de truchas arco iris que desovaron en el otoño en una piscifactoría, y que fueron recibidos en septiembre y diciembre, se consideran como un solo lote; de la misma manera, toda trucha arco iris de desove primaveral de la misma fuente se considera como otro lote); también, cuando una parte del lote se mantiene en un sistema de agua cerrada, cada una será considerada como un lote diferente, y el muestreo será efectuado de la manera correspondiente; b. cuando se efectúa una encuesta en un criadero, piscifactoría o establecimiento piscícola para detectar la presencia de la enfermedad del torneo (Myxobolus cerebralis), un lote se define como la totalidad de los peces en el criadero, piscifactoría o establecimiento piscícola que tengan entre cuatro a ocho meses de edad en una sola fuente de agua (por ejemplo: una truchifactoría que contiene tres diferentes especies de truchas y una sola fuente de agua tendrá solamente un lote). El tamaño MINIMO de la muestra para cada lote será de acuerdo con un plan que provea un nivel de confianza del 95% en la detección de uno o más portadores en el lote. Los números mínimos de peces en el muestreo para lotes de distintas cantidades de individuos, y para una incidencia estimada del 2%, del 5%, y del 10% respectivamente se dan a conocer en la TABLA 1.
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2.1 Peces de cultivo 2.1.1 Muestreos para la detección de virus 2.1.1.1 Peces de producción (es decir: peces para fines de consumo y/o repoblación OTROS que reproductores): el método de muestreo a ser empleado debe ser tal que garantice un nivel de confianza del 95% en la detección de uno o más portadores de cada lote, suponiendo que la incidencia mínima de portadores de la población es del 2% o del 5%. 2.1.1.2 Reproductores (es decir: peces maduros mantenidos para fines de reproducción): se debe tratar de conseguir la misma sensibilidad en cuanto a la detección de portadores se refiere; el muestreo debe llevarse a cabo una vez al año, o durante la época de desove, utilizando productores sexuales en vez de sacrificar reproductores valiosos en gran escala (muestreo letal): en todo caso que sea posible, debe usarse líquido ovárico como muestra para los exámenes de laboratorio correspondientes; los productores sexuales se muestrean de tal manera que garantice un nivel de confianza del 95% en la detección de uno o más portadores en cada lote, suponiendo que la incidencia mínima de portadores en la población es del 2% o del 5%; en vista que sería poco aconsejable confiar exclusivamente en muestras de los productos sexuales para detectar la presencia de virus, se hace necesario sacrificar algunos reproductores con el fin de obtener muestras del riñón, bazo, pán creas y ciegos pilóricos; el muestreo letal debe efectuarse de manera que garantice un nivel de confianza del 95% en la d tección de uno o más portadores en cada lote, suponiendo que la incidencia mínima de portadores en la población es del 10%. 2.1.2 Muestreos para la detección de bacterias 2.1.2.1 Peces de producción: los peces deben ser muestreados para bacterias de la manera que garantice un nivel de confianza del 95% en la detección de uno o más portadores en cada lote, suponiendo que la incidencia mínima de portadores en la población es del 10%; para fines rutinarios se muestrean solamente aquellos peces cuya longitud estándar es más de cuatro centímetros, ya que peces con una longitud estándar menos de 4 cm no son aptos para el examen bacteriológico (por ejemplo: a los efectos de detectar la presencia de Aeromonas salmonicida), además de lo cual dichos muestreos son técnicamente más difíciles de llevar a cabo en la práctica; se efectúan muestreos de peces cuya longitud es menos de 4 cm exclusivamente cuando existen motivos concretos para sospechar la presencia de una enfermedad bacteriana, y cuando mortalidades y/o señales clínicas anormales se experimentan en la población. 2.1.2.2 Reproductores: los reproductores deben ser muestreados para bacterias de tal manera que garantice un nivel de confianza del 95% en la detección de uno o más portadores en cada lote, suponiendo que la incidencia mínima de portadores en la población es del 10%.
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2.1.3 Muestreos para la detección de mixosporidios 2.1.3.1 Peces de producción: los peces deben ser muestreados para mixosporidios (Myxobolus cerebralis, Ceratomyxa shasta) de tal manera que garantice un nivel de confianza del 95% en la detección de uno o más portadores en cada lote, suponiendo que la incidencia mínima de portadores en la población es del 5%; los siguientes procedimientos deben ser cumplidos: 2.1.3.1.1 Myxobolus cerebralis: los peces deben tener por lo menos cuatro meses de edad si los exámenes han de ser fidedignos, dado que la producción de las esporas de M. cerebralis (en base a cuya presencia se fundamentan los exámenes de laboratorio) a veces tarda en desarrollarse en el caso de peces mantenidos en agua cuya temperatura es inferior a los 12°C; la formación de las esporas de M. cerebralis puede tardar hasta nueve a once meses en efectuarse. 2.1.3.1.2 Ceratomyxa shasta: el muestreo rutinario de peces aparentemente sanos para la detección de C. shasta puede llevarse a cabo SOLAMENTE en base a peces cuya longitud estándar es de 10 cm o más; con dichos peces, el material visceral que se requiere para los exámenes de laboratorio es el que no sea requerido para otras pruebas (por ejemplo: virus); se realizan exámenes de laboratorio para la detección de C. shasta sólo en casos cuando se experimentan mortalidades y/o señales clínicas anormales en peces de menor longitud en la población. 2.2 Peces silvestres 2.2.1 Peces sexualmente inmaduros Todo pez sexualmente inmaduro presente en cuerpos de agua naturales debe ser muestreado de tal manera que garantice un nivel de confianza del 95% en la detección de uno o más portadores en los ejemplares capturados, suponiendo que la incidencia mínima de portadores es del 10%; esa tasa de muestreo también es practicable para todos los organismos patógenos objeto de notificación y/o certificación ictiosanitaria (es decir: virus, bacterias, determinados parásitos). 2.2.2 Peces sexualmente maduros En casos cuando se procede a la recolección de reproductores silvestres, o de sus huevos fertilizados, líquido ovárico y semen deben ser obtenidos a partir de los peces hasta un máximo de 60 ejemplares; además debe efectuarse un muestreo letal de un 10% de los reproductores capturados o utilizados hasta un máximo de 30 ejemplares. 2.2.3 Huevos fertilizados La práctica de efectuar muestreos en base a huevos fertilizados procedentes de peces silvestres no constituye un procedimiento de confianza con respecto a la detección de determinados organismos ictiopatógenos capaces de ser transportados sobre la superficie de dichos huevos; por ese motivo, todo procedimiento de inspección y certificación ictiosanitaria Página 8 de 54
se debe fundamentar en un conocimiento completo y fidedigno del estado ictiosanitario de la población y/o del establecimiento de origen de dichos huevos. 2.3 Período de muestreo 2.3.1 Peces de producción Los muestreos se han de efectuar dos veces al año, según las condiciones locales y/o regionales; en vista que la detección de Myxobolus cerebralis y de algunos virus es más facil mediante el empleo de peces de determinadas edades, se recomienda que los muestreos sean efectuados durante los períodos Marzo-Mayo y de Septiembre-Noviembre respectivamente. 2.3.2 Reproductores Los muestreos se efectuarán una vez al año, o sea durante el período de desove; el muestreo de poblaciones cultivadas de reproductores FUERA del período del desove (por ejemplo: el muestreo letal y exámen de las vísceras) para la presencia de virus se efectuará de tal manera que garantice un nivel de confianza del 95% en la detección de uno o más portadores en la población, suponiendo que la incidencia mínima de portadores es del 10%. 3. TECNICAS DE ANAMNESIS A los efectos de llevar a cabo la inspección ictiosanitaria de un criadero, piscifactoría u otro establecimiento piscícola, se hace necesario efectuar una selección sistemática de los peces y proceder a la elaboración de un informe detallado sobre el comportamiento de los mismos en el ambiente en estudio, o sea: preparar una historia clínica detallada en la cual han de anotarse todos los datos básicos de posible interés al Ictiopatólogo. Para ello, es conveniente utilizar un formulario único, tal como se detalla en la TABLA 2. Con el propósito de permitir que el Inspector Ictiosanitario pueda efectuar un diagnóstico fidedigno frente a cualquier problema ictiopatológico que se presente en el establecimiento piscícola y sobre todo en relación a las enfermedades infecto-contagiosas incluidas en la Convención Internacional FAO/OIE para Controlar la Propagación de las Principales Enfermedades Transmisibles de los Peces, es de fundamental importancia completar in toto el formulario anamnésico, y remitirlo junto con las muestras al laboratorio ictiopatológico. 4. ENVIO DE MUESTRAS Muestras de peces destinadas para estudios de laboratorio deben ser manejadas en forma rápida para evitar los cambios autolíticos o degenerativos que dificultarían o imposibilitarían los procedimientos de diagnóstico correspondientes. En casos cuando los peces no puedan ser llevados vivos al laboratorio, deben ser mantenidos en hielo durante un período no mayor de veinticuatro horas. Es de suma importancia que toda muestra sea tomada antes de iniciar cualquier operación de control o terapia. Para el envío de muestras de peces al laboratorio, se recomiendan los siguientes procedimientos:
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4.1 Envío de ejemplares vivos Siempre que sea factible, los peces vivos deben ser transportados en recipientes adecuados conteniendo agua del cual se mantiene oxigenada o aireada, o en bolsas dobleteadas de plástico con atmósfera de oxígeno. Como regla general se colocan hasta cinco alevines, o tres dedinos, por cada litro de agua; en casos cuando sea necesario usar bolsas de plástico, éstas han de ser debidamente selladas, y es conveniente que éstas se despachen en cajas de anime, agregando hielo triturado en la caja cuando eso corresponda. 4.2 Envío de ejemplares moribundos Peces moribundos han de ser transportados tal como se detalla en el renglón 4.1 arriba; para los exámenes de laboratorio, es importante que las muestras se reciban el mismo día de su envío del criadero, piscifactoría u otro establecimiento piscícola. 4.3 Envío de muestras congeladas Aunque siempre es preferible contar con muestras de peces vivos o moribundos, es posible llevar a cabo determinados procedimientos de laboratorio en base a material congelado (por ejemplo: algunos estudios virológicos); en este sentido, los peces deben ser empacados individualmente en bolsas plásticas, las cuales se colocan en forma individual dentro de un recipiente debidamente insulado con hielo seco, asegurando una ventilación adecuada con el fin de evitar una acumulación de presión gaseosa dentro del recipiente; aunque este método no es el más aconsejable, sirve como último recurso en casos de virosis y de mixosporidiosis, ya que la mayoría de los virus pisciarios sobreviven al menos por un período no muy largo en tejidos mantenidos a una temperatura de -20°C, así como las esporas de los mixosporidios M. cerebralis y C. shasta; siempre que eso sea factible, los peces han de ser transportados enteros, y solamente en casos excepcionales pueden ser eviscerados y muestras de riñón, bazo, hígado, etc., reunidas en lotes de no más de cinco por bolsa. 4.4 Envío de muestras preservadas Para estudios histopatológicos, es indispensable que el material a ser examinado haya sido debidamente fijado previamente a su envío al laboratorio; animales moribundos mostrando señales clínicas de la enfermedad o anormalidad que se desea investigar se colocan en un recipiente que contenga una solución acuosa de formaldehido al 4% tamponada; dicha solución se prepara al agregar 10 ml de formol al 40% por cada 90 ml de agua, y según el origen del pez el agua con la cual se efectúa la dilución puede ser dulce, salobre, o marina. Alevines y dedinos pequeños pueden mandarse enteros, pero en el caso de peces cuya longitud estándar sea superior a los 2 cm, es necesario efectuar una incisión en la parte ventral del abdómen para facilitar la penetración de la solución preservativa en la cavidad abdominal, asegurando así la fijación correspondiente de los diferentes órganos y demás tejidos internos. Es conveniente que el volumen de material a líquido preservatorio tenga una relación de 1:10; también puede agregarse una pequeña cantidad de carbonato de calcio al líquido preservativo a los efectos de mantenerlo en un pH cercano al neutro (7,0).
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4.5 Envío de muestras de productos sexuales, heces, etc. Muestras de fluido ovárico y semen se obtienen durante el período de desove, recolectando el material correspondiente en tubos u otros recipientes adecuados estériles; en el caso de heces, 0,5–1,0 ml de heces frescas se recolectan en 5,0 ml de solución isotónica estéril; ni los productos sexuales ni las heces pueden ser mantenidos durante más de veinticuatro horas en hielo, ni a una temperatura de los 4°C. 5. PROCEDIMIENTOS DE AUTOPSIA El biólogo, médico veterinario u otro profesional encargao de las tareas propias de inspección y certificación ictiosanitaria ha de tener conocimientos básicos de la anatomía pisciaria, sobre todo cuando es necesario llevar a cabo las operaciones correspondientes de autopsia, obtención de material para su despacho al laboratorio, etc. Típicamente, el pez teleósteo cuenta con 10 sistemas de órganos, los cuales a la vez están compuestos de varias combinaciones de 6 tipos principales de tejidos, a saber: epitelial, contráctil, tejido de apoyo, reproductivo, circulatorio y nervioso. Las unidades estructurales y funcionales de dichos tejidos las componen células las cuales, como en el caso de los demás grupos animales, se caracterizan por la posesión de un núcleo, citoplasma y membrana celular. En principio los sistemas anatómicos del pez teleósteo (del cual la trucha es un ejemplo) así como las funciones de los mismos, son los siguientes: a. Esqueletal: facilita estructura y apoyo al cuerpo, así como los correspondientes mecanismos de ligaduras y palancas para los músculos y de esa manera ayuda en operaciones tales como natación, ingestión de alimento, etc.; los principales componentes del sistema equeletal lo constituyen los huesos, cartílagos y tejidos conectivos. b. Integumentario: el integumento cubre el cuerpo dando un cierto grado de protección mediante la posesión de la piel, escamas, células pigmentarias y mucosas, etc.. c. Respiratorio: el sistema respiratorio funciona en relación a la respiración externa en el sentido de absorber oxígeno disuelto en el ambiente acuático del pez, así como la excreción de CO2 hacia ese ambiente; a la vez, juega un importante papel en la regulación del equilibrio químico-osmótico entre el pez y el ambiente acuático a raíz de los cambios que tienen lugar a nivel de la superficie branquial. d. Circulatorio: las funciones principales del sistema circulatorio son las de transportar nutrientes, células sanguíneas, fluidos, gases disueltos y productos metabólicos a todas las partes del cuerpo. e. Muscular: este sistema cuenta con tres principales tipos de células, a saber: células estriadas, células no estriadas y células cardíacas, las cuales a la vez permiten los movimientos de natación, de los ojos y otros (musculatura estriada), movimientos involuntarios tales como el de alimento en el tracto gastro-intestinal (musculatura no estriada) y a la circulación sanguínea (musculatura cardíaca) respectivamente; también, y en su conjunto, los músculos ayudan a dar una forma determinada al cuerpo del pez. f. Digestivo: el sistema digestivo hace soluble a las substancias alimenticias en el sentido de permitir su absorción y utilización como fuente de energía, reparación y desarrollo de los distintos tejidos, etc. Página 11 de 54
g. Excretorio: a través de las funciones renales, el sistema excretorio facilita la eliminación de algunos materiales metabólicos del cuerpo; también es de singular importancia este sistema en cuanto al mantenimiento del equilibrio osmótico se refiere; h. Reproductivo: permite la continuidad de la especie gracias a la producción contínua de ovas y espermas. i. Endocrino: el sistema endocrino complementa la integración funcional de todos los demás sistemas mediante la producción de diferentes hormonas en los correspondientes tejidos glandulares; este sistema, por lo tanto, constituye un factor de primordial importancia en el control del desarrollo (por ejemplo: el tiroides) y de la reproducción (por ejemplo: la hipófisis). j. Nervioso: el tejido nervioso facilita la operación de todos los demás sistemas, y también permite la orientación del pez hacia los diversos ambientes a raíz de los órganos de sentido especiales, del cerebro y de los nervios craneales y espinales. Con el fin de proporcionar información básica a título de orientación, se hará una descripción de la anatomía de la trucha arco iris como representante de los salmónidos. 5.1 Caracteres morfológicos externos del salmónido El cuerpo es elongado, compacto, más grueso hacia el centro y más fino hacia la cabeza y la cola respectivamente. La boca queda localizada terminalmente, y el labio inferior queda apoyado entre dos huesos de libre movimiento: el premaxilar hacia la parte anterior, y el maxilar hacia la parte posterior; tanto el premaxilar como el maxilar están dotados de dientes, los cuales se hallan típicamente en una sola fila. En cuanto la boca esté cerrada, se observa una fila de dientes palatinos al interior, la cual se encuentra paralela con la de los dientes maxilares; en la parte meridional de la boca se encuentran los así llamados dientes vomerinos. El labio inferior, o mandíbula, está compuesto de un hueso dentario que lleva dientes, y dos huesos posteriores en ambos lados; los dentarios se reúnen en una sínfisis anterior a la línea meridional, y dicha sínfisis se pone hinchada y encorvada hacia arriba (con forma de gancho) en los salmónidos machos sexualmente maduros en la época del desove. Los ojos son grandes y carecen de párpados; la córnea es transparente. La nariz doble queda localizada un poco anterior a los ojos. No hay evidencia externa alguna de un sistema auditorio. En ambos lados de la región posterior de la cabeza se encuentran los opérculos, cada uno de los cuales consta de tres huesos: opercular, sub-opercular, e inter-opercular respectivamente. El último de estos huesos está ligado con el ángulo de la mandíbula y el pre-opercular es uno de los huesos de la mejilla que sigue la forma general de hiomandibular. La parte ventral de la región ocular da lugar a una extensión delgada y membranosa la cual se denomina la membrana branquiestegal, apoyada por huesos delgados y aplanados llamados los radios branquiestegales. El área estrecha cubre la parte ventral de la garganta, y lo que separa las dos aperturas branquiales entre sí, se denomina el istmo. La cabeza se extiende desde la trompa al límite posterior de la membrana opercular; por tronco se entiende esa parte del cuerpo que comprende el límite posterior del opérculo hacia el ano, llamándose la parte caudal la región postanal. El ano está localizado sobre la superficie ventral del cuerpo a una posición situada en la base de la aleta anal.
