MANUAL de MICROBIOLOGÍA de lo los ALIMENTOS Leeonor Carrillo y M. Carina Audisio L c on la la c ola ola bora bora c ión de
Noemí V. Bejarano, Silvia E. Gómez Molina, E.Gustavo Ancasi y MarceloR.Benítez Ahrendts.
Sa n Sa Sa lvad va d o r d e J ujuy ujuy 2007
Tí Título: ulo: Ma nua nua l de Mi M ic robi ob iología de los los Aliment Alimentos os A utores utores:: Leo Leonor nor Ca C a rrillo, illo, Ma rc ela C a rina ina A udisio, udisio, con la colaboración de Noemí del Valle Bejarano, Silvia Eugenia Gómez Molina, Edgardo Gustavo Ancasi y Marcelo Ra fael fa el Be Beníte níte z A hre hrendts nd ts 1ª edic ed ición, ión, 100 100 ejemplares ejemp lares Impreso por la Asociación Cooperadora de la Facultad de C ienc ias A g ra rias, ias, UNJ UNJ U, SS J ujuy, ujuy, a g o sto 2007 2007 © Leo Leono norr C a rrillo illo
A lber lbe rd i 47, 47, 4600 4600 SS J ujuy, A rg entina ISBN 978-987-05-3214-9 Q ueda ued a hec ho el e l depo de poós ósiito que estab establlec e la Ley 11.72 .723
Carrillo, Leonor Manual de microbiología de los alimentos / Leonor Carrillo y Marcela Carina Audisio ; con colaboración de Noemí del Valle Bejarano ... [et al.]. - 1a ed. - Jujuy : el autor, 2007. 194 p. : il. ; 21x15 cm. ISBN 978-987-05-3214-9 978-987-05-3214-9 1. Microbiología. I. Audisio, Marcela Carina Noemí del Valle, colab. III. Título CDD 616.01
II. Bejarano,
CONTENIDO 1) Seguridad alimentaria 2) Bacterias 3) Mohos 4) Levaduras 5) Virus y parásitos parásitos 6) Calidad analítica 7) Frutas y hortalizas 8) Granos y harinas 9) Micotoxinas 10) Carnes rojas 11) Aves 11) Aves 12) Pescados y mariscos 13) Huevos y ovoproductos 14) Leche y derivados 15) Productos en envases herméticos 16) Agua 16) Agua y bebidas bebidas sin alcohol 17) Hongos comestibles 18) Otros productos Indice de técnicas Indice General
1 19 31 40 47 53 71 84 89 102 117 125 133 140 150 156 167 176 187 191
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SEGURIDAD ALIMENTARIA El sistema de control retrospectivo o a posteriori consiste en la toma de muestras en los lugares de comercialización de los productos y análisis de las mismas para determinar microorganismos patógenos, deteriorantes o marcadores. Esta inspección permite medir el efecto pero no puede prevenir los riesgos. Además para tener datos confiables acerca de un lote, las muestras deben ser obtenidas rigurosamente al azar y el número debe ser elegido de acuerdo con los estudios de distribución de Poisson (1). Por ejemplo en un lote con 0,1% de unidades defectuosas, estas no serán reconocidas con un nivel de probabilidad del 95%, a menos que sean examinadas por lo menos 3.000 muestras (2). También se supone que los microorganismos buscados están distribuidos homogéneamente en el alimento, pero es común la estratificación. La protección adecuada del consumidor solo se puede conseguir mediante la intervención durante el procesamiento de los alimentos. En una planta elaboradora, las buenas prácticas de manufactura y distribución comprenden los procedimientos con los cuales se obtienen productos de calidad microbiológica aceptable, convenientemente controlados mediante pruebas en la cadena de elaboración y de laboratorio. Un código de buenas prácticas debe definir los pormenores del proceso de elaboración que son necesarios para alcanzar este objetivo, por ejemplo materias primas, equipamiento, procedimientos, tiempos, temperaturas, métodos de higiene y desinfección, pruebas de laboratorio (1). La intervención requiere primero la identificación de las prácticas críticas en la totalidad de las líneas de producción y distribución de los alimentos. Las prácticas críticas se definen como aquéllas que presentan riesgos de contaminación y/o multiplicación microbiana (1). Peligro: es el agente biológico, químico o físico presente en el alimento, o bien la condición en que éste se halla, que puede causar un efecto adverso para la salud. Punto crítico: es la fase en la que puede aplicarse un control y que es esencial para prevenir o eliminar un peligro Carrillo L
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relacionado con la inocuidad de los alimentos, o para reducirlo a un nivel aceptable. Riesgo: es una función de la probabilidad de un efecto adverso para la salud y de la gravedad de este efecto, como consecuencia de un peligro presente en el alimento (3). La Comisión del Codex Alimentarius define el sistema de análisis de peligros y control de los puntos (prácticas) críticos (HACCP en sus siglas inglesas) y establece directrices para su aplicación. Los principios del sistema son: o realizar un análisis de los peligros, o determinar las prácticas críticas a controlar, o establecer un límite o límites críticos, o establecer un sistema de vigilancia del control de las prácticas críticas, o establecer las medidas correctivas que han de adoptarse cuando la vigilancia indica que un práctica crítica no está controlada, o establecer procedimientos de comprobación para confirmar que el sistema funciona eficazmente, o establecer pautas de documentación de todos los procedimientos, así como los registros apropiados para estos principios y su aplicación (3). La finalidad del sistema HACCP es lograr que el control se centre en los puntos críticos, aplicándolo a cada operación concreta por separado y teniendo en cuenta las repercusiones de las materias primas y otros ingredientes, los procedimientos de elaboración de los alimentos, la función del control de los peligros en los procesos de fabricación, el probable uso final del producto, las categorías de los consumidores y las pruebas epidemiológicas relativas a la inocuidad de los alimentos (3). El cuadro 1 muestra la secuencia de decisiones para identificar las prácticas críticas y la figura 1 el diagrama de flujo del procesamiento de frutas y hortalizas con el control de las prácticas críticas. La aplicación de los principios del sistema HACCP consta de las siguientes etapas: 1) formación de un equipo multidisciplinario de acuerdo al segmento de la línea de producción involucrado y las categorías generales de peligros que han de abordarse Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 1
3 CUADRO 1. Identificación de los puntos críticos (3).
¿Existen medidas preventivas de control? Si
No
Si
Modificar fase, proceso o producto
¿Se necesita en esta fase por razones de inocuidad? No
No es un punto crítico
Parar y pasar al siguiente peligro identificado
¿Ha sido la fase específicamente concebida para eliminar o reducir a un nivel aceptable* la posible presencia de un peligro? Si
No ¿Podría producirse una contaminación, con los peligros identificados, superior a los niveles aceptables* o éstos podrían aumentar a valores inaceptables*? Si
No
No es un punto crítico
Pasar al siguiente peligro identificado
¿Eliminará una fase posterior los peligros identificados o traducirá su probable presentación hasta un nivel admisible? No
Si
No es un punto crítico
Pasar al siguiente peligro identificado
PUNTO CRÍTICO
*Los niveles aceptables o inaceptables deben ser definidos teniendo en cuenta los objetivos globales.
2) descripción completa del producto, que incluye composición, estructura física y química, tratamientos para la destrucción o inhibición de microbios, envasado, durabilidad, condiciones de almacenamiento y sistemas de distribución 3) determinación del uso al que se destina 4) elaboración de un diagrama de flujo que cubre todas las fases de la operación implicada 5) confirmación in situ del diagrama de flujo Carrillo L
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ejecución de todas las etapas del análisis de peligros, enumerando todos los posibles riesgos relacionados con cada fase y estableciendo las medidas para controlar los peligros identificados, de acuerdo a los principios enumerados antes (3). cosecha recepción lavado
CPC 1 residuos del campo CPC 2 pesticidas, piedras, palos, metal, etc CPC 3 calidad del agua
pelado,descascarado, descarozado, etc separación,clasificación, remoción de los defectuosos selección or calidad blanqueado
CPC 4 calidad del agua, tiempo, temperatura
escurrido llenado cierre del envase calentamiento
CPC 5 nivel de llenado, sello, vacío CPC 6 tiempo y temperatura de calentamiento y enfriado
enfriado rotulado empaquetado
al depósito
FIGURA 1. Diagrama de flujo y control de las prácticas críticas (4).
Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 1
5 ESTRUCTURA DEL ANÁLISIS DE RIESGO Evaluación del riesgo o identificación del peligro o caracterización del peligro o evaluación de la exposición o caracterización del ries o Gestión del riesgo o evaluación del riesgo o valoración de las opciones o implementación de las opciones o control y examen
Comunicación de la seguridad
La identificación del peligro consiste en la determinación de los agentes biológicos, químicos o físicos, capaces de causar efectos adversos en la salud y pueden estar presentes en un alimento o grupo de alimentos en particular. En el caso de los agentes microbianos, se identifican los organismos patógenos y/o sus toxinas (1). Identificación del peligro o ¿es un problema? o ¿hasta qué punto? o ¿cuáles son los detalles del problema?
Evidencia de la vinculación entre el alimento y el patógeno con la enfermedad humana Investigación epidemiológica Bases de datos de vigilancia nacional Investigación microbiológica Evaluaciones del proceso Estudios clínicos (2).
La caracterización del peligro es la evaluación cuali o cuantitativa de la naturaleza de los efectos adversos para la salud (gravedad y duración) asociados con el mismo. Cuando se evalúan los riesgos microbiológicos, el interés está centrado en los microbios y sus toxinas. Carrillo L
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En este caso los factores a tener en cuenta son la fisiología y la virulencia del organismo, la evolución de la infección y la susceptibilidad del individuo, y cuando es posible se realiza una evaluación ‘dosis-respuesta’ (1). Caracterización del peligro o ¿cuán grave es la enfermedad? o ¿cuán larga es? o ¿es posible llevar a cabo un análisis ‘dosis-respuesta’?
Parámetros de virulencia del patógeno Factores del alimento que pueden proteger a los microorganismos, por ejemplo un alto contenido en grasas incrementa la resistencia a la acidez gástrica Factores de sensibilidad o resistencia del hospedador Características de la población (2).
Dosis respuesta o ¿cómo está vinculada la infección o intoxicación con la cantidad ingerida?
Investigación de las epidemias Estudios en animales Ensayos de alimentos humanos Gravedad y duración de las secuelas (2).
La evaluación de la exposición es la apreciación cuali o cuantitativa de la posibilidad de ingestión con los alimentos, de agentes biológicos, químicos o físicos adversos para la salud. Hay que tener en cuenta la frecuencia o probabilidad de contaminación por los organismos patógenos y su prevalencia hasta el consumo, además de la cantidad de alimento ingerida diariamente (1). Evaluación de la exposición o ¿cuántos organismos son ingeridos por el consumidor? o ¿con qué frecuencia?
Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 1
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Fuentes, frecuencia y cantidad de la contaminación, además una estimación de la probabilidad y cuánto será consumido Distribución, desarrollo, inhibición, desde la contaminación primaria a través del procesamiento, la manipulación, la venta al por menor y las prácticas del consumidor Estudios de crecimiento, modelos predictivos Datos del fabricante del alimento Datos de vigilancia del alimento (proceso primario y venta minorista) Datos de enfermedad animal o zoonosis Composición del alimento (pH, aw, contenido de nutrientes, presencia de sustancias antimicrobianas, microbiota competitiva) Demografía de la población Patrones de consumo (2).
La caracterización del riesgo es una estimación cuali y/o cuantitativa de la posibilidad de la ocurrencia del peligro y de la gravedad de los efectos adversos para la salud, conocidos o potenciales, en una determinada población, basada en la identificación del peligro, la caracterización del mismo y la evaluación de la exposición (1). Caracterización del ries o
magnitud del riesgo? ¿Qué individuos o grupos están en riesgo? ¿Cuán graves son los impactos adversos por las exposiciones probables? ¿Cuál es la evidencia y cuán intensa es? ¿Cuál es la incertidumbre sobre la naturaleza del riesgo? ¿Cuál es el rango de criterios sobre la naturaleza y la probabilidad del riesgo? ¿Cuán confiable es la predicción de los gestores del riesgo? (1) La gestión del riesgo es el proceso de ponderar, a la luz de los resultados de la evaluación del riesgo, los criterios,
¿Cuál es la naturaleza y
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alternativas u opciones posibles y, si corresponde, de elegir y poner en funcionamiento las opciones de control apropiadas, incluyendo medidas reglamentarias y normas legales (2). La comunicación de la seguridad es el intercambio entre las partes implicadas (evaluadores y gestores del riesgo, consumidores y otros interesados) de la información y las opiniones sobre la inocuidad de los alimentos. Como ninguna actividad humana, incluyendo el comer y el beber, está libre de peligros, el riesgo “cero” es una utopía. La estimación de los riesgos para la salud es con frecuencia poco exacta. Sin embargo, pueden utilizarse datos de precisión limitada si se manejan convenientemente, para apoyar o refutar los temores tanto de los consumidores como de los responsables de la salud pública (1). La evaluación holística cuantitativa del riesgo se basa en pronósticos del caso peor e incluyen todas las situaciones potencialmente peligrosas a lo largo del proceso. Cuando muestra un peligro inaceptable, es imperativa una recomendación para la gestión del riesgo y, después de puesta en práctica esta recomendación, su eficacia debe ser validada para asegurar que se logró el nivel de riesgo fijado tan bajo como sea necesario y razonablemente alcanzable (1). Las medidas de gestión del riesgo necesarias después del análisis del mismo pueden suponer a menudo gastos considerables, pero éstos deben ser sopesados frente a los beneficios asociados, como el evitar las enfermedades y la mortalidad, y la prevención de la ansiedad injustificada del público (5). El análisis del riesgo es la metodología que siguen los gobiernos y la Comisión del Códex Alimentarius para la fijación del nivel, deseable y alcanzable, de protección de los consumidores. Para trasladarlo a la práctica, este nivel de protección se traduce en objetivos de seguridad alimentaria que a su vez, las empresas de alimentos deben esforzarse en conseguir, empleando los procedimientos y medios más apropiados (2). OBJETIVOS DE SEGURIDAD ALIMENTARIA
Los objetivos de seguridad alimentaria (OSA) se concretan en la fijación del nivel máximo de un peligro microbiológico, Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 1
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químico o físico, que se considera como aceptable en un alimento para que pueda ser consumido. Este máximo nivel de un peligro potencial aceptable como requisito de seguridad, debe ser la exigencia mínima que las industrias de alimentos se deben proponer y conseguir, si bien pueden aspirar a fijarse otras metas más exigentes. Aunque los OSA parecen similares a los criterios microbiológicos, difieren en varios sentidos y no son aplicables a los lotes individuales ni especifican planes de muestreo, número de unidades analizadas, etc. Por ejemplo, un OSA para alimentos enlatados con baja acidez puede ser establecido así: la probabilidad de la presencia de un endosporo viable de Clostridium botulinum será tan baja como 10-12 por lata, y esto es verificable por la medición del tiempo y la temperatura (5). Los OSA definen el nivel de control que se espera para una operación y puede ser satisfecho mediante la implementación de las buenas prácticas de manufactura y distribución, y el sistema HACCP. Además, pueden traducir la meta de salud pública en un nivel de control medible, de acuerdo al cual son diseñados los procesos para que el alimento resultante sea aceptable. También permiten a las autoridades de control comunicar a la industria qué se espera de los alimentos elaborados en operaciones conducidas adecuadamente y establecen la rigurosidad bajo la cual el sistema de control de los alimentos puede operar, por especificación de un peligro microbiológico cuya concentración no podrá ser excedida en el momento del consumo u otro parámetro (5). CRITERIOS MICROBIOLÓGICOS
Los criterios, límites, normas o estándares, también llamados valores, rangos o intervalos de referencia, constituyen el instrumento de medida para juzgar la seguridad y la calidad microbiológica de los alimentos procesados y de las comidas elaboradas en el momento de la comercialización, así como de los ingredientes y materias primas. Los criterios no pueden separarse de las líneas de producción, a lo largo de las cuales deben conseguirse tales atributos mediante la intervención del sistema HACCP (1). Entre las características cualitativas obligatorias de los criterios se encuentra un pequeño número de microorganismos Carrillo L
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de mayor significado ecológico, definidos taxonómicamente: especie, género, familia (2). Los rangos numéricos tienen que ser estimados a partir de estudios exploratorios de los productos específicos procedentes de las líneas de fabricación, almacenamiento y distribución en las que se haya comprobado previamente que se cumplen las buenas prácticas de producción y distribución, por ejemplo las publicadas por la Comisión del Codex Alimentarius, y deben incluir las tolerancias necesarias por la distribución heterogénea de los microorganismos buscados y por la variabilidad intrínseca de las técnicas de recuento y detección de los microbios. Los métodos utilizados tienen que ser tan simples como sea compatible con la exactitud y precisión exigidas, basados en procedimientos normalizados de trabajo y serán utilizados en los estudios prospectivos para establecer los criterios. Por otra parte, la introducción de una metodología mejorada precisa un ajuste de los valores de referencia previamente adoptados. La estrategia retrospectiva, tomada del aseguramiento de la calidad química que consiste en el análisis de los productos finales, no es útil para el caso de los peligros microbiológicos (1). PLANES DE MUESTREO
El valor objetivo m para los microorganismos no patógenos debe estar algo por encima del 95% de los recuentos. El valor M es el límite de la calidad tolerable bajo ciertas condiciones y debe estar muy alejado de los niveles de colonización en los que es inminente la alteración manifiesta o la enfermedad segura después de la ingestión. En la zona comprendida entre m y M solo estará comprendida una fracción de las muestras c/n, donde n es el número de unidades analíticas y c el número de las mismas que pueden presentar valores entre m y M . Por tanto esta interpretación de los datos del estudio exploratorio se denomina plan de tres categorías (5). En los casos que el análisis del riesgo revela un margen excesivamente reducido entre los niveles de colonización observados y los correspondientes a la colonización “inocua”, o bien que algunos recuentos exceden M , deben ser reconsideradas las prácticas de fabricación y distribución. En la estimación de los valores de m y M se incluyen: Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 1
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los límites entre los cuales se puede controlar el sistema de tratamiento del alimento o el efecto previsto de las condiciones después del tratamiento, transporte, almacenamiento y distribución, sobre la microbiota o el efecto de la preparación culinaria normal sobre la composición de la comunidad microbiana o el efecto sobre los grupos de consumidores más sensibles que probablemente ingieran el producto o el grado de estratificación o distribución heterogénea de la colonización en el alimento o el límite de confianza del método de examen microbiológico utilizado, que incluye el muestreo, el método de dilución, el diluyente y el método de recuento (1). La proporción M /m puede variar entre 3 y 103, pero suele ser conveniente 10 con una tolerancia expresada como c/n de 0,2 (1). o
Sin preocupación
Zona de alerta
Frecuencia de los recuentos de colonias
Zona de peligro
95%
m
ufc/g
FIGURA 2. Distribución de las frecuencias de los recuentos de
coloniass en lotes de alimentos que proceden de fábricas que observan buenas prácticas de producción y distribución (1). Carrillo L
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Cuando se trata de microbios patógenos, que generalmente se encuentran en pequeño número en los alimentos, y en el caso particular de organismos deteriorantes de ciertos alimentos procesados, se utilizan los llamados planes de dos categorías. Su finalidad es comprobar si el microorganismo buscado está presente o ausente y el valor que limita ambas categorías es m. El muestreo en este tipo de análisis de alimentos detecta los efectos, mientras que en un trabajo de investigación el muestreo apunta a determinar las causas (5). CUADRO 2. Elección del plan de muestreo (5)
¿Cómo se va a estimar el microorganismo problema? Por pruebas de presencia o ausencia
Por pruebas de recuento
Requieren un plan de dos clases
Se prefiere un plan de tres clases
¿Puede aceptarse la presencia de este microbio en el alimento? No (c = 0)
Si (c > 0)
Elegir n y c para alcanzar la probabilidad deseada
Elegir n Elegir n y c para alcanzar la probabilidad deseada
El Comité Internacional de Especificaciones Microbiológicas en Alimentos (ICMSF) categoriza los tipos de peligros microbiológicos y las condiciones a las cuales estará expuesto un lote de alimento. Esto ayuda en el momento de elección de un plan de muestreo. Los peligros son definidos: 1. no directo para la salud, produce alteración y afecta la vida útil 2. peligro para la salud o bajo e indirecto moderado y directo, pero limitado a los o consumidores del alimento moderado y directo, que puede originar una o epidemia o grave y directo (5). Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 1
13 CUADRO 3. Probabilidad de aceptación de los lotes según los planes de
muestreo con dos y tres clases de atributos (5) Plan de muestreo n
5
10
c 0 1 2 3 0 1 2 3
2 clases 0,77 0.98 1,00 1,00 0,60 0,91 0,99 1,00
5% > m 3 clases % > M 0 5 0,77 0,77 0.98 0,77 1,00 0,77 1,00 0,77 0,60 0,60 0,91 0,60 0,99 0,60 1,00 0,60
2 clases 0,33 0,74 0,94 0,99 0,11 0,38 0,68 0,88
20%> m 3 clases % > M 0 10 0,33 0,33 0,74 0,53 0,94 0,58 0,99 0,59 0,11 0,11 0,38 0,24 0,68 0,32 0,88 0,34
20 0,33 0,33 0,33 0,33 0,11 0,11 0,11 0,11
CUADRO 4. Planes de muestreo sugeridos para combinaciones de
gravedad del peligro y condiciones de manipulación que sufrirá el alimento antes del consumo (5). Grado de peligrosidad relativo a la utilidad y salud No directo para la salud, afecta a la utilidad Bajo e indirecto Moderado, directo y limitado Peligro para la Moderado, directo y salud potencialmente extenso Grave y directo
Carrillo L
Condiciones que reducen la gravedad del peligro
Condiciones que no cambian la gravedad del peligro
Condiciones que aumentan la gravedad del peligro
3 clases, n= 5, c =3
3 clases, n=5, c =2
3 clases, n=5, c =1
3 clases, n=5, c =3
3 clases, n=5, c =2
3 clases, n=5, c =1
3 clases, n=5, c =2
3 clases, n=5, c =1
3 clases, n=10, c =1
2 clases, n=5, c =0
2 clases, n=10, c =0
2 clases, n=20, c =0
2 clases, n=15, c =0
2 clases, n=30, c =0
2 clases, n=60, c =0
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El cuadro 2 se refiere a la elección del plan de muestreo, el 3 a la probabilidad de aceptación de un lote y el 4 resume los planes de muestreo sugeridos para distintas circunstancias. Para determinar los criterios o valores de referencia, se deben usar los mismos métodos que se emplearán más tarde para evaluar la conformidad de las partidas de alimentos, y deben ser descriptos con exactitud en los procedimientos operativos normalizados con el fin de evitar discrepancias en los resultados de distintos laboratorios. Una vez adoptada una técnica, periodicamente se realizará el análisis de muestras de referencia o de muestras contaminadas artificialmente. Otro problema es aconsejar sobre el destino del lote cuando las muestras no satisfacen los criterios microbiológicos. Esto requiere disponer de toda la información relevante sobre el producto, tanto de carácter tecnológico como analítico y microbiológico. Los factores implicados son la gravedad del defecto, es decir las características de los microbios hallados en cantidades excesivas, y el grado en que son superados los límites. También son importantes el valor del producto y la disponibilidad de un alimento alternativo (1). Por ejemplo, cuando se detectan niveles excesivos de microbios deteriorantes inofensivos, puede ser posible acortar la vida comercial, o que el alimento sea vendido congelado en vez de refrigerado. Muchas veces un lote puede ser sometido a un nuevo tratamiento o reprocesado. En algunos casos, con las precauciones adecuadas, se podría usar para alimentar animales. Pero cuando se ha detectado un riesgo grave para la salud, el lote debe ser destruido por incineración. Sin embargo, la toma de estas decisiones cae fuera de la competencia del microbiólogo, pues su deber es aportar resultados fidedignos y garantizar que se proporciona información clara al personal de producción y distribución (1). Los cuadros 5 y 6 muestran las bacterias, virus y parásitos agrupados según la gravedad del peligro. MARCADORES
Índice. Microorganismo o grupo de microorganismos marcadores, cuya presencia y nivel en un alimento permite deducir la suerte de otro microbio o grupo de microbios de Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 1
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importancia, cuando se ven afectados por el procesamiento dirigido a eliminarlos o inhibirlos. Indicador. Microorganismo marcador cuya detección o presencia en un alimento, a niveles determinados, demuestra que el proceso de elaboración y/o distribución no ha sido controlado adecuadamente (1). CUADRO 5. Microbios agrupados según la gravedad del peligro (6)
Peligro grave
Peligro moderado, difusión potencialmente extensa
Peligro moderado, limitado
Clostridium botulinum tipos A, B, E, F y G
Listeria monocytogenes
Bacillus cereus
Shigella dysenteriae
Shigella spp.
Campylobacter jejuni
Salmonella typhi, S. parathyphi serotipos A y B
Salmonella spp.
Clostridium perfringens
Escherichia coli enterohemorrágico
Virus de la hepatitis A y E Brucella melitensis, Brucella abortus Vibrio cholerae O1
Otros Escherichia coli enterovirulentos Streptococcus pyogenes Rotavirus Grupo del virus Norwalk
Staphylococcus aureus Vibrio cholerae no O1 Vibrio parahaemolyticus Yersinia enterocolitica
Vibrio vulnificus CUADRO 6. Parásitos agrupados según la gravedad del peligro (6)
Peligro moderado, difusión potencialmente extensa
Peligro moderado, limitado
Entamoeba histolytica
Giardia lamblia
Diphyllobothrium latum Ascaris lumbricoides Cryptosporidium parvum
Taenia saginata
Carrillo L
Peligro grave Taenia solium
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La familia Enterobacteriaceae se divide en dos grupos uno que no fermenta la lactosa o lo hace muy lentamente, y otro que la fermenta de manera rápida, entre estos últimos se encuentran los géneros Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Erwinia y Klebsiella. Las enterobacterias en conjunto suelen utilizarse como indicadores, porque si se los encuentra en los alimentos procesados por el calor, pone de manifiesto una falla o defecto en el tratamiento, ya que este tipo de alimentos no debería contener bacterias no esporuladas. Escherichia coli, especie con cepas enteropatógenas, también es un organismo índice, pues su presencia puede indicar la existencia de bacterias patógenas relacionadas desde el punto de vista ecológico. Los límites numéricos de los microorganismos indicadores se determinan mediante estudios prospectivos en productos elaborados, almacenados y distribuidos según las buenas normas de manufactura y distribución (6). Las pruebas de presencia ausencia para marcadores adecuadamente seleccionados puede suplementar y eventualmente sustituir, la búsqueda directa de los patógenos transmitidos por los alimentos en productos que han recibido un procesamiento de seguridad. Los experimentos de laboratorio deberán siempre validarse utilizando condiciones industriales. La cuantificación de los organismos índices se expresa como rangos mínimos que se relacionan con los límites tolerables seguros. Estos rangos mínimos se pueden obtener de los datos empíricamente evaluados, específicos para cada alimento, que reciben el nombre de determinantes ecológicos o factores épsilon (ε). Por ejemplo, si en un producto determinado existen 10 ufc/g del patógeno y 10 4 ufc/g de Enterobacteriaceae, el factor ε será 104/10 = 103. Entonces si el límite tolerable seguro para el patógeno es < 10 -2 /g, el rango mínimo tolerable del indicador será de 10 1/g (1). Se usan como indices a E. coli, Enterobacteriaceae, y en menor grado Enterococcus spp. y el grupo coli-aerogenes (coliformes). Las pruebas convencionales no proporcionan una evidencia confiable de que no existe riesgo alguno de contaminación vírica de los alimentos y el agua (7). Esto ha llevado a la introducción del uso de bacteriófagos, por ejemplo Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 1
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los de Bacteroides fragilis y E. coli, como marcadores de la supervivencia de los virus entéricos en los vehículos de contagio ambientales (8). TRAZABILIDAD
La trazabilidad es un conjunto de medidas, acciones y procedimientos que permiten registrar e identificar cada producto alimenticio desde su origen hasta su destino final, considerando el origen y calidad de sus componentes, los procesos aplicados y la distribución del mismo. Comenzó como un sistema para identificar el momento en que un organismo genéticamente modificado se introduce en la cadena de producción y distribución, y se ha generalizado para otros alimentos, por ejemplo carnes y miel (9). CUADRO 7. Resistencia intrínseca de los alimentos a la colonización microbiana (1). CRECIMIENTO MICROBIANO
ilimitado amplio limitado restringido prácticamente ausente
EJEMPLOS
carne, aves y alimentos marinos, frescos y refrigerados leche pasterizada, frutas y hortalizas refrigeradas no dañadas embutidos cocidos en envoltura intacta, refrigerados alimentos fermentados y conservados en vinagre, productos con aw < 0,90 alimentos con esterilización comercial, alimentos desecados hasta a w < 0,60
REFERENCIAS 1. Mossel DAA et al. 2003. Microbiología de los Alimentos. 2° ed. Acribia, Zaragoza, p 341, 375. 2. Downes FP, Ito K. 2001. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4° ed, APHA, Washington, p 13, 267. 3. Codex Alimentarius. 1999. Higiene de los Alimentos. Textos Básicos. FAO, Roma, p 45. 4. Goulg WA. 1997. Fundamentals of Food Processing and Technology. CTI Publications, Maryland, p. 60. 5. ICMSF. 2002. Microorganisms in Foods. Vol. 7. Kluwer Academic/ Plenum, New York, cap. 7, 8.
