Manual de Microbiología buap

BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

M ANUAL DE L ABOR ABO RATOR ATOR I O DE M I CROBI CROBI OL OGÍA

AUTORES: M.E.C. ANA BERTHA ESCOBEDO LÓPEZ. M.S.P. CARLOS CABRERA MALDONADO. M.S.P. MARÍA DE LA CRUZ MENESES SÁNCHEZ. M. en C. ALMA LÓPEZ GARCÍA. M. en C. ALEJANDRO CÉSAR RUÍZ TAGLE. M.S.P. CLAUDY LORENA VILLAGRÁN PADILLA. 2013

1



Índice NÚMERO DE LA PRÁCTICA

TITULO DE LA PRÁCTICA

PÁGINA

Práctica 1

Observación de grupos microbianos

3

Práctica 2

Microscopio

6

Práctica 3

Preparación de material y medios de cultivo

10

Práctica 4

Técnicas para recuento de bacterias

15

Práctica 5

Aislamiento de microorganismos por estría cruzada

18

Práctica 6

Técnicas de tinción diferenciales

21

Práctica 7

Efecto de los factores físicos sobre el crecimiento de los microorganismos

24

Práctica 8

Efecto de los agentes químicos sobre el crecimiento de los microorganismos

28

Práctica 9

Crecimiento de microorganismos Gamnegativos en diferentes medios de cultivo

32

Práctica 10

Crecimiento de microorganismos Grampositivos en diferentes medios de cultivo

34

Práctica 11

Observación de morfología colonial

36

Práctica 12

Pruebas bioquímicas

39

Bibliografía

44

2



Índice NÚMERO DE LA PRÁCTICA

TITULO DE LA PRÁCTICA

PÁGINA

Práctica 1

Observación de grupos microbianos

3

Práctica 2

Microscopio

6

Práctica 3

Preparación de material y medios de cultivo

10

Práctica 4

Técnicas para recuento de bacterias

15

Práctica 5

Aislamiento de microorganismos por estría cruzada

18

Práctica 6

Técnicas de tinción diferenciales

21

Práctica 7

Efecto de los factores físicos sobre el crecimiento de los microorganismos

24

Práctica 8

Efecto de los agentes químicos sobre el crecimiento de los microorganismos

28

Práctica 9

Crecimiento de microorganismos Gamnegativos en diferentes medios de cultivo

32

Práctica 10

Crecimiento de microorganismos Grampositivos en diferentes medios de cultivo

34

Práctica 11

Observación de morfología colonial

36

Práctica 12

Pruebas bioquímicas

39

Bibliografía

44

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Práctica No. 1 Observación de grupos microbianos Introducción La Microbiología estudia a los microorganismos desde el punto de vista de su morfología, función, relación con el ambiente y los métodos que nos llevan a su identificación. Los estudios de cada grupo en particular corresponden a ramas específicas de la Microbiología, como son: 

Bacteriología (bacterias).



Micología (hongos)



Ficología (algas).



Protozoología (protozoarios).



Virología (virus). En 1969 Whittaker propone un sistema de 5 reinos, basándose en tres puntos principales:

complejidad celular (procariontes y eucariontes), complejidad tisular (unicelular, multicelularmultinucleados) y nutrición (absorción, fotosíntesis, ingestión) los cuales son: Monera, Protista, Fungí, Vegetal y Animal. Protozoarios: Son clasificados dentro del reino Protista, siendo microorganismos unicelulares y eucariotes. Son en tamaño mayores a las bacterias y sus estructuras internas muchas veces veces fácilmente observables. observables. Por su morfología se puede diagnosticar diagnosticar la especie. Hongos: Son clasificados dentro del reino Fungi, siendo organismos multinucleados y eucariotes, sus nutrientes los obtienen por absorción. En cuanto a su tamaño es variable, presentan dos dos tipos de crecimiento: crecimiento: filamentoso y levaduriforme. levaduriforme.

3

Los hongos filamentosos tienen como unidad funcional a la HIFA, el conjunto de hifas es denominado MICELIO, el cual puede estar en contacto con el medio y se le denomina VEGETATIVO, o bien por encima del sustrato denominándose micelio AÉREO. Estos hongos tienen aspecto algodonoso o aterciopelado con crecimiento radial. El otro tipo de crecimiento es el levaduriforme, el cual se caracteriza por su tipo de multiplicación o división llamado GEMACIÓN. En tamaño son mayores a las bacterias, son unicelulares y no desarrollan filamentos o micelio. Algunos géneros forman el llamado pseudomicelio, con tinciones apropiadas podemos observar el núcleo, otros organelos como mitocondrias o inclusiones como gránulos de volutina, están presentes en el citoplasma, las colonias de levaduras son de aspecto cremoso. Bacterias: Se encuentran dentro del reino Monera, son células procariotas y unicelulares, se reproducen por fisión binaria, pueden ser móviles por la presencia presencia de flagelos simples, las formas fundamentales de las bacterias son: esféricas (cocos), alargadas (bacilos), helicoidales (espirilos), los cocos pueden agruparse en pares, cadenas, racimos o tetradas, dependiendo del género. Un grupo importante de microorganismos son las Archeas cuya forma fundamental es diferente al de las bacterias, se pueden presentar en forma de estrella o en forma cuadrangular, la característica principal de este grupo microbiano es su crecimiento, requieren condiciones especiales extremas, como altas temperaturas o altas concentraciones de sal.

Objetivo Observar diferentes grupos microbianos, detectando forma y agrupación, usando microscopía óptica. Observar diferentes crecimientos macroscópicos.

Material Preparaciones fijas de bacterias, hongos y protozoarios. Placas de cultivo con crecimiento de hongos y bacterias. Microscopio óptico. 4

Desarrollo Hacer la observación microscópica y macroscópica de cada preparación proporcionada y dibuja tus observaciones.

Cuestionario 1. ¿Qué características microscópicas diferencian a los hongos de las bacterias? 2. ¿Cuál es el tamaño promedio de cocos, bacilos, levaduras y virus? 3. Menciona 5 beneficios de los microorganismos para la humanidad. 4. Menciona 5 consecuencias perjudiciales de los microorganismos para la humanidad. 5. Menciona en forma ascendente en tamaño, los organismos observados.