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En los salmónidos se encuentran dos aletas dorsales. La anterior de ellas se compone de radios óseos blandos, mientras que la parte posterior está compuesta de tejido grasoso, motivo por el cual se llama aleta adiposa. Las otras aletas de los salmónidos incluyen la caudal, la anal, y las pectorales y pélvicas (o ventrales) en pares, todas las cuales se componen de radios blandos. En los salmónidos se presenta un proceso cartilaginoso axilar en el ángulo entre las aletas pélvicas de la pared corporal. La superficie externa del cuerpo se encuentra cubierta por pequeñas escamas, menos la cabeza y las aletas. Se observa una línea lateral bien marcada, la cual posee funciones principalmente sensoriales. La epidermis está dotada de células pigmentarias y glándulas mucosas. Las escamas están situadas en bolsas dentro de la dermis. Cada escama consta de una placa ósea delgada con marcas sobre la superficie, siendo del tipo cicloide en vista que cada una posee un margen delgado liso. 5.2 Caracteres morfológicos internos del salmónido La columna vertebral (o espina dorsal) apoya en forma auxiliar al cuerpo, siendo compuesta de dos tipos de vértebras: las del tronco y las de la cola. Se identifica la primera vértebra caudal por la posesión de una espina anal. Las partes de la vértebra típica del tronco constan de espina neural, arco neural, centro, zigapófisis y parapófisis; el parapófisis lleva costillas pequeñas en las vértebras del tronco, pero en las cuales es de suponerse que esas costillas estén extendidas en forma ventral para así formar el arco hemal y la espina hemal. La parte posterior de la región caudal está modificada para dar apoyo a la aleta caudal. Las espinas neurales y hemales de las vértebras posteriores se encuentran dirigidas caudalmente, siendo aplanadas y anchas, hallándose en yuxtaposición entre sí con el objeto de brindar el apoyo necesario a los radios de la aleta caudal. La parte ósea de la cabeza es muy compleja, y se compone de huesos y cartílagos aislados y, a la vez, mezclados entre sí. La cabeza consta del cráneo, aparato hioides, suspensorio, aparato opercular, arcos branquiales, y labios respectivamente. Tanto las aletas dorsal como anal cuentan con el apoyo de huesos, siendo éstos los interneurales y los interhemales respectivamente. Las aletas pectorales se encuentran apoyadas por el cleitro, supra-cleitro, post-emporo, escápula y coracoide, mientras que las aletas pélvicas tienen como base los basiterigios formando la cintura pélvica. La musculatura consta de una serie de miomeros; músculos especiales, de origen segmental, sirven para hacer funcionar a las aletas, labios, y demás partes dotadas de movimiento. La cavidad corporal se divide entre la cavidad abdominal y la cavidad pericardial respectivamente. La vejiga natatoria queda localizada por encima de las vísceras, y abre hacia el esófago mediante el ducto neumático (es decir: fisotoma). La boca conlleva directamente a la faringe, a partir de la cual las aberturas branquiales abren hacia el exterior. El esófago termina en un estómago tubular, el cual queda separado del intestino delgado mediante un esfínter pilórico. El intestino delgado continúa posteriormente, dando lugar al intestino grueso. La parte anterior del intestino delgado en los salmónidos posee varios tubos truncados, llamados los ciegos pilóricos. Se observa un hígado completo con vesícula biliar, así como un bazo.
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Los salmónidos tienen cuatro pares de branquias, cada una de las cuales está dotada de una doble fila de filamentos branquiales. El quinto arco branquial no lleva filamentos. En ambos lados anteriores por debajo del opérculo se halla un pseudobranquio hioide. La extensión de la superficie respiratoria de cada filamento branquial queda aumentada por los numerosos lamelos branquiales de los cuales está compuesto. La operación de inspiración se efectúa al abrirse los opérculos hacia afuera, proceso durante el cual la boca abre a raíz del movimiento de los opérculos hacia adentro, o sea: hacia el cuerpo. La boca cierra y válvulas orales sellan los espacios por detrás de los dientes de tal manera que el agua debe moverse por encima de la superficie de las branquias y salir por el espacio formado entre el opérculo y el cuerpo. El corazón consta de un sinus venosus, un atrio, y un ventrículo; el ventrículo se continúa con un bulbus arteriosus. La sangre queda oxigenada en las baranquias y pasa hacia la parte anterior y la parte posterior del cuerpo. En el primer caso pasa a través de las arterias carótidas, y en el segundo caso a través de la aorta. Después de proveer oxígeno, etc., a los diferentes sistemas, la sangre vuelve al sinus venosus. El cerebro del salmónido consta de diez pares de nervios craneanos y queda localizado dentro del cráneo. El saco olfatorio es una cavidad ciega a la cual abren las narinas. Los riñones (del tipo mesonéfrico) tienen un tamaño considerable, y quedan situados a lo largo del tronco dorsal en una situación dorsal en relación a la vejiga natatoria. En la parte posterior, o caudal, los riñones drenan en una pequeña vejiga urinaria la cual descarga al sinus urinogenital. En los machos, los testículos son órganos largos, lisos y de color blanquecino, los cuales se extienden casi a lo largo de la cavidad abdominal. Cada uno continúa posteriormente hacia un ducto que abre en el sinus urinogenital. Los testículos están situados inmediatamente por debajo de la vejiga natatoria. Los ovarios de las hembras también se extienden a lo largo de la cavidad abdominal, y contienen numerosas ovas; carecen de oviductos. Los ovarios, en contraste a los testículos, tienen un aspecto granular. Las ovas maduras llegan al exterior a través del sinus urinogenital. 5.3 Técnica de autopsia Aunque de acuerdo con la etiología de la enfermedad puede resultar necesaria una investigación detallada de un determinado órgano (por ejemplo: el riñón en el caso de la enfermedad bacteriana del riñón), es siempre conveniente efectuar una autopsia de una manera completa y uniforme. Cualquier autopsia debe llevarse a cabo tan pronto como sea posible, constando dicho procedimiento de dos partes principales, a saber: el examen externo y el examen interno respectivamente. 5.3.1 Examen externo En primer lugar, se efectúa un cuidadoso examen de la superficie externa del pez con el fin de observar y anotar la presencia de cualquier anormalidad aparente y visible macroscópicamente. En este sentido se destaca la importancia que tiene la coloración del cuerpo, la posible presencia de exoftalmia, erizamiento o pérdida de las escamas, congestión y ulceración, hinchamiento y necrosis de las aletas, erosión de los bordes de los opérculos, Página 14 de 54
presencia de parásitos adultos o larvales, etc. Seguidamente se procede a efectuar exámenes microscópicos de preparados frescos y de frotis de la parte afectada, como así también la siembra de los correspondientes medios de cultivo para el aislamiento de bacterias, hongos, etc. 5.3.2 Examen interno Después de haberse efectuado las siembras correspondientes a partir de toda lesión u otra anormalidad, se desinfecta el pez mediante la limpieza externa del mismo con un algodón o trozo de tela impregnado con una solución acuosa recién preparada de un producto aprobado en base a yodo orgánico que contenga quinientas partes por millón (500 ppm) de yodo disponible (como I2 libre); seguidamente se coloca el pez sobre una bandeja de disección debidamente desinfectada, con el lado izquierdo del pez por arriba. Con instrumental debidamente desinfectado, se corta la aleta pectoral, y se efectúa un corte transversal en un punto inmediatamente anterior al ano en una posición entre éste y las aletas pélvicas, evitando cualquier daño al intestino. Se introduce la punta de un par de tijeras en ese corte transversal, y se procede a efectuar una segunda incisión en la pared abdominal en línea recta hacia el istmo a la altura de las branquias; el segundo corte se efectúa partiendo desde el punto donde se hizo la incisión inicial hacia arriba, en forma semi-circular, para cortar la pared dorsal de la musculatura que cubre la cavidad abdominal; este corte se continúa hasta la altura del opérculo. Al levantar la pared cortada, debe ejercerse mucho cuidado así como desprender cuidadosamente cualquier unión de tejido conectivo que pudiera haber entre ésta y las vísceras, mediante el uso de una aguja de disección. Posterior a esto se hace otro corte, o corte final, desde el opérculo hasta el istmo donde termina el primer corte, para poder retirar la parte anteriormente cortada y dejar expuestas in situ las vísceras. A continuación se corta el opérculo, dejando así descubiertas las branquias. Seguidamente se procede a efectuar un examen macroscópico de los órganos internos para detectar cualquier coloración anormal u otra anormalidad que sea patente en los mismos. También es de importancia observar y anotar la presencia de cualquier líquido o fluido anormal en la cavidad abdominal misma. Han de efectuarse CUANTO ANTES siembras sobre los medios de cultivo correspondientes a partir de cualquier órgano que presente señales anormales, para así evitar en lo posible una contaminación posterior. Al haberse efectuado los correspondientes exámenes macroscópicos de los órganos in situ, se procede a sacar el hígado, bazo, tracto gastro-intestinal y páncreas in toto, cortando el tracto gastro-intestinal a nivel del ano y del esófago respectivamente. Una vez sacados dichos órganos, quedan expuestos para su examen el riñón, vejiga natatoria y gónadas. El riñón se saca al levantarlo cuidadosamente de la parte dorsal de la cavidad abdominal del pez, operación que también puede incluir el retiro de la vejiga urinaria y uretras (si se lleva a cabo con sumo cuidado). La operación final de la autopsia incluye una exposición del cerebro y el retiro de los ojos. El cerebro puede retirarse al efectuar una serie de incisiones en los músculos epaxiales a nivel del cráneo, eliminando la parte superior ósea del mismo. Una vez terminados los procedimientos de autopsia, los restos del pez y de los órganos, etc., deben ser desinfectados mediante su colocación en una solución acuosa recién preparada de un producto aprobado en base a yodo orgánico que contenga quinientas partes por un millón de yodo disponible (como I2 libre). Posteriormente este material será destruido por Página 15 de 54
incineración. El instrumental usado en la disección, vidriería, etc., también será desinfectado mediante la exposición en una solución acuosa recién preparada de un producto aprobado en base a yodo orgánico que contenga quinientas partes de millón (500 ppm) de yodo disponible (como I2 libre). 6. METODOS DE DIAGNOSTICO 6.1 Exámenes bacteriológicos Con el fin de lograr un diagnóstico confirmativo de las enfermedades bacterianas de los salmónidos, es imprescindible que el agente etiológico correspondiente sea aislado e identificado en el laboratorio, siendo la única excepción a esta regla la enfermedad bacteriana del riñón en donde el diagnóstico se fundamenta en un examen de un extendido del riñón y/o de otros órganos para poner de manifiesto la presencia de numerosos diplobácilos Gram positivos. Se permite solamente el uso de peces vivos o moribundos, dado que al morirse los peces éstos son rápidamente invadidos por organismos saprofíticos presentes en el agua y sobre la superficie de la piel, y de esa manera se complica o se dificulta el diagnóstico. El primer paso es el de hacer un examen macroscópico del pez para detectar cualquier lesión, abceso, o forúnculo. A partir de esas anormalidades se preparan extendidos los cuales se examinan microscópicamente para detectar la presencia de mixobacterias, bacterias móviles o inmóviles, etc. El área de la superficie de la lesión se cauteriza cuidadosamente mediante el uso de un cuchillo o bisturí caliente, y el material se toma a partir del tejido con una asa de platino flameada para su posterior siembra en el medio de cultivo. En casos en los cuales no se detecta la presencia de lesiones externas, la superficie del pez se desinfecta cuidadosamente con un trozo de algodón empapado en un producto aprobado en base a yodo orgánico, y una vez seca la superficie (aproximadamente un minuto) se procede a abrir la cavidad abdominal del pez con instrumentos esterilizados para exponer órganos internos in situ. El material para los cultivos se toma con una asa de platino flameada de los órganos internos, y especialmente del riñón, bazo, e hígado. Los siguientes procedimientos representan las técnicas mínimas aceptables para fines del diagnóstico bacteriológico de enfermedades de salmónidos y deben ser utilizados para toda muestra tomada a partir de lotes y/o poblaciones en los cuales se experimenta una apreciable incidencia de señales clínicas anormales y/o mortalidades. En aquellas muestras procedentes de lotes de peces aparentemente sanos, los mismos procedimientos pueden ser aplicados solamente a peces cuya longitud estándar es de cuatro centímetros (4 cm) o más. A. Estriar material tomado asépticamente a partir del riñón (al ser posible de áreas con un aspecto normal) en los siguientes medios de cultivo: a. agar forunculosis (FA); b. agar Cytophaga (CA); c. agar tripticasa soya (TSA); d. agar cólera (CM); e. agar Mueller-Hinton enriquecido con cocarboxilasa; La composición y modus operandi de la preparación de los diferentes medios de cultivo se detallan en el APENDICE A.