Carrillo L
18 6. 7. 8. 9.
Doyle MP et al. 1997. Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers. ASM, Washington, p 66. Formiga Cruz M et al. 2003. Appl Environ Microbiol 69: 1556-1563. Bower PA et al. 2005. Appl Environ Microbiol 71: 8305-8313. http://es.wikipedia.org/wiki/Trazabilidad
Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 1
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BACTERIAS Los alimentos son alterados por diferentes géneros bacterianos y a su vez, pueden servir como vehículo de patógenos o sus toxinas. Se conoce como microbiota dominante a los microorganismos que causan la descomposición bajo las condiciones normales de almacenamiento. Identificar al organismo que ha producido una infección o intoxicación alimentaria o generado el deterioro del alimento, es una tarea laboriosa y compleja (1). CUADRO 1. Bacterias frecuentemente halladas en los alimentos (2).
Alimentos
Carnes rojas y aves
Carnes procesadas
Huevos y subproductos Pescados y mariscos Leche Frutas y hortalizas Zumos de frutas y hortalizas Cereales y harinas
Audisio MC
Microorganismos Acinetobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Campylobacter, Corynebacterium, Enterobacteriaceae, Flavobacterium, Kocuria, Listeria, Micrococcus, Moraxella, Pseudomonas, Psychrobacter, Shewanella, Vagococcus Acinetobacter, Bacillus, Brochothrix, Clostridium, Enterococcus, Lactobacillus, Pseudomonas, Proteus, Staphylococcus, Weissella Acinetobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Enterobacter, Escherichia, Flavobacterium, Micrococcus, Pseudomonas, Proteus, Salmonella, Serratia, Staphylococcus Aeromonas, Moraxella, Pseudomonas, Proteus, Psychrobacter, Shewanella, Vibrio Alcaligenes, Bacillus, Clostridium, Flavobacterium, Lactobacillus, Micrococcus, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus Bacillus, Corynebacterium, Clostridium, Paenibacillus, Pantoea, Pectobacterium, Pseudomonas, Streptomyces Acetobacter, Lactobacillus, Pediococcus, Streptococcus Bacillus
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Las bacterias se estudian por métodos que combinan técnicas de resurrección o preenriquecimiento, aislamiento en medios de cultivos comunes o selectivos, e identificación a través de pruebas bioquímicas. Estos análisis permiten, en la mayoría de los casos, determinar el género bacteriano involucrado y algunas especies. Sin embargo, ciertos organismos muy próximos filogenéticamente precisan de técnicas complejas de biología molecular, para poder distinguir uno y otro. CUADRO 2. Valores mínimos de pH, temperatura y actividad de agua para el crecimiento de algunas bacterias (2, 3).
Bacterias Aeromonas Bacillus Clostridium Escherichia Lactobacillus Listeria Pseudomonas Plesiomonas Salmonella Shigella Staphylococcus Vibrio Yersinia
pH mínimo aw mínima ºC mínimo − 0,5 6,0 0,97 4,4 - 4,9 0,91 - 0,95 7 4,6 - 5,0 0.94 - 0,97 3,3 - 10 4,4 0,95 7-8 3,0 - 3,4 0,93 2-6 − 0,4 4,4 0,92 5,0 0,97 0-4 4,0 0,96 8 3,8 0,94 5,2 4,9 - 5,0 0,96 6,1 - 7,9 4,0 0,86 7 4,8 - 5,0 0,94 - 0,96 5 - 10 − 1,3 4,2 0,96
En general, las bacterias de interés alimentario se pueden cultivar con facilidad y su morfología y/o movilidad se determina por la simple observación de una preparación en fresco, con el microscopio óptico a 1.000 aumentos. Las diferentes técnicas de tinción (Gram, endosporos, flagelos) brindan mayor información sobre el microorganismo en estudio. Los parámetros fisiológicos usados comúnmente en la identificación del agente bacteriano son la tolerancia al oxígeno y la temperatura, la formación de pigmentos, la producción de catalasa y oxidasa, la acción sobre la glucosa por vía oxidativa o fermentativa y otra actividad enzimática (1).
Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 2
21 BACTERIAS GRAM-NEGATIVAS
Los bacilos Gram-negativos, catalasa-positivos, son los agentes más importantes en el deterioro de los alimentos y al mismo tiempo los patógenos más relevante de origen entérico transmitidos por alimentos. CUADRO 3. Alimentos que comúnmente vehiculizan agentes de toxiinfecciones (2).
BACTERIAS
Bacillus cereus Campylobacter jejuni Clostridium botulinum Clostridium perfringens Escherichia coli Listeria monocytogenes Salmonella spp. Staphylococcus aureus Vibrio spp Yersinia enterocolitica
P C E A A S R V C N E A E S D S O S −
L E C H E
H U E V O S
V E D G U E L T C A E L S E S *
E N L A T A D O S **
−
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+
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± ± + + + + +
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± ±
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−
+
+
+ + ± ± + ±
+
−
−
−
−
±
+ +
* hortalizas, granos y harinas, ** hortalizas, carnes, leche en polvo Bacilos oxidasa-negativos fermentadores
Dentro de las enterobacterias se destaca el género Salmonella. Se las considera como una única especie llamada Salmonella enterica con seis subespecies y diversos serotipos, por ejemplo S. enterica serovar Typhimurium; S. enterica serovar Enteritidis; S. enterica serovar Gallinarum biovar pullorum, que se resumen como S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Gallinarum y S. Pullorum (4). Estas serovariedades son patógenos para las aves. Las enfermedades producidas por Salmonella en el hombre son gastroenteritis ( S. Enteritidis, S. Typhimurium y otras) fiebre tifoidea (S. Typhi) y fiebre paratifoidea ( S. Paratyphi),
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éstas últimas transmitidas a través del agua o alimentos contaminados con heces humanas. Las salmonelas, debido a su carácter altamente ubicuo, también pueden ser aisladas de hortalizas, frutas, semillas, especias, alimentos elaborados, bebidas, leche cruda, quesos, agua, moluscos, peces, crustáceos, etc (3). Los organismos fermentadores de lactosa ( Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Pectobacterium ) son marcadores de defectos en el procesamiento térmico de los alimentos elaborados. Una bacteria asociada con el deterioro de hortalizas es Pectobacterium carotovora. Algunos serotipos de Escherichia coli son patógenos, por ejemplo E. coli O157:H7. Yersinia enterocolítica provoca una fiebre entérica y las especies de Shigella son responsables de la disentería bacilar (1). Bacilos oxidasa-negativos no fermentadores
Los bacilos aeróbicos, no acidúricos pues no crecen por debajo de pH 4,5, por ejemplo Acinetobacter, forman parte de las bacterias que causan la alteración de los alimentos proteicos frescos, almacenados en frío, como carne, pescado y ovoderivados. Los bacilos acidúricos oxidantes de los géneros Acetobacter y Gluconobacter, tienen un rol muy importante en la alteración de bebidas alcohólicas y de frutas pues oxidan el etanol (1). Bacilos oxidasa-positivos no fermentadores
En este grupo se encuentran Alcaligenes (móvil), también Psychrobacter y Flavobacterium (inmóviles) que participan en el deterioro de carnes bajo refrigeración y algunos vegetales. Este último género se caracteriza por la producción de pigmentos amarillos a rojos (2). Pseudomonas presenta flagelos polares. Varias especies de este género son psicrotolerantes y por lo tanto, tienen un efecto importante en el deterioro de alimentos conservados a temperaturas de refrigeración como huevos frescos, carne, pescado y leche. Sin embargo, Pseudomonas aeruginosa es un organismo mesófilo patógeno que a veces se puede encontrar en los alimentos, el suelo y el agua. Algunas especies de Pseudomonas y Burkholderia deterioran vegetales (3). Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 2
23
crece anaeróbicamente en presencia de Fe++ y causa el enverdecimiento de las carnes envasadas al vacío (2). Shewanella
putrefaciens
Bacilos oxidasa-positivos fermentadores
En este grupo se incluyen los géneros Vibrio, Aeromonas, Photobacterium y Plesiomonas. Las especies de Aeromonas suelen ser psicrotolerantes y heterofermentadoras, están asociadas con la alteración de alimentos proteicos frescos cuando el desarrollo de los organismos aerobios obligados está limitado, por ejemplo en los productos envasados al vacío. Plesiomonas deteriora pescados y mariscos. Varias especies de Vibrio son patógenas. Vibrio cholerae produce el cólera y Vibrio parahaemolyticus causa gastroenteritis (3). Campylobacter jejuni causa enteritis transmitida por alimentos con las aves como principal vehículo. Una especie relacionada es Helicobacter pylori que está asociado con gastritis y úlceras péptica y duodenal (2). BACTERIAS GRAM-POSITIVAS Bacilos catalasa-negativos, no esporulados, inmóviles
Las especies de Lactobacillus pueden ser anaerobias facultativos o microaerófilas. Se las divide en homo fermentativas si degradan glucosa produciendo sólo ácido láctico, y hetero-fermentativas si forman una mezcla de ácido láctico, CO2, etanol y/o acetato. El ácido láctico disminuye el pH del medio e inhibe el desarrollo de otras bacterias, favoreciendo adaptabilidad a diferentes hábitats. Son frecuentes en la leche fresca, ovoproductos, canales de mamíferos y de aves antes de su almacenamiento (5). Carnobacterium se encuentra en pescados, canales de aves y carnes rojas envasadas al vacío (2). Bacilos catalasa-negativos, esporulados
El género anaeróbico Clostridium altera con frecuencia alimentos que han sido sometidos a calentamiento. Los clostridios productores de ácido butírico pueden crecer a bajas temperaturas y ocasionan deterioro en algunos quesos. Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum es un organismo termofílico que deforma los envases de hojalata.
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24 Clostridium sporogenes produce putrefacción, Clostridium butyricum y Clostridium tertium causan el deterioro butírico y Clostridium bifermentans genera sulfuro de hidrógeno (3). Clostridium botulinum sintetiza una toxina letal en
alimentos con pH ≥ 4,5 y es esta toxina la causa directa de la enfermedad conocida como botulismo. Otra especie patógena es Clostridium perfringens que produce enteritis cuando se encuentra en un número elevado en el alimento (6). Bacilos catalasa-positivos, esporulados
El género Bacillus es un agente de alteración de alimentos que han sido sometidos a calentamiento. Bacillus coagulans y Geobacillus stearothermophilus alteran los productos enlatados acidificando el contenido (7). Bacillus cereus causa enteritis o gastroenteritis cuando se encuentran en un número elevado en el alimento (1).
Bacilos catalasa-positivos, no esporulados
En este grupo se encuentran Corynebacterium, Kurthia y Arthrobacter. Las corinebacterias pueden causar daños en las hortalizas frescas. Microbacterium participa en la alteración de productos cárnicos curados y las especies termodúricas pueden ser detectados en un número apreciable en los productos pasteurizados (lácteos y ovoderivados). Brochothrix thermosphacta se encuentra con frecuencia en la superficie de la carne fresca. Corynebacterium diphteriae y Listeria monocytogenes pueden ser transmitidos por los alimentos. Este último es uno de los pocos patógenos psicrotróficos (1). Cocos catalasa-negativos
En este grupo se encuentran Enterococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus y Aerococcus. Los Enterococcus son de interés en higiene de alimentos como organismos marcadores. Son relativamente termodúricos y pueden sobrevivir en la leche pasteurizada (1). Weisella tiene la propiedad de sintetizar exopolisacáridos a partir de los hidratos de carbono presentes en la leche, bebidas fermentadas o azúcar ocasionando su deterioro por la aparición de una filancia no deseada. Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 2
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es psicrotrófico y Aerococcus termodúrico, por lo que puede sobrevivir en los productos pasteurizados (3). Pediococcus
Cocos catalasa-positivos
Dentro de este grupo se encuentran los géneros Staphylococcus y Micrococcus. Una diferencia entre estos dos géneros es que los estafilococos no crecen a temperaturas inferiores a 7ºC y por lo tanto no causarían problemas en alimentos adecuadamente refrigerados. Numerosas cepas de Staphylococcus aureus producen una potente enterotoxina (1). Micrococcus y Kocuria ocasionan alteraciones en las carnes curadas y en algunos alimentos con baja actividad de agua, por ejemplo leche condensada (2). TINCIÓN DE GRAM
Tomar con un asa una porción de cultivo bacteriano, depositarlo sobre una gota de agua y hacer un extendido sobre un portaobjetos. Dejar secar y fijar por calor. Ponerlo sobre un soporte y cubrirlo con una solución de violeta cristal. Luego de 1 minuto agregar solución de iodo. Después de 1 minuto, lavar con agua. Decolorar con alcohol 96°. Lavar con agua y cubrir con una solución de safranina durante 1 minuto. Lavar con agua y secar. Colocar una gota de aceite para inmersión. Llevar el portaobjetos a la platina de un microscopio. Mirar a través del objetivo de bajo aumento (10x) y una vez enfocado el objeto mover el revólver para colocar el objetivo de inmersión en aceite (100x). Levantar el condensador acercándolo a la platina. Ajustar el enfoque mediante el tornillo micrométrico. Regular la cantidad de luz por medio del diafragma. Las bacterias Gram-negativas se tiñen de rojo anaranjado y las Gram-positivas adquieren color violeta . VIOLETA CRISTAL. Disolver
1 g de colorante en 20 mL de etanol 96° y añadir 80 mL de oxalato de amonio al 1%. SAFRANINA. Disolver 0,25 g de colorante en 10 mL de etanol 96° y agregar 90 ml de agua. SOLUCIÓN DE YODO . Mezclar en un mortero 1 g de iodo y 2 g de ioduro de potasio, disolver con 100 mL de agua (8).
BACTERIAS TOLERANTES
Algunos microorganismos han desarrollado una fuerte resistencia a factores abióticos y por ejemplo, son capaces no Audisio MC
26
sólo de sobrevivir sino de multiplicarse en condiciones de presión osmótica elevada, temperatura alta o baja, o valores de pH y presión de oxígeno extremos. TINCIÓN DE FLAGELOS
Dejar correr una gota del cultivo líquido de 12-18 horas, sobre un portaobjetos nuevo, limpio y tibio. Secar al aire. Mezclar en el momento de usar: 2 mL de alumbre de potasio al 12%, 1 mL de ácido tánico al 20%, 1 mL de agua, 1,5 mL de etanol 96° y 0,3 mL de fucsina básica al 6% en etanol 96°. Volcar de inmediato sobre el portaobjetos y dejar 10 minutos. Lavar con agua. Las bacterias y los flagelos se tiñen de color rojo. Se puede inferir la motilidad de las bacterias al observar su desplazamiento rápido a través del campo microscópico cuando se enfoca una gota de cultivo reciente, colocada entre porta y cubreobjetos (8). TINCIÓN DE ENDOSPOROS
Cubrir el extendido fijado por calor, con verde de malaquita al 2%. Calentar hasta emisión de vapores, dejar enfriar y volver a calentar 3 ó 4 veces más. Lavar con agua. Cubrir con safranina al 0,25% durante 1 minuto. Lavar con agua y secar. Los endosporos se tiñen de verde y las células somáticas de color rojo anaranjado (8). PRUEBA DE LA OXIDASA
Tomar parte de una colonia con una fina varilla de vidrio y frotar un trozo de papel de filtro humedecido previamente con una solución acuosa de clorhidrato de tetrametil-parafenilen-diamina al 1% recién preparada. La aparición de un color púrpura intenso en 5 segundos indica que la prueba es positiva (1). PRUEBA DE LA CATALASA
Colocar una gota de peróxido de hidrógeno al 3% sobre un portaobjetos. Tomar con un asa material del cultivo y mezclar. La formación inmediata de burbujas indica desprendimiento de oxígeno debido a la enzima (1).
Varias bacterias patógenas halladas en los alimentos, como Salmonella, Shigella, E. coli enterovirulento, Campylobacter, Bacillus cereus, Clostridium perfringens y Staphylococcus Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 2
27 aureus,
son termotróficas porque tienen temperaturas críticas (mínima-óptima-máxima) varios grados más elevadas si se las compara con los otros organismos mesófilos (1). PRUEBA DE OXIDACIÓN-FERMENTACIÓN
Sembrar por picadura profunda dos tubos con medio de cultivo. Sobre uno de los tubos, verter una capa de 2 cm de agar-agua estéril fundido y enfriado hasta 45ºC, tomando las precauciones para evitar la contaminación. Incubar a 30ºC durante 48 hs. Observar la formación de ácido o gas. (para Gram-negativos). Triptona 2 g, extracto de levadura 1 g, glucosa 10 g, cloruro de sodio 5 g, fosfato dipotásico 0,2 g, azul de bromotimol 0,08 mg, agar 15 g, agua 1 litro, pH 7,1. Disolver los ingredientes y distribuir en tubos formando una columna de 10 cm. Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos y después dejar solidificar en posición vertical. AGAR GLUCOSA PURPURA (para Gram-positivos). Triptona 10 g, glucosa 5 g, púrpura de bromocresol 0,04 g, agar 15 g, agua 1 litro, pH 7,0. Disolver los ingredientes y distribuir en tubos formando una columna de 10 cm. Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos y después dejar solidificar en posición vertical (1). AGAR GLUCOSA DE HUGH Y LEIFSON
REDUCCION DE NITRATOS
Calentar a ebullición el tubo de caldo nitrato durante 2 minutos. Enfriar sin agitar y sembrar. Incubar a 35ºC durante 24-48 horas. Agregar 0,5 mL del reactivo de Griess A y 0,5 mL del B. La aparición de un color rosado dentro de los 10 minutos indica la presencia de nitritos. Triptona 20 g, fosfato disódico 2 g, glucosa 1 g, agar 1 g, nitrato de potasio 1 g, agua 1 litro. Distribuir en tubos y esterilizar a 120ºC durante 15 minutos. REACTIVO DE GRIESS. A. Ácido sulfanílico 0,8 g, ácido acético glacial 30 mL, agua 75 mL; B. Alfa-naftilamina 0,5 g, ácido acético glacial 30 mL, agua 75 mL (4). CALDO NITRATO.
Algunas bacterias no esporuladas tienen una resistencia térmica más alta y sobreviven a 60 - 80ºC. Se los llama termodúricos, por ejemplo Enterococcus bovis, Micrococcus luteus, Microbacterium sp, que suelen encontrarse en la leche pasterizada (4) .
Audisio MC
28 CUADRO 4. Pruebas corrientes para la identificación de bacterias (9). PRUEBA
PRINCIPIO
USO MÁS COMÚN
Catalasa
Descompone el H2O2
Citrato (única fuente de C)
Alcalinización del medio
Coagulasa
Coagulación del plasma sanguíneo
Bacillus(+); Clostridium, Streptococcus, Micrococcus y Staphylococcus (−) Klebsiella, Enterobacter y Salmonella (+); Escherichia y Edwardsiella (−) Staphylococcus aureus (+) S. epidermidis (−)
Liberación de CO2 y amina
Diferenciación de bacterias entéricas
Producción de ácido fenil-pirúvico
Identificación de Proteus y Providencia
Producción de ácido y/o gas
Diferenciación de bacterias entéricas
Descarboxilasas de lisina, ornitina o arginina Desaminación de fenil-alanina Fermentación de azúcares y polialcoholes β-galactosidasa
Hidrólisis de almidón
Hidrólisis de o-nitrofenil-β-galactosido dando nitrofenol amarillo La solución I2 – I- da azul con almidón
Hidrólisis de gelatina
Licuación del gel de gelatina al 12%
Indol
Conversión del triptofano en indol
Oxidaciónfermentación
Producción de ácido
Oxidasa
Citrocromo c oxida aceptor artificial de electrones
Citrobacter y Arizona (+); Salmonella (−) Bacillus spp.
Identificación de Serratia, Pseudomonas, Flavobacterium, Clostridium Klebsiella, Enterobacter y Salmonella (−); Escherichia y Edwarsiella (+) Aerobiosis: Micrococcus, Pseudomonas
Anaerobiosis: bacterias entéricas, Staphylococcus Moraxella, Aeromonas y Pseudomonas (+); Acinetobacter y bacterias entéricas ( −)
Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 2
29 PRUEBA
Producción de H2S (negro con Fe+++) Reducción de nitrato Rojo de metilo
PRINCIPIO
Reducción de tiosulfato o descomposición de aminoácidos azufrados Aceptor de electrones alternativo, reducido a NO2- o N2 pH < 4,3 por fermentación ácida mixta
Ureasa
Descomposición de urea en 2 NH3 + CO2
Voges-Proskauer
Formación de acetoína por fermentación de glucosa
USO MÁS COMÚN
Identificación de Salmonella, Arizona, Edwarsiella, Proteus
Bacterias entéricas (comúnmente +) Escherichia (+, rojo) Klebsiella y Enterobacter (−) Klebsiella y Proteus (+); Escherichia y Providencia (−) Enterobacter y Klebsiella (+); Escherichia (−) Identificación de Bacillus
La mayoría de las bacterias psicrófilas son Gram-negativas y se encuentran en ambientes donde la temperatura está siempre por debajo de 15 a 20ºC, mientras que las psicrotrofas crecen en ambientes donde la temperatura fluctúa. La mayoría de los psicrófilos hallados en alimentos son especies de Aeromonas, Alcaligenes, Flavobacterium, Pseudomonas, Serratia y Vibrio. Los Gram positivos son especies de Bacillus, Clostridium y Micrococcus. Aún cuando pueden crecer a 0ºC, lo
hacen lentamente y a menudo tardan varias semanas para formar las colonias. Entre las bacterias psicrotrofas que producen deterioro en los alimentos refrigerados se destacan: Acinetobacter, Brochothrix, Enterobacter, Lactobacillus, Lactobacillus, Microbacterium, Microbacterium, Moraxella, Psychrobacter, Shewnella . Ciertos patógenos como Clostridium botulinum tipo E y tipos no proteolíticos B y F, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica y algunas cepas de Bacillus cereus crecen lentamente a temperaturas inferiores a 5ºC (2).
En los pescados y mariscos con 1 a 4% de sal se encuentran Photobacterium, especies halotolerantes de Acinetobacter, Photobacterium, Pseudomonas, Shewanella, Vibrio, y las carnes curadas con 1 Audisio MC
30
a 7% de sal contienen bacterias Gram-positivas, por ejemplo bacterias lácticas, Enterococcus y Micrococcus. La mayoría de las bacterias implicadas en el deterioro de alimentos con 5 a 20% de sal son especies de Bacillaceae y Micrococcaceae (4). (4). REFERENCIAS 1. Mossel DAA et al. 2003. Microbiología de los Alimentos. 2ª ed. Acribia, Zaragoza, p 15, 599, 634, 637. 2. Jay MJ et al. 2005. Modern Food Microbiology. 7ª ed. Springer, New York, p 13. 42, 36. 3. Doyle MP et al. 1997. Food Microbiology. ASM Press, Washington, p 101, 129, 228, 305. 4. Downes FP, Ito K, eds. 2001. Compendium of methods for the microbiological examination of foods. 4ª ed. APHA, Washington, p. 159, 167, 187, 357. 5. Sharpe ME 1981. En: The Prokaryotes. Vol ll. Starr MP et al., eds. Springer-Verlag, Berlin, p 1653. 6. ICMSF. 1996. Microorganismos de los Alimentos. Vol. 5: Características de los Patógenos Microbianos. Acribia, Zaragoza, p 7. ICMSF. 1998. Microorganisms in food. Vol 6: Microbial Ecology of Food Commodities. Blackie Academic & Professional, London, p 131. 8. Collins CH et al. 1999. Microbiological Methods. 7ª ed. ButterworthHeinemann, Oxford, p 102. 9. Madigan MT et al. 2004. Brock - Biology of Microorganisms. 10ª ed. Pearson - Prentice Hall, p 812.
Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 2
31
MOHOS Los hongos se agrupan en el reino Fungi. Son organismos heterotróficos y osmotróficos, con quitina o quitosano en la pared celular. Los oomicetos, cuya pared contiene celulosa, se encuentran en el reino Straminipila (1). Si un hongo es filamentoso se llama moho y cuando es una célula aislada se dice levadura. Los filamentos que constituyen el micelio reciben el nombre de hifas. Las hifas pueden estar separadas en secciones generalmente multinucleadas por medio de septos perforados, o bien carecer de éstos. La pared celular del micelio de los mohos semeja un extenso sistema tubular por el que avanza el citoplasma para su dispersión y búsqueda de nutrientes. Los mohos se reproducen asexualmente en la mayoría de los casos y las estructuras sexuales sólo aparecen cuando las circunstancias son favorables o se encuentran micelios de distinta polaridad. Los hongos anamórficos generan esporas asexuales por mitosis, que tienen diversa forma y son mono o pluricelulares. La morfología corte de de las estructuras que producen las esporas es muy variable. El color de la mayoría de los mohos se debe a sus esporas asexuales, las que suelen desarrollarse en el extremo de unas estructuras espe-cializadas que se extienden en el aire a partir del micelio, conocidas como esporóforos. Las esporas pueden estar encerradas en un esporangio o ser externas (conidios). Los conidióforos generan esporas solitarias o en cadena. A veces están agrupados en un haz (coremio) o sobre un conjunto de hifas entrelazadas (acérvula, esporodoquio) o dentro de un conidioma (picnidio) (2). Carrillo L, Bejarano NV
32 esporodoquio
Un esporangio es una estructura comúnmente globosa con una membrana simple que contiene innumerables esporas, generalmente en el extremo de un esporóforo. Cuando los esporangios tienen pocas esporas se llaman esporangiolos o merosporangios. Las estructuras de resistencia son las células de pared gruesa llamadas clamidosporas y los esclerocios que están formados por un conjunto macroscópico de hifas apelmazadas como un tejido. Los mohos suelen reproducirse también a través de las esporas sexuales (teleomórficos). Los oomicetos producen oosporas y los zigomicetos forman zigosporas de paredes gruesas y obscuras. Ambas son esporas de reposo (2).
Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 3
33
Los ascomicetos producen sus esporas sexuales (ascosporas) dentro de ascos, generalmente ubicados en un cuerpo fructífero llamado ascoma. Los ascomas tienen forma de copa (apotecio) o son cuerpos cerrados (cleistotecio) o abiertos por un ostiolo (peritecio), y se encuentran aislados o reunidos sobre un estroma. Los basidiomicetos desarrollan sus esporas sexuales (basidiosporas) sobre los basidios que se hallan en un cuerpo fructífero denominado basidioma, comúnmente de gran tamaño y entonces se llaman setas, o bejines si son redondos. Muchos oomicetos son saprobios del suelo o el agua, pero algunas especies son parásitas de plantas y peces. Los zigomicetos son hongos saprobios comunes en el suelo. Ambos grupos tienen un micelio sin septos. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA
Suspender el material depositado sobre un portaobjetos, en agua, líquido de montar, lactofenol o azul de algodón. Con ayuda de dos agujas separar los filamentos y colocar un cubreobjetos. LACTOFENOL. Disolver 20 g de fenol en 20 mL de agua, agregar 20 mL de ácido láctico y 40 mL de glicerol. AZUL-LACTOFENOL. Disolver 0,1 g de azul de algodón (= azul de anilina) en 100 mL de lactofenol. LÍQUIDO DE MONTAR. Mezclar 50 mL de acetato de potasio al 2% en agua, con 20 mL de glicerina y 30 mL de etanol 96º (1).
Los ascomicetos y los basidiomicetos tienen filamentos tabicados y son saprobios comunes del suelo o están asociados con plantas como simbiontes o patógenos. Unos pocos ascomas y basidiomas son comestibles. La mayoría de los mohos corrientemente presentan la fase asexual (2).
Carrillo L, Bejarano NV
34 ALGUNOS GÉNEROS (3, 4) Acremonium. Forma
conidios mucosos, reunidos en el ápice del conidióforo. Micelio hialino.