5



Práctica No. 2 Microscopio Introducción El microscopio es un instrumento que permite observar microorganismos imposibles de ver a simple vista. A mediados del siglo XVII el holandés, Antony van Leeuwenhoek, utilizando microscopios simples de fabricación propia, describió por primera vez protozoos, bacterias, espermatozoides y glóbulos rojos. Durante el siglo XVIII el microscopio tuvo diversos adelantos mecánicos que aumentaron su estabilidad y su facilidad de uso. Carl Zeiss, mejoró la microscopía de inmersión sustituyendo el agua por aceite de cedro, lo que permite obtener aumentos de 2000 veces. El microscopio óptico es un instrumento que contiene una o varias lentes que permiten obtener una imagen aumentada del objeto y que funciona por refracción. El microscopio óptico puede ser monocular, consta de un solo tubo y para la observación se utiliza un solo ojo. El binocular es cuando posee dos tubos y la observación se hace con los dos ojos. El microscopio óptico está conformado por tres sistemas: a) El sistema mecánico constituido por una serie de piezas que permiten el movimiento para el enfoque del objeto: brazo, base o pie, platina, pinzas de sujeción, tornillo macrométrico, tornillo micrométrico y tubo. b) El sistema óptico comprende el conjunto de lentes que permiten el aumento de las imágenes que se observan a través de ellas formado por el ocular y objetivos. c) El sistema de iluminación comprende una lámpara incandescente de tungsteno sobrevoltada, el espejo, el diafragma y el condensador; dispuestos de tal manera que ilumine la preparación u objeto que se va a observar en el microscopio de la manera adecuada. 6

La observación por microscopio es el método más común utilizado tanto para la detección directa de microorganismos en las muestras médicas como para la caracterización de microorganismos desarrollados en los cultivos. La microscopía se define como el empleo de un microscopio para aumentar de tamaño objetos demasiado pequeños que no se pueden observar a simple vista, de modo que puedan verse con facilidad. El método empleado para procesar las muestras del paciente está determinado por el tipo y la fuente corporal de la muestra. Las coloraciones o los colorantes específicos aplicados a las muestras, combinados con determinados métodos de microscopía, pueden ayudar a detectar los agentes etiológicos de una manera rápida. La microscopia también desempeña un papel clave en la caracterización de microorganismos cultivados en el laboratorio. Las células teñidas que se van a observar en el microscopio deben parecerse lo más posible a las células vivas. La fijación es el procedimiento que permite que las células se conserven y además permite que se fijen firmemente al portaobjetos, esto se puede lograr con calor o con algún alcohol dependiendo de la naturaleza de la muestra. Los microorganismos se pueden teñir satisfactoriamente con un solo colorante, esto es tinción simple, o bien utilizando tinciones diferenciales que permiten clasificar a las bacterias según sus propiedades de tinción.

Objetivos a)

Realizar una tinción simple de bacterias procedentes de distintas muestras naturales.

b)

Realizar dos tipos de fijaciones bacterianas y saber en qué casos se recomienda una u otra.

c)

Practicar con el microscopio al máximo aumento y con el correcto empleo del aceite de inmersión.

Material Muestras bacterianas de origen natural: yogur, vinagre, sarro dental, suelo, etc. Colorantes para tinción: Cristal violeta Safranina Azul de metileno 7

Microscopio y aceite de inmersión

Desarrollo Bacterias del yogurt 1. Realizar el frotis disolviendo una mínima porción de yogur en una pequeña gota de agua. 2. Fijar con metanol para eliminar parte de la grasa. 3. Teñir con un colorante cualquiera de los arriba indicados durante 1-2 minutos. 4. Observar al máximo aumento del microscopio. 5. Realiza los dibujos de cada observación Bacterias del sarro dental 1. Con un palillo tomar una pequeña porción de sarro dental y disolverla en una gota de agua sobre el portaobjetos. 2. Dejar secar y fijar con calor. 3. Teñir 2-3 min, lavar el exceso de colorante y secar. 4. Realiza los dibujos de cada observación Bacterias del suelo 1. Dejar parcialmente enterrado en vertical un portaobjetos en la tierra de una maceta 2. Después de varios días, las bacterias se habrán adherido al vidrio y sólo habrá que fijarlas por calor y teñirlas con un colorante cualquiera. Previamente hay que limpiar los bordes del portaobjetos, así como la parte que no se va a teñir.

3. Realiza los dibujos de cada observación Completa el siguiente dibujo

8

Cuestionario: 1. ¿Qué tipos de microscopio existen, en qué se fundamenta cada uno de ellos y cuál es su utilidad? 2. ¿En qué objetivo se usa el aceite de inmersión y cuál es su función? 3. ¿Cuál es la diferencia entre una preparación en fresco y una preparación fija? 4. ¿Qué fin tiene la fijación de muestras al realizar un frotis bacteriano? 5. Investiga las diferentes morfologías que presentan las células bacterianas y sus agrupaciones.

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Práctica No. 3 Preparación de material y medios de cultivo Introducción. El material del laboratorio de Microbiología requiere de una preparación especial, deberá ser estéril, para que no ofrezca un riesgo de contaminación de la(s) muestra(s) ya que de ellos dependerá el éxito o fracaso del estudio microbiológico a realizar. La esterilización se mide en grado absoluto, es decir, se encuentra o no estéril, y se define como el proceso (ya sea físico o químico) por el cual se elimina toda forma de vida microbiana, incluyendo formas bacterianas esporuladas y vegetativas, virus, hongos y parásitos. El método de esterilización más empleado en microbiología es por calor húmedo utilizando la autoclave, a 121°C, 15 min y 15 lb. (ver figura 1)