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B. Preparar extendidos del mismo material, colorear según el método de Gram, y examinar microscópicamente para detectar la presencia de bacterias. La presencia de pequeños diplobácilos Gram positivos, a menudo en forma intracelular, constituye evidencia presuntiva para el diagnóstico preliminar de Renibacterium salmoninarum, agente etiológico de la enfermedad bacteriana del riñón. C. Las placas inoculadas se incuban a los 20–25°C durante diez (10) días, y se examinan diariamente para detectar la presencia de colonias de microorganismos. Una placa duplicada de agar Cytophaga se incuba a los 10°C para detectar la presencia de Cytophaga psychrophila. D. Seleccionar colonias juveniles representativas de las placas de agar Cytophaga y hacer extendidos de las mismas. Colorear según el método de Gram y examinar microscópicamente. La presencia de bastones largos y delgados, Gram negativos, los cuales están dotados de un movimiento de deslizamiento, constituye evidencia para el diagnóstico presuntivo de casos de mixobacteriosis. E. Seleccionar colonias juveniles representativas de las placas de agar forunculosis, agar tripticasa soya y agar cólera. Proceder a la identificación preliminar de las bacterias en base a los siguientes caracteres: a. Si las células son Gram negativas, en forma de bastón, citocromoxidasa positivas y móviles, el organismo posiblemente sea una especie de los géneros Aeromonas, Pseudomonas o Vibrio. b. Si el organismo se diferencia de los mencionados en el renglón anterior por ser citocromoxidasa negativo, posiblemente se trata de Yersinia ruckeri, agente etiológico de la enfermedad de la boca roja. c. Si el organismo se diferencia de los mencionados en los renglones (a) y (b) arriba por ser inmóvil y en la producción de un pigmento marrón oscuro hidrosoluble en placas de agar forunculosis y de agar tripticasa soya, posiblemente sea Aeromonas salmonicida, agente etiológico de la forunculosis. d. Si el organismo se desarrolla solamente en agar Mueller-Hinton enriquecido con cocarboxilasa, y no en los demás medios de cultivo, y tiene forma de bastón Gram negativo e inmóvil, es casi seguro que se trata de Haemophilus piscium, agente etiológico de la enfermedad de la úlcera. Cualquier diagnóstico presuntivo de la presencia de los agentes etiológicos de enfermedades bacterianas de los salmónidos de interés para la certificación ictiosanitaria debe ser confirmado en el laboratorio mediante la realización de las pruebas bacteriológicas, serológicas y/o inmunológicas correspondientes. Las características más importantes de estas bacterias ictiopatógenas se detallan en la TABLA 3. La identifación taxonómica precisa de estas bacterias ha de efectuarse en base a sus caracteres morfológicos, bioquímicos y, cuando eso corresponde, inmunoserológicos. Las principales técnicas utilizadas en la identificación de las bacterias asociadas con las más importantes enfermedades infecto-contagiosas de los peces son las que se detallan a continuación: i.
Prueba de movilidad: se remueve una colonia juvenil de la superficie de una placa del medio de cultivo debidamente sembrado, y se efectúa su emulsión en una gota de agua sobre un portaobjeto; la suspensión bacteriana se cubre cuidadosamente con un cubreobjeto, asegurando que no queden atrapadas burbujas de aire; la suspensión se examina microscópicamente con un aumento de × 40 y de × 100; los organismos Página 17 de 54
ii.
móviles muestran un movimiento activo en el campo microscópico, el cual no debe confundirse con el movimiento browniano; la presencia de bastones delgados y largos que muestran un deslizamiento evidencia la presencia de mixobacterias en el material en estudio. Coloración de Gram: se prepara un extendido del material a ser examinado sobre un portaobjeto, fijándolo por el calor; se agrega una solución acuosa al 1% de violeta de genciana durante treinta (30) segundos; se lava con agua y se agrega yodo de Lugol durante treinta (30) segundos como mordiente; se elimina el yodo de Lugol y se lava el extendido con agua; se agrega alcohol etílico al 95% hasta que el extendido esté decolorado, y se lava bien con agua; se contracolorea con fucsina de Ziehl diluida con agua 1:10 durante treinta (30) segundos; se lava con agua, se seca con papel secante o de filtro, y se examina microscópicamente usando un objetivo de inmersión en aceite. Las bacterias Gram positivas se colorean de un azul purpurado profundo, mientras que las bacterias Gram negativas se colorean de un rojo rosado. La fuscina de Ziehl tiene la siguiente composición: fucsina básica alcohol etílico fenol agua destilada
iii.
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v.
300 mg 10,0 ml 5,0 g 95,0 ml
Prueba de citocromoxidasa: se remueve una colonia juvenil de la superficie de una placa de agar sembrada, y se transfiere la masa de bacterias al área de prueba de una tirita de papel impregnado con una solución acuosa al 1% de clorhidrato de tetrametil-p-fenilenodiamina, rociándola cuidadosamente. La formación de un color azul profundo dentro de un período de sesenta (60) segundos se interpreta como una reacción positiva de citocromoxidasa. Prueba de oxidación y fermentación de la glucosa: se calientan dos (2) tubos de medio O/F con glucosa al 1% para eliminar aire disuelto, y se dejan enfriar a la temperatura ambiente. Cada tubo se inocula con un cultivo de la bacteria en investigación. Uno de los tubos inoculados se cubre con una mezcla de aceite mineral y parafina estéril para evitar la entrada de aire, hasta una profundidad no menor de 1 cm. Los dos tubos se incuban a los 20–25°C durante cuarenta y ocho (48) horas. La formación de una coloración amarillenta en uno o en ambos tubos indica la producción de ácido. La presencia de ácido en los dos tubos significa que la glucosa ha sido metabolizada por vía fermentativa, mientras que la presencia de ácido en el tubo cuya superficie ha estado en contacto con el aire, y no en el tubo cuya superficie ha sido cubierta con la mezcla de aceite mineral y parafina estéril, indica que la glucosa ha sido metabolizada por vía oxidativa. Si no ha habido cambio en el color azul de ninguno de los dos tubos, eso indica que no ha tenido lugar reacción alguna. Es importante detectar la presencia de ácido con gas o de ácido sin gas en los tubos, dado que eso indica si la fermentación es aerogénica o anaerogénica respectivamente. Para ello se procede a la inoculación de agua peptonada con glucosa en un recipiente que contenga una campanita de Durham. En casos donde se sospecha que el agente etiológico aislado es un vibrio, debe emplearse el agar cólera para su diagnóstico presuntivo. Prueba de 2,3 - butanediol: esta prueba es de utilidad en el diagnóstico presuntivo de cepas de Aeromonas liquefaciens, puesto que casi ninguna otra bacteria ictiopatógena da una reacción positiva. Se inoculan tubos de 5 ml de caldo nutritivo conteniendo 10% de glucosa con el organismo en estudio y se incuban a los 20°C durante cuarenta Página 18 de 54
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viii.
y ocho (48) horas. Se procede a comprobar la presencia de 2,3 - butanediol según la metodología que se detalla a continuación: a. agregar 1 ml de ácido periódico al 2,3%; agitar suavemente el tubo y dejar durante quince (15) minutos a la temperatura ambiental; b. agregar 1,5 ml de una solución de piperazina que contenga 25 g de hexahidrato de piperazina disuelto en 99 ml de agua destilada; agregar 1,3 ml de ácido fórmico al 87% y seguidamente agregar 0,5 ml de una solución acuosa RECIEN PREPARADA de nitroprusiado de sodio al 4%; c. la producción de una marcada coloración azulada dentro de los dos (2) minutos indica la presencia de 2,3 - butanediol; una coloración verde pálida se interpreta como un resultado negativo; Prueba de parafenilenodiamina: esta prueba puede ser usada como complemento en el diagnóstico presuntivo de casos de la forunculosis causados por Aeromonas salmonicida. Un tubo, o una placa, de agar tripticasa soya (TSA) o agar forunculosis (FA) se siembra con el organismo inmóvil en estudio, y se incuba a los 20°C durante veinticuatro (24) horas. Se agrega 0,5 ml de una solución acuosa de parafenilenodiamina al 1% (la cual puede ser mantenida durante 30 días en la nevera), y se mueve suavemente el tubo o la placa durante tres (3) segundos de tal manera que el reactivo entre en contacto directo con las colonias bacterianas. La producción de una coloración morada o púrpura oscura dentro de 45 segundos a 3 minutos constituye una reacción positiva. Prueba de sensibilidad al agente vibriostático: se prepara una solución acuosa al 0,1% de 2:4 diamino 6:7 di-isopropil piridina fosfato, la cual se esteriliza por filtración usando un filtro Seitz. Se agregan discos de papel de filtro estériles, de un diámetro de 6 mm, a un recipiente estéril al cual se agrega la solución del reactivo a razón de 0,01 ml/disco. Los discos empapados se secan a los 37°C. Se siembra una placa del medio de cultivo correspondiente con el organismo en investigación, colocando seguidamente un disco impregnado con el vibriostato en el centro de la placa. Se incuba la placa 20–25°C durante 24–48 horas. La presencia de una zona clara y sin desarrollo bacteriano alrededor del disco indica sensibilidad al vibriostato y constituye evidencia presuntiva de un vibrio. Reacción de ácido resistencia: esta técnica de coloración es de singular utilidad en la práctica, dado que facilita el reconocimiento de bacterias ácido-resistentes (por ejemplo: Mycobacterium y Nocardia spp.) en frotis y preparados tomados a partir de lesiones y granulomas. Se prepara un extendido o frotis del material a ser examinado sobre un portaobjeto, fijándolo por el calor. Se cubre la superficie del extendido con fucsina de Ziehl (ver renglón (ii) arriba, calentando la parte inferior del portaobjeto con un trozo de algodón empapado en alcohol hasta que se desprende vapor: NO HERVIR EL COLORANTE NI DEJAR SECARSE EL EXTENDIDO. Se deja actuar al colorante durante veinte (20) minutos, y se decolora con alcohol-ácido (etanol al 70% con 1% de ácido clorhídrico) hasta que todos los rastros del colorante hayan desaparecido del extendido. Se lava con agua, y se contracolorea con una solución acuosa al 1% de azul de metileno durante 30–60 segundos. Se lava con agua, se seca con papel de filtro o papel secante y se examina microscópicamente usando un objetivo de inmersión en aceite × 100. Las bacterias ácido-resistentes se colorean de un color rojo, mientras que las bacterias no ácido-resistentes, células tisulares, etc., se colorean de un azul pálido.
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6.2 Exámenes micológicos El aislamiento in vitro de los hongos asociados con diversas enfermedades de los salmónidos (por ejemplo: Achyla, Saprolegnia, Ichthyophorus) (nueva ubicación taxonómica del hongo) generalmente puede llevarse a cabo mediante la siembra sobre placas de un medio de cultivo correspondiente tal como agar glucosado de Sabouraud con neomicina y ciclohexamida (ver APENDICE A), con material tomado a partir de las zonas afectadas del pez. Una vez sembrado el medio de cultivo, la placa se incuba a los 25°C y se observa regularmente para detectar la formación del micelio y de los órganos sexuales del hongo, la morfología de los cuales facilita la identificación taxonómica del mismo. 6.3 Exámenes parasitológicos 6.3.1 Técnicas para el Diagnóstico de Myxobolus cerebralis (Enfermedad del Torneo) 6.3.1.1 Procedimiento de diagnóstico pará situaciones de enfermedad Sacar 5 cabezas de peces sospechosos y calentarlas en agua a 45°C por 1 a 3 minutos para que la carne se separe fácilmente del hueso y cartílago. Remover la carne suelta y el cerebro a un recipiente de basura que contenga agua y lejía doméstica en una proporción de 1:1, recolectar las muestras de huesos y región de la cápsula creaneana, región de los otolitos y arcos branquiales, triturar con un volumen igual de formol al 10% para matar a las esporas viables (y evitar la diseminación del agente etiológico de la enfermedad) en un mortero. Lavar todo lo que se tritura en un vaso de precipitación con agua permitiendo sedimentar el material. El sedimento puede examinarse directamente en preparados frescos a un aumento de 400 o usando el método de MacClean, distribuir 5 a 10 gotas del sedimento en un portaobjeto limpio y dejar que se seque en el aire, el portaobjeto se colorea con verde de malaquita acuoso al 1% durante 5 minutos, se lava con agua de grifo y se decolora al colocarse en alcohol etílico del 70, 90 y 100% las láminas por 30 minutos, se cubren totalmente estas láminas con una delgada película de aciete de inmersión de baja viscosidad y se examina con el lente de × 20 y ocular de × 10 (no bajo inmersión). Revisar todo el extendido. Las esporas aparecen como óvulos verdes con cápsulas polares verdes intensos contra un fondo casi incoloro. 6.3.1.2 Procedimiento para la detección de infecciones asintomáticas Utilice un cuadro de muestreo que posea la capacidad de detectar la enfermedad a un nivel de incidencia del 5%. Las muestras deben separarse conforme a las especies y edades más susceptibles de los peces que están disponibles. Por ejemplo seleccione “truchas de arroyo” y “trucha arco-iris”, más que trucha marrón y salmón coho, si todas se cultivan en las mismas condiciones y seleccione dedinos de unos 5 meses de edad, si los peces se exponen continuamente en aguas de 13°C o más. Peces tan jóvenes como de 2–3 meses de edad pueden proporcionar esporas maduras; en aguas por debajo de 12°C, puede que los peces tengan que alcanzar 8–10 meses de edad antes de poderse hallar esporas maduras. Los siguientes procedimientos son aceptables para la detección de portadores:
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6.3.1.2.1 Método de digestión a. Sacar las cabezas de los peces que se han muestreado y refrigerar si es necesario a 5°C. b. Calentar las cabezas en agua a 50°C durante 5–10 minutos, sacar y desechar la mandíbula inferior, ojos, piel y tejidos en general, pero guardar los arcos branquiales, cartílago craneal, o hueso, o ambos; pesar al gramo más próximo. c. La maceración de los elementos craneales de peces juveniles es opcional; las cabezas óseas de peces de mayor edad, deberían macerarse en una maquinilla, mezclar bien y examinar una pequeña muestra para detectar la presencia de esporas; si no se encuentran proceder con el paso (d) (si se desea que la eficiencia de la recuperación de esporas esté cuantificada, antes de la maceración puede agregarse nitrato de plata para que las esporas sean coloreadas). d. Agregue 20 a 25 volúmenes de solución pepsínica* y digerir a los 37°C por 30 minutos (siendo normalmente suficiente para material de peces juveniles). Puede requerirse hasta 4 horas para la reducción de huesos de peces adultos; centrifugar el digerido a 1200 g durante 10 minutos a 20–25°C; descartar el sobrenadante. e. Agregue 15–20 volúmenes de solución tripsínica ** al residuo pepsínico del paso (d) (arriba) y ajustar el pH a 8–8,5; digerir a 20–25°C con agitación durante 30 minutos. f. Pare la digestión al agregar 0,1 de volumen de suero o 0,1 de suero - albúmina de bovino al 10%, eliminar los residuos no digeridos por filtración a través de un empaque de lana de vidrio o de material de malla fina. g. Centrifugar la suspensión a 1200 g a 20–25°C, descartar el sobrenadante, resuspender el pellet en 8–10 volúmenes de agua o solución salina balanceada, examinar para detectar esporas y si no se encuentran proceder con el paso (h). h. A tubos de centrífuga o botellas de un tamaño correspondiente agregar unos 5 cm de profundidad de una solución acuosa de dextrosa al 55% y luego agregar cuidadosamente sobre la dextrosa en un centímetro de profundidad de un residuo digerido tripsínico; no mezclar, centrifugar a 20–25°C a 1200 g durante 30 minutos, aspirar y descartar todo el material líquido por encima del pellet. i. Resuspender el pellet en 2–4 volúmenes de agua, examinar microscópicamente para la detección de esporas. * Solución pepsínica al 0,5%, pH 1,8 – 1,9 en HCl al 0,5%. Disolver 5 g de pepsina en polvo en 1000 ml de agua y agregar 5 ml de HCl concentrado. La solución puede refrigerarse hasta 1 mes o ser congelada. ** 0,25% de tripsina en la solución de Rinaldini. Hacer una pasta de 2,5 g de polvo de tripsina y solución de Rinaldini y luego diluir a 1 lt. Conservar congelada la solución de Rinaldini que es la siguiente: HCl C1K Citrato de sodio Fosfato sódico monobásico Bicarbonato de sodio Agua destilada (deionizada)