Acremonium sp.
Tiene color oscuro a negro, conidios multiseptados . Alternaria.
Alternaria alternata
Forma cadenas de conidios sobre una dilatación del conidióforo, con diversos colores, algunas especies xerofílicas presentan cleistotecios. Aspergillus.
A. ochraceus
A. parasiticus
A. niger
Esporas sésiles sobre cualquier parte del micelio hialino u oscuro. Aureobasidium.
Aureobasidium ullulans
Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 3
35 Botrytis. Micelio gris,
conidióforos largos, ramificados, conidios unicelulares en racimos.
Botrytis sp. Paecilomyces variotii
Byssochlamys ( anamorfo Paecilomyces).
Conidióforos ramificados en pincel, conidios ovoides o cilíndricos en cadenas, en tonos de pardo. Tiene ascosporas termotolerantes.
Micelio oscuro a negro, forma cadenas ramificadas de conidios. Cladosporium.
Colletotrichum.
Conidióforos reunidos en acérvulas, con cerdas oscuras, conidios oblongos, rectos o falciformes.
Cladosporium sp.
Colletotrichum graminicola
Micelio blanco, cadenas ramificadas de esporas unicelulares, color anaranjado. Chrysonilia.
Chrysonilia sitophyla
Micelio blanco, forma aleurias sobre conidióforos simples, es xerófilo. Chrysosporium. Chrysosporium farinicola
Carrillo L, Bejarano NV
36
Conidióforos simples o ramificados, aislados o reunidos en esporodoquios; conidios de dos tipos, unos grandes, tabicados y curvados, otros pequeños, generalmente unicelulares; algunas especies forman clamidosporas. Fusarium.
Fusarium s orotrichioides
F.equiseti
F. verticilloides F. semitectum
Micelio blanco, las hifas se segmentan en artroconidios. Geotrichum.
Geotrichum sp.
Micelio sin septos, esporas en esporangios, algunas especies forman zigosporas. Mucor.
Mucor hiemalis
Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 3
37
Los conidióforos poseen verticilos de ramificaciones. Las esporas tienen siempre algun tono de verde. Penicillium.
P. commune
P. frequentans
P. italicum
P. digitatum
Tiene conidiosporangios limoniformes o elipsoidales sobre esporangióforos cortos o largos. Produce clamidosporas esféricas o subesféricas. Phytophthora.
Phytophthora sp.
Forma esporangios con esporas irregulares y oscuras. Tiene rizoides al pie del esporóforo. Rhizopus.
Rhizopus nigricans
Carrillo L, Bejarano NV
38 Thamnidium .
esporangiolos, temperaturas.
Tiene esporangios y crece a bajas
Trichothecium.
Thamnidium elegans
Conidios sobre un esporóforo que crece al formar cada uno de ellos. Trichothecium roseum
MICROCULTIVO
Colocar sobre un portaobjetos, previamente flameado y enfriado, un trozo de medio gelificado de 1 cm de lado y 2 mm de espesor, tomado de una placa estéril. Sembrar el hongo en los bordes del trozo de agar. Colocar un cubreobjetos, también flameado y enfriado.
Incubar a temperatura ambiente en una cámara húmeda. Después observar los microcultivos con el objetivo 4x y una vez enfocado pasar al objetivo 10x para apreciar la morfología inalterada de las estructuras fúngicas (1).
Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 3
39 IDENTIFICACION DE MOHOS COMUNES
Hacer repiques de un cultivo puro en tres puntos equidistantes de cada placa con los medios: de cultivo e incubar a 25ºC durante 7 dias, excepto el cultivo en agar papa sacarosa (glucosa) que se incuba a la temperatura ambiente con luz solar indirecta. Además repicar en estrías sobre dos tubos de agar malta e incubar uno a 5ºC y el otro a 37ºC. AGAR MALTA . Extracto de malta 20 g, peptona 1 g, glucosa 20 g, agar 20 g, agua destilada 1 litro. Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos. SOLUCIÓN CONCENTRADA DE CZAPEK. Nitrato de sodio 30 g, cloruro de potasio 5 g, sulfato de magnesio 5 g, sulfato ferroso 0,1 g, agua destilada 100 mL. AGAR CZAPEK. Fosfato dipotasico 1 g, solución de Czapeck 10 mL, extracto de levadura 5 g, sacarosa 30 g, agar 20 g, agua destilada 1 litro. Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos. AGAR CZAPEK GLICEROL. Contiene los ingredientes del anterior disueltos en una mezcla de 250 mL de glicerol y 750 mL de agua destilada. Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos. AGAR PAPA SACAROSA (GLUCOSA). Hervir 200 g de papa rallada en 1 L de agua, durante media hora, y completar el volumen a un litro, añadir sacarosa (glucosa) 10 g y agar 20 g. Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos. Observar y registrar el aspecto macromorfológico de las colonias. Hacer preparaciones en fresco. Si es necesario prolongar la incubación (4). Para la identificación consultar las claves en Pitt & Hocking “Fungi and Food Spoilage” o la versión en español de Carrillo “Los Hongos de los Alimentos y Forrajes, capítulo 10” http://www.unsa.edu.ar (material bibliográfico). REFERENCIAS 1. Mueller GM et al. 2004. Biodiversity of Fungi. Elsevier, Amsterdam, apéndice. 2. Kendrick B. 2000. The Fifth Kingdom. 3ª ed. Focus Publishing, Newburyport, cap 2, 3. 3. Barnett H, Hunter B. 1998. Ilustrated genera of imperfect fungi. 4ª ed. APS Press. St. Paul Minnesota. 4. Pitt JI, Hocking AD. 1997. Fungi and Food Spoilage. 2ª ed. Blackie Academic & Professional, London, cap 2, apéndice.
Carrillo L, Bejarano NV
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LEVADURAS Las levaduras son hongos que forman sobre los medios de cultivo colonias pastosas, constituídas en su mayor parte por células aisladas que suelen ser esféricas, ovoideas, elipsoideas o alargadas. Unas pocas presentan hifas. Las dimensiones pueden oscilar de 1 a 9 µm de ancho y 2 a más de 20 µm de longitud según la especie, nutrición, edad y otros factores. Algunos hongos fitopatógenos forman colonias levaduriformes en cultivos axénicos y varios patógenos de animales se presentan como levaduras en los materiales clínicos (1). En general, las células de las levaduras son conidios formados según diferentes tipos de conidiogénesis. En Saccharomyces una célula madre da lugar a la formación de yemas en diferentes puntos de la superficie produciendo en cada uno sólo una célula hija (blastoconidio o blastospora), pero en Rhodotorula o Cryptococcus todos los brotes surgen desde un solo punto. La célula apiculada de Saccharomycodes brota repetidamente de cada extremo, extendiéndose un poco con cada conidio formado. En el caso de Schizosaccharomyces la célula es casi cilíndrica y los conidios tienen una base muy ancha. Las levaduras hifales, como Trichosporon o Geotrichum producen artroconidios (o artrosporas) por formación de septos dobles en las hifas, que luego se escinden (2). Las levaduras pertenecen a dos clases de hongos: ascomicetos o basidiomicetos, aunque muchas de ellas se presentan comúnmente en la forma imperfecta. Las levaduras ascomicéticas forman ascas libres, con 1 a 8 ascosporas, y en las especies hifales las ascas están desnudas. Las ascoporas de las levaduras son algo más resistentes al calor y la desecación que las células vegetativas, si bien tienen mucha menor resistencia térmica que las esporas bacterianas, por lo que mantienen la viabilidad de la especie durante los cambios adversos del medio ambiente (1). El modo de diploidización en las levaduras ascomicéticas se efectúa entre una célula y su brote, como es el caso de Schwanniomyces, Debaryomyces y otras, o puede efectuarse entre dos células independientes, por fusión directa (Schizosaccharomyces) o por medio de un tubo de conjugación Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 4
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(Zygosaccharomyces). En el caso de levaduras estabilizadas en el estado diploide, éste se restaura por conjugación de las ascosporas dentro del asca (Saccharomycodes). En ciertos casos, si el cigoto se reprodce por mitosis, existen en el mismo ciclo las fases vegetativas haploide y diploide ( Saccharomyces ) (2). La figura siguiente muestra un esquema de varios géneros de levaduras (3).
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Entre las levaduras basidiomicéticas se encuentran Filobasidium (teleomorfo de Cryptococcus) que forma hifas con fíbulas, Sporobolomyces que produce esporas exógenas en la punta de una protuberancia de la célula y las descarga con fuerza, y Rhodotorula que, como la anterior, forma un pigmento carotenoide rojo (2). Las levaduras son organismos aerobios y aunque muchas especies son fermentadoras, otras no lo son, como los géneros Cryptococcus y Rhodotorula. Las levaduras suelen fermentar unos pocos glúcidos, principalmente hexosas y disacáridos. El género Saccharomyces y unos pocos más, son fermentadores enérgicos de los azúcares bajo condiciones anaeróbiocas. Dekkera, su anamorfo Brettanomyces y algunas otras, fermentan glucosa más rápido en aerobiosis (4). membranaefaciens, Las levaduras oxidativas, como Pichia membranaefaciens, producen niveles inaceptables de acetaldehído, ésteres y ácido acético en vinos. Las especies fermentativas Z. bailii, Dekkera intermedia y Saccharomycodes ludwigii causan una carbonatación excesiva, sedimento, turbiedad, ácidos y ésteres desagradables. Sólo Schwanniomyces, Lipomyces y Saccharomyces diastaticus pueden hidrolizar almidón. Otras poseen actividad pectinolítica. Muchas especies sintetizan todas las vitaminas necesarias, pero algunas requieren biotina y otros compuestos (5). Las levaduras ‘asesinas’ secretan secretan polipéptidos tóxicos para otras especies de levaduras, aún del mismo género, y además suelen inhibir a otros organismos. Pueden ser contaminantes en la fermentación de mostos, dominando a la cepa industrial para dar un producto espúreo, aunque por otra parte una cepa ‘asesina’ seleccionada seleccionada puede suprimir a las levaduras salvajes indeseables (1). AMBIENTE
Las levaduras se encuentran con frecuencia en las hojas y las flores, aunque en número muy pequeño, siendo los insectos un importante vector de diseminación de las mismas. Están sobre la epidermis de frutas y pueden penetrar a los tejidos subyacentes como resultado de un daño mecánico. El suelo es un importante reservorio, desde el cual pueden llegar a los alimentos, pero también suelen hallarse en el agua de lagos y Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 4
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ríos. Su presencia depende de la temperatura, el pH, la humedad y la disponibilidad de azúcares simples (1). Las levaduras constituyen la causa más común de alteración de frutas y jugos, pues tienen azúcares fermentables y elevada acidez. Comúnmente asociadas con el deterioro de las frutas secas están Zygosaccharomyces rouxii y especies de Hanseniaspora, Candida, Debaryomyces y Pichia. También forman parte de la microbiota de productos lácteos y cárnicos. Las levaduras de las pasturas y suelo de los corrales pueden ser transportadas a los mataderos y de allí a las carcasas. Cryptococcus laurentii, Cryptococcus luteolus, Rhodotorula mucilaginosa y Debaryomyces hansenii suelen hallarse en carcasas de cordero y cerdo. Por otra parte, Schwanniomyces y Lipomyces son géneros típicos del suelo. Las principales especies presentes en los productos lácteos son Kluyveromyces marxianus y D. hansenii, aunque también se encuentran R. mucilaginosa, Yarrowia lipolytica y Candida parapsilosis (4). IDENTIFICACIÓN
La forma no es un indicio para la identificación de las especies, ni la variedad morfológica en un mismo cultivo es una prueba de la contaminación del mismo. El comportamiento fisiológico es muy importante para la identificación. Mientras que las caracterísiticas morfológicas y sexuales permiten generalmente identificar el género, las características bioquímicas definen la especie de la levadura, por ejemplo la utilización de compuestos carbonados (almidón, L-arabinosa, cadaverina, celobiosa, 2-cetogluconato, citrato, eritritol, galactosa, inositol, lactosa, lisina, maltosa, manitol, melibiosa, -metilglucósido, rafinosa, ramnosa, sacarosa, trehalosa, xilosa) y nitrogenados (nitratos), el crecimiento a 37 °C, la fermentación de glucosa y sacarosa, la necesidad de vitaminas, la resistencia a la cicloheximida, la hidrólisis de urea o el desarrollo en presencia de algunos inhibidores (acetato de sodio 1%, cloruro de sodio 16%, glucosa 60%) (4). La identificación sólo puede llevarse a cabo sobre una cepa en cultivo puro, previamente aislada en una placa de medio gelificado. Se comienza examinando el aspecto de los cultivos tras incubación a 28°C durante 3 días o más. Se observa el α
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aspecto del cultivo en medio líquido, la formación de sedimento y su aspecto (fino, grueso), la película superficial y la producción de gas. Se examina el cultivo en el mismo medio con 2% de agar para definir el tamaño de las colonias, la forma (contornos nítidos o irregulares, convexas o cóncavas), la superficie (mate o brillante) y la pigmentación (5). Las características micromorfológicas se estudian sobre preparaciones microscópicas efectuadas en estado fresco. La aptitud para la filamentación se manifiesta en un microcultivo (ver capítulo 3) sobre agar harina de maíz (harina de maíz 30 g, agar 20 g, agua 1 litro (4)) tras una incubación de 3-5 días. Se observa si se trata de pseudomicelio o micelio verdadero, además la abundancia y ramificación. La formación de clamidoconidios (= clamidosporas) es característica de Candida albicans, Metschnikowia y ocasionalmente se puede ver en cultivos viejos de Trichosporon o Cryptococcus. Las balistosporas de Sporobolomyces u otros, al ser proyectadas al aire se acumulan sobre la tapa de la caja de Petri. Para la identificación de las levaduras ascomicéticas es necesario poner en evidencia las ascas y las ascosporas. Al no tener todas las especies las mismas exigencias, se deben utilizar simultáneamente varios medios de esporulación y sembrarlos a partir de un cultivo en fase exponencial (5). El método de identificación simplificado dado por Déak & Beuchat (4) permite la rápida y correcta identificación del 91% de las levaduras, e incluye todas las comunes en los alimentos. Las pruebas de asimilación se llevan a cabo agregando los azúcares al medio base nitrogenado estéril (sulfato de amonio 5 g, fosfato monopotásico 5 g, sulfato de magnesio heptahidratado 0,5 g, agar 20 g, agua 1 litro) y los compuestos con nitrógeno al medio base carbonado (glucosa 10 g, fosfato monopotásico 1 g, sulfato de magnesio heptahidratado 0,5 g, agar 20 g, agua 1 litro). La necesidad de vitaminas se demuestra volcando una gota de una suspensión de células en agua estéril sobre un caldo libre de vitaminas (glucosa 10 g, sulfato de amonio 5 g, fosfato monopotásico 1 g, sulfato de magnesio heptahidratado 0,5 g, agar 20 g, agua 1 litro) y como testigo se emplea el mismo medio adicionado de 10 mL de extracto de levadura al 2% (4). Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 4
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La fermentación se demuestra por el cambio de pH y la retención de gas en el pequeño tubo invertido colocado dentro del medio base (triptona 5 g, extracto de levadura 5 g, agua 1 litro) al que se añadió 2,5 ml de solución etanólica de azul de bromotimol y 20 g de glucosa o sacarosa. Para demostrar el crecimiento a baja actividad agua, alta acidez o la resistencia a la cicloheximida, se agrega al medio base estéril (triptona 5 g, extracto de levadura 5 g, glucosa 5 g, agua 1 litro), 160 g de cloruro de sodio o 600 g de glucosa o 10 mL de ácido acético glacial o 10 mL de una solución de cicloheximida al 1%. La hidrólisis de urea se observa por la alcalinización del medio de cultivo (extracto de levadura 0,1 g, fosfato monopotásico 1 g, fosfato disódico 1 g, urea 20 g, solución de rojo de fenol al 1% 1 mL, agua 100 mL) (4). PRODUCCIÓN DE ASCOSPORAS
A partir de un cultivo de 24-36 hs en agar-malta-levadura sembrar abundante cantidad en la cara superior de un bloc de yeso (2 x 2 x 0,5 cm) colocado en una caja de Petri con agua estéril, también hacer estrías sobre el agar de Gorodkowa y agarpapa-zanahoria. Incubar a temperatura ambiente entre 7 y 20 días. Examinar periódicamente los preparados en fresco con azullactofenol, observar si hay producción de ascas, la forma y facilidad de ruptura, el número y la forma de las ascosporas y su posición en el asca. Extracto de malta 3 g, extracto de levadura 3 g, peptona 5 g, glucosa 10 g, agar 20 g, agua 1 litro. Esterilizar a 120°C durante 15 minutos. AGAR-PAPA-ZANAHORIA. Papa molida 20 g, zanahoria molida 20 g, agar 20 g, agua corriente 1 litro. Esterilizar a 120°C durante 20 minutos. AGAR DE GORODKOWA. Glucosa 1 g, triptona 10 g, extracto de levadura 2 g, agar 20 g, agua 1 litro. Esterilizar a 120°C durante 15 minutos (6). AGAR-MALTA-LEVADURA.
REFERENCIAS 1. 2. 3.
Carlile MJ et al. 2001. The Fungi. 2ª ed. Academic Press, San Diego, p 70. Kendrick B. 2000. The Fifth Kingdom. 3º ed. Focus Publishing, Newburyport, p 112. Salle AJ. 1965. Bacteriología. Gustavo Gili, Barcelona, cap 5.
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46 4. 5. 6.
Déak T, Beuchat LR. 1996. Handbook of Food Spoilage Yeasts. CRC Press, Boca Ratón, cap 7. Leveau JY, Bauix M. 2000. Microbiología Industrial. Acribia, Zaragoza, cap 3. . Mueller GM et al. 2004. Biodiversity of Fungi. Elsevier, Amsterdam, p 595.
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VIRUS y PARÁSITOS VIRUS
Los virus son elementos genéticos que pueden replicarse independientemente de los cromosomas de una célula, pero sólo dentro de la misma. Poseen una forma infecciosa extracelular, que les permite ser transmitidos con facilidad de un hospedante a otro y replicarse por sí mismo mediante una vía destructiva para la célula que lo aloja. En el estado extracelular, un virus es una partícula diminuta metabólicamente inerte que contiene ácido nucleico rodeado de proteína y ocasionalmente, según el virus, otros compuestos macromoleculares. Una vez que el ácido nucleico viral es introducido en una célula, se inicia el estado intracelular y ocurre la replicación del virus mediante la producción de nuevas copias del genoma y la síntesis de los componentes de la cubierta. El genoma viral es muy pequeño y codifica aquellas funciones que no puede adaptar del hospedante. Redirige la maquinaria preexistente en el hospedante para permitir la replicación y ensamblaje de las nuevas partículas virales. Los virus pueden tener ADN o ARN, mono o bicatenario. Unos pocos virus tienen ambos tipos de ácido nucleico, pero en diferentes estadios de su ciclo reproductivo, por ejemplo el de la hepatitis que contiene ADN en la partícula extracelular y un ARN intermediario en la célula (1). Los virus semejantes al Norwalk, pequeños y de estructura redonda, son los agentes más conocidos de los brotes de gastroenteritis transmitida por el agua y los alimentos, enfermedad caracterizada por nauseas, vómitos, diarrea y una duración de 1 a 3 días. El modo común de transmisión es el consumo de alimentos contaminados, por ejemplo mariscos crudos y cocidos, hielo, agua, productos de panadería congelados, varios tipos de ensaladas y alimentos fríos. También pueden ser transmitidos por los manipuladores infectados, asintomáticos o enfermos. El virus de la hepatitis A es transmitido por el agua y los alimentos, a través de la ruta fecal-oral. El período de incubación dura 2 a 6 semanas y la enfermedad comienza con Carrillo L, Audisio MC
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síntomas inespecíficos pero luego aparece ictericia. La gravedad depende de la edad (2). Los enterovirus y poliovirus, los tipo Norwalk y el de la hepatitis A son vertidos al ambiente con la materia fecal. El más peligroso es el poliovirus, cuya forma nativa se considera eliminada en muchas partes de la Tierra. Aunque los virus pueden sobrevivir en el agua por largos períodos de tiempo, son neutralizados fácilmente por los tratamientos de purificación, por ejemplo 0,6 ppm de cloro libre (1). Los virus entéricos son muy estables a pH poco ácido pero muy sensibles a la desecación (2). PARASITOS
Son los organismos que pasan toda o parte de su existencia a expensas del hospedante, causándole o no daño, y con quien tienen una dependencia obligada y unilateral. Entre los parásitos que el hombre puede adquirir a través de la ingestión de la comida y/o el agua, se encuentran los protozoos y helmintos. En el ciclo directo, no es necesaria la presencia de un hospedante intermediario. Puede ser corto si la forma emitida es la infectante, por ejemplo Giardia lamblia, o largo cuando la forma emitida necesita pasar un cierto tiempo en el medio para transformarse en infectante, por ejemplo Ascaris lumbricoides. Los parásitos con un ciclo indirecto requieren un hospedante intermediario y la presencia del mismo en el medio determina la parasitosis, por ejemplo Taenia saginata. Los protozoos son organismos unicelulares que con frecuencia forman quistes o esporos de elevada resistencia. Los protozoos de importancia en los alimentos pertenecen principalmente a las divisiones Sarcomastigophora (Entamoeba histolytica, Giardia lamblia y dinoflagelados) y Sporozoa (Toxoplasma gondii, Cryptosporidium parvum, Sarcocystis spp). Éstos últimos con un ciclo de vida relativamente complejo y fases alternadas de reproducción sexual y asexual. La infección se puede producir por: a) ingestión de los protozoos que se encuentran dentro de los tejidos del alimento a consecuencia natural de su ciclo biológico como los quistes en Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 4
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la carne (endógeno), b) consumo de un alimento contaminado exteriormente por el protozoo (exógeno) (3). Cryptosporidium parvum se transmite como ooquistes, principalmente en el agua de bebida, a partir de animales infectados, de persona a persona y por alimentos contaminados. Causa diarrea profusa y anorexia, pero en humanos saludables la infección se autolimita. C. parvum es inactivado por calor, congelamiento y secado (4). Sarcocystis es un protozoo que tiene dos ciclos distintos de vida. Los animales carnívoros son sus hospedantes definitivos y los herbívoros intermediarios, mientras que en los omnívoros se observan las dos categorías. El hombre puede ser infectado por dos especies, S. hominis presente en la carne vacuna y S. suishominis en la de cerdo, causando diarreas (5). Toxoplasma gondii es intracelular e incapaz de ingerir materia corpusculada, carece de órganos de locomoción o pseudópodos y produce esporos resistentes. Los gatos son los hospedantes definitivos del parásito, el cual se reproduce en el intestino siendo los ooquistes eliminados con la materia fecal. Éstos son infecciosos a las 48 hs de excretados. El hombre se contagia por ingestión de carnes mal cocidas, leche no pasteurizada, huevos crudos y hortalizas mal lavadas (6). Giardia lamblia produce en el hombre una infección gastroenteritis. Los quistes no resisten la desecación ni las temperaturas por encima de los 50ºC, pero en el suelo húmedo a la sombra son viables unos tres meses. Son resistentes a la cloración del agua donde se mantienen viables por dos meses. El hombre es el principal reservorio, pero también parasita a los perros. La vía de transmisión es fecal-oral. Se detectaron más de 40 variedades. Entamoeba histolytica se caracteriza por sus movimientos a través de unas prolongaciones, que se proyectan y retraen en respuesta de estímulos externos. Fuera del organismo el quiste resiste las bajas temperaturas, es resistente a la cloración del agua y en medio húmedo sobrevive de semanas a meses. La vía de transmisión es fecal-oral. Son reservorios animales los perros y roedores. Los helmintos son organismos pluricelulares y los transmitidos por los alimentos pertenecen a los Trematodos (distomas), Cestodos (tenias) y Nematodos (vermes redondos). Carrillo L, Audisio MC
50 CUADRO 1. Parásitos transmitidos por los alimentos y el agua (2).
Alimento
Parásitos
Estado PROTOZOOS
Carne de aves, cabra, cordero, cerdo y vaca
Toxoplasma gondii
quistes en los tejidos
Agua
Cryptosporidium parvum Entamoeba histolytica Giardia intestinalis Toxoplasma gondii
ooquistes quistes quistes ooquistes
CESTODOS
Carne de cerdo Carne de vaca Hortalizas contaminadas
Taenia solium Taenia saginata Taenia serialis Echinococcus granulosus
cisticercos cisticercos huevos huevos
NEMATODOS
Carne de cerdo Pescado Agua Hortalizas contaminadas
Trichinella spiralis Anisakis sp. Ascaris lumbricoides
larvas larvas huevos
Ascaris lumbricoides
huevos
TREMATODOS
Hortalizas contaminadas
Fasciola hepatica
larvas
Los trematodos causan infestaciones intestinales, pulmonares y hepáticas en el hombre. Poseen órganos reproductores masculinos y femeninos en cada individuo, un canal alimentario bien desarrollado y ventosas oral y ventral. Tienen ciclos biológicos complejos, con moluscos como hospedantes intermediarios y hasta seis fases larvarias. Fasciola hepatica es un trematodo con forma de hoja y su hospedador definitivo es la oveja, aunque también se encuentra en la cabra y ganado vacuno. Es transmitido al hombre indirectamente por los vegetales acuáticos como el berro, donde se enquistan, y cuando estos vegetales son ingeridos por el hombre (6). Los cestodos que producen infestaciones intestinales son los cestodos Taenia saginata hospedante intermediario de la vaca y Taenia solium del cerdo. Los huevos se eliminan con la materia fecal y pueden sobrevivir de días a meses en el Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 4
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ambiente. En el intestino del animal, las larvas invaden la pared intestinal y emigran a los músculos estriados, donde se convierten en quistes llamados cisticercos que se presentan como unas ampollas blancas, ovales, pequeñas y llenas de líquido. El congelamiento a -10ºC durante 10 días ó a -15ºC por 6 días destruye los quistes en la carne, así como el calentamiento a más de 56ºC (5). El hombre se infesta con las tenias al ingerir la carne cruda o poco cocinada. En el intestino humano, el quiste se convierte en un parásito solitario que puede sobrevivir por años y alcanza varios metros de largo. La cisticercosis es causada por ingestión de los huevos de Taenia solium y el hombre se comporta como hospedante intermediario. Echinococcus granulosus es un cestodo que provoca la hidatidosis. Se transmite a los perros por las visceras de animales parasitados. Esta enfermedad grave se adquiere por la ingestión de los huevos eliminados en las heces de los perros. En los hospedantes intermediarios, como el hombre, se forman los quistes hidatídicos (5). Los nematodos son vermes cilíndricos, no segmentados, que tienen un intestino tubular y existen dos sexos separados (5). La forma infectante de Ascaris lumbricoides son los huevos producidos por la hembra dentro del intestino humano y eliminados por la materia fecal. Necesitan un período de 2 a 3 semanas para embrionarse y volverse infecciosos en el suelo húmedo. Los parásitos adultos pueden vivir 1 a 2 años en la luz del intestino delgado y una sola hembra suele producir unos 200.000 huevos por día. El hombre puede ser infectado por especies del nematodo Anisakis al consumir pescado crudo o fermentado, cuya larva genera la enfermedad. Alrededor de los 2/3 de los pacientes tienen lesiones gástricas agudas o crónicas. El calentamiento a 60° C o la congelación a –20° C por más de 24 horas destruyen las larvas en el pescado. La triquinosis se adquiere por la ingestión de larvas enquistadas de Trichinella spiralis, presentes carne de cerdo cruda o insuficientemente cocida. Las larvas pueden ser destruídas por cocción de la carne como mínimo a 58ºC o por congelación a -15ºC durante 30 días (6). Carrillo L, Audisio MC
52 REFERENCIAS 1. Madigan MT et al. 2005. Brock-Biology of microorganisms. 10º ed. Prentice Hall, Upper Saddle River, p 231. 2. ICMSF. 1996. Microorganismos de los Alimentos. Características de los Patógenos Microbianos. Acribia, Zaragoza, p 517. 3. Euzéby J. 2001. Los parásitos de las carnes. Acribia, Zaragoza. 4. Mossel DAA et al. 2003. Microbiología de los Alimentos. 2ª ed. Acribia, Zaragoza, p 61. 5. Downes FP, Ito K, eds. 2001. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4º ed, APHA, Washington, p 429, 447. 6. Doyle MP et al., eds. 1997. Food Microbiology - Fundamentals and Frontiers. ASM Press, Washington, p 435,447.