Fig. 1. Partes de la autoclave

La desinfección no es sinónimo de esterilización, es un proceso químico o físico, por el cual son eliminadas solo formas bacterianas vegetativas y no formas esporuladas. Dentro de los procesos físicos para la esterilización se encuentra el calor (húmedo y 10

seco), la filtración, las radiaciones, ultracentrifugación y ultrasonido. Dependiendo de la naturaleza del material (ya sea termorresistente o termolábil) se deberá elegir el método de esterilización. Los métodos de esterilización pueden ser evaluados a través de agentes físicos (termopares y termómetros), químicos (cinta testigo) y biológicos (ampolletas Sterikon). Un medio de cultivo es un sustrato que proporciona los nutrientes necesarios para el desarrollo del microorganismo a probar. Los microorganismos presentan diferencias en sus requerimientos nutricionales que son reflejo de la extrema diversidad bioquímica y fisiológica. El agua, sales inorgánicas, fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno y metales son necesarios para los microorganismos. Existen bacterias que necesitan la presencia de determinado nutriente, sin el cual no pueden desarrollarse, este nutriente se denomina: factor de crecimiento y las bacterias que necesitan de ellos se llaman auxótrofos. Los medios de cultivo con base a su contenido de material gelificante pueden ser: líquidos, semisólidos y sólidos (los líquidos carecen de material gelificante). En Microbiología el material gelificante más utilizado es el agar, químicamente es un polisacárido obtenido a partir de algas marinas, presentando entre sus ventajas que la mayoría de los microorganismos no lo utilizan como nutriente. La presencia y cantidad de éste permite diferenciar los medios semisólidos (0.2-0.5% de agar), sólidos (1 a 2% de agar) y líquido que carece de agar. De acuerdo a la función de los medios de cultivo se pueden ser medios selectivos, diferenciales, de enriquecimiento, enriquecidos, de transporte, de mantenimiento, de caracterización bioquímica entre otros, el uso de cada uno de ellos dependerá de las necesidades en el laboratorio. El medio de transporte tiene como objetivo transportar los especímenes que contienen a los microorganismos, del sitio de la toma de la muestra hasta el laboratorio donde va a efectuarse el estudio, aseguran la viabilidad de los microorganismos desde el momento de la toma de la muestra hasta su siembra en el laboratorio. El medio de transporte Stuart modificado, es un medio semisólido empleado en el 11

transporte y conservación de especímenes para cultivos de diversos microorganismos como estreptococos, enterobacterias, Haemophilus y otros microorganismos exigentes. La siembra debe efectuarse no más de las 36 h siguientes a la obtención de la muestra. Otro medio utilizado para este fin es el medio de Cary Blair que se utiliza primordialmente en el transporte de coprocultivos, debido, a que la viabilidad de las especies de Shigella es superior que en otros medios de transporte. Los medios de enriquecimiento generalmente son líquidos y estimulan la multiplicación de algún microorganismo determinado, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto. Por ejemplo, la utilización de caldo de tetrationato o caldo selenito para el enriquecimiento de Salmonella en heces. El medio enriquecido es aquel que tiene añadidos factores de crecimiento, como la sangre y otros nutrientes especiales para favorecer el crecimiento de heterótrofos exigentes. El medio selectivo permite el crecimiento de un tipo de microorganismos determinado, inhibiendo el desarrollo de los demás y finalmente el medio diferencial aquél que contiene indicadores de tipo ácido base, redox o sustancias que detectan cambios en el medio o en las características típicas de las colonias, y que permite distinguir a simple vista dos o más tipos de bacterias en función de su distinto comportamiento respecto de algún nutriente del medio. Los medios de cultivo para Microbiología se fabrican de forma granulada o de polvo, ambas presentaciones son higroscópicas por lo que deben mantenerse perfectamente cerradas y en ambientes secos.

Objetivo Preparar el material necesario para el Laboratorio de Microbiología. Preparar diferentes medios de cultivo sólidos y aplicar la esterilización por calor húmedo.

Material Algodón Cajas Petri estériles Matraz Erlenmeyer

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Pipetas Mechero Autoclave Medios de Cultivo en polvo Probeta Balanza Espátula o cuchara Parrilla de calentamiento Guantes para calor

Desarrollo 1. Preparar diferentes materiales que se utilizan para el aislamiento de los microorganismos. 2. La forma en la cual se preparan los medios de cultivo viene indicada en cada etiqueta y depende del fabricante. Se recomienda lo siguiente: a)

Utilizar un recipiente de volumen 2.5 veces mayor al que se va a preparar.

b)

Al medio se le agrega aproximadamente la mitad del agua total a utilizar dejándolo reposar unos 15 minutos.

c)

Si es necesario calentar, el calentamiento debe ser paulatino y agitando continuamente, evitar el calentamiento prolongado.

Proceso de esterilización 1. Verificar el nivel de agua de la autoclave. 2. Introducir al autoclave los medios de cultivo perfectamente cubiertos, (en el caso de esterilizar medios de cultivo en tubos con tapón de rosca, estos deben estar tapados flojamente y cerrados perfectamente después de esterilizar). 3. Cerrar la tapa de la autoclave y esperar que se sature de aire caliente antes de poner válvula de presión. 4. Esterilizar a 121°C (15 lbs de presión) por 15 min. 5. Deben incluirse controles de esterilización para autoclave. 6. Compuestos termolábiles no deben ser esterilizados en autoclave.

Cuestionario 1. ¿Qué ocurriría si los medios de cultivo no se esterilizaran tras su preparación? 13

2. ¿Qué es y cómo se lleva a cabo la esterilización por calor húmedo y por calor seco? 3. Describe los siguientes métodos de eliminación de microorganismos: tindalización, pasteurización, filtración, radiaciones y gases. 4. ¿Qué es un bioindicador de esterilidad? 5. ¿Qué ventajas presenta el agar?

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Práctica No. 4 Técnicas para recuento de bacterias Introducción Si se pretende conocer el número total de microorganismos presentes en una muestra líquida o sólida, es recomendable que se encuentren ésta última en forma líquida y homogenizada, además de utilizar un método apropiado. Es importante señalar que el número no guarda relación con el tipo de microorganismos patógenos, por lo que no puede usarse como índice de su presencia y sólo debe considerarse como un indicador de las características higiénicas de la muestra. Además dependiendo de las características del medio utilizado y de las condiciones de incubación, los microorganismos analizados serán miembros de poblaciones diferentes. En general se investiga la presencia de microorganismos aerobios o aerotolerantes aunque en ciertas situaciones puede ser de interés hacer recuentos anaerobios totales.

Objetivo Realizar el aislamiento de microorganismos a partir de muestras problema utilizando el método de diluciones y vertido en placa.