'8 g 0,2 g 1,0 g 0,05 g 1,0 g 1,0 lt
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Glucosa Rojo fenol (solución acuosa al 1%)
1,0 g 1,0 ml
6.3.1.2.2 Método de Inmunofluorescencia En caso de que se detecten esporas de 7–10 um, indistinguibles de M. cerebralis, y las circunstancias merecen, una confirmación, deben ponerse en contacto con un Ictiopatólogo capacitado para identificar M. cerebralis para que confirme la patología de la enfermedad del torneo. La identificación de M. cerebralis puede lograrse por la técnica directa de anticuerpos fluorescentes: a. Transferir la suspensión en estudio del paso (g) a un tubo de centrífuga y concentrar los residuos por centrifugado a 1200 g durante 10 minutos a la temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante y ajustar la concentración de los residuos con agua a un volumen que permita una óptima observación de las esporas entre los residuos. b. Limpiar cuidadosamente un portaobjeto FAT (fluorescent antibody test) con detergente y agua deionizada, lavar bien y enjuagar bien con acetona, rotular una o más áreas circulares para M. cerebralis (control positivo) u otra espora (control negativo) u otro material (desconocido). c. Cubrir suavemente el portaobjeto con albúmina de huevo al 50%. d. Aplicar unas pequeñas gotas del material desconocido y de control a los puntos indicados en el portaobjeto y secarlo durante 15–20 minutos a 50–60°C, fijar con metanol durante 5 minutos y secar al aire. e. Aplicar suero de conejo anti-M. cerebralis conjugado con FTC (isotiocianato de fluoresceína) a cada prueba. Dejar actuar el suero durante 30–60 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. f. Enjuagar el antisuero conjugado del portaobjeto con un tampón de pH 9–9,5 (bicarbonato de sodio 33,6 g, carbonato de sodio 10,6 g en 1 litro de agua). Sumergir cuidadosamente el portaobjeto en el tampón con agitación suave durante 5 minutos. Un lavado demasiado vigoroso o descuidado puede dar lugar a la pérdida de esporas. g. Sacar el portaobjeto y secar con sumo cuidado con papel de filtro limpio. Agregar 1 gota de aceite de inmersión a cada punto y examinar de × 1000 en un microscopio fluorescente. h. Detritos de cartílago y esporas pueden auto-fluorescer bajo luz ultravioleta. Esta fluorescencia es amarillenta. La identificación positiva de M. cerebralis se fundamenta en la detección de esporas y pre-esporas, las cuales fluorescen de un color verde manzana. 6.3.2 Técnicas para el diagnóstico de ceratomixosis A. Preparar preparados frescos de material a partir de la pared intestinal inferior o líquido ascítico si éste está presente. Debe examinarse también el contenido de la vesícula biliar o de cualquier lesión que esté presente en cualquier tejido. Usar microscopía óptica o de contraste de fase a un aumento de × 440 para un preparado fresco. B. Preparados frescos pueden colorearse por el método de: a. Zeihl-Neelsen pero sin calentamiento; mediante este método las cápsulas polares se colorean de rojo contra un fondo y de esporoplasmas azulados. Página 22 de 54
b. Azul de metileno de Loeffler*; por un minuto se somete la muestra al colorante, luego se lava con agua destilada de pH 7,0 y se deja secar al aire. Los filamentos y cápsulas polares se tiñen de azul intenso y el esporoplasma se observa de azul ténue. C. Preparados permanentes pueden obtenerse de extendidos fijados con Schaudinn** y teñidos con hematoxilina férrica de Heidenhain. D. Examinar 25–30 campos, usando aumentos de × 440 para la detección de esporas. * Azul de metileno de Loeffler: Solución A Azul de metileno 300 mg Alcohol etílico al 95% 30 ml Solución B Solución de KOH al 0,01% (peso/volumen 100 ml) Mezclar las dos soluciones antes de efectuar la coloración. ** Fijador de Schaudinn Solución saturada mercurio clorhídrico
de
Alcohol de 95% Acido acético glacial
66 ml 33 ml 5 ml
6.3.3 Técnicas para la coloración de frotis sanguíneos 6.3.3.1 Técnica de Leishman A. Preparar un frotis con sangre fresca, sin uso de anticoagulante y secar al aire. B. Colocar el frotis con el colorante de Leishman*. Agregar 1 ml del colorante preparado, durante 1 minuto; luego agregar 1 ml de agua destilada tamponada a pH 6,8 al colorante ya colocado sobre el frotis, por 15 minutos; lavar cuidadosamente con el agua destilada tamponada. C. Dejar secar en el aire. Examinar con aceite de inmersión y un objetivo de × 100. 6.3.3.2 Técnica de Giemsa A. Preparar un frotis con sangre fresca sin uso de anticoagulante B. Fijar el frotis con metanol y secar al aire. C. Colorear con una solución de Giemsa**, en la siguiente proporción: 7,5 ml de colorante más 15 ml de agua tamponada a pH 6,8 durante 15 minutos. Lavar con agua corriente. D. Dejar secar en el aire. Examinar con aceite de inmersión y un objetivo de × 100. Página 23 de 54
* Colorante de Leishman Colorante de Leishman en polvo Metanol libre de acetona
0,15 g 100 ml
** Colorante de Giemsa Eosina azul II Azul II Glicerina Alcohol metílico neutro (libre de acetona)
3g 800 mg 250 ml 250 ml
6.3.4 Técnicas para la coloración de protozoos 6.3.4.1 Método de Klein modificado (impregnación de plata para tri codínidos) A. Preparar frotis delgados tanto de piel como de las branquias en un portaobjeto bien limpio. B. Se deja secar al ambiente. C. Cubrir el portaobjeto con una solución acuosa al 2% de nitrato de plata durante 7 minutos. Para tricodínidos marinos o estuarinos se recomienda utilizar la solución a una temperatura de 4°C. D. Lavar con agua destilada o con agua de lluvia. E. Exponer el portaobjeto al sol entre 10–30 minutos según el espesor del frotis. Puede verse al microscopio a los 5 minutos. Se deja secar. F. Chequear las muestras al microscopio. G. Colocar la lámina en alcohol absoluto y después llevarlo a xilol. H. Montar con bálsamo de Canadá. 6.3.4.2 Técnicas para la fijación y coloración de helmintos Como regla general los metazoos parasitarios pueden ser preservados para su posterior identificación en una solución fijadora que contenga 10 ml de formol, 20 ml de alcohol al 95% y 15 ml de agua; inmediatamente antes de usarse, se agregan 5 ml de ácido acético glacial a la solución fijadora. No obstante, se recomienda el empleo de las siguientes técnicas para la fijación y coloración de metazoos pertenecientes a diferentes clases:
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6.3.4.2.1 Trematodos 6.3.4.2.1.1 Fijación de trematodos: el parásito se lava cuidadosamente en suero fisiológico (solución acuosa al 0,85% de cloruro de sodio), y se prensa entre dos portaobjetos actuando con sumo cuidado para no destruir los órganos internos. Seguidamente se agrega por un costado solución formol-acético (50 ml de formol y 20 ml de ácido acético glacial en 930 ml de suero fisiológico), colocando en el costâdo opuesto un trozo de papel secante. Dejar actuar la solución fijadora durante 24–48 horas, conservando los parásitos fijados en solución formol-acético o en etanol al 70%. 6.3.4.2.1.2 Coloración de trematodos: lavar los parásitos durante diez (10) minutos en agua corriente y después durante diez (10) minutos en agua destilada respectivamente. Transferir los parásitos a alcohol etílico al 70% durante veinte (20) minutos, y colocarlos en carmín clorhídrico alcohólico durante treinta (30) minutos a veinticuatro (24) horas, según su tamaño. Transferir al alcohol etílico al 70% durante diez (10) minutos, diferenciar en alcohol ácido por diez (10) minutos, y transferir los parásitos sucesivamente al alcohol etílico al 80%, al 90% y al 100% por diez (10) minutos respectivamente*. Efectuar la eliminación del alcohol mediante exposición en xilol, y proceder a montar los parásitos en bálsamo de Canadá neutro para su posterior estudio microscópico. El colorante carmín clorhídrico alcohólico tiene la siguiente composición: Carmín Acido clorhídrico Agua destilada Alcohol al 90%
5 ml 5 ml 5 ml 200 ml
6.3.4.3 Cestodos La metodología para la fijación y coloración de los cestodos es la misma que se ha señalado en 6.3.4.2.1 arriba. 6.3.4.4 Nemátodos Los nemátodos también pueden ser preservados en formol-acético o en alcohol etílico al 70%, procediendo a efectuar su coloración con carmín clorhídrico alcohólico tal como se ha detallado en 6.3.4.2.1 arriba. 6.3.4.5 Acantocéfalos Al igual que los trematodos, los acantocéfalos se fijan y se colorean según lo detallado en 6.3.4.2.1 arriba. Para la fijación de material destinado al estudio de protozoos, es aconsejable emplear el fluido de Schaudinn (véase 6.3.2). Los exámenes parasitológicos propiamente dichos se llevan a cabo de conformidad con las técnicas que a continuación se detallan. Página 25 de 54
6.3.5 Piel y aletas La superficie externa de la piel y de las aletas se estudia cuidadosamente, examinándolas con una lupa o con un microscopio de disección a fin de detectar la presencia de cualquier zooparásito (por ejemplo: anélidos, nemátodos, crustáceos, etc.). El mucus de la piel y de las aletas es cuidadosamente removido con un bisturí y montado con una gota de agua sobre un portaobjeto. Este preparado fresco se examina cuidadosamente para detectar la presencia de protozoos (por ejemplo: Ichthyobodo (según la nueva ubicación taxonómica) Chilodonella, Ichthyophthirius, Trichodina, etc) y de metazoos (por ejemplo: Argulus, Gyrodactylus, etc). * Alcohol de 70% = 70 ml de alcohol al 95% + 25 ml de agua destilada Alcohol de 80% = 80 ml de alcohol al 95% + 15 ml de agua destilada Alcohol de 90% = 98 ml de alcohol al 95% + 5 ml de agua destilada Alcohol ácido = 98 ml de alcohol al 95% + 2 ml de HCl 6.3.6 Branquias Se remueve el opérculo y la superficie de las branquias es cuidadosamente examinado con una lupa o con un microscopio de disección para detectar cualquier parásito (por ejemplo: mixosporidios, trematodos, crustáceos, etc.). El arco branquial se separa con unas tijeras y las branquias se ponen en una cápsula de Petri junto con una pequeña cantidad de agua. El raspado del mucos se hace con un bisturí y se monta en una gota de agua sobre un portaobjeto. Los preparados frescos son examinados microscópicamente, usando los aumentos × 40 y × 100 para detectar la presencia de protozoos (por ejemplo: Ichthyobodo (según la nueva ubicación taxonómica), Chilodonella, Trichodina, etc.) y de metazoos (por ejemplo: Ergasilus, Tetraonchus, etc.). 6.3.7 Ojos Los ojos de un salmónido que muestran señales clínicas de diplostomatosis son removidos in toto y colocados en una cápsula de Petri. Cada ojo se abre cortando con unas tijeras de punta fina y la lente se remueve. Las lentes y el humor vítreo son cuidadosamente examinados al microscopio para detectar la presencia de metacercarias de trematodos digenésicos. 6.3.8 Musculatura Antes de examinar el tejido muscular en sí, se remueve la piel cuidadosamente y se examina el epitelio con el objeto de detectar la presencia de quistes de metacercarias de trematodos digenésicos, poniendo especial cuidado a aquellos de Neascus sp. y de Cryptocotyle lingua causantes de la “enfermedad del punto negro” en salmónidos procedentes de aguas dulces y saladas respectivamente. Se hace entonces una serie de cortes paralelos en el tejido muscular con un bisturí y el tejido se estudia aparte con ayuda de agujas de disección para exponer cualquier metacercaria enquistada, cestodo, nemátodo, etc. 6.3.9 Hígado La superficie exterior del hígado se examina microscópicamente con el fin de detectar cualquier anormalidad obvia o zooparásito (por ejemplo: trematodos digenésicos, cestodos, nemátodos, etc.). Una pequeña porción del hígado se extrae y se monta en una gota de agua
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sobre un portaobjeto. Ese preparado fresco se examina microscópicamente, empleando los aumentos × 40 y × 100 para detectar mixosporidios o microsporidios. 6.3.10 Vesícula biliar La vesícula biliar es cuidadosamente removida del hígado, y el contenido se examina microscópicamente para detectar la presencia de mixosporidios, especialmente de Ceratomyxa shasta - el cual es de importancia desde el punto de vista de la certificación ictiosanitaria. Es preciso que los salmónidos sean examinados e investigados en el laboratorio, y en forma regular, para detectar la presencia de esporas de C. shasta, y los correspondientes procedimientos biológicos se dan a conocer en el presente Manual en la sección “diagnóstico” de la ceratomixosis; estos procedimientos han de cumplirse al pie de la letra antes de poder efectuar cualquier envío de salmónidos al exterior, puesto que todo envío debe ser acompañado por un Certificado Ictiosanitario otorgado por un Inspector Ictiosanitario perteneciente al organismo gubernamental competente. 6.3.11 Tracto gastro-intestinal Se remueve por entero el tracto gastro-intestinal después de haber cortado el esófago y el recto. El tracto está dividido en sus varias partes componentes principales (por ejemplo: esófago, estómago, intestino delgado, recto, etc.), cada una de las cuales se coloca separadamente en un recipiente apropiado con una pequeña cantidad de agua. La pared del órgano se corta longitudinalmente con unas tijeras, el contenido se remueve con un bisturí o con cualquier otro instrumento apropiado, y se examina con una lupa o con un microscopio de disección para detectar la presencia de cualquier protozoo o metazoo parasitario. Las paredes del órgano deberán ser cuidadosamente examinadas para detectar la presencia de cestodos enquistados y larvas de nemátodos. Es también importante que el contenido del recto sea examinado microscópicamente para detectar la presencia de Hexamita salmonis, agente etiológico de la hexamitiasis. Para los fines de la Certificación Ictiosanitaria, es necesario que los salmónidos sean examinados e investigados en el laboratorio y, en forma regular, para detectar la presencia de las esporas de C. shasta. 6.3.12 Cerebro y cápsula creaneana Para los fines de la Certificación Ictiosanitaria, los términos de los Anexos Técnicos de la Convención Internacional FAO/OIE para Controlar la Propagación de las Principales Enfermedades Transmisibles de los Peces requieren que los salmónidos sean examinados e investigados en el laboratorio y, en forma regular, para detectar la presencia de las esporas Myxobolus cerebralis, agente etiológico de la enfermedad del torneo, en la cápsula creaneana. Los correspondientes procedimientos de laboratorio se detallan en el presente Manual en el renglón 6.3.1 arriba. Es de importancia fundamental que estos requisitos se cumplan al pie de la letra en lo que se refiere al diagnóstico de esta parasitosis antes de efctuarse cualquier envío de salmónidos en el comercio internacional, como así también que todo envío que llegue sea acompañado y amparado por un Certificado Ictiosanitario otorgado por un Inspector Ictiosanitario pertenciente al organismo gubernamental competente en el país de procedencia del envío.