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CALIDAD ANALÍTICA El principal objetivo de un laboratorio es producir datos analíticos de precisión y confiabilidad suficientes en un plazo aceptable y a un costo admisible. La garantía de calidad es el proceso total que asegura la confiabilidad de los resultados de laboratorio. Un programa de garantía de calidad proporciona un registro de seguimiento que asegura la integridad de la muestra, con documentación para verificar que los instrumentos de laboratorio funcionan adecuadamente y que los datos del laboratorio se produjeron según procedimientos normalizados. Esta garantía abarca tanto el control como la evaluación de la calidad (1). Un programa de garantía de la calidad contiene tres elementos esenciales: o Prevención. Comprende una planificación ordenada y una serie de medidas positivas antes y durante los análisis, para asegurar que todos los sistemas analíticos funcionan adecuadamente, por ejemplo la utilización de medios de cultivo estandarizados, la calibración y el mantenimiento de los instrumentos, la formación contínua de los analistas. o Evaluación. Consiste en comprobaciones periódicas del rendimiento mediante el análisis de muestras seleccionadas, usando una metodología validada. Corrección. Abarca las medidas adoptadas para o determinar las causas de los defectos de calidad y restablecer el funcionamiento adecuado de las operaciones analíticas, por ejemplo la reparación de los equipos averiados, la revisión de la metodología, la capacitación del personal (2). La acreditación es un componente de la garantía de calidad y consiste en la auditoría por un agente externo para procurar que el laboratorio se ajuste a ciertos cánones definidos. Un esquema de acreditación debe ser completo, cubriendo todos los aspectos del laboratorio, incluídos organización y administración, formación y actualización del personal, equipamiento y comodidades, procedimientos y criterios (1). Carrillo L
54 LABORATORIO
Aunque el diseño lo hacen los arquitectos o ingenieros, los analistas deben participar en las decisiones que afectarán, finalmente, a su medio de trabajo y las condiciones en que éste se desarrollará. El laboratorio de microbiología no debe ocupar una sola sala polivalente, sino más bien dos o más locales dedicados al almacenamiento del instrumental de vidrio y de los medios deshidratados, la preparación y esterilización de los medios, la descontaminación del material peligroso, la zona de trabajo analítico y el almacenamiento de las muestras a analizar y las ya analizadas que pasan a la reserva. Si los medios, reactivos y los materiales de vidrio se deben almacenar en la misma habitación en que se llevan a cabo los análisis microbiológicos, se guardan en envases herméticos dentro de armarios limpios de polvo, preferentemente con puertas corredizas que permanecen cerradas cuando no es necesario acceder a los mismos. En las paredes pueden colocarse, con el mismo fin, estanterías protegidas por puertas corredizas. Es conveniente utilizar dos autoclaves ubicados a bastante distancia uno de otro, para la esterilización de los medios y la descontaminación del material peligroso, a fin de reducir al mínimo las posibilidades de contaminación mutua. El material de vidrio puede lavarse en el mismo local donde se encuentran los autoclaves. Debe preverse en cada local dos puertas, para facilitar una rápida evacuación en caso de incendio o cualquier otra emergencia. También es conveniente una habitación propia para el personal, por pequeña que sea. Los muros deben pintarse con una pintura impermeable y a prueba de moho, que proporcione una superficie lisa de fácil limpieza. Los suelos deben ser de baldosas resistentes, lisas y que puedan fregarse rápidamente (2). El laboratorio de microbiología debe estar alejado de cualquier lugar en que haya emanaciones de gases o humos. Conviene que esté equipado con aire acondicionado filtrado, porque los ventiladores levantan polvo y pueden ser una causa importante de contaminación. Las ventanas cerradas reducen al mínimo las corrientes de aire que pueden causar Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 6
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contaminación e impiden la entrada de insectos voladores. Si la temperatura del local supera los 23ºC, las estufas de cultivo no funcionan bien así como los medidores de pH (3). Suele ser conveniente la instalación de una campana de ventilación con su propio suministro de gas, agua y electricidad, y la compuerta deberá bajarse hasta el nivel indicado por el fabricante. La eficiencia del sistema de ventilación se debe verificar todos los años. La campana no debe emplearse para el almacenamiento de materiales. La zona de trabajo debe mantenerse despejada para los análisis microbiológicos y no se ha de emplear para almacenar equipo de laboratorio, soportes u otros instrumentos. Debe estar hecha de material no poroso, impermeable y exento de intersticios, empalmes visibles u otras zonas defectuosas en las que puedan crecer los microorganismos, y contar con gas, agua, aire y electricidad. Es conveniente instalar con una campana de flujo laminar (1). Debe haber otras mesadas auxiliares. Algunas piezas del equipo de laboratorio, como por ejemplo el baño agua o la centrífuga, no deben estar en la misma mesada en que se colocan los microscopios o las balanzas (2). Las muestras se reciben, almacenan, manejan y analizan en condiciones ambientales que no afecten desfavorablemente a los análisis. La temperatura, la humedad y la iluminación deben ser adecuados para proteger las muestras, los extractos, el personal y el equipo. Se debe llevar un registro de los resultados del muestreo ambiental en los locales del laboratorio. El control microbiológico de las superficies del laboratorio permite determinar la limpieza de la zona de trabajo y la frecuencia necesaria de dicha operación. La vigilancia microbiológica del aire sirve para verificar la eficacia de los filtros de aire y la frecuencia con que deben cambiarse, así como cualquier fuente posible de contaminación ambiental de las muestras (3). El recuento de los microorganismos en las superficies del laboratorio puede efectuarse por el método de frotación o el de contacto directo del microorganismo con una placa rebosante de agar para recuento. Si la superficie fue limpiada con compuestos fenólicos o de amonio cuaternario, se agrega 0,5% Carrillo L
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de polisorbato 80 y 0,7% de lecitina de soja al medio (1). La calidad microbiológica del aire ha de verificarse por lo menos semanalmente, mediante la sedimentación del polvo residual sobre la placa de medio de cultivo (2). Las bacterias y esporas fúngicas pueden estar suspendidas en el aire aisladamente, en grumos o adheridas a la superficie del polvo proveniente de los materiales procesados. Las partículas más pequeñas pueden quedar suspendidas en el aire por largos periodos, moviéndose con las corrientes de aire, y los filtros de los acondicionadores de aire suelen no removerlas. Las partículas más grandes se asientan rápidamente y contaminan las superficies (1). VIGILANCIA DE SUPERFICIES
Cortar esponjas de celulosa en piezas de 1 x 5 x 5 cm, ponerlas en bolsas individuales de papel y esterilizarlas en autoclave. Humedecer una pieza con 10 mL de diluyente y frotar vigorosamente 1 m2 de la zona seleccionada, sujetándola con una pinza o un guante esterilizado. Colocarla en una bolsa plástica esterilizada, agregar 100 mL de diluyente, aplicar un masaje vigoroso a la esponja durante 1 minuto y dejar 20-30 minutos. Transferir dos alícuotas de 1 mL a sendas cajas de Petri y volcar 15 mL de agar para recuento fundido y enfriado a 45-50ºC. Incubar las placas a 30 y 35ºC durante 48 hs. Calcular el número de microorganismos en el área frotada (2). CONTROL DEL AIRE
Exponer dos placas de agar para recuento al ambiente del laboratorio durante 15 minutos. Colocar las tapas e incubar a 30ºC. Contar el número de colonias. Más de 15 colonias por placa indica que la calidad del aire es inapropiada (2). AGAR PARA RECUENTO. Triptona 5 g, extracto de levadura 2,5 g,
glucosa 1 g, agar 15 g, agua 1 litro, pH 7. Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos (1).
Los suelos, mesadas y otras superficies deben limpiarse con regularidad. Todas las superfices deben frotarse con un trapo húmedo. El aerosol generado por barrido demora unas tres horas en sedimentar. También hay que limpiar las Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 6
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campanas, el equipo y el instrumental de vidrio. Los congeladores y refrigeradores deben vaciarse y limpiarse periódicamente, sin poner en peligro la integridad del contenido. Hay que prever la eliminación de insectos atraídos por los alimentos almacenados, inevitable cuando se trata de muestras en litigio. Debe llevarse un registro de las operaciones de limpieza, desinfección y desinsectación (2). PERSONAL
En un laboratorio típico hay dos clases de personal: analistas y auxiliares, estos últimos preparan medios y soluciones, y limpian el material. Los auxiliares deben ser conscientes de la importancia de su cometido y de la necesidad de informar cualquier circunstancia que exceda a sus posibilidades o conocimientos, ya que la capacitación y supervisión de los mismos depende de los analistas (2). Las formación contínua de los analistas se determina en función de los objetivos definidos para el laboratorio y es un medio que permite producir resultados de calidad aceptable. Deberán organizarse actividades de capacitación en la metodología analítica específica, a veces en el mismo laboratorio, bajo la responsabilidad del director. Un programa de verificación de muestras es un ensayo efectuado entre diversos laboratorios para determinar la eficiencia analítica de los participantes. Un laboratorio de referencia prepara las muestras homogéneas con niveles teóricamente iguales de microorganismos. Los resultados cuali o cuantitativos se envían al laboratorio de procedencia para su evaluación estadística. La presencia de resultados discrepantes, como los positivos falsos o negativos falsos, es causa de preocupación. Otro tipo de programa de ensayos entre laboratorios es el estudio en colaboración, con el que se miden los resultados de un método. Trabajando independientemente, los participantes analizan las muestras de ensayo con el método que debe validarse y envían los resultados al laboratorio de procedencia. Los datos se analizan estadísticamente y los resultados del método se expresan en términos de exactitud, capacidad de reproducción y repetición (3). Carrillo L
58 MUESTRAS
La información y el estado de las muestras que van a ser analizadas influye de modo muy importante en su validez y por tanto en la calidad de los resultados obtenidos. Por consiguiente, la toma de muestras debe realizarse con tanto cuidado como el propio análisis. La operación de muestreo debe ser organizada de antemano con todos los instrumentos y envases estériles a mano (3). Siempre que sea posible, se eligen cinco o diez unidades del mismo producto según el plan de muestreo. Se mezclan y toman muestras de cada una de estas unidades con cucharas o cuchillos estériles. Todas las fases (acuosa, grasa, granular, etc.) deben estar representadas. Se registra la temperatura, el estado y las características especiales de las muestras. Las muestras de un lote de alimento preparado a escala industrial se eligen aleatoriamente y se obtienen al menos diez, siempre que sea posible (4). Cuando el muestreo no es realizado por el analista, es esencial disponer de un registro escrito que responda de la integridad de la muestra entre el momento de recolección y la utilización definitiva. En cada ficha debe constar el número de subunidades de la muestra, el nombre del producto, el nombre del recolector, la fecha y hora de muestreo y recepción en el laboratorio, el método y lugar de almacenamiento, el nombre del analista, la fecha de análisis, el método y lugar de almacenamiento de reserva en los casos de muestras oficiales, el método y fecha de eliminación o destino final de la muestra (2). Las muestras perecederas deben transportarse al laboratorio refrigeradas y entre el momento de la llegada al mismo y el inicio del análisis deben mantenerse a una temperatura de 0 a 4ºC. Los alimentos congelados se mantienen en ese estado. El análisis debe realizarse entre las 6 y 24 hs de la toma de la muestra, según el tipo de alimento. Se emplea hielo seco o “hielo-gel” comercial/hielo normal para mantener las muestras congeladas o refrigeradas, respectivamente, durante el transporte al laboratorio, evitando el contacto del producto con el hielo fundido. La integridad de la muestra entre el momento de recolección y el de la entrega Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 6
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al laboratorio se garantiza mediante un precinto, y quien la recibe verifica el estado del mismo (3). Para efectuar el estudio, el analista extrae una porción de cada unidad de muestra y las examina separadamente. Si el alimento está molido, triturado o en polvo, o es líquido o semilíquido, se mezcla con un utensilio esterilizado antes de extraer la porción de ensayo. La unidad congelada debe descongelarse rápidamente en un baño de agua con una agitación contínua, termostáticamente controlado, sin sacar el producto del envase (2). Las muestras que contienen microorganismos peligrosos deben ser tratadas en autoclave y las que contienen toxinas fúngicas sumergidas en solución comercial de hipoclorito de sodio diluído 1/10, antes de ser eliminadas. EQUIPAMIENTO Cámaras de cultivo
Se coloca un rótulo en el exterior, indicando la temperatura a la que deben mantenerse. Algunos modelos suelen ser muy sensibles a las variaciones diarias de la temperatura ambiente y se deben adoptar las precauciones necesarias, especialmente en verano. La temperatura interior se debe observar con uno o más termómetros, según el tamaño de la estufa. Las cámaras grandes sufren menos fluctuaciones de temperatura que las pequeñas (1). El margen de tolerancia es de + 1 a 2ºC. El termómetro de inmersión parcial, con un intervalo de graduación de 0,1ºC, debe estar inserto en un tubo con agua cuya boca estará sellada con masilla para evitar la evaporación. Todos los termómetros deben calibrarse una vez al año . Para cultivos a 15-20ºC se requiere más bien un refrigerador antes que una estufa, pero algunas cámaras tienen ambas cualidades con controles de calentamiento y enfriamiento (2). Los recipientes con los cultivos deben estar claramente etiquetados con el nombre del analista y la fecha y hora en que se introdujo. Los cultivos que deben incubarse durante 3 a 7 días se colocan dentro de bolsas plásticas junto a un vaso con agua para mantener la humedad. Carrillo L
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Todo derrame que se produzca dentro de una cámara se debe absorber y desinfectar de inmediato. Por lo menos una vez al mes se debe limpiar en interior de las cámaras. Baño de agua
Se emplea toda vez que se deba mantener la temperatura dentro de un margen de tolerancia de + 0,2ºC. Se carga con agua destilada para evitar depósitos calcáreos, excepto los que están conectados al grifo de agua corriente porque tienen un dispositivo que mantiene el nivel constante. La tapa tiene que estar bien ajustada para impedir una excesiva evaporación (1). Si no se utilizará en dos semanas, se drena el agua, se lava y seca el interior. Se debe inspeccionar con frecuencia para impedir o retrasar los daños causados por la corrosión. La temperatura se suele controlar después de un período de estabilización de 3 horas, con un termómetro de inmersión total cuyo intervalo de graduación es de 0,1ºC. Generalmente se utiliza a 44,5 - 45,5ºC, rango en el cual un cultivo de Escherichia coli incubado durante 24 hs produce gas y el de Enterobacter aerogenes no lo forma en el medio EC (triptona 20 g, lactosa 5 g, sales biliares 1,5 g, fosfato dipotásico 4 g, fosfato monopotásico 1,5 g, cloruro de sodio 5 g) (2) Refrigerador y congeladora
El refrigerador se debe mantener a una temperatura de menor a 5ºC. El exterior se limpia por lo menos una vez al mes y el interior del equipo desconectado cada tres meses. Se vigila con termómetros de inmersión para baja temperatura cuyo intervalo de graduación es de 1ºC. La congeladora se mantiene a una temperatura de -20ºC y se debe desconectar y limpiar cada seis meses. Todos los recipientes tienen que llevar rótulos con el tipo de material, el nombre del responsable y la fecha de depósito. Todo funcionamiento defectuoso de los aparatos del laboratorio y las reparaciones realizadas deben ser documentadas (2). Autoclave
Es preferible el modelo de carga horizontal. Conviene que posea un termómetro calibrado para medir una temperatura Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 6
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interna de 120ºC (2), el uso de un manómetro de presión no es útil a alturas superiores a los 900 m snm porque ya no coincidirá la temperatura interna con la escala dada por los fabricantes a nivel del mar (5). El interior de la cámara de esterilización se debe limpiar todos los días. Semanalmente se lava el desagüe de la cámara y el generador de vapor, y se verifican las señales de control y el estado del aparato. Todos los meses se lubrica la bisagra de la puerta de la cámara y trimestralmente se inspeccionan las juntas de la puerta y la válvula de purga. Se debe utilizar agua con baja dureza (2). En caso de que se disponga del clásico autoclave de Chamberland (tipo olla a presión) hay que considerar que el vapor saturado a una presión absoluta de 2,02 kg/cm 2 tiene una temperatura de 120ºC, y la presión absoluta es la suma de la presión atmosférica del lugar más la presión indicada por el manómetro. Cuanto mayor sea la altura sobre el nivel del mar, más baja es a presión ambiente y mayor la presión que debe indicar el manómetro para alcanzar la temperatura de esterilización, por ejemplo la lectura manométrica en San Salvador de Jujuy y en Salta debe ser de 1,2 kg/cm 2, y de 1,4 kg/cm2 en Abra Pampa (5). Se debe registrar en cada ciclo de esterilización, la temperatura y el tiempo, los materiales, la presión máxima alcanzada, la fecha y la hora de comienzo y finalización (3). La eficacia se controla mediante el método indirecto de colocar una ampolla con esporos de Geobacillus stearothermophilus, los que deben estar muertos luego de cumplir el ciclo de esterilización. Todas las semanas se vacía la caldera y trimestralmente se inspeccionan la válvula de purga, la junta de la tapa y las arandelas de los tornillos de cierre, reemplazándolas cuando fuere necesario (1). Estufa u horno de esterilización
Se emplea para la mayoría del material de vidrio. Se registra el mateial tratado, el tiempo y la temperatura en cada ciclo de esterilización. Periódicamente se hace un control de esterilidad del material de vidrio tratado (3). Carrillo L
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El horno debe tener un termómetro calibrado que registre temperaturas entre 160 y 180ºC. Se deben vigilar diversos puntos internos con termómetros para altas temperaturas cuyo intervalo de graduación no supere 1ºC. Todos los meses se deben limpiar las superficies internas y externas (2). Balanza
El laboratorio debe estar equipado con una balanza de 200300 g de capacidad y una sensibilidad de 0,1 g, y otra con una capacidad de 100-150 g y una sensibilidad de 1 mg. Cada vez que se usan se debe limpiar los platillos de pesada. La exactitud de las balanzas debe verificarse cada tres meses con pesas calibradas. Conviene que anualmente un representante del fabricante haga una limpieza y calibración de la balanza analítica de alta precisión (2). pHmetro
Es preferible usar un medidor de pH antes que las tiras indicadoras para los medios rehidratados, las soluciones y otros materiales, pero para productos con pH <4,0 es aceptable el empleo de los papeles indicadores (3). Si el aparato es nuevo se deben seguir las instrucciones del fabricante para su puesta en marcha. Los electrodos necesitan cuidados especiales. Cuando se transfieren de una solución a otra, se deben enjuagar con la segunda solución y con agua desmineralizada al terminar el trabajo. El procedimiento de almacenamiento depende del tipo de electrodo, los de vidrio deben colocarse en una solución reguladora neutra, para los de referencia se usa una solución de cloruro de potasio 0,1 M. Los pHmetros se controlan antes de cada uso con soluciones reguladoras de pH 4,0, 7,0 y 10,0. Hay que dejar que las muestras y soluciones alcancen la misma temperatura antes de de efectuar las mediciones. Con el uso o el tiempo la eficiencia de un electrodo se reduce. Deberá limpiarse la punta con ácido clorhídrico 0,1 M, luego con solución de EDTA, terminando con acetona o metanol. Si las lecturas erráticas persisten se debe a otras causas y probablemente haya que sustituirlo (2).
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63 Campana de flujo laminar
De preferencia el flujo debe ser vertical, provisto de un filtro HEPA que elimine partículas < 0,3 µm de diámetro. Deben ponerse en marcha sólo cuando vaya a ser utilizada. No se recomienda el empleo de mecheros dentro de la campana pues provocan una columna ascendente de aire más intensa que el flujo descendente de aire filtrado (2). En una cámara de flujo laminar (o de seguridad tipo II) elrededor del 70% del aire es reciclado a través de los filtros de manera que el área de trabajo es bañada por aire casi estéril. Pero algo del aire (alrededor del 30%) sale a la atmósfera y es reemplazado por una cortina de aire ambiental que entra por la cara frontal del equipo. Esto previene el escape de cualquier partícula o aerosol generado durante el trabajo fuera de la cámara (4). EFICACIA DE LÁMPARA UV GERMICIDA
Preparar con el diluyente, una suspensión de un cultivo de E. aerogenes de 24 hs en agar nutritivo, que tenga una densidad óptica igual a la del tubo 1 de Mac Farland. Llevar 1 mL de la suspensión (10 -1) a un tubo con 9 mL de diluyente, mezclar bien (10-2) y repetir la operación para obtener sucesivamente otras diluciones hasta 10-5. Luego diluir al ½. Sembrar 0,1 mL de la última dilución en la superficie de cada placa de agar para recuento. Exponer una placa destapada a la luz ultravioleta y otra a la luz fluorescente, durante 5 minutos. Colocar las tapas e incubar a 35ºC durante 24 hs. Contar las colonias. Si la reducción del número de colonias en las placas expuestas a la luz UV es menor al 80% se debe reemplazar la lámpara (2). DILUYENTE. Peptona 1 g, cloruro de sodio 9 g, agua 1 litro. Esterilizar a
120ºC durante 15 minutos. AGAR NUTRITIVO. Extracto de carne 3 g, peptona 5 g, agar 15 g, agua 1 litro. Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos (1). ESCALA DE MAC FARLAND. El tubo 1 se prepara mezclando 0,1 mL de cloruro de bario al 1% con 9,9 mL de ácido sulfúrico al 1%. La turbiedad corresponde a una suspensión de aprox. 3 x10 8 ufc / mL (3).
En una cámara de seguridad de tipo I, el aire ambiente entra en la cámara y arrastra cualquier aerosol liberado de los Carrillo L
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cultivos hacia el filtro absoluto que permite liberar aire limpio a la atmósfera. El flujo de aire se debe mantener entre 0,7 y 1,0 m/s, y si no se alcanza este nivel los filtros deben ser cambiados. La eficiencia de toda cámara depende del mantenimiento adecuado (4). El interior de la campana se debe limpiar y desinfectar después de usarla. La eficiencia de la desinfección puede controlarse mediante el método de contacto directo. Los filtros se deben revisar todos los meses para detectar obturaciones o acumulación de suciedad, y cambiarlos según sea necesario. El rendimiento de los filtros se verifica exponiendo al aire una placa de agar para recuento durante 1 hora y después de la incubación prácticamente no debe haber colonias. Si tres ensayos sucesivos indican la presencia de contaminación, se considera que la campana funciona deficientemente y se recurrirá al servicio técnico especializado. La lámpara fluorescente se limpia cada dos semanas con un paño suave humedecido en alcohol. Cada tres meses hay que controlar la lámpara ultravioleta germicida, si emite menos del 80% de la intensidad teórica debe ser reemplazada. Se debe encender 10 minutos antes de utilizar la campana, estando ésta vacía (2), y apagarla al hacer los análisis. Microscopio
Es preferible un microscopio estándar binocular, con objetivos y oculares que proporcionen aumentos de 40x, 100x, 400x y 1000x aproximadamente, un condensador con una abertura numérica de 1,25, un diafragma iris y el sistema de iluminación montado en la base. En los laboratorio que lleven a cabo procedimientos con colorantes fluorescentes, es imprescindible un microscopio de fluorescencia (2). Una lupa binocular es conveniente para el examen de la morfología del cultivo y facilita el repique en una placa atestada de colonias (4). Deben colocarse en una superficie exenta de vibraciones y no es conveniente cambiarlos de emplazamiento. Cuando no se utilicen se cubren con una funda para evitar el polvo. Los lentes se deben limpiar, después de usarlos, con papel para lentes o algodón muy suave. El objetivo de inmersión se Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 6
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limpia sin desmontarlo, con el solvente recomendado por el fabricante, generalmente etanol (2). Material de vidrio
Conviene el fabricado con vidrio borosilicato de bajo contenido alcalino. Todos los materiales volumétricos deben estar acompañados de la certificación de calibración. Después de cada uso se revisan y descartan los que tienen bordes mellados o la superficie interna corroída. La punta mellada de una pipeta hará que los volúmenes vertidos sean inexactos. El gollete de los matraces se debe inspeccionar para detectar fisuras que puedan causar derrames y los tapones de plástico si son nuevos se lavarán con una solución detergente caliente para eliminar residuos tóxicos. DETERMINACION DE RESIDUOS BACTERIOSTÁTICOS
Lavar 6 cajas de Petri con el procedimiento habitual del laboratorio. B . Lavar 6 cajas de Petri con el mismo procedimiento y enjuagarlas doce veces con agua destilada. C. Lavar otras 6 cajas pero no enjuagarlas. Esterilizar las cajas por el procedimiento habitual. Preparar una suspensión de un cultivo de E. aerogenes (ver pág -6 63), hacer diluciones decimales hasta 10 y luego diluir al ½. Colocar en cada caja 1 mL de la última dilución, volcar 15 mL de agar para recuento fundido y enfriado a 45ºC y mezclar cuidadosamente por desplazamiento horizontal. Incubar las placas a 35ºC durante 48 hs. Contar las colonias. Una diferencia > 15% entre A y B indica la presencia de residuos inhibitorios del detergente, y entre C y A demuestra que las propiedades inhibitorias del detergente desaparecen con el enjuague ordinario (2). A .
Como los residuos ácidos o alcalinos pueden permanecer el el material de vidrio después del lavado, se verifica el pH de algunos objetos con el indicador azul de bromotimol (azul de bromotimol 0,1 g, hidróxido de sodio 0,01 N 16 mL, agua destilada 250 mL) que es amarillo a pH 6,5, azul a 7,3 y verde en el intervalo. También se deben analizar para detectar posibles sustancias antimicrobianas que puedan haberse adherido a la superficie interna (3). Carrillo L
66 Material de plástico
Hay dos categorías, descartable y esterilizable. El material descartable, tal como cajas de Petri, recipientes para muestras, puntas de pipetas automáticas, etc. reduce el tiempo empleado en las tareas de limpieza, pero complica la eliminación una vez usado. El material recuperable, por ejemplo cajas de Petri de policarbonato, puede ser esterilizado en autoclave (4). PRODUCTOS QUÍMICOS / MEDIOS / REACTIVOS
Es preferible emplear medios deshidratados comerciales, con la fecha límite de validez, para lograr una uniformidad metodológica. Nunca se deben adquirir frascos de medios que no serán usados dentro del año, debido a las características higroscópicas de los mismos. En los rótulos se coloca la fecha de apertura de los frascos. Los medios que se hayan alterado por absorción de humedad o presentan un cambio de color, se descartan. Cada tres meses se debe hacer un inventario y los medios que hayan excedido su fecha de validez se retiran. El uso de los productos deshidratados comerciales no evita la necesidad de probar los lotes nuevos de medios selectivos antes de utilizarlos, cultivando un microorganismo testigo y comparando los recuentos, el tamaño y la apariencia de las colonias con los observados en un medio satisfactorio, no debiendo diferir los valores en más de 10% (2). También se puede hacer la comprobación sembrando inóculos insignificantes de por lo menos cinco cepas de los microorganismos para los que el medio es selectivo, e inóculos masivos de cinco cepas de los microbios a suprimir (4). Los compuestos químicos que se utilizan en los medios pueden contener impurezas inhibidoras o estimulantes del crecimiento microbiano, por lo que deben ser de calidad analítica. En cuanto a los colorantes tienen que ser certificados pues la variación entre los lotes, en cuanto a pureza y tipo de sustancias acompañantes, es grande. Uno de los factores más importantes de la preparación de medios y reactivos microbiológicos es la calidad del agua utilizada. Se debe emplear agua destilada o desionizada, salvo Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 6
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que se indique otra cosa como, por ejemplo en algunos medios micológicos. Los fluoruros no se eliminan con la destilación (2). IDONEIDAD DEL AGUA
Preparar la solución concentrada del medio mínimo con agua recien obtenida en destilador de vidrio. Recoger unos 200 mL del agua desconocida y 200 mL de agua de control. Colocar en un fresco 20 mL de agua de control y 10 mL de solución, y en otro 20 mL del agua desconocida y 10 mL de solución. Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos. Preparar una dilución 10-6 de un cultivo de E. aerogenes (ver pág 65). Sembrar 1 mL en cada frasco e incubar a 35ºC durante 24 hs. Hacer diluciones decimales sucesivas de cada frasco y sembrar 0,1 mL en sendas placas de agar para recuento. Incubar a 35ºC durante 24 hs. Contar las colonias. Si la relación recuento agua desconocida/ recuento control es < 0,8 - se encuentran sustancias inhibidoras en el agua, 0,8 a 1,2 - no hay inhibidores presentes, > 1,2 - se hallan fuentes estimuladoras del crecimiento. MEDIO MÍNIMO CONCENTRADO. Citrato de sodio dihidrato 0,58 g,
sulfato de amonio 1,2 g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,52 g, cloruro de calcio dihidrato 0,34 g, cloruro de sodio 5,0 g, sulfato ferroso dihidrato 0,46 g, fosfato dipotásico 1,36 g, agua destilada 1 litro (2).