Material Muestra de agua o de alimento. Mechero bunsen. 3 Matraces conteniendo 500 mL de agar nutritivo estéril cada uno. 30 Pipetas de 10 mL o puntas azules estériles y micropipeta con capacidad de 1000 µL. 20 Tubos conteniendo 9 mL de solución salida isotónica estéril (diluyente). 30 Cajas Petri estériles desechables. Benzal

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Algodón Marcador de tinta permanente

Desarrollo 1. Colectar 100 mL de muestra en un frasco estéril. 2. Limpiar el área de trabajo con benzal y algodón. 3. Colocar en una gradilla 5 tubos conteniendo 9 mL de solución salina estéril (diluyente) y numerarlos. 4. Tomar 1 mL de la muestra en condiciones de esterilidad y transferirlo a un tubo que contenga 9 ml de diluyente, así se obtiene una dilución 10 -1, homogenizar el contenido. 5. Transferir 1 mL a un tubo de dilución que contenga 9 mL de diluyente, agitarlo vigorosamente para homogenizar la muestra y obtener la dilución 10 -2. 6. Realizar sucesivamente las siguientes diluciones, transfiriendo 1 mL de la muestra a otro tubo con 9 mL de diluyente para obtener las diluciones 10 -3, 10-4, 10-5, 10-6 como se indica en el esquema. 7. Pipetear 1 mL de cada una de las diluciones realizadas y transferirlos por separado a una caja Petri estéril vacía. 8. Adicionar inmediatamente en las cajas Petri de 10 a 15 mL de agar nutritivo mezclando el inóculo con el medio fundido, con movimientos rotatorios a la derecha, a la izquierda y de arriba abajo. 9. Dejar gelificar las placas. 10. Rotular las placas indicando la dilución que contienen y el tipo de muestra, incluir su nombre así como la fecha de ingreso y de salida del material. 11. Colocar las placas en la estufa bacteriológica y dejarlas durante 24 h a 37° C. 12. Limpiar nuevamente el área de trabajo con benzal y algodón. 13. Evaluar el crecimiento a las 24 h, hacer el recuento de las unidades formadoras de colonias (colonias) con ayuda del contador de colonias, registrar los resultados. 14. Seleccionar la placa representativa que corresponde a la dilución que presente entre 30 y 300 unidades formadoras de colonias (UFC). 15. Multiplicar el No. de UFC por el inverso de la dilución para obtener el No. de unidades formadoras de colonias/ mL presentes en la muestra. 16. Colocar el material “sucio” en el cuarto de lavado. 17. Escribe el número de UFC encontradas en las placas sembradas en las diferentes 16

diluciones: 10-1 ____________

10 – 2 ____________ 10 – 3 _____________

10 – 4 ____________

10 – 5 ____________ 10 – 6 _____________

18. ¿Cuál fue tu placa representativa y cuál fue la dilución de la placa? 19. Calcula el no. de UFC/mL presente en la muestra (ver fig. 2)

Fig. 2. Método de diluciones y vertido en placa

Cuestionario 1. Investiga las técnicas que existen para el conteo total de microorganismos e indica su fundamento. 2. ¿Qué ventajas e inconvenientes presenta el método utilizado en la práctica? 3. Escribe 3 ejemplos donde se aplique este procedimiento. 4. ¿Por qué es necesario hacer diluciones en esta técnica? 5. ¿Cuál es el criterio para seleccionar la placa representativa?

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Práctica No. 5 Aislamiento de microorganismos por estría cruzada Introducción Para el microbiólogo es de gran utilidad contar en el laboratorio con técnicas que le permitan estudiar un único microorganismo separado del resto de la población. Para lograr este fin se necesita de un cultivo puro formado por células que provienen de una célula única. Aislamiento se define como la separación de un microorganismo determinado de las poblaciones mixtas que existen en la naturaleza; el cultivo, es el crecimiento de las poblaciones microbianas en ambientes artificiales (medios de cultivo) en condiciones de laboratorio. El proceso mediante el cual se separan los microorganismos se denomina “aislamiento” y el microorganismo separado “aislado”.

La manera de inocular (sembrar) una muestra depende del tipo de medio de cultivo: a)

Medio líquido: la inoculación se efectúa mediante el asa bacteriológica, pipeta o hisopo.

b)

Medio semigelificado (semisólido): con ayuda del asa bacteriológica recta, por punción.

c)

Medio gelificado (sólido): en caja Petri o en tubos con agar inclinado, la inoculación se realiza por estría o picadura.

Objetivo Realizar el aislamiento de microorganismos utilizando placas con medio de cultivo simple, con el asa bacteriológica por el método de estría cruzada.

Material 

2 Placas con agar nutritivo. 18



Mechero Bunsen.



Asa bacteriológica.



Cepa bacteriológica: Escherichia coli.



Benzal



Algodón

Desarrollo 1.

Limpiar el área de trabajo con benzal y algodón.

2.

Flamear el asa bacteriológica hasta llevarla al rojo vivo.

3.

Dejar enfriar el asa.

4.

Destapar el tubo o placa conteniendo la cepa problema.

5.

Tomar la muestra con el asa bacteriológica y volver a tapar el tubo.

6.

Hacer las estrías sobre la superficie del medio de cultivo, como se indica en el esquema de trabajo teniendo cuidado de flamear el asa antes de cada serie de estrías y enfriarla en una orilla de la placa. Con la última serie de estrías no volver a tocar la primera serie de estrías (ver fig. 3).

1ª serie

2ª serie

3ª serie

4ª serie

Fig. 3. Esquema de estría cruzada

7.

Rotular las placas con su nombre, fecha de ingreso y de salida del material que se va a meter a incubar.

8.

Colocar las placas en la estufa bacteriológica y dejarlas durante 24 horas a 37° C.

9.

Limpiar nuevamente el área de trabajo con benzal y algodón.

10.

Evaluar el crecimiento a las 24 horas, identificando la presencia de colonias aisladas y determinar si hubo cultivo puro o mixto.

11.

Colocar el material “sucio” en el cuarto de lavado.

Otras formas para la siembra de cepas con asa bacteriológica empleadas en microbiología 19

se muestran en la figura 4.