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6.3.13 Riñón Como primer paso, se efectúa un examen macroscópico para detectar la presencia de cualquier anormalidad o parásito detectable a simple vista (por ejemplo: nemátodos, cestodos, trematodos digenésicos). Se toma un pequeño trozo del órgano para ser estudiado microscópicamente, poniendo de manifiesto la presencia de mixosporidios y sus esporas en el caso de hallarse presentes. Con una aguja de disección se procede a la exploración de las uretras para detectar trematodos digenésicos (por ejemplo: Phyllodistomum) u otros parásitos que pudiera haber en los mismos. 6.3.14 Bazo Se efectúa un examen tanto macro como microscópico del órgano para detectar cualquier tipo de anormalidad y/o parásito en el mismo. El procedimiento a seguir en este estudio es el descrito anteriormente en el renglón 6.3.13 para el riñón. 6.3.15 Corazón El corazón es removido in toto y cortado longitudinalmente. Una pequeña porción del órgano se monta en una gota de agua sobre un portaobjeto y el material es examinado microscópicamente como preparado fresco. Debe tenerse en cuenta que el corazón puede albergar trematodos digenésicos pertenecientes al género Sanguinicola. 6.3.16 Sangre El examen de extendidos debidamente coloreados de la sangre es una operación importante en ictiopatología, por cuanto permite el reconocimiento de hemaflagelados, hemogregarinas y algunos nemátodos larvales. La sangre se obtiene por punción cardíaca y el extendido correspondiente se prepara lo antes posible para evitar problemas de coagulación. En la Sección 6.5 de este Manual se describen las técnicas para la obtención y coloración de sangre pisciaria. En la TABLA 5 se detallan importantes caracteres para facilitar el reconocimiento de los principales grupos de zooparásitos en los salmónidos. 6.4 Exámenes histopatológicos El propósito fundamental de los líquidos preservativos o fijadores es el de evitar autólisis y putrefacción, de solidificar material coloidal y convertirlo en un gel irreversible, de preservar los constituyentes celulares y tisulares de una manera natural, y de endurecer a los tejidos blandos (por ejemplo: el cerebro) con el fin de facilitar su manejo durante la disección. Todo tejido u órgano debe ser removido cuanto antes y colocado en recipientes que contengan el preservativo deseado. El volumen líquido preservativo ha de ser en una proporción de 15– 20:1 en relación al tejido u órgano correspondiente. El espesor ideal de tejidos u órganos destinados a estudios histopatológicos es de 3–5 mm, el cual permite que los procedimientos de fijación y manejo posterior se cumplan en un tiempo mínimo. Muestras enteras de peces deben ser preservadas con la pared abdominal previamente cortada, para así permitir la penetración del líquido preservativo en los órganos internos. Para muestras grandes, es generalmente más conveniente utilizar técnicas de inyección e inmersión. Página 28 de 54
La fijación cambia el índice de refracción de los tejidos y de sus componentes celulareŝ, haciéndolos más fácilmente visibles. La osmosis también juega un papel importante en el proceso de fijación y en casos cuando el líquido preservativo no es isotónico, las células experimentan distorsiones. Entre los líquidos preservativos compuestos se incluyen los de rutina tales como el formol, el líquido de Bouin, etc. El formol es uno de los líquidos preservativos más usados, ya que tejidos u órganos pueden permanecer en el mismo durante largos períodos de tiempo sin experimentar endurecimiento excesivo. Sin embargo, y a veces, el mantenimiento de órganos o tejidos en formol durante mucho tiempo da lugar a la formación de un pigmento, el cual puede ser eliminado al tratarse el material con alcohol pícrico. También puede ser evitada esa pigmentación mediante la utilización de formol tamponado a un pH de 7,0 (pH neutro). El proceso de fijación en sí se completa dentro de las veinticuatro (24) horas, aunque muestras de mayor tamaño requieren períodos de tiempo más prolongados para su fijación completa. Material destinado para biopsias puede ser fijado en aproximadamente doce (12) horas, así como material que tenga menos de 3mm de espesor. Después de haberse fijado en formol, los tejidos están dotados de buenas propiedades de coloración. El formol preservativo tiene la siguiente composición: Formol al 40% neutro Cloruro de sodio Agua
10 ml 0,9 g ad 100 ml
El líquido de Bouin permite una fijación rápida y uniforme, no merma a los tejidos y brinda excelentes propiedades de coloración (por ejemplo: hematoxilina - eosina, métodos tricrómicos). Es, por lo tanto, un líquido preservativo ideal para uso en ictiopatología, teniendo en cuenta que los procesos de autólisis y putrefacción tienen lugar más rápidamente en los peces que en material procedente de aves y mamíferos. El proceso de fijación generalmente queda completo dentro de las veinticuatro (24) horas, pero material destinado para biopsia (de un espesor de 2–3 mm) puede ser fijado en forma satisfactoria dentro de dos a tres (2–3) horas. Una vez terminado el proceso de fijación, los órganos o tejidos se colocan directamente en alcohol etílico al 60%. El líquido de Bouin tiene la siguiente composición: Cloruro de mercurio Dicromato de potasio Sulfato de sodio Agua destilada
5g 2,5 g 1g ad ml
100
Inmediatamente antes de usarse el líquido de Bouin, se agregan 5 ml de ácido acético glacial. Siempre es conveniente que las muestras utilizadas para estudios histopatológicos sean peces vivos o moribundos. Material congelado carece de utilidad para histopatología, dado que los tejidos quedan distorsionados, alterados o destruidos. El material preservado se incluye posteriormente en bloques de parafina, a partir de los cuales se procede a preparar los cortes histológicos con el micrótomo. Después de haberse efectuado Página 29 de 54
los cortes y conforme a la metodología histológica normal, se suprime la parafina utilizando xilol y alcohol etílico de 100%, 90%, 70%, 50% y 30%, seguido por agua respectivamente. Posteriormente se procede a realizar la técnica de coloración correspondiente. 6.4.1 Técnicas de coloración en histología A título de información, se detallan a continuación algunas de las técnicas más comúnmente usadas en la coloración de cortes histológicos de material pisciario. 6.4.1.1 Técnica de hematoxilina y eosina Los cortes, de un espesor de 3–5 um, se colorean durante doce a quince (12–15) minutos con hematoxilina ácida de Ehrlich (o con hematoxilina de Delafield). Se colocan en agua destilada que contenga unas gotas de una solución acuosa de carbonato de litio (solución saturada) durante cinco a diez (5–10) minutos y se contracolorea en una solución acuosa de eosina al 0,2% durante un (1) minuto. Después de deshidratar y tratarse con xilol, los cortes se montan en bálsamo de Canadá neutro para su examen microscópico. Los núcleos se colorean azul oscuro y el citoplasma se colorea rojo rosado. 6.4.1.2 Técnica de coloración tricrómica de Mallory Los cortes, de un espesor de 3–5 um, se colorean durante uno a cinco (1–5) minutos en fucsina ácida acuosa al 0,5%. Se elimina el colorante y se colocan durante veinte (20) minutos en una solución colorante que contenga 0,5 g de anilina hidrosoluble, 2 g de naranja G y 100 ml de ácido fosfotúngstico al 1%. Se lavan en alcohol etílico al 95%, hasta que no se desprende más colorante, se deshidratan y se tratan con xilol antes de montar los cortes en un bálsamo neutro. Las fibras colágenas se colorean de azul, las fibras elásticas se colorean de rosado o amarillo y los fibroblastos y neuroblastos se colorean de rojo. 6.4.1.3 Técnica de coloración de Van Gieson Los cortes, de un espesor de 3–5 um, se colorean durante diez (10) minutos en hematoxilina de Harris. Después de haberse lavado con agua, se colocan durante diez (10) minutos en una solución colorante que contenga 7,5 ml de fucsina ácida acuosa al 1% y 50 ml de ácido pícrico acuoso saturado. Se lavan en alcohol etílico al 95%, se deshidratan y se tratan con xilol antes de montar en bálsamo de Canadá neutro. Los núcleos se colorean de azul-negro, los músculos de amarillo y las fibras de colágeno de rojo. 6.4.1.4 Técnica de coloración de Giemsa Los cortes de un espesor de 3–5 um, se fijan en metanol neutro al 100% durante diez (10) minutos. Se secan en el aire hasta eliminar al metanol. Se colocan en una solución recién preparada de colorante de Giemsa diluida 1:10 con agua destilada con un pH de 6,6 – 6,8 durante diez a veinte (10–20) minutos. Se elimina el colorante y se lavan cuidadosamente los cortes en agua destilada. Se deshidratan, se tratan con xilol y se montan en un bálsamo de Canadá neutro. Esta técnica es de especial utilidad para poner de manifiesto la presencia de esporas de Myxobolus cerebralis, Ceratomyxa shasta y otros mixosporidios, así como también focos de bacterias en áreas necrotizadas de los tejidos.
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6.5 Exámenes hematológicos En la actualidad, se están utilizando cada vez más los exámenes hematológicos para complementar el diagnóstico de enfermedades infecto-contagiosas en operaciones de truchi- y salmonicultura, así como para controlar el estado fisiológico y nutricional de los peces, habiéndose comprobado plenamente el valor de estas pruebas en la práctica. Los métodos más comúnmente empleados son los que miden el nivel de hemoglobina, el hematocrito y el recuento eritrocitario respectivamente, además de estudios rutinarios sobre la morfología y distribución de los elementos celulares formados en la sangre periférica. Al no existir textos especializados sobre el tema de la hematología pisciaria, se ha estimado conveniente la inclusión en el presente Manual de los métodos detallados correspondientes para facilitar de esa manera la realización de exámenes hematológicos con respecto a los salmónidos. 6.5.1 Obtención de las muestras 6.5.1.1 Dedinos y ejemplares pequeños: dado el reducido tamaño de dedinos y salmónidos juveniles, resulta difícil obtener cantidades suficientes de sangre como para permitir la realización de todos los exámenes hematológicos. Por ese motivo es generalmente suficiente preparar frotis sanguíneos y obtener una muestra de la sangre para determinar el hematocrito. La superficie del pez se seca cuidadosamente con una toalla de papel y se corta el pedúnculo caudal en la región posterior a las aletas adiposa y anal respectivamente. La sangre que brota se recolecta en un tubo capilar heparinizado para el hematocrito (ver 6.5.4) y una gota se coloca sobre un portaobjeto limpio para preparar el frotis (ver 6.5.6). 6.5.1.2 Ejemplares grandes y adultos: la técnica más frecuentemente utilizada es la de la punción intracardíaca. El pez se coloca decúbito ventral y se introduce la aguja de una jeringa heparinizada en el ventrículo del corazón. Al aspirar la jeringa, se obtiene la cantidad de sangre deseada. Siempre es conveniente proceder a la preparación de los frotis sanguíneos en el momento de haberse efectuado la extracción. Debe tenerse en cuenta que la muestra consta de sangre venosa. 6.5.2 Hemoglobinometría La determinación del contenido hemoglobínico de la sangre, o sea la hemoglobinometría, es de mucho valor en el diagnóstico de ciertas condiciones patológicas, así como indicador de la condición fisiológica y nutricional del pez. Las técnicas más precisas se fundamentan en la determinación de la capacidad oxigenadora, o bien en el contenido férrico de la sangre respectivamente. Sin embargo, estas técnicas de laboratorio son muy laboriosas y, por lo tanto, no se prestan para la práctica diaria de la piscifactoría ni del laboratorio ictiopatológico. Cualquier método de hemoglobinometría aplicado a la sangre pisciaria se complica a raíz del hecho que los eritrocitos son nucleados. Sin embargo, se ha demostrado que el método de cianmethemoglobina es una técnica bastante confiable para fines prácticos, dado que oxihemoglobina, carboxihemoglobina, methemoglobina y hemoglobina reducida se convierten en cianmethemoglobina, cuya concentración se mide colorimétricamente. Las hemoglobinas se oxidan por la acción de ferricianuro a methemoglobina, la cual queda convertida en cianmethemoglobina por la acción de cianuro.