La mayoría de los medios microbiológicos se esterilizan con un tratamiento en autoclave a 120ºC. Algunas sustancias sensibles al calor como los azúcares se deben tratar a una temperatura menor, o por poco tiempo, o ambas cosas a la vez. Los tapones a rosca se deben aflojar antes de introducir el medio en el autoclave, para que el vapor pueda penetrar en el contenido. Como medida adicional de protección contra la contaminación posterior a la esterilización, los tapones de algodón se protegen con papel poroso antes del tratamiento en autoclave. En cuanto el manómetro de la cámara de presión vuelve a cero, se saca el medio del autoclave (2). Después del tratamiento en autoclave, los tubos para fermentación, con ampollas invertidas en su interior, se revisar para asegurarse que no haya burbujas de aire (4). Carrillo L
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Los materiales sensibles al calor se esterilizan por filtración. Los filtros tampoco deben contener sustancias inhibitorias o estimulantes del crecimiento microbiano. El flujo a través del filtro ha ser como mínimo de 55 mL /min /cm 2 a 25ºC. Los filtros deben soportar el tratamiento en autoclave a 120ºC durante 10 minutos. Como algunos reactivos se autoesterilizan, por ejemplo ciertas soluciones colorantes, se preparan añadiendo el colorante al recipiente con agua esterilizada. Los medios deshidratados y los productos químicos se almacenan en lugares secos, frescos y protegidos de la luz y el polvo. Los medios preparados en tubos con tapón a rosca, bien cerrados, se pueden almacenar a 4ºC durante 3 meses, los que llevan tapón de algodón no más de 1 semana (2). METODOLOGÍA
Abundan los métodos microbiológicos. El empleo de métodos diferentes para analizar un determinado alimento suele conducir a resultados diferentes. Los microbiólogos deben conocer la finalidad y las aplicaciones de los principales manuales de análisis microbiológico de los alimentos, entre ellos están: o
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AOAC International. 1998. Official Methods of Analysis, 16ª ed, 4ª rev. Gaithersburg. APHA. 2001. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4ª ed. Downes FP, Ito K, editores. Washington. ICMSF. 1982. Microorganismos de los Alimentos, vol I. Acribia, Zaragoza. Mossel DAA et al. 2003. Microbiología de los Alimentos. 2ª ed. Acribia, Zaragoza, cap. 9: Procedimientos normalizados y validados.
Todas las técnicas analíticas presuponen que el analista ha sido instruído adecuadamente en las prácticas microbiológicas de laboratorio y se ha familiarizado con las técnicas de seguridad empleadas cuando se manipulan microorganismos patógenos (1). Antes que un método sea utilizado corrientemente en un laboratorio, debe ser convalidado. El método ha de facilitar datos con un grado predecible de precisión y exactitud cuando lo empleen analistas calificados. La precisión da la medida de Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 6
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la variabilidad del método entre varios laboratorios. La exactitud indica el grado en que el método determina el verdadero nivel del microorganismo analizado. Ha de ser lo más rápido y sencillo que sea posible, sin dejar de reunir los requisitos de confiabilidad. El método no debe contener un secreto comercial (2). El estudio en colaboración de muestras homogéneas, entre analistas competentes y experimentados de laboratorios independientes que obtienen resultados equivalentes, es el mecanismo empleado para validar un procedimiento. Siempre que sea posible el método a validar se compara con un método existente, empleando alimentos que están naturalmente contaminados con del microorganismo analizado. Cuando se analizan las muestras desconocidas, el analista deberá seguir al pie de la letra el método recomendado, porque las modificaciones que parecen secundarias pueden poner en peligro los resultados del análisis (3). DOCUMENTACIÓN
Se debe proceder a un registro sistemático y documentado de toda la información que tenga alguna relevancia práctica para los análisis realizados, y permita reconstruir una situación analítica mucho después de que se haya efectuado el trabajo. La documentación es un mecanismo que colabora con la localización de una muestra de laboratorio desde que se recoge hasta que se elimina. La secuencia de registros deben constituir un cuerpo contínuo que proporcione un historial claro, exacto e indiscutible de la muestra, sin discrepancias. Los datos de la garantía de calidad (calibración, mantenimiento o reparación de un equipo; preparación de medios y reactivos; control microbiológico del aire; etc) deben registrarse en el cuaderno de notas y no en las fichas de análisis de las muestras (3). El manual de procedimientos operativos normalizados es el documento más importante para el mejoramiento y mantenimiento de la calidad del servicio, y es esencial para la acreditación del laboratorio microbiológico de alimentos. Debe cumplir con los siguientes criterios: Carrillo L
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Debe ser recopilado por un profesional con experiencia práctica en los métodos. No es conveniente el uso exclusivo de los catálogos comerciales. Factibilidad. Debe ser claro, conciso y explícito en la descripción de los procedimientos, numerando las etapas. Actualización. Debe ser formalmente revisado todos los años y corregido si es necesario. Disponibilidad. Debe estar al alcance de todos los analistas del laboratorio, los que deben apegarse a las reglas (1). Autoridad.
REFERENCIAS 1. 2. 3. 4. 5.
Collins CH et al. 1999. Microbiological Methods. 7ª ed. ButterworthHeinemann, Oxford, pp 11, 19, 39. Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación. 1992. La Garantía de la Calidad en el Laboratorio Microbiológico de Control de los Alimentos. Roma. Downes FP, Ito K, editores. 2001. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4º ed. American Public Health Association, Washington, pp 1, 13, 25. Mossel DAA et al. 2003. Microbiología de los Alimentos. 2ª ed, Acribia, Zaragoza, p 585. Carrillo L. 2005. Manual de Microbiología Agrícola. Ediunju, Jujuy, p 51.
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FRUTAS y HORTALIZAS Una vez que el producto es cosechado, comienza de inmediato la senescencia, haciéndolo más sensible al deterioro microbiano. El grado y la velocidad del incremento de la población de microorganismos depende del producto y las condiciones de almacenamiento. El deterioro es realmente causado por solo una pequeña proporción de la microbiota inicialmente presente y un tipo específico de alteración se desarrolla bajo las condiciones normales de almacenamiento a temperaturas apropiadas. Los factores que influyen sobre la microbiota dominante y determinan la clase de deterioro, son la contaminación inicial, las propiedades del sustrato, las condiciones ambientales y las características de los microbios. Todos los vegetales poseen una microbiota residente que subsiste con pequeñísimas cantidades de carbohidratos, proteínas y sales inorgánicas disueltas en el agua exudada o condensada sobre la superficie del hospedante. Otros factores importantes son la contaminación a partir del suelo, el agua, los animales domésticos y salvajes, y la extensión del contacto durante la cosecha con las superficies sucias de las cosechadoras y contenedores (1). DETERIORO
La microbiota dominante sobre las hortalizas recién cosechadas es muy variable. Está constituída por bacterias gramnegativas como Enterobacter, Pantoea y Pseudomonas (2), pero las partes que crecen cerca o dentro del suelo contienen bacterias grampositivas, por ejemplo Bacillus, Paenibacillus, Clostridium (3) y organismos corineformes. Sobre la superficie de algunas verduras se propagan los Leuconostoc y Lactobacillus (4). Muchos de estos organismos son pectinolíticos o celulolíticos y originan el reblandecimiento característico de las podredumbres blandas, por ejemplo Pectobacterium carotovorum (5).
Los hongos filamentosos aislados de las hortalizas con más frecuencia son Aureobasidium, Fusarium, Alternaria, Epicoccum, Mucor, Rhizopus, Phoma, Chaetomium y en menor proporción Aspergillus, Acremonium, Botrytis, Cladosporium, Bejarano NV, Carrillo L
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etc (6). Algunos de estos mohos son patógenos oportunistas, mientras que otros son patógenos verdaderos que pueden invadir el tejido sano. El alto contenido acuoso de las hortalizas, así como su crecimiento en contacto con el suelo, predisponen al deterioro. Es poco común el tratamiento en la zona de empaque y son más sensibles al frío que las frutas. En el campo los puntos de contaminación son diversos: la microbiota saprobia epífita y del suelo, los frutos, ramas u hojas enfermos, los envases cosecheros, las plantas de empaque, el agua de reciclado, las cámaras de almacenamiento, desverdización o frío, el transporte y la venta (7). Aunque los mismos tipos de microbios pueden estar presentes sobre frutas u hortalizas, las características intrínsecas del producto afectan a los organismos residentes determinando cuáles finalmente desarrollarán. Las hortalizas tienen en general un pH entre 5 y 6 mientras que las frutas muestran un valor menor a 4,5 aunque existen excepciones, por ejemplo melón. Por lo tanto las bacterias crecen más rápido que los mohos y levaduras sobre la mayoría de las hortalizas, y viceversa en el caso de las frutas. La alteración de las frutas y hortalizas frescas se denomina enfermedad post-cosecha debido a que son partes vivas de las plantas y aunque éstas suelen poseer algunas defensas naturales contra la infección microbiana, en la práctica son de escasa importancia. Ciertas propiedades tales como una cáscara o piel gruesa, pueden proteger contra un daño superficial y el crecimiento subsecuente de los organismos saprobios. Por otra parte, también es posible que existan microbios vivos en los tejidos internos no dañados (2). La infección fúngica que causa deterioro post-cosecha puede ocurrir antes o después de la recolección. El tipo de infección fúngica post-cosecha puede ser epicuticular o subcuticular. La primera suele encontrarse en cualquier parte del fruto. Si el hongo aún no ingresó se puede eliminar con tratamientos en el empaque. Este tipo de infección es activa apenas el hongo ingresa al tejido por heridas ( Penicillium spp) o bien latente inactiva cuando Penicillium, Sclerotium, Trichoderma, Ulocladium,
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requiere de un ambiente apropiado para que las esporas Phytophthora spp) (8). germinen ( Phytophthora La infección subcuticular ocurre en campo y en el momento de la cosecha el hongo ya ingresó. Suele encontrarse en cualquier parte del fruto, aunque con frecuencia se halla en los extremos pedunculares y estilares. En general se trata de patógenos difíciles de eliminar con tratamientos en el empaque y la madurez acelera la expresión del deterioro (9). Durante o después de la cosecha, los factores que predisponen a las infecciones son: o las microheridas causadas en la manipulación pues proporcionan agua y nutrientes para la germinación de esporos, los golpes producen zonas necróticas mayores, por ejemplo o oleocelosis en cítricos, escaldados en peras y manzanas, las fisiopatias originadas en el campo por deficiencia o o exceso de nutrientes, por ejemplo calcio, o los daños por frío en el almacenamiento originan una necrosis de tejidos necrótico, o la maduración en ambientes modificados pueden causar senescencia de tejidos, por ejemplo en la inserción peduncular de cítricos debida Diplodia spp (10). Las peras y manzanas se cosechan durante 4 meses y se almacenan casi un año, las podredumbres incrementan los últimos 40 días de conservación. El tipo de deterioro depende de características varietales, por ejemplo en manzana var. Golden luego de 6 meses el 83 % es debido a Gloeosporium (11) y en nuestro nuestro país se citan citan pérdidas pérdidas del 10 - 14 % en manzana variedad ‘red delicius’ por Penicillium expansum (12). Los organismos causales, además de los nombrados, son Monilinia, Glomerella, Mucor, Alternaria spp, Botrytis, Rhizopus, Phytophthora spp y Penicillium spp (13). La pérdida de cítricos por deterioro fúngico es variable según se apliquen, o no, tratamientos con fungicidas. Sólo en plantas de empaque se estiman pérdidas del 14% al 18% (14). Los organismos causales son Penicillium spp., Phytophthora spp, Phomopsis, Diplodia, Geotrichum, Botrytis y Colletorichum (10, 15).
Las levaduras aisladas de las frutas pertenecen a los géneros Candida, Debaryomyces, Hanseniaspora, Pichia, Bejarano NV, Carrillo L
74 Rhodotorula, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Sporobolomyces, Trichosporon, Zygosaccharomyces Zygosaccharomyces y otros (16).
En condiciones normales las nueces, almendras y otras frutas secas no presentan problemas de deterioro bacteriano debido a la baja actividad de agua, pero pueden ser dañadas por insectos y contaminadas por mohos (2). ALMACENAMIENTO
La refrigeración reduce el metabolismo y mantiene el sabor y el valor nutritivo, y puede disminuir la incidencia de las podredumbres. Sin embargo las plantas tropicales y subtropicales sufren lesiones debido al frío con la consiguiente pérdida de calidad. El aire debe circular dentro de la cámara refrigeradora y se requiere una humedad entre 90 y 95% para evitar el secado de las frutas y hortalizas, pero si se mantiene una humedad más alta aumentará el número y tipo de microbios a pesar de la baja temperatura. El ajuste de la humedad relativa permite equilibrar la disminución del crecimiento microbiano y la pérdida de humedad del producto (17). Por otra parte el almacenamiento en una atmósfera modificada extiende la vida útil del producto mientras se mantenga la temperatura baja, por ejemplo las manzanas, pues bajo ciertos niveles de dióxido de carbono se restringe el crecimiento de organismos aerobios como los mohos (1). En el caso de las papas, se almacenan los tubérculos limpios y secos bajo ventilación, con una humedad relativa elevada y una temperatura entre 4 y 10°C (18). Otros productos como alcaucil, apio, arveja, cebolla, coliflor, espárrago, espinaca, lechuga, nabo, perejil, repollo y zanahoria se almacenan alrededor de los 2°C, mientras que ají, berenjena, chaucha y pepino se colocan a 7°C, tomate a 10°C, calabaza y zapallo a 10 - 13°C y batata a 13 - 15°C. La mayoría de las frutas se almacenan a 2°C, pero limón, lima, mango, papaya, banana, ananá y otras requieren mayor temperatura. El deterioro durante la comercialización es variable pudiendo llegar hasta el 50% de las hortalizas y algunas frutas. Además de la refrigeración, refrigeración, las siguientes medidas antes del almacenamiento ayudan a controlar el deterioro: Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 7
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eliminación de todos los productos dañados, o uso de un desinfectante después del lavado, o secado del exceso de humedad, encerado de zapallos, calabazas y frutas cítricas, o o manipulación cuidadosa (1). Una de las desventajas del uso de cloro como desinfectante la corrosión de los equipos y la otra, la formación de derivados clorados indeseables (19). El Código Alimentario Argentino (CAA) en su artículo 820 admite la preparación de hortalizas frescas, enteras o trozadas, lavadas con solución de ácido eritórbico (= iso-ascórbico, 100 ppm) y envasadas al vacío (20). o
PATÓGENOS
Las hortalizas crudas sólo participan de un modo secundario en las infecciones transmitidas por alimentos. Cuando aparecen estas infecciones, son debidas a la contaminación por estiércol (21) o aguas residuales (22), por ejemplo huevos de vermes, quistes de protozoos, bacterias y virus entéricos como el de la hepatitis A. Las bacterias patógenas y amebas pueden sobrevivir por un tiempo en el suelo y contaminar las hortalizas que serán consumidas crudas. El lavado y desinfección de estos alimentos puede reducir algo del problema, pero no eliminarlo (1). Con el fin de controlar estos peligros son necesarias las siguientes precauciones: evitar el uso de aguas fecales y de estiércol animal no o compostado como abono, o evitar el riego con agua contaminada, o lavar previamente todas las materias primas con agua potable, higienizar con un agente desinfectante, o o limpiar y desinfectar adecuadamente las instalaciones y enjuagar con agua potable (18). Las hortalizas son alimentos cuya durabilidad se suele prolongar mediante refrigeración, especialmente las cocidas. La presencia de Clostridium botulinum no proteolíticos (tipos B, E y F) constituye un peligro pues puede formarse la toxina en 10 días a 8ºC si hay microambientes anaeróbicos en el producto almacenado (23). Por otra parte, las hortalizas y frutas frescas tratadas con bioinsecticidas que contienen Bejarano NV, Carrillo L
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suelen tener residuos de una enterotoxina formada por dicha bacteria (24).
Bacillus
thuringiensis
CONSERVACIÓN
Los métodos más importantes para conservar las frutas y hortalizas son desecación, congelación, apertización, fermentación láctica y colocación en vinagre o salmuera, pero ninguno mejora la calidad de la materia prima. La selección previa ayuda a eliminar los materiales crudos deteriorados y la limpieza en seco quita el suelo del producto antes del lavado con agua clorada (2 a 5 ppm de cloro residual) (2). El blanqueo es un paso crítico en el procesamiento de las hortalizas congeladas pues elimina la mayoría de los organismos contaminantes, y las dificultades en el control de la contaminación post-blanqueo depende del tipo de producto. La microbiota predominante en los vegetales congelados depende de la región geográfica y de la hortaliza. Suelen encontrarse bacilos gram-negativos, enterococos, especies de Lactococcus y Leuconostoc, y un bajo número de mohos (1). Como las frutas comúnmente no son blanqueadas mantienen la microbiota adquirida en el campo, a la se suma la incorporada durante el procesamiento. Predominan las levaduras y los mohos, especialmente Geotrichum pues suele acumularse en las superficies del equipamiento. También se encuentran bacterias lácticas y especies de Acetobacter, Gluconobacter y Zymomonas (2). Las frutas a desecar deben cosecharse cuando hayan alcanzado su madurez. Las hortalizas son blanqueadas antes de la deshidratación a una temperatura y por un tiempo que dependen de la madurez del producto. De esta manera se eliminan microbios e inactivan enzimas. El dióxido de azufre a un nivel de 1.0003.000 ppm, previene el oscurecimiento y reduce el número de microorganismos. El secado al sol está limitado a un clima favorable y a ciertos frutos y hortalizas. Es posible el deterioro durante el proceso de secado, el producto está también expuesto a la contaminación ulterior por polvo, suciedad, insectos y roedores, que añaden microorganismos al producto desecado (2). En las cabinas de secado los factores que influyen son la temperatura, la humedad relativa del aire, la velocidad del Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 7
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flujo de aire y el tiempo. Las frutas son deshidratadas a una temperatura de 60-74°C, las hortalizas a 57-93°C. Este rango cubre los puntos de muerte térmica de algunos mohos (por ejemplo 60°C para Rhizopus nigricans, 52°C para Monilinia fructicola, 58°C para Penicillium digitatum). Algunas piezas del material vegetal deshidratado pueden tener mayor contenido de humedad que otras, permitiendo el desarrollo microbiano si no hay un ajuste de humedad suficientemente rápido (2). Según el artículo 824 del CAA las verduras desecadas o deshidratadas no deben presentar un contenido de humedad superior al 7% (20). Las hortalizas tales como arvejas, papas y batatas tienen un alto contenido de almidón, pero las otras poseen menos carbohidratos 6,6%) que el promedio presentado por las frutas (12,9%). La presión osmótica es una función del número de partículas en solución. Como las frutas contienen más azúcares, hay una presión osmótica mayor en los productos frutales respecto a los hortícolas. Por esta razón las frutas desecadas pueden retener más humedad sin deterioro de la calidad. Como el pH de las frutas es más ácido que el de las hortalizas, las frutas deshidratadas son atacadas por mohos y levaduras, mientras que sobre las hortalizas deshidratadas crecen bacterias además de mohos (1). Cuando la humedad relativa de la atmósfera sobre el alimento en un contenedor cerrado, puede alcanzar el equilibrio con la aw del producto, se denomina humedad relativa en equilibrio (HRE). Si la humedad relativa del aire donde se almacena el alimento es mayor que la HRE correspondiente a su aw hace que el alimento tome humedad desde el aire (25). La mayoría de las levaduras tienen una a w mínima entre 0,90 y 0,95, sin embargo existen especies xerotolerantes como Zygosaccharomyces rouxii que puede crecer a una aw de 0,62 (16). Algunas frutas desecadas, tales como los dátiles, suelen ser pasterizadas para destruir a los patógenos (2). El artículo 919 del CAA permite el tratamiento superficial de las frutas deshidratadas con ácido sórbico o sus sales, siempre que el contenido residual sea menor a 100 ppm (20). Los tipos y números de microorganismos hallados en los productos deshidratados dependen en gran medida del tipo de Bejarano NV, Carrillo L
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alimento, de sus antecedentes y de su composición (18). Además de los esporos de Bacillus y Clostridium suelen encontrarse en las hortalizas deshidratadas, las bacterias Alcaligenes, Corynebacterium, Enterobacter, Escherichia, Pantoea, Pseudomonas, Streptococcus y principalmente los mohos Aspergillus y Penicillium (1). Rara vez aparecen actinomicetos
o levaduras. La microbiota de las frutas deshidratadas comprende sobre todo levaduras ( Candida, Hanseniaspora, Pichia, Saccharomyces, Zygosaccharomyces) y mohos Chrysosporium, Eurotium, Penicillium, ( Aspergillus, Xeromyces) (26). Las hortalizas acidificadas por adición de ácido acético solo permitirán el crecimiento de una gama relativamente reducida de organismos acidúricos. En los trozos relativamente grandes, cuyo pH interno está bien regulado, la penetración del ácido acético puede ser lenta e incompleta, manteniendo en el centro un pH no inhibidor. Además puede ocurrir la asimilación del ácido acético por algunos microbios, originando una alcalinización secundaria y la proliferación de los organismos inicialmente controlados (18). ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO
Se toman las muestras llevando a cabo las técnicas apropiadas para evitar cualquier contaminación durante su obtención y la posibilidad de crecimiento o muerte de los microbios durante el transporte al laboratorio. La muestra es el material obtenido y la unidad de análisis el material realmente utilizado. Ambos pueden ser lo mismo, pero en general el tamaño de la muestra suele ser más del doble de la unidad analizada para permitir otro ensayo posterior. Se usan recipientes limpios, secos, esterilizados y cerrados, de capacidad adecuada para el escandallo deseado, como frascos de boca ancha con tapa a rosca o bolsas plásticas desechables. Los instrumentos de muestreo requeridos también son esterilizados. Las etiquetas deben tener un tamaño adecuado para registrar todos los datos necesarios. Las muestras refrigeradas o congeladas se colocan en un recipiente aislante. En el caso de productos envasados cada paquete es la muestra (27). Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 7
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Las hortalizas que se comercializan listas para el consumo inmediato o que se sirven crudas en un restaurante, deben ser analizadas para comprobar que fueron obtenidas observando buenas prácticas de cultivo y manipulación. La población microbiana sobre los productos frescos puede variar mucho y el recuento suele estar en el rango de 10 4 - 106 ufc/g, aunque a veces puede alcanzar las 10 9 ufc/g. Con frecuencia estos organismos no están distribuidos uniformemente, por ejemplo suele hallarse 10 4 ufc/g en las hojas externas de una planta de lechuga sin sobrepasar las 30 ufc/g en las internas (2). Listeria monocytogenes puede sobrevivir en tomates enteros o cortados (28). La población de mohos aislados de hortalizas está influenciada por las condiciones climáticas, la proximidad al suelo de las partes comestibles y el tiempo transcurrido desde la cosecha. La micotoxina patulina producida por P. expansum y otros mohos suele encontrarse en el jugo de manzanas (2). Los valores microbiológicos de referencia en las hortalizas crudas listas para el consumo, acordes con las buenas prácticas de manipulación son: recuento de colonias a 17ºC de 10 5 ufc/g, recuentos de E. coli y de Enterococcus spp. de 10 ufc/g en cada caso, y ausencia de L. monocytogenes en 1 g. Estos valores son accesibles cuando se llevan a cabo correctamente el abonado, el riego, la recolección, el lavado y el procesamiento posterior (18). El análisis de hortalizas refrigeradas que se consumirán crudas, según el ICMSF, implica la investigación de E. coli mediante un programa de 3 clases (n = 5, c = 2, m = 10 /g y M = 103 /g) y la de Salmonella con un programa de 2 clases (n = 10, c = 0 y m = 0), mediante métodos normalizados (27). Los coliformes y enterococos son contaminantes comunes de las hortalizas congeladas, pero E. coli es relativamente raro en los vegetales blanqueados por lo que su presencia es índice de contaminación fecal. La presencia de coliformes en las frutas congeladas no suele ser índice de peligro para la salud pública (2). El análisis de hortalizas congeladas destinadas al consumo en crudo comprende recuento de bacterias heterótrofas (<10 5 /g), la investigación de coliformes (n = 5, c = 2, m = 10 /g y M = 103 /g) y la de E. coli (NMP = <3 /g), mediante métodos normalizados (1). Bejarano NV, Carrillo L
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El examen de la microbiota de alimentos desecados suele incluir los recuentos de bacterias heterótrofas, mohos y levaduras, bacterias coliformes, E. coli, bacterias esporuladas mesofílicas y termofílicas, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, bacterias lácticas, y la presencia o ausencia de Listeria y Salmonella, según el producto analizado y el destino del mismo (2). El análisis de verduras desecadas, según el ICMSF, incluye la investigación de E. coli mediante un programa de 3 clases donde n = 5, c = 2, m = <3 /g (o sea ningún tubo positivo en la técnica del NMP con 3 tubos) y M = 10 2 /g, y de Salmonella con un programa de 2 clases donde n = 10, c = 0 y m = 0. El análisis frutas secadas, como dátiles e higos, implica la investigación de E. coli mediante un programa de 3 clases donde n = 5, c = 2, m = <3 /g y M = 10 2 /g. El análisis de otras frutas secadas al sol comprende la investigación mediante un programa de 3 clases de levaduras osmófilas (n = 5, c = 2, m = 10 /g, M = 103 /g), mohos (n = 5, c = 2, m = 10 2 /g, M = 104 /g) y E. coli (n = 5, c = 2, m = <3 /g, M = 10 2 /g) (27). RECUENTO MICROSCÓPICO DE MOHOS
Colocar en el círculo central de la cámara de Howard 1 gota de la muestra bien mezclada y diluída con agua o azul-láctico, de tal manera que la concentración de residuo sólido de la suspensión sea 8-9%. Depositar el cubreobjetos de tal manera que el material se distribuya por todo el círculo y se formen los anillos de Newton en las franjas laterales. El material examinado en cada campo microscópico tiene un volumen definido. Se observan al menos 25 campos microscópicos separados en cada carga de la cámara. Si tres trozos de hifas sumados miden 1/6 del campo, se considera positivo dicho campo. Si se necesitan más de tres trozos para lograr esa longitud, se considera como un campo negativo. Examinar al menos dos cargas y calcular el porcentaje de campos positivos (2). AZUL-LACTICO.
Azul de algodón (= azul de anilina) 0,1 g, ácido láctico
(85%) 100 mL (29).
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81 RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS
Suspender 10 g del alimento en 90 mL de diluyente tensoactivo (10-1), pasar 1 mL a un tubo con 9 mL de diluyente (10-2). Colocar 0,1 mL de cada dilución en la superficie de una placa de medio de cultivo y extender con una varilla de vidrio doblada en L. Incubar durante 5 días a 22-25°C. Observar las placas que tengan entre 10 y 100 colonias de mohos o levaduras. Suspender los productos secos en una solución de sacarosa al 20% p/v. Emplear un diluyente con 5% p/v de NaCl para los productos salados. Si la muestra es muy ácida, ajustar el pH de la suspensión a 3,5-4,0 (26). Peptona 1 g, polisorbitano 80 (tween) 0,5 mL, agua 1 litro. Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos (31). AGAR-DICLORÁN-CLORANFENICOL (general). Glucosa 10 g, peptona 5 g, extracto de levadura 5 g, fosfato monopotásico 1 g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,5 g, agar 20 g, agua 1 litro, cloranfenicol 0,1 g, diclorán (0,2% p/v en etanol) 1 mL. Esterilizar a 120°C durante 15 minutos. AGAR-GLUCOSA-TRIPTONA-LEVADURA (para levaduras en ausencia de mohos). Glucosa 100 g, triptona 5 g, extracto de levadura 5 g, cloranfenicol 0,1 g, agar 20 g, agua corriente 1 litro. [Puede adicionarse 0,03 g de azul tripán al medio neutro]. Esterilizar a 120°C durante 10 minutos (30). AGAR-DICLORÁN-GLICEROL (productos secos). Glucosa 10 g, peptona 5 g, fosfato monopotásico 1 g, extracto de levadura 5 g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,5 g, agar 20 g, cloranfenicol 0,1 g, diclorán (0,2% p/v en etanol) 1 mL, glicerol 220 g, agua csp 1 litro (a w=0,955). Esterilizar a 120°C durante 15 minutos. AGAR-MALTA-GLUCOSA-SAL (productos salados). Extracto de malta 20 g, extracto de levadura 5 g, cloruro de sodio 100 g, glucosa 120 g, agar 20 g, agua 1 litro, a w=0,88. Se calienta en autoclave con vapor fluente durante 30 minutos o en baño de agua hirviente. AGAR-MALTA-ACÉTICO (productos ácidos) . Extracto de malta 20 g, extracto de levadura 5 g, agar 20 g, agua 1 litro. Esterilizar a 120 ºC durante 15 minutos. Agregar 5 mL de ácido acético glacial al medio estéril, fundido y tibio (pH aprox. 3,8) (26). DILUYENTE TENSOACTIVO.