Fig. 4. Diferentes estrías

Cuestionario 1. ¿Por qué se incuban las cajas con las tapas hacia abajo? 2. ¿Qué ventajas e inconvenientes ofrece el método de estría cruzada? 3. ¿Con que propósito se emplean las otras técnicas de siembra diferentes a la estría cruzada? 4. ¿Cuál es la diferencia entre un medio sólido, semisólido y líquido? 5. ¿Qué tipo de medio es el agar nutritivo y para qué se utiliza?

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BENEM RITA UNIVERSIDAD AUT NOMA DE PUEBLA FACULTAD DE CIENCIAS QU MICAS LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOG A

Práctica No. 6 Técnicas de tinción diferenciales

Introducción Los organismos vivos son incoloros y presentan pobre contraste cuando se observan al microscopio. Cuando los organismos son teñidos antes de observarlos, aumenta en gran medida el contraste de las células y su medio. Antes de teñir es necesario hacer un frote y fijarlo. Un frote es una delgada capa de células que cubre un área de un portaobjetos, este frote debe ser secado al aire y fijado por calor o químicamente con alcohol. Así los frotes no fijados son lavados en el proceso de tinción. Existen varias técnicas de tinción ocupadas en Microbiología, por ejemplo: 

Tinción simple o directa.



Tinción diferencial.



Tinción de estructuras.



Tinción negativa.



Tinción de material de reserva, etc. La tinción más empleada en Microbiología es la de Gram, que es una tinción

diferencial. Los microorganismos difieren entre sí desde el punto de vista químico y físico por lo que reaccionan de manera diferente a los colorantes. Las tinciones diferenciales ocupan dos colorantes, uno primario y otro de contraste o secundario. Para la tinción de Gram el colorante primario es cristal violeta mientras que la safranina corresponde al de contraste. La tinción de Gram clasifica a los microorganismos según su capacidad de retener el colorante primario (Grampositivos) o el colorante de contraste (Gramnegativas).

21

La tinción de esporas y tinción negativa son tinciones de estructuras específicas, la primera permite teñir las endosporas bacterianas y la segunda revela la presencia de cápsulas.

Objetivo a)

Aprender el fundamento y la técnica de la tinción de Gram para determinar la morfología microscópica de diferentes cepas bacterianas.

b)

Aprender el fundamento de la tinción negativa para levaduras.

c)

Aprender el fundamento de la tinción de esporas para bacterias.

Material Mechero Asas bacteriológicas Placas sembradas con diferentes microorganismos Portaobjetos Colorantes Microscopios Cepas

Desarrollo Técnica de Tinción de Gram 1. Hacer un frote de las colonias caracterizadas, tomando con el asa bacteriológica una pequeña muestra de una colonia aislada y mezclarla con una gota de agua sobre un portaobjetos. Extender esta suspensión y dejar secar. 2. Fijar el frote por calor deslizando el portaobjetos sobre la flama del mechero. 3. Cubrir el frote con cristal violeta y dejarlo actuar por un minuto. Escurrir el colorante y lavar con chorro suave de agua corriente. 4. Cubrir el frote con lugol, dejarlo actuar por un minuto. Escurrir y lavar. 5. Decolorar el frote con alcohol-acetona, de 5-30 segundos. Escurrir y lavar. 6. Cubrir el frote con safranina y dejarlo actuar por 30 segundos. Escurrir y lavar. 7. Dejar secar al aire. 8. Observar el frote con objetivo de inmersión. 9. Determinar la morfología microscópica y la respuesta a la Tinción de Gram de cada cepa empleada.

22

Técnica de tinción negativa 1. Mezclar las levaduras con tinta china sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos. 2. Observar el frote con objetivo seco fuerte.

Técnica de tinción de esporas (Tinción de Schaeffer y Fulton) 1. Hacer un frote de las colonias caracterizadas, tomando con el asa bacteriológica una pequeña muestra de una colonia aislada y mezclarla con una gota de agua sobre un portaobjetos. Extender esta suspensión y dejar secar. 2. Fijar el frote por calor deslizando el portaobjetos sobre la flama del mechero. 3. Cubrir el frote con verde de malaquita a emisión de vapores y dejarlo actuar por un minuto. Escurrir el colorante y lavar con chorro suave de agua corriente. 4. Cubrir el frote con safranina, como colorante de contraste dejarlo actuar por un minuto. Escurrir y lavar. 5. Observar el frote con objetivo de inmersión y dibújala

Cuestionario 1. ¿Qué es un frotis y para qué se utiliza? 2. ¿Qué es un colorante? ¿Cómo está constituido? ¿Cómo es que se combina con los diferentes componentes celulares? 3. ¿Qué factores intervienen para que los colorantes se combinen con los componentes celulares? 4. ¿Qué es un mordente? Menciona tres ejemplos. 5. ¿Cuál es el objetivo de calentar en la tinción de esporas?

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Práctica No. 7 Efecto de los factores físicos sobre el crecimiento de los microorganismos Introducción Para que los microorganismos puedan ser aislados en el laboratorio se deben satisfacer todos sus requerimientos nutricionales, para ello deben sembrarse en condiciones de cultivo que aseguren por un lado, el suministro de los sustratos adecuados y por otro el mantenimiento de las condiciones físicas óptimas, que nos ayuden a obtener un crecimiento satisfactorio. Los factores físicos que más influyen en este aspecto y sobre los cuales se debe mantener un control preciso, son: temperatura, pH, concentración de azúcares, luz y concentración de sales. La temperatura influye sobre las reacciones metabólicas que cada microorganismo realiza, de manera que cada especie se desarrolla mejor en ciertos rangos de temperatura. Así tenemos que los microorganismos que crecen a temperaturas menores de 20°C se denominan psicrófilos. En el otro extremo encontramos a los que crecen a temperaturas mayores de 45°C y se denominan termófilos. Y por último, los que crecen en rangos de 20 a 45°C y se les llama mesófilos. En los rangos, los extremos superior e inferior se designan como temperaturas máxima y mínima de crecimiento respectivamente, sin embargo los microorganismos se desarrollan mejor a un valor específico de temperatura que se designa entonces como temperatura óptima de crecimiento. Según el pH al que se desarrollan las bacterias se clasifican en acidófilos cuando crecen en un rango de pH entre 1 y 5; neutrófilos cuando crecen entre 5.5 y 8.5 y los basófilos crecen entre 9 y 12. Existen organismos que para su crecimiento necesitan de altas concentraciones de 24

sales y se les denomina

halófilos, mientras otros soportan esas altas concentraciones

denominándose como sal tolerantes, debe entenderse entonces que en el primer caso se refiere a un requerimiento mientras en el segundo es una adaptación a las condiciones de cultivo.