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Una cantidad de 20 mm3 (0,02 ml) de sangre total heparinizada y bien mezclada se obtiene con una pipeta de Sahli, llevando la columna de sangre un poco más arriba de la marca de la pipeta y luego expulsando cuidadosamente el exceso. Se limpia la parte exterior de la pipeta y se agrega la muestra sanguínea de 20 mm3 a un volumen exacto de 5 ml de solución de Drabkin en un recipiente de vidrio. La composición de la solución de Drabkin es la siguiente: Bicarbonato de sodio Ferricianuro de potasio Cianuro de potasio Agua destilada
1g 0,2 g 0,2 g ad 1000 ml
Se mezcla la sangre y el diluyente y se cierra el tubo con un tapón de caucho. El tubo se invierte varias veces para asegurar una buena mezcla de la sangre con el diluyente y la mezcla se deja a la temperatura ambiente durante por lo menos diez (10) minutos antes de efectuarse la lectura. Siempre que sea factible, deben efectuarse determinaciones en duplicado para cada muestra. La densidad óptica de la solución se mide a los 540 mu en un espectrofotómetro. El contenido hemoglobínico de la muestra se expresa de la manera convencional como Hb g 100 ml de sangre total. El resultado puede ser calculado en base a uno u otro de los siguientes métodos: 6.5.2.1 Patrón artificial: el patrón es una solución de concentración conocida y cuya densidad óptica a los 540 mu corresponde a la de una cantidad determinada de Hb g 100 ml. Es aconsejable emplear patrones comerciales fidedignos para ese fin. La densidad óptica del patrón se determina a los 540 mu al agregar aproximadamente 5 ml a una cubeta y medirla con el espectrofotómetro. Seguidamente se determina la densidad óptica de cada muestra de sangre y el contenido hemoglobínico se calcula conforme a la siguiente fómula:
El patrón contiene aproximadamente 60 mg% de hemoglobina, pero la cifra precisa se da a conocer en cada ampolla. Por ejemplo: Densidad óptica de la muestra Densidad óptica del patrón Hb mg% del patrón
= 0,35 = 0,41 = 60,0 (= 0,06 g%)
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Para convertir esa cifra en Hb g 100 ml de sangre total, se emplea el factor de dilución: Hb g% en la muestra x factor de dilución = Hb g 100 ml de sangre total La muestra se diluye 1:251 (20 mm3 en 5 ml de diluyente), así que el resultado del ejemplo citado sería: 0,05 × 251 = 12,55 (o sea: 12,55 g Hb/100 ml de sangre total) 6.5.2.2 Curva standard: es preferible utilizar una curva estándar para llevar a cabo la hemoglobinometría rutinaria de especies de salmones y truchas. Dichas curvas se preparan en base a estudios efectuados para determinar la densidad óptica de soluciones de cianmethemoglobina a los 540 mu frente a la concentración precisa de hemoglobina en g 100 ml determinada mediante técnicas de medición del contenido férrico en mg/100 ml (por ejemplo: el método de Wong). El contenido hemoglobínico se calcula en base a la fórmula 1 mg Fe% = 0,298 g Hb%. Es muy importante tener en cuenta la necesidad de elaborar curvas estándar distintas para salmónidos en aguas dulces y en aguas saladas respectivamente. Una vez elaborada la curva correspondiente, el contenido hemoglobínico puede determinarse directamente por extrapolación de la densidad óptica de la muestra. 6.5.3 Recuento eritrocitario El fin perseguido por esta técnica es el de determinar correctamente el número de eritrocitos en la sangre periférica. La muestra sanguínea se obtiene en un recipiente heparinizado y debe estar bien mezclada antes de efectuarse el recuento propiamente dicho. Se utiliza una pipeta cuenta-glóbulos de Thoma (con marca de „101‟), con la cual se lleva la sangre hasta la marca „0,5‟. La parte externa de la pipeta se limpia cuidadosamente y se ajusta la columna de sangre EXACTAMENTE en la línea „0,5‟. Se llena la pipeta con suero fisiológico (solución acuosa de cloruro de sodio al 0,85%) hasta que la mezcla sangre-diluyente llega a la marca „101‟. Tapando la pipeta con el pulgar y el dedo anular, se agita suavemente con la mano para asegurar una mezcla uniforme. Una vez efectuada la mezcla y dilución de la sangre, se prepara una cámara cuenta-glóbulos de tipo Neubauer. La cámara en sí, como así también el cubreobjeto óptico correspondiente, se limpian cuidadosamente para librarlos de grasa y el cubreobjeto óptico se ajusta suavemente hasta que aparezcan los anillos de Newton en cada lado del pozo central. Se agita otra vez la pipeta y se expulsa el primer tercio de su contenido. Una gota de la dilución se agrega a la cámara cuenta-glóbulos, dejándose correr por capilaridad hasta llenar la cámara. La cantidad de eritrocitos se enumera, de acuerdo a las técnicas hematológicas ya establecidas, en cinco (5) grupos de cuadros de la cámara cuenta-glóbulos. Para calcular el Página 33 de 54
número de eritrocitos/mm3 de sangre total, se utiliza la siguiente fórmula, donde N representa el número de eritrocitos/mm3.
Esta fórmula se fundamenta en las consideraciones que a continuación se detallan: Dilución de la sangre Profundidad de la cámara cuenta-glóbulos
= 1:200 = 0,1 mm
Cada cuadro pequeño
= 1/400 mm2
Número de cuadros pequeños contados
= 80
En la praćtica rutinaria, es suficiente multiplicar × 10 000 el número total de eritrocitos en los cinco (5) grupos de pequeños cuadros. Por ejemplo: número total de glóbulos rojos contados = 118
= 1,18×106/mm3 6.5.4 Hematocrito El hematocrito es el volumen ocupado por los elementos celulares en 100 ml de sangre total. La técnica de determinación se fundamenta en la centrifugación de las células en una masa compacta, cuando la altura de la masa de células se expresa como un porcentaje de la altura total de la columna de células más plasma. Es preferible llevar a cabo determinaciones del hematocrito con sangre heparinizada, para así no tener que aplicar un factor de corrección como sería el caso con sangre oxalatada o citratada. La muestra se obtiene en un tubo de microhematocrito heparinizado (disponibles en el comercio), asegurando la ausencia de burbujas de aire en la columna sanguínea. La altura de la columna debe ser de por lo menos 3 cm. Un lado l tubo se sella y el tubo se coloca en una centrífuga especial para microhematocritos. Se centrifuga durante cinco (5) minutos y se procede a leer el microhematocrito de cada muestra. Las células se compactan en tres capas, de las cuales la inferior es la que corresponde a los eritrocitos. Por encima de ellos quedan los leucocitos y los trombocitos, visibles en una capa delgada y de color blanco-grisáceo. Se ha de medir solamente la altura de la capa de eritrocitos. Debe observarse también el color del plasma, haciendo notar cualquier variación o desviación de su color amarillento pálido normal.
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6.5.5 Indices hematológicos Los índices hematológicos son de utilidad por cuanto dan información sobre ciertos caracteres de los eritrocitos, especialmente en el diagnóstico de casos de anemia. También es interesante señalar que el volumen corpuscular medio, por ejemplo, podría ser de valor en relación al tamaño de los eritrocitos cuando los salmónidos experimentan cambios fisiológicos tales como aclimatación a agua salada en la fase de esguín, migración hacia agua dulce para el desove, etc. A los efectos de poder calcular los índices hematológicos, se requieren tres datos básicos, a saber: contenido hemoglobínico (Hb g 100 ml), recuento eritrocitario (× 106/m3) y hematocrito (%). Todos los valores citados son sujetos al error experimental y con el fin de asegurar que los índices hematológicos sean los más exactos posibles, es imperativo que los datos empleados hayan sido determinados con precisión. 6.5.5.1 Volumen corpuscular medio (V.C.M.) el V.C.M. se expresa en micrones cúbicos (u3) y corresponde al volumen ocupado por un eritrocito medio. Se determina conforme a la siguiente fórmula:
Por ejemplo: Hematocrito Recuento eritrocitario
= 40% = 1,1×106/mm3
6.5.5.2 Hemoglobina corpuscular media (H.C.M.): la H.C.M. se expresa en micro-microgramos (uug) y equivale al peso de la hemoglobina en un eritrocito medio. Se determina conforme a la siguiente fórmula:
Por ejemplo: Hb Recuento eritrocitario
= 9,5 g/100 ml = 1,1 × 106/mm3
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6.5.5.3 Concentración corpuscular media de hemoglobina (C.C.M.H.): la C.C.M.H. se expresa como el porcentaje de células (NO de sangre total) ocupado por la hemoglobina. Se determina conforme a la siguiente fórmula:
Por ejemplo: Hb Hematocrito
= 9,5 g/100 ml = 40%
6.5.6 Preparación y coloración de frotis sanguíneos El frotis debe ser preparado con sangre fresca, preferiblemente sin el uso de anticoagulantes (para lo cual hay que tener en cuenta que el tiempo de coagulación de la sangre de truchas y otros salmónidos es de alrededor de 10–20 segundos). Una gota (aproximadamente 10 mm3) de sangre se coloca a una distancia de 1,5 cm de la parte terminal de un portaobjeto limpio y libre de grasa. Con un segundo portaobjeto, mantenido en un ángulo de 45°, se procede a preparar un frotis delgado mediante un movimiento suave y cuidadoso que permite la extensión de la gota de sangre sobre la superficie del primer portaobjeto. Una vez preparado el frotis, se seca en el aire moviendo el portaobjeto cuidadosamente entre el pulgar y el dedo índice. El frotis delgado puede ser coloreado por cualquiera de los métodos de Romanowsky, pero en la práctica es mejor la técnica de coloración de Leishman. Es preferible utilizar un colorante de Leishman ya preparado y disponible en el comercio; en el caso de que eso no sea factible, se prepara el colorante en el laboratorio al agregar una cantidad de 0,15 g del colorante de Leishman en polvo a 100 ml de metanol libre de acetona. Se agrega una cantidad de 1 ml del colorante preparado a la superficie del frotis en posición horizontal, y se deja actuar durante un (1) minuto. Posteriormente, se agregan 2 ml de agua destilada tamponada a pH 6,8 al colorante ya colocado sobre el frotis, dejando actuar la mezcla de colorante - agua destilada durante quince (15) minutos. Se lava cuidadosamente con agua destilada tamponada (pH 6,8) para eliminar restos del colorante y se deja secar el preparado en el aire. Una vez seco, el frotis puede ser examinado microscópicamente utilizando aceite de inmersión y un objetivo X 100. Se procede a efectuar un cuidadoso examen de los elementos celulares formados, así como de la fórmula leucocitaria (o sea: el
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porcentaje de distribución de los granulocitos y linfocitos) según los procedimientos hematológicos establecidos. 6. METODOS DE DIAGNOSTICO (contd.) 6.6 Exámenes virológicos Para la investigación de casos de una posible virosis, es muy importante tener en cuenta que el material ha de mantenerse frío durante las fases de su manejo y estudio, motivo por el cual debe conservarse en hielo hasta tanto se haya comprobado que el virus tolera mayores temperaturas. El hielo seco NO DEBE USARSE para la preservación de material para exámenes virológicos, puesto que el dióxido de carbono produce un pH bajo, el cual afecta en forma adversa la sobrevivencia de los virus. Es importante recordar que los virus son principalmente intracelulares y por ello se hace necesario triturar u homogenizar el material (o los materiales) para liberar el virus. La trituración puede efectuarse de manera muy económica mediante el empleo de un mortero y mazo, usando arena estéril como abrasivo. Es también necesario tener en cuenta que, según la naturaleza sospechada de la posible virosis, el material destinado para los exámenes de laboratorio correspondientes debe transportarse de la siguiente manera: a. Septicemia hemorrágica viral, necrosis hematopoyética viral, Herpesvirus salmonis: transportar el material en hielo. b. Necrosis pancreática infecciosa: transportar el material en glicerol tamponado al 50%. Al recibirse el material en el laboratorio, se prepara una solución acuosa de un producto aprobado en base a yodo orgánico que contenga quinientas partes por millón (500 ppm) de yodo disponible (como I2 libre). Esta solución recién preparada se usa para la desinfección de todo instrumental, restos de pescado y demás material una vez terminado el procedimiento correspondiente, efectuándose una exposición del material durante quince (15) minutos en la solución desinfectante. Para fines de la Certificación Ictiosanitaria, la detección y aislamiento de cualquier agente filtrable capaz de producir un efecto citopatógeno (ECP) en las líneas celulares específicas debe considerarse como “certificable”, aún cuando el mismo agente no puede ser identificado mediante las técnicas inmunoserológicas u otras correspondientes, así como si tenga o no una patogenicidad determinada o comprobada para salmónidos u otros peces. El siguiente procedimiento biológico básico es aceptable para la detección y aislamiento de los virus incluidos en la lista de las enfermedades transmisibles de los salmónidos consideradas en la Convención Internacional FAO/OIE para Controlar la Propagación de las Principales Enfermedades Transmisibles de los Peces: i.
Las muestras se homogenizan con un volumen igual de una solución fisiológica isotónica tamponada a un pH de 7,6 – 7,8 (por ejemplo: solución de Earle o de Hanks), agregando hielo picado al atomizador cuando eso sea necesario para mantener una temperatura mínima; el líquido ovárico permanece sin diluir, o puede diluirse 1:2 en casos cuando el mismo está muy turbio. Página 37 de 54
ii. iii.
iv.
v.
vi.
vii.
viii.
El tejido homogenizado (o triturado) o líquido ovárico se centrifuga a 1000–2000 g durante diez a quince (10–15 minutos. Bacterias y hongos se eliminan del líquido sobrenadante mediante filtración aséptica a través de un filtro de membrana con porosidad de 0,4 – 0,5 um; para evitar cualquier pérdida apreciable de virus por absorción en el filtro, es importante recolectar el máximo volumen posible de filtrado; bacterias y hongos también pueden ser eliminados mediante el uso de una mezcla de antibióticos, a saber: estreptomicina, penicilina G y nistatina a niveles de 1000 mcg, 1000 U.I. y 500 U.I. respectivamente/ml de homogenado; cuando se utiliza la mezcla de antibióticos, la muestra así tratada debe ser mantenida durante tres (3) horas a los 20°C. Si es necesario, se reajusta el pH a 7,6–7,8 y la muestra (tratada por filtración o con antibióticos) se inocula por duplicado en frascos o tubos que contengan el cultivo celular correspondiente en forma de monocapa; para toda prueba de rutina se emplean monocapas de las líneas celulares RTG-2 (ATCC N° CCL 45) y FHM (ATCC N° CCL 42) y es imprescindible asegurar que estas líneas celulares sean sensibles al virus que se intenta aislar; en ese sentido es conveniente notar que la línea RTG-2 no es especialmente sensible al virus de la necrosis hematopoyética infecciosa y en casos cuando se sospecha la presencia de esta enfermedad, o cuando se desea lograr el aislamiento del agente etiológico de la misma, es necesario confiar en la línea FHM. Para el aislamiento de virus, es conveniente utilizar tubos de vidrio, de 16 × 125 mm, con tampón de rosca; para cada monocapa se emplea 1,0 ml del medio esencial mínimo (MEM) de Eagle, el cual tenga un pH de 7,6–7,8 en el caso de los virus de los salmónidos; el medio contendrá sales de Eagle, glutamina y suero de feto bovino al 10%; para controlar el desarrollo de bacterias se puede emplear una mezcla de 100 mcg de estreptomicina y 100 U.I. de penicilina G/ml, o de 50 mcg de gentamicina/ml; para controlar el desarrollo de hongos se puede emplear 25 U.I. de nistatina/ml o de 0,25 mcg de amfotericina/ml; la línea celular FHM se incuba a los 20°C y en el momento de efectuarse el inóculo con la muestra en investigación, las monocapas deben tener una confluencia del 75–90% como mínimo, así como tener menos de cuatro (4) días de edad. Se inocula asépticamente 0,1 ml de la muestra filtrada o tratada con antibióticos/ml de cultivo celular, usando dos (2) cultivos de la línea RTG-2 y dos (2) cultivos de la línea FHM respectivamente por cada muestra: los cultivos inoculados se incuban a los 15°C en el caso de la línea celular RTG-2 y a los 20°C en el caso de la línea celular FHM; para cada lote de células inoculadas, es preciso utilizar un testigo negativo para lo cual se repite el procedimiento con 0,1 ml de solución fisiológica isotónica tamponada y estéril/ml de cultivo; después de haberse efectuado el inóculo, se deja pasar una (1) hora como período de absorción a la temperatura ambiente, después del cual se agrega el volumen normal de medio de mantenimiento. A pesar de los considerables peligros e inconvenientes que representan para los países latinoamericanos, puede ser necesario utilizar un testigo positivo; en ese caso, se procede tal como se ha detallado en los renglones (v) y (vi) arriba, utilizando una suspensión del virus de la necrosis pancreática infecciosa (cepa ATCC N° VR - 299) que contenga 102–103 DICC del virus (DICC = Dósis Infectiva en Cultivos Celulares). Los cultivos se incuban a la temperatura correspondiente (ver (v) arriba) y se examinan diariamiente para detectar la presencia de cualquier efecto citopatógeno (ECP); si se llega a presentar un fuerte ECP durante las primeras veinticuatro (24) horas de incubación, suele indicar la toxicidad del material inoculado en los cultivos celulares y en tales casos las células se cosechan al agitar fuertemente el tubo o frasco; la cosecha se ultrasonifica durante diez (10) segundos, se diluye 1:5 en medio de Página 38 de 54
ix.
x.
mantenimiento y se reinocula en nuevas monocapas; si se produce contaminación bacteriana o micótica de los cultivos celulares, las células se cosechan, se ultrasonifican durante veinte a treinta (20–30) segundos, se centrifugan a 1000 g durante quince (15) minutos, se filtra el sobrenadante a través de una membrana de porosidad de 0,4–0,5 um y se reinocula en nuevos cultivos celulares. Para fines de la Certificación Ictiosanitaria, una prueba se considera negativa si no se produce ECP alguno ni en el cultivo original ni en el paso ciego correspondiente; en casos en los cuales se produce un ECP un uno o más de los cultivos celulares inoculares con el material en investigación, es mandatario proceder al aislamiento e identificación de cualquier agente filtrable; aunque una identificación presuntiva del agente productor de un ECP puede efectuarse en base a las señales clínicas observadas en el momento de tomar las muestras, así como en el tipo de ECP producido, la identificación posterior definitiva se efectúa mediante la neutralización del agente con el antisuero correspondiente y si no se produce aglutinación alguna frente a los antisueros utilizados, se hace necesario pensar en la posible presencia de un virus desconocido en el material en investigación. Al producirse un ECP reproducible y virus-específico, se procede en primer lugar a demostrar a manera diferencial la presencia de nucleoproteinas ribo (ARN) y desoxiribo (ADN) mediante la técnica de coloración de May-Grunwald-Giemsa; los colorantes se preparan de la siguiente manera: a. Colorante May-Grunwald: 2,5 g disuelto en 1000 ml de metanol al 100%; dejar envejecer durante un (1) mes. b. Colorante Giemsa: 1 g disuelto en 66 ml de glicerol durante dos (2) horas a los 60°C; agregar 66 ml de metanol al 100%. Filtrar las soluciones colorantes antes de usarse. La técnica de coloración se lleva a cabo tal como se detalla a continuación: c.
d. e. f. g. h. i.
j.