El recuento de mohos de Howard-Stephenson se usa para determinar si un producto apertizado tiene un alto número de hifas de mohos por campo microscópico. Si hay una cantidad excesiva de mohos, indica pobre selección del producto crudo (2). El CAA tolera, por ejemplo un recuento de mohos del 20% de campos positivos para jugo de tomates y ananá (art 1061 y Bejarano NV, Carrillo L
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1064). Los artículos 943 a 948 no admiten más de 50 % de campos positivos en el líquido de tomates pelados o no (enteros, cubeteados o triturados), ni más de 60 % en la dilución con 8,37-9,37% de residuo sólido libre de cloruro de sodio para el concentrado de tomates o chucrut (art 976) (20). El análisis de las hortalizas conservadas en vinagre requiere la comprobación de los valores de pH, especialmente en los sitios donde la penetración del ácido podría haber sido lenta, además de la inspección del olor, el aspecto y la investigación de las enterobacterias (<10 ufc/g), las bacterias lácticas y levaduras (<104 ufc/g) y de Acetobacter que puede crecer y alcalinizar el producto (18). El art 1251 del CAA se especifica que la fase líquida de los encurtidos con vinagre y salados, debe tener un pH no mayor que 3,5 (20). El análisis microbiológico de las especias puede ser azaroso debido a los componentes antimicrobianos naturales. La acción inhibitoria en los alimentos está limitada por las cantidades en que se usan estos productos. La pimienta negra muestra los recuentos de bacterias más altos (>10 6 ufc/g) seguida por albahaca, coriandro, paprika, pimienta blanca y timol. La nuez moscada presenta recuentos bajos y los valores menores se observan en el clavo de olor. Los mohos suelen alcanzar 105 ufc/g en apio, canela, cardamomo, pimienta blanca, romero, salvia, timol, mientras que otras especias tienen recuentos muy bajos. Predominan los Aspergillus, seguidos de Penicillium y Mucorales. B. cereus no ha sido aislado de clavo de olor, pimienta de Cayena y cebollín, pero en otras los recuentos son menores que 104 ufc/g. C. perfringens fue aislado de una amplia variedad de especias con valores inferiores a 500 ufc/g (2). REFERENCIAS 1. Jay JM et al. 2005. Modern Food Microbiology. 7° ed. Springer, New York, p 125. 2. Downes FP, Ito K, eds. 2001. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. APHA, Washington, p 515, 533, 561. 3. Guinebretiere MH et al. 2001. Appl. Environ. Microbiol. 67: 4520. 4. Berrang ME et al. 1989. Appl. Environ. Microbiol. 55: 2167. 5. Hernández Y, Trujillo G. 2004. Interciencia 29: 447. 6. Webb TE, Mundt JO. 1978. Appl. Environ. Microbiol. 35: 655.
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GRANOS y HARINAS La microbiota de los granos de cereales y leguminosas es la proveniente del suelo y el ambiente del depósito, además de la adquirida durante el procesamiento. Aunque tienen alta concentración de carbohidratos y proteínas, su baja actividad de agua restringe el crecimiento microbiano si se almacenan adecuadamente (1). Las condiciones de almacenamiento, tales como el contenido de humedad de los granos, la temperatura y el tiempo de almacenamiento, son factores críticos en el control de los microorganismos. Las distintas variedades de granos no presentan grandes diferencias entre sí, respecto a las poblaciones microbianas. Los mohos, las levaduras y la mayoría de las bacterias mesofílicas presentes, son indígenas de las plantas. Algunos tipos de granos están constantemente contaminados con mohos tales como Cladosporium, mientras que otros contienen Aspergillus, Fusarium, Alternaria y otros. Los contaminantes bacterianos (coliformes, enterococos, E. coli) son aportados por los pájaros, insectos y roedores, los cuales están ecológicamente asociados a los granos (2). Para prevenir el crecimiento de mohos, el contenido de humedad de los cereales debe ser tan bajo como sea posible. Un aumento de 0,5% en el rango de 14,2 a 15,5% eleva la cantidad del desarrollo de Aspergillus amstelodami, A. repens y otros en un período de un mes. El ataque fúngico de los granos comienza en el campo antes que el grano esté maduro. La contaminación con micotoxinas puede ocurrir en el campo o durante el almacenamiento y no está limitada a una región geográfica o climática particular (3). La población bacteriana en los granos es alta, pero el número de patógenos es bajo y suele incluir B. cereus, C. perfringens, C. botulinum y en algunos casos Salmonella spp. Los niveles de mohos y levaduras también son elevados, y si los granos están secos mueren lentamente. La baja actividad agua de los granos de cereales evita el desarrollo de las Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 8
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bacterias, pero estos organismos pueden sobrevivir durante la molienda y contaminar las harinas (2). El número de microorganismos de las harinas de cereales es relativamente bajo debido a los agentes blanqueadores. Cuando las condiciones de humedad favorecen el crecimiento aparecen por lo común las bacterias del género Bacillus y diversos tipos de mohos. Varias especies aeróbicas formadoras de endosporos, son capaces de producir amilasa, la que les permite usar la harina y productos relacionados. Con una humedad algo menor puede haber crecimiento micelial y formación de esporas fúngicas (1). Los panes caseros pueden presentar una alteración limosa debida a especies amilolíticas de B. subtilis y ocasionalmente B. licheniformis, B. cereus, B. firmus y B. firmus provenientes de la harina (4). Los panes producidos comercialmente carecen de humedad suficiente para permitir el crecimiento de microorganismos, excepto los mohos. Éstos aparecen cuando el pan es almacenado en un ambiente húmedo o envuelto mientras aún está caliente, los más comunes son Rhizopus stolonifer que crece a una a w >0,93 y Neurospora sitophila, pero también suelen desarrollar especies de Penicillium o Aspergillus cuyas esporas germinan a una a w entre 0,90 y 0,84 (1). Las levaduras amilolíticas de los géneros Saccharomycodes e Hyphopichia producen el pan yesoso (5). El deterioro de los productos de pastelería refrigerados, por ejemplo la masa de pizza, es causado principalmente por bacterias lácticas (Lactobacillus, Leuconostoc y en menor proporción Streptococcus), alcanzando valores de 10 8 ufc/g en los productos alterados, pero los mohos se hallan en bajo número. Las tortas, en cambio, rara vez sufren un deterioro bacteriano debido a la alta concentración de azúcares pero son alteradas por los mohos; éstos provienen de cualquiera de los ingredientes (1). ANALISIS MICROBIOLOGICO
La microbiota normal de los granos de cereales comprende mohos (102 - 104 /g), levaduras y hongos levaduriformes (10 2 104 /g), bacterias aerobias (10 2 - 106 /g), coliformes (10 2 - 104 /g), E. coli (<102 - 103 /g), actinomicetos (10 3 - 106 /g). Carrillo L
86 RECUENTO DE Bacillus cereus
Sembrar en sendas placas del medio de cultivo con 0,1 mL de -2 -6 las diluciones decimales del alimento (comúnmente 10 a 10 ) y extender el inóculo con una varilla de vidrio doblada en L. Incubar a 30ºC durante 24 hs. Si es necesario incubar otras 24 hs. Observar las colonias redondas, chatas, secas, de color rosado a violeta pues no ha sido fermentado el manitol, rodeadas de un precipitado causado por la actividad lecitinasa. Repicar 5 colonias en agar nutritivo e incubar a 30ºC durante 24 hs. Colorear las preparaciones; observar el endosporo verde, central a subterminal, que no deforma la célula y los glóbulos pseudolipídicos dentro del citoplasma teñido de azul obscuro. AGAR MYP. Extracto de carne 1 g, peptona 10 g, D-manitol 10 g, cloruro de sodio 10 g, rojo de fenol 0,025 g, agar 15 g, agua 900 mL. Distribuir en porciones de 200 mL Esterilizar a 120ºC durante 20 minutos. Enfriar a 50ºC, agregar 10 mL de la emulsión de yema de huevo y 2 mL de la solución de polimixina. SOLUCIÓN DE POLIMIXINA . Disolver 500.000 unidades de sulfato de polimixina B estéril en 50 mL de agua destilada estéril. COLORACIÓN DE ENDOSPOROS Y GLOBULOS DE POLIHIDROXIBUTIRATO.. Cubrir con verde de malaquita al 5% y calentar dos o tres veces sin que se seque. Lavar, secar con papel y cubrir durante 20 minutos con solución de negro Sudan B al 0,3% en etanol al 70%. Volcar y cubrir con xileno durante 10 segundos. Secar y colorear con safranina al 0,5% durante 20 segundos (2).
La microbiota normal de las harinas y sémolas de cereales contiene mohos (<10 2 - 104 /g), levaduras y hongos levaduriformes (<10 - 102 /g), bacterias aerobias (10 2 - 106 /g), coliformes (<10 - 102 /g), endosporas del limo (<10 - 102 /g). Las harinas de soja a veces contienen Salmonella (2). El análisis de los subproductos de cereales (salvado, harinas, etc) comprende el recuento de mohos (n = 5, c = 2, m = 102 /g y M = 10 4 /g), la investigación de endosporos de bacterias formadoras de limo (n = 5, c = 2, m = 10 2 /g y M = 10 4 /g), la de endosporas de bacterias termófilas (n = 5, c = 2, m = 10 2 /g y M = 104 /g), la de B. cereus (n = 5, c = 1, m = 10 3 /g y M = 10 5 /g) y la de C. perfringens (n = 5, c = 1, m = 10 2 /g y M = 104 /g), mediante métodos normalizados (6). Los límites dados por el art 720 del Código Alimentario Argentino (CAA) para las pastas frescas refrigeradas y Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 8
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vendidas dentro de las 48 hs son Salmonella ausente en 25 g y S. aureus coagulasa positiva < 10 3 ufc/g, y para las rellenas además de estos valores, clostridios sulfito-reductores < 10 3 ufc/g. Las pastas frescas adicionadas de propionato o sorbato, con o sin relleno, deben cumplir (art 721) con mohos y levaduras < 10 4 ufc/g, además las pautas establecidas en el art anterior. Otras bacterias esporuladas anaerobias sulfito-reductoras además de C. perfringens, son C. absonum, C. baratii, C. celatum, C. bifermentans, C. botulinum, C. sporogenes (2). RECUENTO DE Clostridium perfringens -1
-5
Preparar diluciones 10 a 10 en un diluyente con cisteína.* Distribuir 10 mL de cada dilución en 10 tubos estériles con tapa a rosca y volcar de inmediato en cada uno 10 mL de agar sulfito fundido y a 50ºC. Una vez gelificado cubrir con una capa de agaragua de 3 cm de espesor. Incubar a 46ºC durante 14-18 hs. Contar el número de colonias negras y multiplicar por el factor de dilución correspondiente. Confirmar mediante observación de la inmovilidad de las células, la reducción de nitratos, la licuación de gelatina en 24-48 horas y la producción de ácido y gas por fermentación de lactosa pero no de rafinosa. DILUYENTE CON CISTEINA. Peptona 1 g, cloruro de sodio 9 g, clorhidrato de cisteína 1 g, agua 1 litro. Esterilizar a 120ºC durante 20 minutos. AGAR-AGUA. Agar 15 g, agua 1 litro. Esterilizar a 120ºC durante 20 minutos. AGAR SULFITO. Triptona 15 g, extracto de levadura 10 g, citrato férrico 0,5 g, agar 15 g, agua 1 litro, pH 7,0. Esterilizar a 120ºC durante 20 minutos. Enfriar a 50ºC. Añadir 10 mL de sulfito de sodio heptahidratado al 5% y 10 mL de D-cicloserina al 4%, esterilizados por filtración (5). MEDIO GELATINA LACTOSA. Triptosa 15 g, extracto de levadura 10 g, lactosa 10 g, gelatina 120 g, rojo de fenol 0,05 g, agua 1 litro, pH 7,5. Distribuir en tubos con tapa a rosca. Esterilizar a 120ºC durante 10 minutos. La licuación se observa luego de enfriar el cultivo. MEDIO FERMENTACION. Tripticase 10 g, neopeptona 10 g, agar 2 g, tioglicolato de sodio 0,25 g, agua 1 litro, pH 7,4. Distribuir en tubos con tapa a rosca. Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos. Agregar 1 mL de solución estéril de rafinosa al 10% (2). * No calentar la dilución porque esta bacteria esporula muy poco en los alimentos.
Carrillo L
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El CAA establece en el art. 1497 para la harina de soja los límites siguientes: bacterias totales <20.000/g, bacterias termófilas <1.500/g, endosporos <10 /10g, coliformes negativo /g, E. faecalis negativo /g, Staphylococcus negativo /g, C. perfringens <100/g, Salmonella negativo /50g, levaduras y mohos < 50/g, aflatoxinas <30 ng/g (7). RECUENTO DE Bacillus FORMADORES DE LIMO
Pesar 50 g de harina u otro ingrediente en un recipiente estéril, agregar 450 mL de solución de peptona al 0,1%, agitar enérgicamente durante 2 minutos y colocarlo en un baño de -2 agua hirviente durante 20 minutos. Preparar las diluciones 10 a -4 10 . Sembrar 0,1 mL en sendas placas de agar triptona glucosa, extendiendo con una varilla de vidrio en L. Incubar a 35ºC durante 48 hs. Contar las colonias blanco grisáceo, que se vuelven secas y arrugadas. Multiplicar por el factor de dilución correspondiente, para obtener el número de endosporos de bacterias formadoras de limo por gramo. AGAR TRIPTONA GLUCOSA. Triptona 5 g, extracto de levadura 2,5 g, glucosa 1 g, agar 15 g, agua 1 litro, pH 7. Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos (2).
REFERENCIAS 1. Jay MJ et al. 2005. Modern Food Microbiology. 7ª ed. Springer, New York, p. 199. 2. Downes FP, Ito K, eds. 2001. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4ª ed. APHA, Washington, p. 223, 327, 549. 3. ICMSF. 1998. Microorganisms in food. Vol 6: Microbial Ecology of Food Commodities. Blackie Academic & Professional, London, p. 313. 4. Pepe O et al. 2003. Appl Environ Microbiol 69: 2321. 5. Mossel DAA et al. 2003. Microbiología de los Alimentos. Acribia, Zaragoza, p. 548. 6. ICMSF. 1981. Microorganismos de los Alimentos. Vol 2. Acribia, Zaragoza, p.109. 7. Código Alimentario Argentino. http//:www.anmat.gov.ar/codigoa /caa1.htm cap 9.
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MICOTOXINAS Los mohos crecen sobre los materiales vegetales produciendo el deterioro de los mismos. Forman metabolitos secundarios que actúan como antibióticos favoreciendo la prevalencia del moho frente a otros microorganismos, muchos de los cuales son tóxicos para plantas y/o animales. Estos metabolitos que enferman o matan a los animales que los consumen se conocen como micotoxinas y la afección se llama micotoxicosis. Las micotoxinas en la mesa del consumidor constituyen un problema que comienza en el campo y continúa durante el acopio y la comercialización, cuya única solución es prevenir el crecimiento fúngico. Se ha comprobado la acción de unas pocas toxinas en brotes de intoxicación humana y animal, las otras han sido ensayadas en animales de experimentación. La presencia de las micotoxinas en los vegetales puede deberse: o a la infección de la planta en el campo por el hongo patógeno o a la colonización por los saprobios, o al crecimiento de los mohos saprobios o patógenos postcosecha sobre los frutos y granos almacenados, o al desarrollo fúngico saprobio durante el almacenamiento de los productos ya procesados (1). Las micotoxinas son compuestos ubicuos que difieren en sus propiedades químicas, biológicas y toxicológicas. Una micotoxicosis primaria se produce al consumir vegetales contaminados, y secundaria al ingerir carne o leche de animales que comieron forrajes con micotoxinas (2). La presencia de aflatoxina M 1 en la leche materna es consecuencia de la ingestión de aflatoxina B 1 con los alimentos y provoca una micotoxicosis en el bebé (3). Las características de una micotoxicosis son las siguientes: o no es una enfermedad transmisible, o el tratamiento con drogas o antibióticos tiene poco o ningún efecto, o en los brotes observados en el campo, el problema es estacional debido a que las condiciones climáticas afectan al desarrollo del hongo, Carrillo L, Gómez Molina SE
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el brote está comúnmente asociado a un alimento o forraje específico, o el examen del alimento o forraje sospechoso revela signos de actividad fúngica (2). Los primeros casos de micotoxicosis conocidos en la Edad Media fueron debidos al centeno contaminado con Claviceps purpurea. En 1912 Quevedo (4), en la Argentina, describió la acción de los metabolitos tóxicos de un Aspergillus del maíz sobre varias especies animales, lo que constituye la primera observación científica de las micotoxicosis en Sudamerica. En 1960 la intoxicación masiva de pavos en Inglaterra llevó al aislamiento de las aflatoxinas, llamadas así pues son producidas por especies del grupo Aspergillus flavus (2). o
MOHOS
Los hongos adquiridos en el campo son Alternaria, algunos Aspergillus, Cladosporium, Epicoccum, Fusarium, Verticillium, además de otros fitopatógenos, y las especies difieren según el vegetal, el clima y la región geográfica (5, 6). Para crecer requieren generalmente una humedad relativa entre el 90 y 100% y un contenido de agua en los granos de 22 a 23%, con un amplio rango de temperatura entre 0 y 30°C, aunque algunos pueden desarrollarse a 35°C o más (7). La colonización de las partes aéreas de las plantas por los microorganismos comienza tan pronto como son expuestas al aire. Las bacterias suelen aparecer primero, luego las levaduras y finalmente los hongos filamentosos saprobios y patógenos. Los mohos continúan desarrollándose a lo largo de todo el crecimiento de la planta, lo que se acentúa cuando envejece y las semillas maduran. La cosecha perturba el ecosistema y las condiciones relativamente estables del almacenamiento entrañan un profundo cambio en la composición de la microbiota (5). Los restos vegetales abandonados en el campo suelen albergar esclerocios, como en el caso de A. flavus, que serán la fuente de contaminación del cultivo en la temporada siguiente (6). El crecimiento fúngico continua en los productos frescos después de la cosecha y causa lesiones que desfiguran el aspecto de frutas y hortalizas. Los hongos toxigénicos persisten Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 9
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en los granos de cereales secos y soportan la competencia de otras especies incorporadas posteriormente (7). Otros hongos presentes en los productos almacenados son especies de Aspergillus, Penicillium y algunos xerófilos (5). Los factores que influyen en su desarrollo son el contenido de humedad del substrato, la temperatura, el tiempo, el grado de invasión fúngica antes del almacenamiento y la actividad de insectos y ácaros que facilitan la diseminación. Requieren menor humedad relativa ambiente (70 - 90%) y menor contenido de agua en las semillas (15 - 20%), pero el rango de temperatura es más amplio (0 - 45°C) y pueden crecer a una concentración de oxígeno más baja (7). PRODUCCIÓN DE MICOTOXINAS
La microbiota sobre y dentro de los vegetales afecta la calidad y el comportamiento durante el acopio y el procesamiento de varios productos hortícolas. La competencia entre las poblaciones microbianas mixtas que se encuentran naturalmente suele constituir una desventaja para la producción de las micotoxinas (1). Se conocen algunas especies fúngicas, por ej. Trichoderma viride, que inhiben la producción de aflatoxinas. A su vez A. flavus impide la formación de toxinas en un cultivo mixto con Aspergillus ochraceus o Aspergillus versicolor (2). También A. flavus y A. ochraceus inhiben la formación de toxinas de Myrothecium. roridum en un cultivo mixto (8). En cambio la rubratoxina B, un metabolito de Penicillium purpurogenum, aumenta la producción de aflatoxinas por Aspergillus parasiticus, y el ácido ciclopiazónico producido por A. flavus potencia la acción de la aflatoxina B 1 (2). El metabolismo primario de los mohos es similar al de la mayoría de los organismos eucarióticos. Los metabolitos secundarios son formados a partir de unos pocos intermediarios del metabolismo primario, bajo condiciones sub-óptimas y de estrés (1). Durante la biosíntesis de estos metabolitos, la cantidad producida depende no sólo de los parámetros nutricionales y ambientales, sino también de la historia del desarrollo del moho. La formación de las micotoxinas refleja que el hongo ha alcanzado cierto grado de Carrillo L, Gómez Molina SE
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diferenciación bioquímica, fisiológica y morfológica (2). Se conocen unas 300 toxinas fúngicas. Las micotoxinas son especificas. Cuanto más compleja es la ruta biosintética de estos metabolitos secundarios, más restringido es el número de especies de hongos productores. La aflatoxina B1 es generada por tres especies estrechamente relacionadas Aspergillus nomius, A. flavus y A. parasiticus (9). La patulina es producida por unas once especies de Penicillium, tres de Aspergillus y dos de Byssochlamys (2). Es enorme la variabilidad en la producción de metabolitos secundarios por una especie dada. Penicillium roqueforti produce algunas micotoxinas en las condiciones de laboratorio pero no en los quesos madurados. Los rendimientos de toxina T-2 por cepas de Fusarium sporotrichioides varían considerablemente cuando crecen en el laboratorio, y no todas las cepas de A. flavus son aflatoxigénicas (2). Por otra parte, la temperatura tiene una gran influencia sobre el crecimiento y la actividad de los mohos. El género Aspergillus es más común en los trópicos, Penicillium predomina en las zonas templadas y Fusarium está asociado a los climas fríos, aunque hay algunas especies tropicales. La temperatura a la cual el material amohosado es incubado en el laboratorio puede influir en la microbiota aislada. La incubación a 12° C favorece el aislamiento de Penicillium verrucosum de un substrato con ocratoxina A, donde predomina el género Aspergillus (7). El estrés por sequía durante el período del crecimiento del maní puede conducir a la presencia de aflatoxinas, si la temperatura de la geocarpósfera se Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 9
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mantuvo entre 20 y 32°C durante las seis semanas anteriores a la cosecha (2). Aunque el crecimiento de P. verrucosum ocurre entre 0 y 31°C a una aw = 0,95, la producción de ocratoxinas sólo se detecta si el rango de temperatura estuvo entre 12 y 24°C, siendo máxima a 20°C y aw = 0,85 (9). Alternaria arborescens produce la máxima concentración de alternariol sobre granos de trigo a 25° C con una a w = 0,98, pero la producción óptima de ácido tenuazónico ocurre a 20°C con un contenido de humedad más elevado. Por otra parte, Fusarium graminearum produce la mayor cantidad de zearalenona a 25°C y de desoxinivalenol a 28°C a una aw = 0,98. También influye el pH del substrato, así la producción de patulina en manzanas debida a Penicillium expansum se produce en un rango de pH 3,2 - 3,8, mucho más estrecho que aquel en que hay un crecimiento activo (2). La planta sana en crecimiento tiene muchas barreras a la infección, pero éstas suelen ser sobrepasadas por microorganismos especializados que conducen a una interrrelación planta-hongo muy específica. También los tejidos de las plantas suelen acumular substancias tóxicas como mecanismo específico de defensa ante el ataque de algunos hongos, como es el caso de las papas invadidas por Phytophthora infestans (10). En el campo se observa que una micotoxina particular se produce en gran cantidad sobre un producto y no sobre otro. Así los tricotecenos están asociados a cereales de zonas templadas, y las aflatoxinas se encuentran con más frecuencia en oleaginosas y cereales de zonas cálidas, pero no Carrillo L, Gómez Molina SE
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suelen aparecer en cantidades significativas en soja probablemente debido a sustancias inhibitorias del grano (2). CUADRO 1. Afecciones en el hombre provocadas por la ingestión de
micotoxinas.
MICOTOXINAS
aflatoxina B1
AFECCIONES
inducción de cáncer hepático, se excreta por leche como aflatoxina M 1, pasa al feto (3, 11, 12, 13)
inducción de cáncer hepático, excretada en leche materna, pasa al feto (3) alcaloides del ergotismo convulsivo; ergotismo gangrenoso ergot necrótico (9) citroviridina beriberi cardíaco agudo (2) diarrea, nauseas, vómitos, cefalalgia, dolor desoxinivalenol abdominal, anorexia, escalofríos, convulsiones, vértigo; inmunotoxicidad (9) fumonisinas lesiones precancerosas en esófago (9, 14) moniliformina cardiopatía endémica en China (15) nefropatía endémica de los Balcanes, Túnez y Escandinavia; excreción por leche materna, ocratoxina A pasa al feto; tumores en tracto urinario (3, 16, aflatoxina M1
17, 18, 19)
psoralenos T-2 y HT-2 zearalenona
dermatitis por contacto, eritema y ampollas (2)
aleukia tóxica alimentaria: sensación de quemazón en boca y garganta; vómitos, diarrea y dolor abdominal; hemorragias; destrucción de médula ósea; inmunosupresión; muerte (9) cambios puberales precoces (9)
La presencia de una micotoxina, y el peligro asociado, solamente puede ser determinada después de la extracción e identificación de la misma porque: o la presencia del hongo no asegura que exista una micotoxina, o la micotoxina continúa en el alimento aunque el moho haya desaparecido, Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 9
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un hongo dado puede producir más de una micotoxina, o una determinada toxina puede ser formada por más de una especie de moho (1). En el cuadro 1 se resumen las afecciones provocadas en el hombre por la ingesta de algunas micotoxinas, y en el 2 los hongos que las producen. o
CUADRO 2. Mohos productores de algunas micotoxinas (2, 9, 20, 21, 22).
MICOTOXINAS
MOHOS
aflatoxinas
Aspergillus flavus, A. nomius, A. parasiticus Claviceps purpurea, Neotyphodium coenophialum Aspergillus terreus, Eupenicillium ochrosalmoneum, Penicillium citreonigrum Fusarium culmorum, F. graminearum, F. pseudograminearum Alternaria arborescens, Fusarium nygamai, F. proliferatum, F. verticilloides Fusarium acuminatum, F. avenaceum, F. fujikuroi, F. proliferatum, F. subglutinans, F. thapsinum Aspergillus alliaceus, A. carbonarius, A. melleus, A. niger, A. ochraceus, A. sclerotiorum, A. sulphureus, Penicillium verrucosum Sclerotinia sclerotiorum Fusarium armeniacum, F. equiseti, F. musarum, F. poae, F. sporotrichioides Fusarium crookwellense, F. culmorum, F. equiseti, F. graminearum, F. semitectum
alcaloides del ergot citroviridina desoxinivalenol fumonisinas moniliformina
ocratoxina A psoralenos toxina T-2 zearalenona
INCIDENCIA Y LÍMITES
La contaminación con micotoxinas de los productos hortícolas y animales no es grande, mientras que la de los granos es variable. Algunos mohos toxigénicos no producen micotoxinas sobre todos los substratos, pero tampoco fueron Carrillo L, Gómez Molina SE
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buscadas todas las toxinas que potencialmente podrían producir en los materiales amohosados. Las concentraciones de micotoxinas se expresan en µg/kg (1/109), lo que equivale a la relación que existe entre una regla de dibujo y la distancia entre la tierra y la luna. La acción de estas pequeñas cantidades es acumulativa manifestándose la enfermedad, en algunos casos, al cabo de meses o años. Esto ocurre principalmente con las toxinas mutagénicas. La aflatoxina B1 y las fumonisinas parecen estar relacionadas a los cánceres hepático y esofágico, respectivamente (9). Además, la infección viral hepática es un factor adicional que aumenta la sensibilidad a las micotoxinas. Entre los factores valorados para establecer límites a la presencia de micotoxinas en los alimentos se encuentran: o la distribución de la micotoxina en el producto, o las limitaciones inherentes al método de análisis, o la evaluación de los riesgos y el potencial tóxico, o la disponibilidad de alimentos para la población (23). El nivel de aflatoxinas en los alimentos es muy variable, oscilando los valores en choclo y maíz entre 0,1 y 2.000 µg /kg (11). En Argentina se impusieron límites de 5 µg de aflatoxina B1/kg y 20 µg de aflatoxinas totales/kg para el contenido en alimentos de consumo humano, mientras que FAO/OMS establecieron 15 µg de aflatoxinas totales/kg basadas en los posibles problemas económicos que generaría un nivel menor (24). En nuestro país, el contenido de aflatoxina M 1 en leche oscila entre 0 y 0,9 µg /L según el tipo de forraje y se concentra 3 a 6 veces durante la elaboración de los quesos. La ingesta media en la dieta latinoamericana, se encuentra entre 0 y 0,52 µg/kg, lo que constituye un riesgo muy bajo para la salud humana (25). Los pollos de engorde que ingieren 0,07 mg de aflatoxina B1 por kg de alimento presentan síntomas de hepatotoxicidad en 42 días (26). Los tricotecenos (desoxinivalenol, toxina T-2 y otros) causan distintas afecciones según la toxina específica y la cantidad ingerida. El desoxinivalenol, también llamado vomitoxina, es un contaminante frecuente del trigo, tiene propiedades inmuno y neurotóxicas, y es 70 veces menos tóxico que la toxina T-2 (15). Los tricotecenos en su mayor parte son destruídos en el rumen. El rango de los residuos de toxina T-2 Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 9
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en carne y vísceras vacunas es 8,8-18,5 µg/kg y en leche 11,4 µg/kg para animales que consumieron forraje con 31 mg/kg (27). El nivel máximo admisible de toxina T-2 y HT-2 es 100 y 25100 µg/kg respectivamente, mientras que el de desoxinivalenol es 5.000-10.000 µg/kg (23). La toxicosis en humanos fue observada en Ucrania (11) y varias regiones de Asia (28). PRESENCIA DE DESOXINIVALENOL EN TRIGO
Añadir 200 mL de acetonitrilo-agua (84+16) a 50 g de granos triturados o harina y agitar enérgicamente durante 30 minutos. Filtrar y recoger 20 mL en un vaso. b . Preparar una columna con 1,5 g de una mezcla de carbón activado, alúmina neutra activada y tierra de diatomeas previamente lavada con ácido (7+5+3). Aplicar succión y tapar con lana de vidrio. Agregar 20 mL del filtrado y cuando alcance el ápice del relleno, añadir los 10 mL de acetonitrilo-agua (86+14) con los que se enjuagó el vaso, continuando la succión hasta que el flujo se detenga. Recoger los eluatos. c. Evaporar el solvente y retomar en 3 mL de acetato de etilo. Pasar a un tubo con tapa. Enjuagar con tres porciones de 1,5 mL de acetato de etilo y agregarlas al tubo. Evaporar a sequedad el contenido del tubo. d. Disolver el extracto en 100 µL de cloroformo-acetonitrilo (4+1) y aplicar alícuotas de 5 y 10 µL junto a 1, 2, 5, 10 y 20 µL del testigo (20 ng desoxinivalenol/µL) sobre la placa de gel de sílice G-60. Desarrollar con cloroformo-acetona-isopropanol (8+1+1). Evaporar bajo campana de extracción de vapores durante 10 minutos. e. Rociar con solución hidroalcohólica (1+1) de cloruro de aluminio hidratado al 20%. Mirar bajo luz UV para detectar interferencias. Calentar la placa en estufa a 120ºC durante 7 minutos y observar la mancha celeste de desoxinivalenol a un Rf aproximado de 0,6 (31). a.