Objetivos a)

Determinar las condiciones óptimas de crecimiento de microorganismos cultivados bajo diferentes variables de temperatura, pH, concentración de sal y de azúcar.

b)

Determinar las diferencias en los parámetros anteriores de acuerdo al grupo microbiano.

Material Cepas de Pseudomonas sp , Escherichia coli, Candida spp, Staphylococcus aureus Tubos con caldo nutritivo preparados bajo las siguientes variables: a) pH: 2, 5, 7 y 12. b) NaCl: 0.85%, 5.0%, 7.0% y 10%. c) Sacarosa: 2.5%, 5.5%, 10.0% y 20%. d) Normales para incubación a diferentes temperaturas.

Desarrollo 1. Formar un grupo de 16 tubos con caldo nutritivo que contengan las cuatro variables de cada uno de los factores a probar. Estos 16 tubos se emplearán para analizar el comportamiento de una sola cepa. 2. Sembrar una asada de la cepa correspondiente en cada uno de los 16 tubos anteriores. El procedimiento se ilustra en el esquema de abajo. 3. Incubar todos los tubos de pH, NaCl y sacarosa a 37°C durante 24 h. 4. Incubar los tubos con caldo nutritivo preparado normalmente a las siguientes temperaturas: 4, 25, 37 y 45°C durante 24 h. 5. Observando el crecimiento de las cepas sembradas, reporte sus resultados en el cuadro de reporte.

25

CEPA

pH

2

5

7 12

% Sacarosa

% NaCl

2.5 5.5 10 20

0.85 5

Incubar a 37°C / 24 hrs.

Tem eratura en°C

7 10

Incubar por 24 hrs. a 4 25 37 45

6. Para el llenado siga el método de las cuatro cruces. Comparando simultáneamente los cuatro tubos de las variantes de un mismo factor, asigna valores de 1-4 cruces según la turbidez presente en el medio. Donde no exista crecimiento asigne 0. 7. Construye una gráfica para cada factor físico. 8. Determina las condiciones óptimas de crecimiento para las diferentes cepas empleadas con respecto a cada factor valorado. 9. Completa la siguiente tabla

26

Microorganismo

4°C

TEMPERATURA 25°C 37°C

45°C

2

DIFERENTES pH 5 7

12

1 2 Microorganismo 1 2 % NaCl Microorganismo

0.85

5.0

7.0

2.5

% SACAROSA 5.5 10

10.0

1 2 Microorganismo

20

1 2

Cuestionario 1. Menciona un ejemplo de microorganismo psicrófilo, de un mesófilo y de un microorganismo termófilo. 2. Menciona un ejemplo de microorganismo acidófilo, de un neutrófilo y de un microorganismo basófilo. 3. Define: microorganismo aerobio estricto, anaerobio facultativo, anaerobio y microaerofílico. 4. Da un ejemplo de un microorganismo halófilo y de uno sal tolerante. 5. Explica a que se deben las diferencias de crecimiento, si las hay, para los microorganismos sembrados bajo las variantes de cada factor.

27



Práctica No. 8 Efecto de los agentes químicos sobre el crecimiento de los microorganismos Introducción Para el control del crecimiento microbiano o la eliminación total de las poblaciones microbianas podemos emplear sustancias químicas conocidas

como desinfectantes o

antisépticos, que actúan sobre el microorganismo por los siguientes mecanismos:



Ruptura de pared.



Alterando la naturaleza coloidal del protoplasma.



Alterando la permeabilidad.



Inactivando enzimas.



Desnaturalizando proteínas.



Disminuyendo la tensión superficial. Entre los agentes químicos empleados tenemos: ácidos, bases, jabones, detergentes,

alcoholes, metales pesados y colorantes. El término desinfectante está restringido a las sustancias que son aplicadas sobre superficies. La acción desinfectante se ve aumentada por la temperatura y la concentración. Un método que permite evaluar la acción de los agentes químicos sobre el crecimiento microbiano es el de difusión en disco, consiste en impregnar un disco de papel filtro con una cantidad determinada del agente químico a probar y colocarlo sobre una superficie de agar en la cual se ha distribuido un inóculo del microorganismo, se formará por difusión del agente químico un gradiente de concentración alrededor del sensidisco y la sensibilidad del

28

microorganismo estará indicada por el tamaño de la zona de inhibición del crecimiento bacteriano. El gradiente se forma aproximadamente en 6 horas y la zona de inhibición dependerá del equilibrio entre la difusión del agente y la velocidad de crecimiento del microorganismo.

Objetivo Observar el efecto de diversos agentes químicos sobre el crecimiento de los microorganismos y determinar la diferente susceptibilidad de los organismos.

Material Placas con agar nutritivo Hisopos estériles Discos de papel filtro impregnados con los siguientes agentes: a) Agentes surfactantes: benzal, jabón, detergente y sales biliares b) Metales pesados: merthiolate c) Desinfectantes: Cloro, yodo d) Colorantes: cristal violeta, safranina e) Antibióticos Pinzas Cepas de microorganismos

Desarrollo 1. Ajustar el inóculo a 0.5 de densidad en SSI con un densitómetro. 2. Con la disolución, sembrar las placas con agar nutritivo en forma masiva, empleando hisopos estériles con cada uno de los microorganismos proporcionados, en 3 diferentes direcciones y alrededor de la placa (ver fig. 5 y 6)

Fig. 5. Esquema para estriado masivo

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Crecimiento Papel filtro impregnado con agente químico

microbiano

Halo de inhibición del crecimiento bacteriano

Fig. 6. Halos de inhibición

3. Empleando pinzas flameadas en el mechero, colocar adecuadamente discos de papel filtro, impregnados con el agente químico a probar. La distancia entre cada disco no debe ser menor a 2 cm. Debido a que la difusión del disco comienza instantáneamente después de apoyado sobre el agar, éstos no deben levantarse para cambiarlos de lugar. 4. Incubar todas las placas a 37°C durante 18-24 h. 5. Hacer lectura midiendo en mm el diámetro de los halos de inhibición alrededor de los discos de papel filtro impregnados con el agente químico. 6. Menciona si crecieron igual los diferentes microorganismos frente a los diferentes agentes químicos. Explica a que crees que se deban las diferencias si las hay. 7. Completa el siguiente cuadro registrando los resultados de cada cepa.