Cubreobjetos de tipo Leighton se colorean in situ; cubreobjetos comunes pueden ser colocados en vidrios de reloj previa su coloración; la coloración ha de efectuarse con la monocapa celular por abajo, para así minimizar la acumulación de gránulos de colorante y demás artefactos. Lavar CUIDADOSAMENTE tres (3) veces con solución fisiológica isotónica tamponada a pH 7,6–7,8. Fijar durante cinco (5) minutos, en metanol al 100%. Usando pipetas de vidrio, colorear durante diez (10) minutos con 1,0–1,5 ml de colorante May-Grunwald. Usando pipetas de vidrio, colorear durante quince (15) minutos en colorante Giemsa diluido 1:10 en agua destilada. Enjuagar rápidamente dos (2) veces en acetona para deshidratar el tejido; NO DEJAR SECAR la lámina o cubreobjeto. Clarificar al enjuagar tres (3) veces en una mezcla de acetona: xilol (2:1) y tres (3) veces en una mezcla de acetona: xilol (1:2), seguido por una exposición de diez (10) minutos en xilol. Agregar una gota de bálsamo de Canadá neutro a un portaobjeto de vidrio y colocar encima el cubreobjeto con las células empapadas en xilol para montar el preparado.
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k.
xi.
xii.
Dejar secar el preparado y examinarlo microscópicamente; la proteina ARN se colorea azul, mientras la proteina ADN se colorea de rojo-morado; puede utilizarse una prueba de ribonucleasa durante una (1) hora como testigo. Es de mayor importancia determinar CUANTO ANTES la identidad de cualquier virus aislado en cultivos celulares y para ello se utilizan pruebas inmuno- o serológicas; sea cual sea la prueba utilizada, será necesario emplear anti-sueros estandarizados de especificidad reconocida contra los diferentes virus; en vista de la reconocida diversidad serológica de virus del grupo de la necrosis pancreática infecciosa, la confirmación serológica de cualquier virus de tipo NPI aislado debe fundamentarse en una reacción positiva frente a un anti-suero polivalente para los principales serotipos de dicho virus; pueden utilizarse tubos o placas de microtítulo para las pruebas serológicas; cultivos celulares mostrando un ECP reproducible y virus-específico deben cosecharse, ultrasonificarse durante diez (10) segundos y diluirse 1:1000 (10–3) con medio de mantenimiento; una vez efectuada la cosecha y dilución correspondientes, se procede como sigue con la prueba de seroneutralización: a. Mezclar 0,3 ml de anti-suero diluido (la dilución será de acuerdo al título específico, pero normalmente es de 10-2 – 10-3) con 0,3 ml de cada una de las diluciones de la muestra; mezclar 0,3 ml de suero normal con 0,3 ml de cada una de las diluciones de la muestra; en los casos donde se utiliza un testigo positivo, llevar a cabo de la misma manera una prueba de neutralización de suero, utilizando un anti-suero homólogo y suero normal respectivamente. b. Incubar las mezclas durante una (1) hora a los 15°C o a los 20°C; posteriormente se inocula 0,2 ml de cada mezcla en cultivos duplicados de la línea celular en el cual fue aislado el virus, incubándolos a la temperatura correspondiente. c. Examinar los cultivos a las 24, 48 y 72 horas para detectar la presencia o ausencia de un ECP; la ausencia de un ECP en los cultivos los cuales tengan un anti-suero determinado, pero no en los que hayan sido inoculados con suero normal que no contenga anticuerpos, constituye una base para la identificación del virus; si se produce un ECP en los cultivos que hayan sido inoculados con la cosecha celular mezclada con el anti-suero, eso indica que la identidad del virus no es la que se sospechó, o bien que la concentración del virus en la dilución al 10-3 era demasiado alta como para ser neutralizada por el anti-suero específico a una dilución al 10-2; esta situación no debería pasar con el virus de la necrosis pancreática infecciosa, ya que es relativamente fácil preparar un antisuero con un título aglutinante alto, pero podría constituir un problema en las pruebas de neutralización con los dos rabdovirus (Rhabdovirus egtvedi, virus de la necrosis hematopoyética infecciosa), contra los cuales es difícil preparar anti-sueros con títulos aglutinantes altos; en estos casos, se hace necesario el empleo de técnicas de reducción de placas o inmunofluorescentes. La prueba de reducción de placas puede ser empleada para todas las virosis incluidas en la Convención Internacional FAO/OIE para Controlar la Propagación de las Principales Enfermedades Transmisibles de los Peces: el siguiente procedimiento virológico es aceptable para fines de la Certificación Ictiosanitaria: a. El fluido de un cultivo celular que muestra un ECP reproducible y virusespecífico se diluye como para contener aproximadamente 10-3 UFP (Unidades Formadoras de Placas)/ml; esta dilución se mezcla con un volumen igual del antisuero correspondiente (la dilución del cual será de acuerdo con el título, pero nunca debe ser menor de 100).
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b.
c. d.
e.
Otro volumen del fluido de cultivo diluido se mezcla con un volumen igual de medio de mantenimiento; cantidades iguales de anti-suero y testigo negativo respectivamente se mezclan con una cepa viral de referencia para dar un testigo positivo. Las mezclas se mantienen durante aproximadamente una (1) hora a la temperatura ambiente. Cantidades determinadas de cada mezcla se inoculan a cultivos celulares de comprobada sensibilidad en cápsulas de Petri, y en los volúmenes apropiados; después de una absorción de treinta (30) minutos, los cultivos celulares se cubren con un medio que contenga agarosa al 0,5%; como testigos negativos se emplean dos (2) cultivos celulares no inoculados. Las cápsulas de Petri se incuban durante 48–72 horas a los 15°C o a los 20°C (según el tipo de línea celular utilizado); las monocapas celulares se colorean con rojo neutro (0,2 mg/ml), y se procede a enumerar la cantidad de placas en las cápsulas de Petri; una reducción del 40% o más en el número de placas en las cápsulas de Petri inoculadas con la mezcla del virus con anti-suero se interpreta como evidencia de la presencia del virus correspondiente en el material examinado.
En la TABLA 5 se dan a conocer las principales propiedades de los más importantes virus asociados con enfermedades infecto-contagiosas de los salmónidos. TABLA1 Tamaño de muestreo requerido para la detección de por lo menos un (1) portador en una población piscícola, suponiendo una incidencia mínima determinada de portadores en esa población. El tamaño del muestreo supone un nivel de confianza del 95% en la detección de portadores. Tamaño del población
lote
o
Número de peces en el muestreo cuando la incidencia mínima de portadores es: 0,5%
1,0%
2,0%
3,0%
4,0%
5,0%
10,0%
50
46
46
46
37
37
29
20
100
93
93
76
61
50
43
23
250
192
156
110
75
62
49
25
500
314
223
127
88
67
54
26
1000
448
236
136
92
69
55
27
2500
512
279
142
95
71
56
27
5000
562
288
145
96
71
57
27
10000
579
292
146
96
72
57
27
100000
594
296
147
97
72
57
27
1000000
600
300
150
100
75
60
30
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TABLA2 Formato anamnésico básico para el examen de salmónidos Fecha: Localidad: Especie de pez (cepa y/o raza cuando corresponda): Edad del pez: Sexo del pez: Largo total (mm): Peso total (g): Arroyo, quebrada, río, etc., de origen (nombrar): Criadero, piscifactoría, etc (nombrar): Area del estanque o pileta: Largo: Ancho: Profundidad: Origen del agua: Flujo del agua (litros/minuto): Alimento proporcionado: Frecuencia de alimentación/día: Fecha de recepción/fabricación del alimento: Tamaño del pellet (si corresponde): Fecha en la cual se observaron las primeras mortalidades: Mortalidades diarias (% de la problación): Medicamentos utilizados durante la presente epizootia: Dósis utilizada y frecuencia de administración: Eficacia del medicamento en controlar las mortalidades: 1. CONDICIONES FISICO-QUIMICAS DEL AGUA (marcar con una “X” donde corresponda) Clara ( ) Turbia ( ) Colorada ( ) Temperatura (°C): pH: O2 disuelto (ppm): Salinidad (%): Dureza (ppm): Nitratos (ppm): Nitritos (ppm): Amoniaco (ppm): CO2 disuelto (ppm): Alcalinidad: Sales de metales pesados (ppm): 2. CONDICION DE LOS PECES (marcar con una “X” donde corresponda) Distribución normal en el agua ( ) Agrupados a los costados de los estanques ( ) Agrupados cerca de la entrada del agua ( ) Agrupados cerca del desagüe ( ) Distribuidos hacia la superficie del agua ( ) Boqueando ( ) Aspecto normal ( ) Con señales de letargia ( ) Con señales nerviosas ( ) Flotando sin rumbo ( ) Nadando de lado ( ) Cayendo al fondo ( ) Con movimientos espasmódicos ( ) Cor. señales de agotamiento ( ) Frotándose contra el fondo o los lados del estanque Otras señales de comportamiento anormal (señalar): Página 42 de 54
3. EXAMEN CLINICO DE LOS PECES (marcar con una “X” donde corresponda) A. Superficie del cuerpo Aspecto normal ( ) Coloración blanco-grisácea ( ) Capa blanco-azulada ( ) Lesiones con sangre y/o pus ( ) Congestión ( ) Ulceración ( ) Granulación ( ) Zonas necróticas ( ) Pequeños puntos en la dermis ( ) Puntos negros ( ) Puntos blancos o blanquecinos ( ) Oscurecimiento parcial ( ) Copos blancos ( ) Oscurecimiento total ( ) Presencia de ectoparásitos ( ) Tumores ( ) Otras anormalidades (señalar): B. Tejido muscular Aspecto normal ( ) Presencia de forúnculos ( ) Presencia de quistes ( ) Presencia de úlceras ( ) Presencia de lesiones necróticas ( ) Presencia de parásitos ( ) Señales de micosis ( ) Licuación localizada ( ) Otras anormalidades (señalar): C. Aletas Aspecto normal ( ) Deshilachamiento parcial o total ( ) Necrosis ( ) Congestión ( ) Presencia de puntos negros ( ) Presencia de puntos blancos ( ) Hinchamiento ( ) Presencia de hemorragias ( ) Señales de micosis ( ) Otras anormalidades (señalar): D. Ojos Aspecto normal ( ) Exoftalmia unilateral ( ) Exoftalmia bilateral ( ) Opacidad ( ) Hinchamiento ( ) Falta de uno o ambos ojos ( ) Congestión ( ) Presencia de puntos rojos intraoculares ( ) Presencia de puntos rojos ( ) Hemorragias peri-oculares ( ) Puntos blancos en la lente ( ) Ceguera manifiesta ( ) Otras anormalidades (señalar): E. Branquias y opérculos Aspecto del opérculo normal ( ) Aspecto de las branquias normal ( ) Opérculos muy abiertos ( ) Coloración de las branquias normal ( ) Coloración rosada de las branquias ( ) Coloración rojo oscura de las branquias ( ) Branquias con aspecto anémico ( ) Congestión ( ) Hemorragias ( ) Zonas de necrosis ( ) Branquias hinchadas ( ) Fusión de los filamentos branquiales ( ) Señales de micosis branquial ( ) Presencia de abundante moco ( ) Presencia de granos de arena o arcilla en las branquias ( ) Acumulación de restos de alimento sobre la superficie branquial ( ) Señales de parásitos ( ) Otras anormalidades (señalar): F. Cavidad abdominal Aspecto normal ( ) Presencia de un líquido incoloro ( ) Presencia de un líquido opaco ( ) Presencia de parásitos ( ) Congestión de la pared abdominal ( ) Presencia de quistes en la pared abdominal ( ) Presencia de hemorragias en la pared abdominal ( ) Otras anormalidades (señalar):
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G. Hígado Aspecto normal ( ) Coloración rojiza ( ) Coloración marrón ( ) Coloración pálida ( ) Coloración amarillenta ( ) Presencia de quistes ( ) Presencia de hemorragias ( ) Presencia de parásitos ( ) Aspecto grasoso ( ) Otras anormalidades (señalar): H. Vesícula biliar Aspecto normal ( ) Hinchamiento ( ) Bilis de color verdoso ( ) Bilis de color amarillo-verdoso ( ) Bilis de aspecto acuoso ( ) Bilis de color negruzco ( ) Otras anormalidades (señalar): I. Bazo Aspecto normal ( ) Hinchamiento ( ) Con señales de atrofia ( ) Presencia de quistes ( ) Congestión ( ) Presencia de hemorragias ( ) Color rojo cereza ( ) Color negruzco ( ) Otras anormalidades (señalar): J. Corazón Aspecto normal ( ) Hinchamiento ( ) Con señales de atrofia ( ) Presencia de quistes ( ) Congestión ( ) Presencia de hemorragias ( ) Color pálido ( ) Otras anormalidades (señalar): K. Riñón Aspecto normal ( ) Hinchamiento parcial ( ) Hinchamiento total ( ) Congestión ( ) Con señales de atrofia ( ) Con señales de necrosis ( ) Presencia de puntos o áreas blanco-grisáceas ( ) Presencia de puntos negros ( ) Consistencia cremosa ( ) Consistencia dura al tacto ( ) Presencia de parásitos ( ) Otras anormalidades (señalar): L. Tracto gastro-intestinal Aspecto normal ( ) Vacío ( ) Lleno de alimento normal ( ) Lleno de moco ( ) Colocación amarillenta ( ) Congestión ( ) Hemorragias ( ) Congestión y hemorragias a nivel del recto ( ) Presencia de parásitos ( ) Presencia de necrosis ( ) Otras anormalidades (señalar): M. Vejiga natatoria Aspecto normal ( ) Congestión ( ) Presencia de líquido ( ) Presencia de parásitos ( ) Otras anormalidades (señalar): N. Ciegos pilóricos Aspecto normal ( ) Ciegos unidos ( ) Hinchamiento ( ) Presencia de zonas de necrosis ( ) Congestión ( ) Presencia de hemorragias ( ) Presencia de parásitos ( ) Otras anormalidades (señalar): O. Gónadas Aspecto normal ( ) Con señales de atrofia ( ) Hemorragias ( ) Congestión ( ) Señales de retención de los huevos ( ) Otras anormalidades (señalar): Página 44 de 54
P. Otras observaciones clínicas de especial importancia (Firma del Ictiopatólogo) TABLA3 Características claves para el diagnóstico de las principales bacterias ictiopatógenas
T A B L A 3a
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T A B L A 3b
T A B L A 3c
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TABLA4 Clave para el reconocimiento de los principales grupos de zooparásitos de los salmónidos 1. 2. 3.