Los niveles de contaminación de productos agrícolas con fumonisinas pueden alcanzar hasta 330.000 µg/kg, principalmente en los destinados al consumo animal. El nivel medio en maíz de exportación es menor que 300 µg fumonisina B 1/kg (29). La “International Agency for Research on Cancer” clasificó a estas micotoxinas como posibles cancerígenos en humanos (11). Carrillo L, Gómez Molina SE
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En Argentina, la ingesta media diaria estimada de fumonisina B1 es 0,2 µg /kg de peso corporal y este valor debería aumentarse un 40% si se consideran fumonisinas totales. La ingesta diaria por persona en Latinoamérica oscila entre 0,2 y 17.000 µg (30). Hay una correlación positiva entre el contenido de esta toxina y el cáncer de esófago en zonas de China (23). PRESENCIA DE AFLATOXINAS EN MANÍ
Mezclar 25 g de muestra molida u homogeneizada con 100 mL de metanol-agua (85+18), agitar 30 minutos y filtrar. b . Tratar 50 mL del filtrado en ampolla de decantación con 50 ml de cloruro de sodio al 10 % y 25 mL de hexano, agitar, dejar separar las fases y eliminar la capa superior. c. Agitar el filtrado desengrasado en ampolla de decantación con 25 mL de cloroformo, repetir con igual volumen. Combinar los extractos clorofórmicos, evaporar el solvente en baño de agua. d. Preparar una columna de 6 mL rellena con 0,5 g de gel de sílice 60 y 0,75 g de sulfato de sodio anhidro arriba. Lavar con 3 mL hexano y luego 3 mL diclorometano, usando vacío. Disolver el residuo en 3 mL de diclorometano y agregarlo. Enjuagar con dos porciones de 1 mL de diclorometano y añadirlas a la columna. Lavar con 3 mL de hexano, 3 mL de éter etílico anhidro y 3 mL de diclorometano. Eluir las aflatoxinas con tres porciones de 2 mL de cloroformo-acetona (9+1). Reunir los eluatos y evaporar el solvente. e. Disolver el extracto en 100 μL de cloroformo. Sembrar 5, 10 y 10 μL de muestra en placa de gel de sílice G60, previamente activada una hora a 110°C, y 2, 5, 7 y 10 μL del testigo de concentración conocida, además de 5 μL del testigo sobre una de las siembras de 10 μL de la muestra. Correr con cloroformoacetona (9+1 volúmenes). Dejar evaporar el solvente en una campana y terminar de secar en una estufa a 50ºC. Observar bajo luz UV 366 nm para ver la fluorescencia de las manchas con la misma apariencia y Rf que el testigo. Los valores de Rf se encuentran alrededor de 0,40, 0,36, 0,32 y 0,29 para las aflatoxinas B1, B2, G1 y G2 respectivamente (39). f . Rociar con ácido sulfúrico-agua (1+3). Las aflatoxinas cambian la fluorescencia azul o verde a amarillo (31). a.
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99 PRESENCIA DE FUMONISINAS EN MAÍZ
Mezclar 50 g de muestra homogeneizada y molida con 100 mL de metanol - agua (3 +1), agitar durante 60 minutos y filtrar. b. Ajustar a pH 6,0 - 6,1 y pasar 10 mL de filtrado por un cartucho SAX intercambiador de aniones. Eluir con una solucion de ácido acético al 0,5% en metanol. c. Evaporar a sequedad el eluído bajo una corriente de aire, disolver el residuo con 100 μL de metanol. d. Sembrar 5, 10 y 10 μL en una placa de sílicagel normal secando con corriente de aire, una siembra simultáneamente con 10 μL de testigo (100 ng de fumonisina B 1). Correr con cloroformo - metanol - ácido acético (60 + 35 +10). e. Rociar con p-anisaldehído al 0,5% en metanol - ácido sulfúrico - ácido acético (85 +5 +10). Calentar a 110°C durante 5 minutos y fumonisina B1 aparecerá de color rojo a un Rf aproximado de 0,32 (40, 41, 42). a.
Mientras que los psoralenos originan fotodermatitis, la zearalenona es hiperestrogénica (2). La “Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives” (JECFA) estableció una ingesta máxima tolerable de zearalenona de 0,5 µg toxina/kg de peso corporal/día (32). La ocratoxina A también es considerada como posible cancerígena y los valores máximos en granos alcanzan hasta 5.000 µg/kg. La JECFA estimó tolerable una ingesta semanal máxima de 0,1 µg/kg de peso corporal. y se establecieron límites de 1 a 50 µg/kg para el consumo humano y veinte veces mayor para los animales (11). PREVENCIÓN
El manejo correcto de los cultivos y cosechas, y el control de la calidad de los alimentos para los animales de la granja constituyen los únicos medios de prevención. La presencia de cualquier alteración organoléptica de frutas u hortalizas es causa suficiente para rechazar el producto por la potencial formación de toxinas debida al deterioro fúngico, las que se distribuyen con facilidad por todo el substrato, por ejemplo en los tomates. Por otra parte, es difícil prever la presencia de micotoxinas al adquirir carnes, huevos y quesos ‘caseros’, sin Carrillo L, Gómez Molina SE
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conocer cuál era el estado de los animales y la calidad de los alimentos que consumían (1). Una vez formadas las micotoxinas no se pueden eliminar durante el procesamiento culinario o industrial, aunque en unos pocos casos se reduce su contenido (33, 34, 35, 36). Las micotoxinas son moderadamente estables a los procedimientos de tostado, así los maníes pierden alrededor del 40% de aflatoxina B1 y los granos de café verde cerca del 80% de ocratoxina A. El proceso de panificación reduce en un 16 a 69% el desoxinivalenol presente en la harina de trigo. El tratamiento de maíz quebrado con NaOH disminuye significativamente el contenido de aflatoxina, pero la preparación del grano entero con Ca(OH)2 reduce sólo un 40% de la misma (2). La mayor cantidad de toxina suele estar concentrada en unos pocos granos y si se logra separarlos, se disminuye la proporción en los subproductos. Las técnicas de clasificación visuales se han usado en maníes y la selección neumática con las nueces de Pará. El mondado de las manzanas para remover las zonas alteradas reduce entre 93 y 99% el contenido de patulina en la sidra preparada con las mismas (2). La fermentación alcohólica no destruye las fumonisinas ni la panificación al desoxinivalenol (37) pero algunos Lactobacillus inhiben las producción de toxinas (38). La bentonita y otros sílicoaluminatos adsorben las aflatoxinas de los substratos pero no otras micotoxinas, y suelen ser mezclados con los alimentos para aves (2). REFERENCIAS 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
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Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 9
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Carrillo L, Gómez Molina SE
102
CARNES ROJAS La carne roja de vacunos, búfalos, cerdos, ovejas, cabras, llamas y otras especies, es un medio de cultivo excepcional para el desarrollo de la mayoría de los microorganismos. Tiene un alto contenido de proteínas, baja proporción de carbohidratos y sustancias solubles de menor peso molecular, y una aw = 0,99. La humedad disponible para el crecimiento microbiano se expresa en términos de actividad agua (a w) cuyo valor es 1 para el agua pura y por ejemplo, 0,990 para una solución 0,30 molal de cloruro de sodio. El contenido en vitaminas del músculo es muy elevado (unos 60 µg/g) y comprende a tiamina, riboflavina, niacina, ácido fólico, ácido pantoténico, B6, B12 y biotina (1). El tejido muscular está recubierto por sus fascias protectoras y las miofibrillas contenidas dentro del sarcolema. Una vez que han sido descuartizadas las reses, gran parte de su protección inicial se destruye y durante el picado desaparece por completo. Los alimentos de origen animal poseen sustancias inhibidoras como las inmunoproteínas, muy específicas en su acción pero con un reducido espectro de actividad antimicrobiana, que no proveen protección práctica alguna (2). Todos los animales transportan grandes cantidades de microorganismos. Numerosas bacterias, además de mohos y levaduras, están presentes en el cuero, los pelos y las pezuñas de los vacunos, y son transmitidos a la carcasa luego del sacrificio. Los restos de estiércol en la pelambre suelen acceder al músculo, así como el contenido intestinal si la evisceración no se hace cuidadosamente. Por otra parte, las bacterias también pueden proceder de los pisos, paredes, mesadas, cuchillos y manos de los operadores en la planta de faena (1). Los bacterias psicrotróficas de la superficie de las carnes no provienen del intestino e incluyen especies de Pseudomonas, Moraxella, Flavobacterium, Acinetobacter, Brochothrix thermosphacta, y algunas Enterobacteriaceae y Lactobacillaceae (2).
En la superficie de la carne bovina suelen encontrarse varios tipos de Escherichia coli, algunas especies de Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 10
103 Enterobacter y Serratia, Pantoea agglomerans, Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Yersinia enterocolitica (3, 4), Enterococcus (5), Listeria (6), Salmonella, Campylobacter (7), Clostridium (8), Streptococcus, Corynebacterium (9), Staphylococcus, Bacillus, bacterias lácticas, mohos y levaduras (1).
La microbiota dominante en el tracto gastrointestinal de los cerdos jóvenes está compuesta por E. coli, Clostridium perfringens, Streptococcus, también se halla Campylobacter coli en el intestino delgado. Estos animales son más susceptibles a las infecciones por Salmonella, siendo S. Cholerae-suis el huésped específico y le siguen en frecuencia S. Typhimurium y S. Derby. Algunos cerdos sanos son portadores de Y. enterocolitica (1). El cuidado esmerado de la higiene durante la faena puede reducir de modo importante la carga microbiana de las carnes, pero no puede prevenir la contaminación. El tratamiento con soluciones de ácido láctico o de fosfato trisódico suele reducir las enterobacterias y otros microorganismos patógenos, si se aplican dentro de las dos horas después del sacrificio, cuando las bacterias gram-negativas todavía no se han fijado a los tejidos (2). Las carnes curadas y fermentadas, por ejemplo salame, contienen cultivos iniciadores que incluyen Pediococcus, Lactobacillus, Micrococcus y Staphylococcus. Para el ‘emplume’ se aplican sobre la superficie del embutido una mezcla de levaduras y especies no toxigénicas de mohos, por ejemplo Penicillium nalgiovense (1).
DETERIORO
Las carnes son fácilmente alterables, sobre todo si están procesadas, pues tienen un pH entre 5,1 y 5,6, adecuado para el desarrollo de la mayoría de los microorganismos, y un potencial de reducción que permite el crecimiento de los anaerobios en profundidad y los aerobios en la superficie (1). Las bacterias están confinadas a la superfice de las carnes durante la fase de crecimiento logarítmico, e interviene en la adhesión al sustrato la carga superficial de los microbios y su hidrofobicidad (10). Las enzimas extracelulares, secretadas por los gérmenes proteolíticos cuando alcanzan su densidad máxima, les permite penetrar en la carne (11). Audisio MC
104
La actividad enzimática dentro de los tejidos del músculo luego de la faena contribuye a cambios favorables, pero las modificaciones organolépticas observadas en la descomposición son el resultado de la proliferación de los microbios y sus metabolitos. Los factores asociados con la alteración de la carne vacuna suelen ser cambios de color y textura, así como el desarrollo de malos olores y limo. La formación de limo tiene lugar en la superficie y se debe a las bacterias lácticas, entre otras, mientras que el agriado ocurre en el interior. El limo se detecta cuando la población microbiana alcanza un valor de 10 7 ufc/cm2 y la aw está próxima a 0,99 (1). El enverdecimiento producido por peróxido es debido a lactobacilos heterofermentadores y Leuconostoc, mientras que el color verde originado al reaccionar el sulfuro de hidrógeno con la hemoglobina es causado por Shewanella putrefaciens y algunas otras bacterias (12). Los anaerobios son importantes cuando la temperatura se eleva por sobre los 25ºC y predominan los clostridios. Alrededor del 60% de las carcasas de cerdos transportan C. perfringens y un 10% contiene Clostridium botulinum. El almacenamiento a bajas temperaturas en las cámaras frigoríficas selecciona a los organismos psicrotrofos, pues no crecen los mesófilos. La velocidad de deterioro es mayor cuanto más alto sea el número inicial de microbios, la temperatura de almacenamiento y la a w de la superficie de los tejidos. Casi toda la contaminación se concentra en la superficie de las reses y sólo un porcentaje pequeño de los microbios que el animal transportaba en la piel y el intestino, está implicado en la alteración cuando se conserva la carne por debajo de 5ºC (1). Por lo general, las primeras etapas de la alteración están acompañadas de una elevación del pH y una mayor capacidad de hidratación de las proteínas cárnicas. La carne de vaca picada en descomposición puede alcanzar valores de pH cercanos a 8,5. Las vísceras son más sensibles al deterioro que el tejido muscular por ser mayor el pH, por ejemplo el hígado tiene un valor cercano a 6,8. S. putrefaciens crece en las carnes con pH superior a 6,0 (13). Después de un almacenamiento prolongado, la alteración comienza a temperaturas de 5 a 7ºC y las bacterias psicroManual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 10
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tróficas que predominan en la superficie de la res son bacilos gram-negativos, aerobios, móviles o no, siendo el género Pseudomonas el responsable de más del 50% de los casos especialmente las especies no pigmentadas (14). En carnes de cerdo y cordero, las enterobacterias psicrotróficas y la gram-positiva B. thermosphacta (15) producen modificaciones de los lípidos superficiales, además pueden encontrarse bacterias lácticas, algunos mohos y levaduras. En general, estos microorganismos no provienen del intestino sino de la piel de los animales, el ambiente de los locales de enfriamiento y el suministro de agua. En las reses almacenadas a temperaturas menores a 4ºC, como la humedad ambiental es menor, se deseca la superficie de la carne donde encuentran casi todos los contaminantes, alcanzando una aw < 0,95. Esto facilita una alteración fúngica superficial y localizada causada por Cladosporium herbarum, Geomyces pannorum, especies de Mucor, Thamnidium, Penicillium o Rhizopus, y algunas levaduras de los géneros Candida, Torulopsis o Rhodotorula. También en el caso de los productos curados, por la disminución de la actividad del agua el principal proceso de alteración es debido a los mohos (16). El picado de la carne distribuye por todo el producto los microorganismos que al principio sólo se encontraban en la superficie favoreciendo la alteración y la vida comercial es mucho más corta que la correspondiente a la res. Colabora con esta situación el que se utilice los recortes y restos más contaminados. El deterioro se debe solo a bacterias, siendo Pseudomonas, Alcaligenes, Acinetobacter, Moraxella y Aeromonas los géneros más importantes (16). Son pocas las especies psicrotrofas de Enterobacteriaceae. En las carnes envasadas en una atmósfera modificada el deterioro se produce entre 7 y 14 días, y las especies dominantes dependen de la proporción de gases usada, la temperatura y el tiempo de almacenamiento. Comúnmente se encuentran Pseudomonas cuando la proporción de oxígeno es elevada y se suele hallar Lactobacillus, pero si la carne se mantiene al aire crecen Pseudomonas, Rahnella y Carnobacterium (17). Puede extenderse la vida útil de la carne enfriada con una atmósfera que contiene entre 10 y 20% de Audisio MC
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CO2, aumentando el grado de inhibición con el descenso de la temperatura (18). Cuando la carne se almacena al vacío y con refrigeración, los causantes del deterioro son bacterias lácticas y B. thermosphacta en la mayoría de los casos. El tipo de organismos predominantes depende de la eficiencia de la barrera al oxígeno y del pH, valores bajos favorecen a las bacterias lácticas (1). Las carnes crudas curadas son tratadas con cloruro de sodio, nitrito, ascorbato y otras sales. Mientras la concentración de las mismas dentro del tejido es baja, es necesario enfriar para prevenir el crecimiento de organismos indeseables como C. botulinum, luego predominan los micrococos y estafilococos, acompañados de bacterias lácticas, B. thermosphacta y mohos, mientras que las especies de Pseudomonas son inhibidas. Las bacterias lácticas ocasionalmente tienen un efecto negativo sobre las carnes curadas cocidas, envasadas al vacío o con atmósfera modificada. Se espera que estos productos se mantengan con buenas condiciones sensoriales de 2 a 4 semanas a una temperatura por debajo de los 10ºC, sin embargo a veces ocurre el deterioro dentro del período de vida útil del producto, generando agriado, formación de gas, limo y/o un líquido blanco. La mayoría de las bacterias encontradas son lácticas y el número está por debajo de 10 ufc/g en el momento del empaquetado, pero pueden alcanzar valores de 108 ufc/g a 10ºC después de 7 a 12 días (19). En las carnes curadas cocidas que son pasterizadas y envasadas con películas flexibles, pueden sobrevivir Enterococcus y otras bacterias lácticas, causando licuación de la gelatina, producción de gas o agriado. Si son envasadas al vacío, la sal y el nitrito combinados con un almacenamiento a baja temperatura evitan el desarrollo de C. botulinum cuyos esporos sobreviven al tratamiento térmico. Por otra parte, el nitrito puede originar nitrosaminas al reaccionar con los componentes cárnicos. Las empanadas y pasteles son rellenados con la carne precocida y una vez cerrados vueltos a cocer. Dado que se suprimen los organismos competidores, cabe la posibilidad del Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 10
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crecimiento de los clostridios si se mantienen a temperatura elevada (1). MICROORGANISMOS PATÓGENOS
La carne vacuna está considerada como el origen de la diseminación de ciertos tipos virulentos de E. coli. Las bacterias Staphylococcus aureus, C. perfringens, Campylobacter spp., Listeria monocytogenes y Salmonella spp., se encuentran en un bajo número sobre las superficies de las carnes crudas sin embargo pero puede aumentar por una manipulación inadecuada (4). Los patógenos más comunes transmitidos por la carne vacuna son Salmonella spp., Staphylococcus aureus y C. perfringens. La carne de cerdo es un vector importante en la transmisión de Campylobacter jejuni y Y. enterocolitica (7). Por otra parte Listeria puede sobrevivir, a temperatura reducida, en la carne procesada porque es osmóticamente tolerante y acumula solutos compatibles en el citosol (20). La presencia de patógenos en la carne cruda es un problema imposible de solucionar. Ninguno de los procedimientos disponibles actualmente pueden proporcionar una carne roja, cruda, libre de patógenos. A pesar de este riesgo, la carne y las hamburguesas se suelen consumir crudas o mal cocidas. Esto ha producido en los últimos años brotes de infección humana por E. coli O157:H7, que podrían haberse evitado si la temperatura interna de cocción hubiera alcanzado los 65ºC (16). Existen varios tipos de E. coli patógenos, entre ellos se encuentran el enterohemorrágico (ECEH O157:H7) que coloniza el tracto gastrointestinal y sintetiza verotoxinas, el enteropatógeno (ECEP) que provoca la destrucción de las microvellosidades de la pared intestinal, el enterotoxigénico (ECET) que es la principal causa de la diarrea del viajero y las infantiles, y el enteroinvasor (ECEI) que origina una enfermedad similar a Shigella (21). En el 36,5% de las reses bovinas y 54,5% de las carnes molidas faenadas en el noreste del país se aislaron cepas de ECEH, el cual es un patógeno emergente asociado a casos esporádicos de diarrea, colitis hemorrágica. síndrome urémico-hemolítico o púrpura trombocitopénica en seres humanos (22). Audisio MC
108
Por otra parte, la ingestión de carnes cocidas en vías de descomposición puede causar una intoxicación alimentaria debido a las aminas termoestables, por ejemplo la histamina, producidas por descarboxilación de los aminoácidos (2). Los parásitos que se pueden adquirir a través de la ingestión de carnes son protozoos ( Toxoplasma gondii, Sarcocystis spp.) o helmintos ( Taenia saginata, T. solium, Trichinella spiralis) (13). ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO
Se suele emplear el recuento de bacterias aeróbicas totales, el recuento de anaerobios totales, y la determinación de una o más de las clases de microorganismos a diferentes temperaturas (2). CUADRO 1. Valores microbiológicos observados en las carnes frescas cuando se cumplieron las buenas prácticas de faenamiento (2).
Tipos de carnes
Media res y cuartos mayorista*
Deshuesada congelada**
Cortes minorista*
Carne picada ***
Recuento de colonias a 30ºC
105 ufc/ 100 cm2
106,5 ufc/ 1 mL
106 ufc/ 100 cm2
107 ufc/g
103 ufc/ 100 cm2 1 ufc/100 cm2
104 ufc/mL
104 ufc/ 100 cm2 10 ufc/ 100 cm2
105 -106 ufc/g
na
na
102-103 ufc/g
na
50% positivo/ 1 cm2
na
Enterobacteriaceae Salmonella S. aureus
Presenciaausencia de E. coli
na 70% positivo/ 10 cm2 20% positivo/ 1 cm2
0,1 ufc/mL
1 ufc /g
na: no aplicable, * muestreo por hisopado, ** jugo exprimido manualmente, ***depende del tipo y origen, además de la preparación en la carnicería
Los métodos químicos para detectar el deterioro microbiano se basan en los metabolitos formados, tales como amoníaco, sulfuro de hidrógeno, indol o aminas (16). La Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 10
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estimación del nivel de bacterias gram-negativas psicrotrofas sobre carnes refrigeradas puede hacerse mediante la detección de la actividad aminopeptidasa mediante un sustrato cromogénico (24). Según la disposición 3496 de SENASA, cada 300 vacunos faenados se toma en cuatro sitios de una media res (nalga, ijada, pecho y cogote) una muestra con hisopo en una superficie de 100 cm 2 para el análisis de E. coli. En el caso de cerdos se hace cada 1.000 animales sacrificados. CUADRO 2. Límites establecidos por el Código Alimentario Argentino
en los art. 255, 302 y 286 bis para carne picada, chacinados frescos y fiambres (25). ANALISIS
Recuento de aerobios mesófilos/g Recuento de E.coli/g Recuento S. aureus coagulasa positivo/g E. coli O157:H7/NM Samonella spp. Listeria monocytogenes
Coliformes totales Clostridios sulfitoreductores Mohos y levaduras *criterios obligatorios
CARNE PICADA CHACINADOS
n=5 c=3 m=106 M=107 n=5 c=2 m=100 M=500 n=5 c=1 m=100 M=1000 n=5 c=0 ausencia en 65 g* N=5 c=0 ausencia en 10 g*
FIAMBRES −
<10 ufc/g <100 ufc/g ausencia en 25 g ausencia en 25 g
− −
ausencia en 25 g <100 ufc/g
−
<100 ufc/g
−
<1000 ufc/g
En el análisis de las carnes picadas y salchichas se hacen placas de las diluciones 10 -4 a 10-8 pues los recuentos pueden ser muy altos. Suele ser conveniente estimar el número de coliformes presentes y determinar la proporción de E. coli. Cuando se trata de productos empanados se examina solamente el relleno y se hacen las diluciones 10 -1 y 10-2 para el recuento de los microorganismos totales. En el caso de carnes Audisio MC
110
curadas crudas las diluciones utilizadas son 10 -2 y 10-3, y si están cocidas 10-1 a 10-3 (26). E. coli es un bacilo gram-negativo, móvil, catalasa positivo, oxidasa negativo, no forma H 2S, reduce nitrato y la mayoría de las cepas posee β-glucuronidasa y β-galactosidasa. Éstas producen unas colonias oscuras con brillo verde metálico sobre agar eosina - azul de metileno, pero las de algunas cepas de K. pneumoniae son similares. Se suele usar agar con rojo neutro y violeta cristal (VRBA o agar McConkey) adicionado de MUG, el que al ser hidrolizado libera un compuesto fluorescente bajo luz ultravioleta (366 nm), o bien un medio cromogénico con 5bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucurónido y 5-bromo-4-cloro-3indolil-β-D-galactopiranósido, donde las colonias presentan color violeta. Sin embargo E. coli O157H7 no fermenta lactosa ni sorbitol, no posee β-glucuronidasa y no crece a 45ºC (23). Para la identificación se hacen tradicionalmente las pruebas IMVyC, que representan a la producción de indol, las reacciones del rojo de metilo y Voges-Proskauer y el crecimiento en un medio con citrato, mostrando E. coli el patrón “+ + – –” aunque algunos aislados forman indol muy lentamente y unos pocos dan todas las pruebas negativas. CUADRO 2. Incidencia de Salmonella observados en hamburguesas crudas en relación al número más probable de E. coli (23).
Rango del NMP E. coli /g <3 3 – 51 51 – 100 101 – 240 241 – 1.100 1.101 – 11.000 < 11.000
Muestras dentro del rango 270 406 54 96 65 56 25
Muestras positivas para Salmonella
2 20 3 4 3 9 5
% positvo para Salmonella
0,7 4,9 5,6 4,1 4,6 16,1 20,0
Los coliformes y las Enterobacteriaceae en general no son habitantes obligados del tracto intestinal de los mamíferos, se encuentran comúnmente en los ambientes donde se Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 10
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manufacturan alimentos si la desinfección es inadecuada y algunas especies pueden crecer a temperaturas de refrigeración. Por tal motivo suele cuestionarse la premisa de que E. coli indica contaminación fecal y la presencia presuntiva de bacterias enteropatógenas (23). RECUENTO DE BACTERIAS AEROBIAS MESÓFILAS
Extraer con un bisturí estéril una capa de 2-3 mm de profundidad y área externa de 10 cm2 y colocarla en un frasco de vidrio con 100 mL del diluyente y 20 perlas de vidrio estériles. Agitar enérgicamente durante 2 a 3 minutos. b. Pesar asépticamente 25 g de la muestra picada, agregar 225 mL de diluyente en bolsas de plástico estériles y homogeinizar en un 'Stomacher' durante 2 minutos, o en frascos de vidrio estériles con 20 ó 30 perlas de vidrio. Agitar repetidas veces por espacio de 2 a 3 minutos. Llevar 1 mL de cualquiera de las suspensiones anteriores (10-1) a un tubo con 9 mL de diluyente, mezclar bien (10-2) y repetir la operación para obtener sucesivamente otras diluciones según el material analizado. Depositar 0,1 mL de las tres últimas diluciones en sendas placas de agar para recuento y distribuir el inóculo con una varilla de vidrio previamente flameada. Incubar las placas invertidas a 35ºC durante 48 hs. Contar las colonias de las placas que presentan 30 a 300. Multiplicar el número obtenido por la inversa de la dilución correspondiente y la inversa del volumen sembrado para obtener las ufc/g o cm2, según corresponda. c. Pasar un hisopo estéril sobre el área central de la plantilla estéril (100 cm2) y colocarlo en un tubo con 10 mL de diluyente. Apretar el hisopo repetidas veces contra las paredes y agitar para recuperar los microorganismos. Cada 0,1 mL del líquido corresponde a 1 cm2. Hacer la dilución 10-1 y otras sucesivas según la superficie analizada. Sembrar e incubar como se indica arriba. Contar las colonias y calcular las ufc/cm2 multiplicando el número obtenido por la inversa de la dilución correspondiente (2, a.