30

Nombre de la cepa: Agente químico

Tamaño de halo de inhibición

Sensible (S), Intermedio (I) o Resistente (R)

Cuestionario 1. Menciona, ¿a qué se le llama halo de inhibición? 2. Indica la importancia de estandarizar el inóculo. 3. Indica a ¿cuántas UFC/mL corresponde 0.5 de densidad? 4. Explica, ¿qué indica el diámetro del halo de inhibición? 5. Menciona un método para realizar un antibiograma y menciona su utilidad.

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Práctica No. 9 Crecimiento de microorganismos gramnegativos en diferentes medios de cultivo Introducción El grupo de bacterias Gramnegativas incluye una amplia variedad de tipos bacterianos. Se encuentran en ambientes como el suelo, mucosas de diversos hospederos como parte de su flora normal o hasta contaminando alimentos. Independientemente de su respuesta a la tinción de Gram, los microorganismos poseen complejidad bioquímica y fisiológica con características que se hacen evidentes al emplear medios de cultivo de composición química especial, que ponen de manifiesto alguna propiedad metabólica. Las bacterias Gramnegativas, enterobacterias y algunos no fermentadores como Pseudomonas crecen en diversos medios de cultivo como Mac Conkey, Salmonella-Shigella,

Verde Brillante, Sulfito de Bismuto, Eosina Azul de Metileno, Xilosa-Lisina-Desoxicolato entre otros; todos estos medios comparten la característica de ser medios selectivos porque contienen diferentes inhibidores que permiten en diferente medida el crecimiento de los gramnegativos e inhiben a las bacterias Grampositivas y son diferenciales porque permiten distinguir alguna característica bioquímica importante para su identificación.

Objetivo Manejar los medios de cultivo adecuados para bacterias Gramnegativas e interpretar los cambios bioquímicos presentados en ellos.

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Material Placas de Petri preparadas con los medios de cultivo: Mac Conkey, EMB, Verde Brillante y Sulfito de Bismuto. Mechero Bunsen Asa bacteriológica Cepas de bacterias Gramnegativas

Desarrollo 1. Sembrar por el método de estría cruzada cada uno de los medios, con la cepa seleccionada. 2. Incubar las placas sembradas a 37°C por 18-24 h. 3. Hacer la lectura detallando el tipo de crecimiento en cada uno de los medios sembrados y determinar el medio de cultivo óptimo para el aislamiento de cada cepa. 4. De los medios utilizados en la práctica llena el siguiente cuadro Medio

Tipo de medio

Indicadores

Vire del indicador (pH)

ácido

neutro

básico

Inhibidores

Fuente de carbono fermentable

5. ¿Qué indica el vire del indicador en los medios empleados? 6. Dibuja las placas antes y después de inocular

Cuestionario 1. Menciona la característica de la pared celular de las bacterias Gramnegativas. 2. Da 5 ejemplos de microorganismos Gramnegativos. 3. ¿Qué componentes deben estar presentes en un medio de cultivo? 4. Menciona el fundamento del Mac Conkey. 5. ¿Qué otros medios de cultivo, diferentes a los empleados en esta práctica, pueden ser utilizados para el crecimiento de gramnegativos?

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Práctica No. 10 Crecimiento de microorganismos Grampositivos en diferentes medios de cultivo Introducción El grupo de bacterias Grampositivas comprende un espectro muy amplio de tipos morfológicos, la mayoría son heterótrofos que crecen como saprófitos viviendo de materia orgánica muerta. Las bacterias Grampositivas generalmente abundan en el suelo aunque un número importante de ellas son patógenos de plantas y animales. Un número menor de las bacterias Grampositivas son autótrofas y producen ácido acético a partir de dióxido de carbono e hidrógeno. Dentro de las bacterias Grampositivas también se ha descrito un grupo fotosintético, las heliobacterias. Las bacterias Grampositivas contienen mayor cantidad de péptidoglucano que las bacterias Gramnegativas, y sus paredes carecen de lipopolisacárido, componente característico en las Gramnegativas. Entro de las bacterias Grampositivas de interés médico se encuentran los cocos Grampositivos de los géneros Streptococcus y Staphylococcus que crecen en medios enriquecidos principalmente.

Objetivo Manejar los medios de cultivo adecuados para bacterias Grampositivas e interpretar los cambios bioquímicos presentados en ellos.

Material Placas de Petri preparadas con los medios de cultivo: Sal y Manitol; Agar sangre de carnero y Agar Chocolate. Mechero

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Asa bacteriológica Cepas de cocos Grampositivos

Desarrollo 1. Sembrar por el método de estría cruzada cada uno de los medios, con la cepa proporcionada por el profesor. 2. Incubar las placas sembradas a 37°C por 18-24 h. 3. Hacer la lectura detallando el tipo de crecimiento en cada uno de los medios sembrados y determinar el medio de cultivo óptimo para el aislamiento de cada cepa. 4. Para el caso del medio Agar sangre de carnero, determinar el patrón de hemólisis presentado por cada cepa de acuerdo al siguiente criterio: 

Alfa-hemólisis: parcial aclaramiento alrededor de la colonia con decoloración verde en el medio.



Beta-hemólisis: zona de completo aclaramiento debido a la lisis total de los glóbulos rojos.



Gamma-hemólisis: no hemólisis.

5.- De los medios utilizados llenar el siguiente cuadro: Medio

Tipo de medio

Indicadores

Vire del indicador (pH)

ácido

neutro

básico

Inhibidores

Fuente de carbono fermentable

Cuestionario 1. Menciona las características principales de la pared celular de las bacterias Grampositivas 2. Menciona 5 ejemplos de bacterias Grampositivas 3. ¿Qué otros medios de cultivo, diferentes a los empleados en esta práctica, pueden ser utilizados para el crecimiento de Grampositivos? 4. Menciona el fundamento del sal y manitol e indica el grupo bacteriano que crece en este medio. 5. Investiga otros medios utilizados para el crecimiento de Grampositivos.