Organismos microscópicos, no visibles al ojo Organismos no microscópicos, visibles al ojo Organismos unicelulares Organismos multicelulares Organismos ectoparasitarios, con ganchos o ganchitos en la parte posterior del cuerpo
4.
5.
6. 7.
Organismos bivalvos, enquistados sobre las branquias y/o aletas Organismos enquistados sobre la superficie del pez Organismos no enquistados sobre la superficie del pez Quiste con un solo organismo Quiste conteniendo muchos organismos (esporozoos) Forma del organismo enquistado en dos valvas Forma del organismo enquistado sin valvas Organismo unicelular (Ichthyophthirius) Organismo multicelular
8. 9. 10.
11.
12.
13. 14. 15.
Cuerpo algo aplanado Cuerpo no aplanado Cuerpo segmentado Cuerpo no segmentado Organismo con ventosas anteriores y posteriores, provisto de tracto digestivo; ectoparásitos Organismos ĉon un solo haptor anterior, el cual puede estar provisto de varias ventosas; sin tracto digestivo; parásitos intestinales Organismos con boca y cavidad digestiva; sin ano; órganos de fijación bien desarrollados Organismos sin boca y cavidad digestiva; ventosas poco desarrolladas en la parte anterior del cuerpo Organismos provistos de ganchos y ganchitos a nivel del haptor posterior Organismos que carecen de ganchos posteriores; ventosas oral y posterior presentes Organos internos ausentes Cuerpo cilíndrico Cuerpo no cilíndrico Cuerpo plástico; organismo activo con
2 4 PROTOZOOS 3 TREMATODOS MONOGENESICOS MOLUSCOS 5 8 6 PROTOZOOS MOLUSCOS 7 PROTOZOOS TREMATODOS DIGENESICOS 9 14 10 11 ANELIDOS CESTODOS 12 13 TREMATODOS MONOGENESICOS TREMATODOS DIGENESICOS CESTODOS (formas larvales 15 17 NEMATODOS Página 47 de 54
16.
17.
movimientos anguiliformes; endoparásitos Cuerpo no plástico, con forma bastante rígida Organismos con espinas sobre la proboscis anterior; parásitos intestinales Organismos con protuberancias anteriores en forma de ancla; ectoparásitos (Lernaea) Cuerpo en forma de hoja aplanada, ectoparásitos (Argulus) Forma de cuerpo variable, pero con apéndice visibles para fijación sobre el cuerpo del pez
16 ACANTOCEFALOS CRUSTACEOS CRUSTACEOS CRUSTACEOS
TABLA5 Caracteres comparativos de algunos de los principales virus ictiopatógenos de importancia para los salmónidos
CARACTERES
SHV
NOMBRE DE LA ENFERMEDAD NHI
NPI
Herpesvirus salmonis
Tipo de virus
Rabdovirus
Rabdovirus
Birnavirus
Herpesvirus
Morfología
Bala
Bala
Icosahedro
Nucleocápsi do hexagonal
Tamaño um
180 × 165
120 - 180 × 60 - 90
60
-
Nombre
Rhabdovirus egtvedi
-
-
Herpesvirus salmonis
Número de serotipos
2
1
Por lo menos 3
?
Sensibilidad al éter etílico
+
+
+
+
Resistencia al glicerol al 50% tamponado
-
-
+
-
Inactivación por exposición a los 60°C durante 15 minutos
+
+
(+)
+
Células de tipo racimo de uvas; marginación cromatínica; lisis celular
Células plumosas o en forma de cuerda; lisis celular
Fusión y redondamien to de las células; formación de sincitios
Tipo de ECP en células RTG-2 sensibles
Células redondas, celular
lisis
Tipo de ECP en células FHM sensibles
Células redondas; marginación cromatínica; lisis celular
Inhibición por suero anti - SHV
+
-
-
-
Inhibición por suero anti - NHI
-
+
-
-
Inhibición por suero anti - NPI
-
-
+
-
Principal tejido afectado
Hematopoyético
Hematopoyético
Pancreático
? Hematopoyé tico
Dedinos, juveniles
Alevines, dedinos
Alevines, dedinos
Alevines, dedinos
Edad del pez susceptibilidad
de
mayor
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Efecto patógeno sobre el pez afectado
Provoca muerte
Temperatura epizootias (°C)
óptima
para
Métodos de identificación
la
Provoca la muerte
Provoca muerte
la
Provoca muerte
la
15
10–15
10–18 (serotipo SP); 10–24 (serotipos AB y VR)
10
Aislamiento en la línea RTG-2; neutralización serológica; microscopía fluorescente
Aislamiento en las líneas RTG-2 y FHM; neutralización serológica; histología
Aislamiento en la línea RTG-2; neutralización serológica; histología
Aislamiento en la línea celular RTG-2; observación de sincitios e inclusiones nucleares; histología
APENDICE A Preparación de los principales medios de cultivo y soluciones isotónicas utilizadas en ictiopatología A.1 MEDIOS DE CULTIVO A.1.1 Agar forunculosis (FA) Triptona Extracto de levadura Cloruro de sodio Tirosina Agar Agua destilada
10,0 g 5,0 g 2,5 g 1,0 g 15,0 g ad 1000 ml
pH: 6,8 Este medio de cultivo se encuentra disponible en el comercio como medio deshidratado (Difco Laboratories Inc., Detroit, Michigan, EE.UU. de N.A.). Para su preparación, se suspenden 33,5 g del medio deshidratado en 1000 ml de agua destilada fría y se calienta suavemente para disolver. El medio se esteriliza en el autoclave a los 121°C (es decir: 15 libras de presión durante 15 minutos). A.1.2 Agar tripticasa soya (TSA) Existen en el comercio dos medios deshidratados (“Trypticase Soy Agar” y “Tryptic Soy Agar”), los cuales son igualmente adecuados para el aislamiento de bacterias a partir de muestras de peces enfermos y moribundos. Cualquiera de estos dos medios puede utilizarse y su preparación se realiza según las instrucciones dadas a conocer por la correspondiente casa comercial. Página 49 de 54
A.1.3 Agar Cytophaga (medio de Carlson y Pacha) Triptona Extracto de levadura Extracto de carne Leche peptonizada Acetato de sodio Agar Agua destilada
0,05 g 0,05 g 0,02 g 0,5 g 0,02 g 15,0 g ad 1000 ml
pH: 6,8 Al disolver los ingredientes en el agua destilada, el medio se esteriliza en el autoclave a los 121°C (es decir: 15 libras de presión durante 15 minutos). Después de haberse esterilizado, se agrega antes de usar el medio 5 mcg/ml de neomicina y 10 mcg/ml de ciclohexamida respectivamente. Es muy importante que las placas, antes de ser sembradas, se dejen secar durante 48 horas a los 37°C. A.1.4 Agar cólera (CM) Peptona Extracto de carne Cloruro de sodio Carbonato de sodio Sulfato laurílico de sodio Sacarosa Agar Agua destilada
10,0 g 10,0 g 20,0 g 1,1 g 0,1 g 10,0 g 15,0 g ad 1000 ml
pH: 8,5 Este medio se encuentra disponible como medio deshidratado en el comercio (Oxoid Ltd., Londres, Reino Unido). Para su preparación se suspenden 61,2 g del medio deshidratado de ebullición para disolver los ingredientes. Se deja enfriar hasta los 75°C y se agregan 2 ml de una solución desfibrinizada de sangre de caballo, mezclando cuidadosamente. El medio se mantiene a una temperatura de los 75°C durante unos minutos dejándolo enfriar a los 50°C antes de distribuirlo en cápsulas de Petri. A.1.5 Agar Mueller-Hinton enriquecido Caldo de carne Acido casamínico (hidrólisis ácida de caseina
300 ml 17,5 g
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Almidón Agar Agua destilada
1,5 g 15,0 g ad 1000 ml
pH: 7,4 Al disolver los ingredientes en el agua destilada, el medio básico se esteriliza en el autoclave a los 115°C (es decir: 10 libras de presión durante 10 minutos). Para su empleo, el medio se calienta a los 50°C y se agrega asépticamente 5 ml de una solución acuosa estéril al 0,1% de cocarboxilasa (difosfotiamina). La esterilización de esta solución se efectúa por filtración. Es muy importante no proceder a recalentar el medio una vez agregada la cocarboxilasa, sino que las placas se preparan de inmediato, dejándolas enfriar antes de efectuarse la siembra correspondiente. A.1.6 “Kidney disease medium - 2” (KDM-2) Peptona Extracto de levadura Clorhidrato de cisteina Agar Agua destilada
10,0 g 0,5 g 1,0 g 15,0 g ad 1000 ml
pH: 6,5 Se disuelve la peptona, extracto de levadura y clorhidrato de cisteina en agua destilada y se ajusta el pH a 6,5 mediante la adición de soda cáustica. Seguidamente se agrega el agar y se calienta para lograr su disolución. El medio básico se esteriliza en el autoclave a los 121°C (es decir: 15 libras de presión durante 15 minutos). Antes de usar, el medio básico se calienta para fundir y se deja enfriar hasta que alcanza los 45°C, momento en el cual se adiciona 200 ml de suero bovino estéril por cada litro de medio; la temperatura del suero bovino también ha de ser de los 45°C en el momento de agregarse al medio básico. Se ha observado que los mejores resultados se obtienen cuando el medio final se utiliza dentro de una (1) semana de su preparación, dado que el medio se deteriora rápidamente cuando se almacenan las placas en la oscuridad y a la temperatura ambiente. A.1.7 Medio de Ordal y Earp Triptosa Cloruro de sodio Extracto de levadura Clorhidrato de cisteina Agar Agua destilada
10,0 g 5,0 g 3,0 g 1,0 g 15,0 g ad 1000 Página 51 de 54
ml pH: 6,8 Este medio básico se esteriliza en el autoclave a los 121°C ( es decir: 15 libras de presión durante 15 minutos). Antes de usarse, se calienta a los 50°C y se agrega asépticamente sangre humana citrada o heparinizada a razón de 20 ml por cada 80 ml de medio básico. Una vez efectuada la adición de la sangre humana estéril, se preparan las placas para la siembra correspondiente. A.1.8 Medio de Lowenstein-Jensen (L-J) Fosfato monopotásico Citrato de magnesio Sulfato de magnesio Asparagina Harina de papa Verde de malaquita
2,4 g 0,6 g 0,24 g 3,6 g 30,0 g 0,4 g
Este medio básico se encuentra disponible en el comercio (Difco Laboratories Inc., Detroit, Michigan, E.E.U.U. de N.A.). Del medio deshidratado, se disuelven 37,2 g en 600 ml de agua destilada fría que contiene 12 ml de glicerina pura. Se lleva cuidadosamente al punto de ebullición, agitando constantemente la mezcla para lograr una disolución uniforme y se esteriliza en el autoclave a los 121°C (es decir: 15 libras de presión durante 15 minutos). Para preparar el medio final, se calienta el medio básico estéril hasta los 60°C, agregando a cada 600 ml del medio 1000 ml de una suspensión uniforme de huevos frescos, mezclando con sumo cuidado para obtener una suspensión uniforme y sin burbujas de aire atrapadas. El medio así preparado se distribuye asépticamente en tubos de cultivo estériles con tapón de rosca, colocando los tubos posteriormente en un espesador a los 65°C durante 50 minutos para lograr la correspondiente coagulación del medio. El medio preparado ha de conservarse en la nevera hasta que sea usado. Para la elaboración de la suspensión uniforme de los huevos frescos, es conveniente que los mismos sean expuestos previamente a una solución acuosa al 5% de jabón y la superficie debidamente limpiada con un pequeño cepillo, procurando que esa limpieza sea llevada a cabo con el cuidado correspondiente. Una vez lavados los huevos, los mismos se enjuagan con agua limpia, y se cascan en forma aséptica para que el contenido de los mismos sea recolectado en un frasco estéril que contiene perlas de vidrio. El frasco con las perlas de vidrio y los huevos se agita con el fin de obtener una emulsión uniforme, la cual puede ser agregada al medio básico tal como se ha detallado en el párrafo anterior. A.1.9 Agar glucosado de Sabouraud (SGA) Peptona micológica Glucosa Agar Agua destilada
10,0 g 10,0 g 15,0 g ad 1000 ml
pH: 5,6 Página 52 de 54
Este medio se encuentra disponible en el comercio como medio deshidratado (Difco Laboratories Inc., Detroit, Michigan, E.E.U.U. de N.A.). Para su preparación, se hidratan 65,0 g de medio comercial con 1000 ml de agua destilada fría, calentando para disolver. El medio se esteriliza en el autoclave a los 121°C (es decir: 15 libras de presión durante 15 minutos). Para su empleo, el medio básico se calienta entre los 45–50°C y se agrega asépticamente una solución acuosa estétil de penicilina G y estreptomicina para dar una concentración final de 20 U.I. de penicilina y 40 mcg de estreptomicina respectivamente por cada ml del medio. Es conveniente utilizar para estos fines una solución acuosa comercial de dichos antibióticos, procurando de esa manera que la concentración sea una que permite la adición de muy pequeñas cantidades de líquido al medio básico. A.2 SOLUCIONES ISOTONICAS A.2.1 Solución fisiológica isotónica de Earle Cloruro de sodio Cloruro de potasio Cloruro de Calcio (Cl2Ca. 2H2O) Sulfato de magnesio (SO4Mg. 7H2O) Fosfato diácido de sodio (H2HPO4Na. H2O) Glucosa Rojo de fenol Bicarbonato de sodio Agua bidestilada
6800 mg 400 mg 265 mg 200 mg 140 mg 1000 mg 10 mg 2200 mg 1000 ml
A.2.2 Solución fisiológica isotónica de Hanks Cloruro de sodio Cloruro de potasio Cloruro de calcio (Cl2Ca. 2H2O) Sulfato de magnesio (SO4Mg. 7H2O) Fosfato disódico (HPO4Na2. 7H2O) Fosfato diácido de potasio (H2PO4K) Glucosa Rojo de fenol
8000 mg 400 mg 186 mg 200 mg 90 mg 60 mg 1000 mg 20 mg Página 53 de 54
Bicarbonato de sodio
350 mg 1000 ml
Agua bidestilada A.3 SOLUCIONES FIJADORAS A.3.1 Fluido de Schaudin Solución acuosa saturada cloruro de mercurio Alcohol etílico al 95% Acido acético glacial
de
660 ml 330 ml 50 ml
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