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Práctica No. 11 Observación de morfología colonial Introducción Las muestras sembradas en los medios adecuados y bajo las condiciones ambientales óptimas crecerán como un agregado macroscópico de muchas e idénticas células provenientes de una, formando una colonia en la superficie de un medio de cultivo “sólido”. Una vez aisladas las

colonias los pasos a seguir para llegar a la identificación del tipo bacteriano son: a)

Determinar las características de la morfología colonial.

b)

Determinar la pureza de las cepas por medio de tinciones.

c)

Observación de cambios alrededor de las colonias, que reflejan alguna actividad metabólica.

d)

Realizar pruebas metabólicas diferenciales.

Morfología colonial, ver figura 7. Las características que determinan la morfología colonial son: 1.

Tamaño de las colonias en milímetros.

2.

Color de las colonias.

3.

Forma: puntiforme, circular, irregular, filamentosa

4.

Elevación: plana, elevada, convexa, pulvinada, umbonada

5.

Superficie: lisa, rugosa, granular

6.

Aspecto: húmedo, seco.

7.

Bordes: enteros, ondulados, filamentosos

8.

Luz reflejada: brillante o mate.

9.

Luz transmitida: opaca, translúcida, transparente.

10. Consistencia: suave (butirosa, mucoide o friable) o dura.

36

Fig. 7. Diferentes morfologías coloniales

Objetivo Aprender a leer la morfología colonial.

Material Mechero. Asas bacteriológicas. Placas sembradas con diferentes microorganismos.

Desarrollo 1. Identifique las características morfológicas de las colonias crecidas en los diferentes agares. 2. Realiza la tinción de Gram y dibuja tu observación. 3. Completa la siguiente tabla:

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Característica 1. tamaño (mm) 2. color 3 Forma: puntiforme circular irregular 4. elevación: plana elevada convexa pulvinada umbonada 5. superficie: lisa rugosa 6. aspecto: húmedo seco 7. bordes: enteros irregulares filamentosos 8. luz reflejada: brillante mate 9.luz transmitida: opaca translúcida transparente 10. consistencia: butirosa mucoide friable Dura

Agar:

Agar:

Agar:

Agar:

Cuestionario 1. ¿Se presentó la misma morfología en los diferentes medios de cultivo?, si hubo variaciones explica ¿a qué crees que se deban? 2. ¿Qué entiendes por el término butirosa? 3. ¿Qué entiendes por el término friable? 4. ¿Cuál es la importancia de realizar la morfología colonial de las bacterias? 5. ¿Por qué crees que varía el tamaño de las colonias bacterianas?

38



Práctica No. 12 Pruebas bioquímicas Introducción El aislamiento de bacterias de productos biológicos es un procedimiento de rutina en un laboratorio clínico, que tiene como finalidad encontrar al agente causal de algún cuadro infeccioso. El éxito del aislamiento de bacterias depende en un principio de la correcta toma de la muestra, que deberá ser representativa del estudio deseado (exudado faríngeo, coprocultivo, urocultivo, exudado de herida, exudado ótico, hemocultivo, cultivo de líquido cefalorraquídeo, etc.), el siguiente paso es la selección de los medios de cultivo adecuados, que deberán ser selectivos, diferenciales y/o enriquecidos dependiendo de los microorganismos buscados. Una vez que se obtienen los cultivos puros, el siguiente paso, generalmente para la identificación de los microorganismos son las pruebas metabólicas o pruebas bioquímicas, las cuales se basan en la determinación de enzimas, productos finales del metabolismo, etc. Dichas pruebas son características de cada género y especie, para esto se siembra a los microorganismos en medios que contienen un sustrato específico, un indicador de pH, y los nutrientes necesarios para su crecimiento (en algunas ocasiones es necesario agregar algunos reactivos al medio donde se ha desarrollado el microorganismo para visualizar la reacción bioquímica).

Objetivos Conocer el fundamento de las pruebas metabólicas

Material Tubos con agar TSI 39

Tubos con agar LIA Tubos con agar MIO Tubos con agar Citrato Tubos con agar Urea Reactivos para la prueba de Catalasa Reactivos para la prueba de Oxidasa Colorantes de Gram Portaobjetos Asa bacteriológica Mechero Microscopios Cepa a estudiar

Desarrollo Pruebas metabólicas Al término de la incubación pasar a la identificación de bacterias de interés médico, para lo cual se utilizarán las pruebas metabólicas o bioquímicas, de la siguiente manera: 1. Realizar tinción de Gram. 2. Con la ayuda de un aplicador estéril tomar una colonia de interés y colocarla en un portaobjetos con una gota de peróxido de hidrógeno al 10% (prueba de catalasa). 3. De igual forma hacer prueba de oxidasa. 4. Con el asa bacteriológica estéril en punta tomar una colonia y depositarla en el tubo con agar TSI. 5. Con la misma asa sin esterilizar sembrar los tubos con el resto de las bioquímicas. Poner atención a las indicaciones del maestro para la siembra de estos tubos. 6. Rotular e incubar a 37°C por 18-24 h. 7. Leer e interpretar las pruebas bioquímicas. Para la lectura de producción de indol agregar una gota de reactivo de Kovac’s, (apóyese en la siguientes

identificación de enterobacterias). 8. Completa la siguiente tabla

40

tablas para la

Prueba bioquímica

Indicador

Fuente de carbono

Pruebas a realizar

TSI

LIA

MIO

Citrato

Urea

Catalasa

Oxidasa

41

Todas las posibles lecturas

Dibujo del medio sin inocular

42

Cuestionario 1. Menciona el mecanismo de las bacterias para utilizar a la lactosa. 2. Indica la reacción de la descarboxilación de la lisina. 3. Menciona a las enterobacterias H 2S positas, móviles y que desaminan la lisina. 4. ¿Qué otro medio de cultivo, diferente al MIO, se puede utilizar para determinar la movilidad? 5. ¿Cuál es la reacción entre el indol y el reactivo de Kovac’s?

43

Manual de Microbiología buap

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