23).
Sin embargo E. coli es un microorganismo ‘índice’ de la suerte de los patógenos durante el procesamiento dirigido a eliminarlos o inhibirlos y a su vez es ‘indicador’ de que el proceso de elaboración no ha sido controlado adecuadamente. Audisio MC
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Se suele considerar también a la totalidad de los miembros de la familia Enterobacteriaceae como organismos marcadores, en este caso se hacen cultivos en agar McConkey con glucosa (2). RECUENTO DE Brochothrix thermosphacta
Sembrar las placas de agar estreptomicina-talio con 0,1 mL de las diluciones decimales de la muestra, extendiendo el inóculo con una varilla de vidrio en L. Incubar 2 días a 22ºC. Contar las colonias regulares y más bien pequeñas. Si es necesario confirmar, hacer una estría recta en agar TSGY e incubar a 4ºC durante 10 días. Son bacilos no esporulados, catalasa positivo. Peptona 7 g, triptona 7 g, peptona de soja 6 g, extracto de levadura 2 g, glicerol 15 g, fosfato dipotásico 1 g, sulfato de magnesio hidratado 15 g, agar 15 g, agua 1 litro, pH 7,0. Esterilizar a 120ºC durante 20 minutos. Enfriar hasta 50ºC y agregar, en condiciones de asepsia, 10 mL de sulfato de estreptomicina al 5%, 10 mL de cicloheximida al 0,5% y 10 mL de acetato de talio al 0,5%, todas ellas esterilizadas por filtración. AGAR TSGY. Triptona 17 g, peptona de soja 3 g, extracto de levadura 3 g, cloruro de sodio 5 g, fosfato dipotásico 2,5 g, glucosa 2,5 g, agar 15 g, agua 1 litro, Esterilizar a 120ºC durante 20 minutos (2). AGAR ESTREPTOMICINA-TALIO.
RECUENTO DE E. coli
Preparar las diluciones de la muestra (10 -1 y 10-2) por alguno de los procedimientos descriptos más atrás. Sembrar 0,1 mL de cada dilución en sendas placas de medio de cultivo. Incubar a 35ºC durante 24 - 48 hs. Incubar a 35ºC durante 24 - 48 hs. Contar las colonias oscuras con brillo verde metálico en agar-eosina-azul de metileno o las de color púrpura con halo del mismo color y fluorescentes en agar McConkey-MUG. Peptona 10 g, lactosa 10 g, fosfato dipotásico 2 g, eosina Y (solución acuosa al 2%) 20 mL, azul de metileno (solución acuosa al 0,25%) 25 mL, agar 15 g, agua 1 litro, pH 7,1. Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos. AGAR MC CONKEY-MUG. Peptona 20 g, lactosa 10 g, sales biliares 1,5 g, cloruro de sodio 5 g, rojo neutro (sol. hidroalcohólica al 1%) 3 mL, violeta cristal (sol. acuosa al 0,1%) 1 mL, metil-umberiferil- β-glucurónido 0,05 g, agar 15 g, agua estéril 1 litro, pH 7,1. Calentar a ebullición hasta disolución completa (2, 23). AGAR EOSINA-AZUL DE METILENO.
Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 10
113 IDENTIFICACION DE E. coli
Tomar material de varias colonias y suspenderlas en 1 mL de diluyente. Hacer una tinción de Gram y la reacción de catalasa. Sembrar por punción con aguja en el medio SIM, y con asa en caldo glucosa y agar citrato. Incubar a 35ºC durante 48 hs. Observar el color del agar citrato si tiene color azul hubo asimilación del citrato. En el medio SIM el crecimiento de E. coli se aleja de la punción de siembra debido a la movilidad y no colorea el medio de negro (H2S negativo). Añadir 1 mL del reactivo de Kovac y agitar, al cabo de 10 minutos aparece color rojo en capa superior si hubo formación de indol. Dividir en dos tubos el cultivo en caldo glucosa. Tubo 1: agregar unas gotas de rojo de metilo, se verá color rojo si hubo una fermentación ácida mixta. Tubo 2: añadir 1 mL de α-naftol y 0,5 mL de creatina alcalina, dejar en reposo hasta 3 hs. Si hubo formación de acetoína, un intermediario de la fermentación butilén-glicólica, aparecerá un color rojo (reacción de Voges-Proskauer). Sulfato de magnesio heptahidrato 0,2 g, fosfato monoamónico 1 g, fosfato dipotásico 1 g, citrato de sodio dihidrato 2 g, cloruro de sodio 5 g, azul de bromotimol (solución al 0,2%) 40 mL, agar 15 g, agua 1 litro, pH 6,8-7. Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos. MEDIO SIM. Triptona 20 g, peptona de soja 6 g, sulfato ferroso amónico 0,2 g, tiosulfato de sodio 0,2 g, cloruro de sodio 5 g, agar 3,5 g, agua 1 litro, pH 7,3. Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos. CALDO GLUCOSA. Proteosa-peptona 5 g, glucosa 5 g, fosfato dipotásico 5 g, agua 1 litro. Esterilizar a 120 ºC durante 15 minutos. -NAFTOL. Disolver 1 g en 20 mL de etanol y usar. CREATINA ALCALINA. Disolver 0,3 g de creatina y 40 g de hidróxido de potasio, en 100 mL de agua destilada. ROJO DE METILO. Disolver 10 mg en 30 mL de etanol 96º y añadir 20 mL de agua, esta solución es roja a pH 4,4 y amarilla a pH 6,2. REACTIVO DE KOVAC . Disolver 1 g de p-dimetil-amino-benzaldehído en 15 mL de alcohol isoamílico y añadir 20 mL de ácido clorhídrico concentrado (2, 25). AGAR CITRATO DE SIMMONS.
α
La investigación de la presencia de Salmonella se hace mediante un enriquecimiento en el caldo con verde malaquita de Rappaport-Vassiliadis y luego un cultivo sobre un medio selectivo, por ejemplo el agar xilosa lisina desoxicolato Audisio MC
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adicionado de novobiocina o el agar cromógeno selectivo para Salmonella (2). El S. aureus se aisla en agar Baird-Parker y la mayoría de las cepas productoras de enterotoxinas forman coagulasa (2). El recuento de C. perfringens se lleva a cabo en anaerobiosis con el medio agar-sulfito-hierro-cicloserina. Las colonias negras obtenidas a 46ºC se examinan para comprobar morfología, ausencia de movilidad y producción de indol (2). Las células somáticas pierden viabilidad si el alimento es congelado antes del análisis (23). PRESENCIA-AUSENCIA DE E. coli O157:H7
Suspender la muestra en el diluyente para revitalizar las células y dejar a 30ºC durante 4 a 6 hs. Agregar igual volumen del medio de enriquecimiento concentrado. Incubar durante 18-24 hs a 37ºC. Hacer el aislamiento sobre agar McConkey-sorbitol-TC e incubar a 37ºC durante 24-48 hs. Observar las colonias incoloras y confirmar mediante una prueba serológica de aglutinación. Peptona 20 g, glucosa 5 g, fosfato dipotásico 8 g, fosfato monopotásico 2 g, bilis de buey 40 g, verde brillante (sol. acuosa al 0,5%) 3 mL, agua esteril 1 litro, pH 7,2. Calentar a ebullición hasta disolver. AGAR MC CONKEY-SORBITOL-TC. Peptona 20 g, sorbitol 10 g, desoxicolato de sodio 1 g, cloruro de sodio 5 g, violeta cristal (sol. acuosa al 0,1%) 1 mL, rojo neutro (sol. hidroalcohólica al 1%) 3 mL, agar 15 g, agua estéril 1 litro, pH 7,1. Calentar a ebullición para disolver y enfriar a 50ºC, agregar las soluciones apropiadas de telurito de potasio y cefixima para obtener las concentraciones de 2,5 y 0,05 mg/L, respectivamente MEDIO DE ENRIQUECIMIENTO CONCENTRADO.
(23).
El art 255 bis del CAA sobre carne vacuna cruda, de humedad intermedia (a w=0,83-0,88) y envasada al vacío, establece como valores máximos: pH 5,2, NaCl 10%, ácido sórbico 0,12 %, recuento de mesófilos (a 35ºC) 10 6 ufc/g, esporulados anaerobios 100 ufc/g, enterobacterias 10 ufc/g, S. aureus coagulasa positiva 100 ufc/g. El art 379 bis sobre carne cocida (aw=0,85-0,91) y envasada al vacío, indica los siguientes valores máximos de ufc/g: recuento de mesófilos (a 35ºC) 10 3, Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 10
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esporulados anaerobios 100, enterobacterias 10, S. aureus coagulasa positiva 10. El art 360 del CAA que trata del fiambre de cerdo cocido establece la ausencia de E. coli O157:H7, Salmonella y Listeria monocytogenes en 25 g, y los siguientes valores máximos de ufc/g: coliformes totales 100, E. coli 10, S. aureus coagulasa positiva 100, clostridios sulfito-reductores 100, mohos y levaduras 10 3 (25). La triquinoscopía directa de la musculatura de cerdos y equinos es un procedimiento sencillo y económico para detectar las larvas enquistadas de Trichinella, pero puede pasar desapercibida una baja parasitosis. Se mejora mediante la digestión artificial del músculo (27). El empleo de técnicas serológicas facilita el análisis, especialmente el ensayo comercial de inmunoabsorción enzimática (ELISA) que tiene una sensibilidad del 100% y una especificidad del 97% (28). REFERENCIAS 1. ICMSF. 1998. Microorganisms in Foods - Microbial Ecology of Food Commodities. Vol 6, Blackie Academic & Professional, London, p 1. 2. Mossel DAA et al. 2003. Microbiología de los Alimentos. 2ª ed, Acribia, Zaragoza, p 493, 510, 636. 3. Stiles ME, Ng LK. 1981. Appl Environ Microbiol 41 : 867. 4. Doyle MP, Schoeni JL. 1987. Appl Environ Microbiol 53 : 2394. 5. Hayes JR et al. 2003. Appl Environ Microbiol 69 : 7153. 6. Smith LT. 1996. Appl Environ Microbiol 62 : 3088. 7. Zaho C et al. 2001. Appl Environ Microbiol 67 : 5431. 8. Hall HE, Angelotti R. 1965. Appl Microbiol 13 : 352. 9. Jay JM. 1967. Appl Microbiol 15 : 943. 10. Dickson JS, Koohmaraie M. 1989. Appl Environ Microbiol 55 : 832. 11. Gill CO, Penney N. 1977. Appl Environ Microbiol 33 : 1284. 12. McMeekin TA, Patterson JT. 1975. Appl Microbiol 29 : 165. 13. Doyle MP et al., eds. 1997. Food Microbiology - Fundamentals and Frontiers. ASM Press, Washington, p 83, 478. 14. Koutsoumanis K et al. 2006. Appl Environ Microbiol 72 : 124. 15. Prieto M et al.. 1994. Arch Lebensmittelhyg 45 : 83. 16. Jay JM et al.2005. Modern Food Microbiology. 7ª ed, Springer, New York, p 63. 17. Ercolini D et al. 2006. Appl Environ Microbiol 72 : 4663. 18. Gill CO, Tan KH. 1980. Appl Environ Microbiol39 : 317. 19. Hamasaki Y et al. 2003. Appl Environ Microbiol 69 : 3668. 20. Smith LT. 1996. Appl Environ Microbiol 62 : 3088. 21. ICMSF. 1996. Microorganismos de los Alimentos - Características de los Patógenos Microbianos. Acribia, Zaragoza, p 147. 22. Cicuta ME et al. 2006. Rev Vet 17 : 20.
Audisio MC
116 23. Downes FP, Ito K, eds. 2001. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4º ed, APHA, Washington, p 69, 325. 24. Castro BP de, et al. 1988. Appl Environ Microbiol 54 : 1462. 25. Código Alimentario Argentino. http//:www.anmat.gov.ar/codigoa /caa1.htm Cap 6. 26. Collins CH et al. 1999. Microbiological Methods. 7º ed, ButterworthHeinemann, Oxford, p 222. 27. Jimenez Cardozo E et al. 2005. Vet Mex 36: 269. 28. Bartoloni A et al. 1999. Rev Panam Salud Publica 5: 97.
Manual de Microbiología de los Alimentos - capítulo 10
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AVES La carne de ave comprende el tejido muscular, la piel adherida, el tejido conectivo y los órganos que se consumen (hígado, molleja y corazón). El contenido de agua de las porciones comestibles de las canales de aves es aproximadamente 70% para pollo parrillero mientras que el contenido de proteínas y lípidos es 20,5% y 2,7%, respectivamente (1). A diferencia de las carnes rojas (vaca, cerdo) la grasa en el pollo se encuentra justo por debajo de la piel y en la cavidad abdominal lo que facilita su remoción. El contenido de grasa varía con la edad, sexo, anatomía y especie aviar. El sistema intensivo de cría, que limita el libre desplazamiento de las aves, constituye una de las principales causas de estrés y aumenta la difusión de los microorganismos de animal a animal. Además, el traslado de las aves a la planta de faena implica un período de ayuno y el hacinamiento de las aves en jaulas de pequeñas dimensiones que favorecen la infección por Salmonella (2). El ayuno es una práctica común al final del período de crianza y se lo realiza para reducir el contenido del tracto gastrointestinal, previo al procesamiento de las aves. La infección del ave por parásitos del género Eimeria alteran la mucosa intestinal, barrera protectora natural del lumen intestinal, que favorece la proliferación de bacterias patógenas y la oportunidad que éstas alcancen otros órganos concluyendo en una septicemia (3,4). Algunas bacterias de los géneros Bacillus, Paenibacillus y Clostridium se encuentran presentes en todo tipo de carnes, rojas y blancas, por otro lado, Arcobacter y Campylobacter se encuentran principalmente en las carnes de aves (5). La contaminación interna del huevo puede provenir de infecciones en el ovario u oviducto de la gallina ponedora. Si el huevo es destinado para el consumo crudo y lleva el agente en la yema, puede desencadenar una infección alimentaria. Si es un huevo fértil, el pollito nacerá infectado. Entre las bacterias que pueden habitar el sistema reproductor de la gallina se Audisio MC
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destacan Salmonella spp, Escherichia coli, Mycoplasma sp y Enterococcus spp (1). Por otro lado, todos los procesos involucrados con la faena de las aves que culminan con el envasado generan cambios en la microbiota del ave y pueden colaborar con la infección de las personas que las manipulan. Esta sería una de las formas de transmisión horizontal de Salmonella, Listeria monocytogenes y otras bacterias patógenas para el ser humano (6). DETERIORO
En el matadero la contaminación tiende a propagarse por: la contaminación cruzada entre aves vivas y canales, una temperatura insuficiente en el tanque de escaldado, los dedos de goma de la máquina desplumadora, la forma de evisceración, la conservación de la piel y un inadecuado enfriamiento final (7). La población microbiana de las carcasas de las aves está constituída por la microbiota natural de la piel y las plumas, la microbiota transitoria durante la faena y los contaminantes que se adquieren durante el procesamiento (1). Las aves enteras suelen dar recuentos microbianos más bajos que las troceadas. Los estudios de la microbiota bacteriana de la carne fresca de aves demostraron la presencia de unos 25 géneros diferentes. Sin embargo, cuando las canales se refrigeran para detener o reducir la contaminación, el principal agente causal de deterioro lo constituyen las especies de Pseudomonas (5). También se suelen encontrar Acinetobacter, Flavobacterium, Corynebacterium, Alcaligenes, y algunas microbacterias y lactobacilos. El deterioro de las aves está limitado a la superficie porque las partes internas de los tejidos generalmente son estériles o contienen microorganismos que no suelen crecer a bajas temperaturas. La mayor parte de los organismos están en la superficie y los recuentos superficiales por cm 2 ofrecen mayor información que los recuentos de muestras que incluyen tejidos profundos. Las canales de aves frescas y almacenadas en un ambiente muy húmedo son muy susceptibles al ataque por Pseudomonas Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 11
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y en los estados de alteración avanzados se observa fluorescencia en la superficie iluminada con luz ultravioleta (1). Cuando la carne de ave sufre deterioro, los malos olores se perciben antes que la presencia de limo, siendo detectados por primera vez cuando el recuento microbiano es aproximadamente 107 ufc/cm2. El limo aparece después, con un recuento cercano a 10 8 ufc/cm2. En el caso de la alteración microbiana del pollo sin eviscerar los microorganismos invaden los tejidos internos de la cavidad abdominal a través de las paredes intestinales. Esto provoca un característico olor ácido y el principal agente de dicha modificación es Shewanella putrefaciens. Esta bacteria es sensible a bajos pH pero crece bien al pH de la piel del ave (cercano a 6,6) y genera compuestos sulfurosos, provocando así el mal olor (1). También causa la alteración de las canales envueltas en plástico impermeable al oxígeno, junto a Brochothrix thermosphacta y lactobacilos atípicos (6). La pechuga del pollo cuyo pH 5,7-5,9 se deteriora más lentamente que los muslos levemente más neutros (pH 6,36,6). Los hongos no tienen un rol importante en el deterioro de este tipo de producto pero si se utilizaen antibióticos para tratar de limitar el crecimiento bacteriano, las levaduras y mohos se tornan los principales agentes de alteración. Candida, Rhodotorula, Debaromyces y Yarrowia son levaduras comúnmente asociados con el deterioro de la carne de aves (7). MICROORGANISMOS PATÓGENOS
La producción en gran escala de carne de aves ha generado una serie de problemas sanitarios. Se ha observado y publicado que porcentajes elevados de canales (de pollos y de pavos) contienen Salmonella spp., Campylobacter jejuni y Listeria monocytogenes (7). Con frecuencia se han detectado aves contaminadas con Yersinia enterocolitica, en un estudio hecho en el país, el 10% de los pollos faenados contenían especies de Yersinia, y el 4,3% Y. enterocolitica (8). Campylobacter jejuni, e s una bacteria gram-negativa, microaerófila, móvil, con forma de bacilos o espirilos. Campylobacter es transmitido al hombre a través de alimentos contaminados (aves, cerdos, leche), de aguas superficiales sin Audisio MC
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cloro y por su distribución a través de la ruta fecal-oral a partir de animales o personas infectadas (9). C. jejuni es un habitante normal del intestino de las aves y junto a otras especies contaminan alrededor del 20% de las canales (10). Las prácticas “orgánicas” en los criaderos disminuye sensiblemente la presencia de cepas resistentes a los antimicrobianos (11). RECUENTO DE Enterobacteriaceae a.
Hacer la suspensión de la muestra obtenida por extracción 2 de una capa superficial de 100 cm , por hisopado de igual área o por macerado de 25 g en 225 mL de diluyente. Preparar -2 -6 diluciones decimales (10 - 10 ) y dejarlas a temperatura ambiente durante 1 hora para revitalizar las células. b. Transferir 1 mL de cada una a sendas cajas de Petri. Volcar en las mismas unos 15 mL de agar VRGB fundido y enfriado a 50ºC. Mezclar suavemente, girando las placas sobre la mesada, tres veces a la derecha y otro tanto a la izquierda. c. Una vez que ha gelificado, verter unos 10 mL del mismo medio a 50ºC y dejar enfriar. Incubar a 30 ó 42ºC durante 24 horas. 2 d. Calcular el número de ufc por g ó cm , multiplicando el número promedio de las colonias de color púrpura por el factor de dilución correspondiente. AGAR VRBG. Extracto de levadura 3 g, peptona 7 g, cloruro de sodio 5 g. sales biliares 1,5 g, glucosa 10 g, rojo neutro 0,03 g, cristal violeta 0,002 g, agar 15 g, agua 1 litro, pH 7,4. Calentar hasta ebullición para disolver los ingredientes y mantener en baño de agua a 50ºC (7).
es una bacteria de forma bacilar, gram-positiva, no esporulada, móvil, catalasa positiva que crece bien a temperaturas de refrigeración y a valores de a w < 0,93. Se encuentra distribuida en aguas superficiales, hortalizas, carnes en canales y cuartos, carne picada, aves de corral y alimentos de origen marino. Como es una bacteria común también se halla en las instalaciones y equipamientos de las industrias lácteas y cárnicas (7). El uso de fluoroquinolona en la producción de pollos selecciona la microbiota intestinal y cepas resistentes de E. coli enterovirulento pueden ser transmitidas al hombre (12). Listeria monocytogenes
Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 11
121 PRESENCIA-AUSENCIA DE Listeria monocytogenes
Colocar la canal sin trozar en una bolsa plástica con 100 mL de peptona al 0,1%. Agitar y masajear la superficie durante 2 minutos (16). Mezclar 25 mL del líquido de lavado con 25 mL de caldo infusión de cerebro y corazón de doble concentración. Dejar 6 horas a temperatura ambiente. b. Agregar 50 mL de caldo PALCAMY de doble concentración. Mezclar bien e incubar a 30ºC durante 48 horas. Observar el ennegrecimiento completo del cultivo. c. Sembrar en estría por agotamiento, sobre agar PALCAM. Incubar a 30ºC durante 48 horas. d. Observar colonias planas, regulares, de color negro verdoso sobre un fondo rojo cereza. a.
CALDO INFUSIÓN DE CEREBRO Y CORAZÓN (doble concentracion). Infusión deshidratada de cerebro 25 g, infusión deshidratada de 10 g, triptona 20 g, glucosa 4 g, cloruro de sodio 10 g, fosfato disódico 5 g, agua 1 litro, pH 7,4. Esterilizar a 120ºC durante 20 minutos. CALDO PALCAMY (doble concentración) . Tripteína 5 g, peptona 5 g, peptona de soja 5 g, digerido de corazón 3 g, extracto de levadura 3 g, almidón 1 g, cloruro de sodio 5 g, glucosa 0,5 g, manitol 10 g, esculina 0,75 g, citrato férrico amónico 0,5 g, cloruro de litio 15 g, rojo fenol 0,08 g, agua 500 mL, pH 7,2. Esterilizar a 120ºC durante 20 minutos. Enfriar a 50ºC y en condiciones de asepsia agregar los antimicrobianos y 25 mL de emulsión estéril de yema de huevo al 20%. Mezclar y distribuir en matraces estériles. EMULSIÓN DE YEMA DE HUEVO. Lavar la cáscara con una solución al 0,1% de dodecil-sulfato de sodio y desinfectar con una dilución de lavandina comercial al 8% (hipoclorito de sodio 5,25%) recién preparada. Cascar, separar la yema y volcarla en un frasco graduado estéril con perlas de vidrio. Agregar 4 volúmenes de solución estéril de cloruro de sodio al 0,8% y agitar enérgicamente. 5 ANTIMICROBIANOS. Acriflavina 5 mg, sulfato de polimixina B 10 UI, ceftazidima pentahidratada 25 mg. AGAR PALCAM. Tripteína 5 g, peptona 5 g, peptona de soja 5 g, digerido de corazón 3 g, extracto de levadura 3 g, almidón 1 g, cloruro de sodio 5 g, glucosa 0,5 g, manitol 10 g, esculina 0,75 g, citrato férrico amónico 0,5 g, cloruro de litio 15 g, rojo fenol 0,08 g, agar 15 g, agua 1 litro, pH 7,2. Esterilizar a 120ºC durante 20 minutos. Enfriar aprox. a 48ºC y en condiciones de asepsia agregar los antimicrobianos. Mezclar y distribuir en cajas de Petri estériles (7).
El art 257 del Código Alimentario Argentino autoriza la inmersión de las aves en solución de clortetraciclina y Audisio MC
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clorhidrato de oxitetraciclina en concentración tal que el remenente no exceda las 7 ppm (13). Los patos salvajes son el reservorio del virus de la influenza aviar, una zoonosis emergente (14). Por otra parte, la carne y las vísceras de pollo suele contener residuos de aflatoxinas, especialmente el hígado (15). PRESENCIA- AUSENCIA DE Campylobacter jejuni
Colocar la canal sin trozar en una bolsa plástica con 100 mL de peptona al 0,1%. Agitar y masajear la superficie durante 2 minutos (16). Separar el líquido de lavado e incubar a 30ºC durante 4 a 6 horas. b. Agregar un volumen igual de caldo selectivo PCS de doble concentración. Mezclar bien e incubar a 42ºC durante 16-24 horas. c. Sembrar en estría por agotamiento, sobre agar selectivo PCS. Incubar bajo condiciones de microaerofilia a 42ºC durante 48 hs. d. Observar la formación de colonias de color gris, húmedas, planas y con un diámetro de 1 mm. a.
CALDO PCS (doble concentración). Proteosa peptona 15 g, digerido de hígado 2,5 g, extracto de levadura 5 g, cloruro de sodio 5 g, agua 500 mL, pH 7,5. Esterilizar a 120ºC durante 20 minutos. Enfriar a 50ºC y en condiciones de asepsia, agregar 25 mL de sangre de caballo lisada y los antimicrobianos. Mezclar y distribuir en matraces estériles. SANGRE DE CABALLO. Lisar la sangre fresca por congelacióndescongelación. 3 ANTIMICROBIANOS. Polimixina B 5*10 UI, rifampicina 10 mg, lactato de trimetoprim 10 mg, cicloheximida 100 mg. AGAR PCS. Proteosa peptona 15 g, digerido de hígado 2,5 g, extracto de levadura 5 g, cloruro de sodio 5 g, agar 15 g, agua 1 litro, pH 7,5. Esterilizar a 120ºC durante 20 minutos. Enfriar aprox. a 50ºC y en condiciones de asepsia agregar 50 mL de sangre de caballo lisada y los antimicrobianos. Mezclar y distribuir en cajas de Petri estériles (7). MICROAEROFILIA. Colocar en la cámara de cierre hermético con un sobre para generar una atmósfera especial (10% CO 2, 5% O2, 85% N2).
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO
El recuento de enterobacterias termotróficas a 42ºC, permite evaluar la contaminación de origen intestinal en el matadero, siendo el nivel de referencia inferior a 10 3 – 104 ufc/cm2. Las pruebas directas de presencia-ausencia de Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 11
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y Yersinia pueden servir para calcular el porcentaje de canales contaminadas, pero hay que tener en cuenta que las canales no son descontaminadas para su comercialización (7). La identificación rápida se puede hacer por métodos tales como PCR-ELISA (16). Salmonella, Listeria, Campylobacter
PRESENCIA-AUSENCIA DE Yersinia enterocolitica
Colocar la canal sin trozar en una bolsa plástica con 100 a 400 mL de peptona al 0,1% Agitar y masajear la superficie durante 2 minutos (17). Separar el líquido de lavado e incubar a 20-25ºC durante 4 a 6 horas. b. Dejar que las partículas de alimento sedimenten durante 10 minutos. Luego sembrar 10 mL en caldo selectivo BOS e incubar a 20-25ºC durante 24-48 horas. c. Agitar el cultivo y mezclar 1 mL, con 1 mL de solución acuosa de hidróxido de potasio al 0,5% y cloruro de sodio al 0,5%. Luego de 1 minuto, sembrar en estría por agotamiento, sobre agar CIN selectivo. Incubar a 20-25ºC durante 48 hs. d. Observar la formación de colonias con centro de color rojo oscuro y borde transparente. a.
CALDO BOS. Fosfato disódico 17,25 g, oxalato de sodio 5 g, sales biliares 2 g, cloruro de sodio 1 g, sulfato de magnesio 0,01 g, agua 670 mL, pH 7,6. Esterilizar a 120ºC durante 20 minutos. Enfriar hasta 50ºC y agregar los siguientes ingredientes esterilizados por filtración: sorbosa al 10% 100 mL, asparagina al 1% 100 mL, metionina al 1% 100 mL, extracto de levadura al 0,25% 10 mL, piruvato de sodio al 0,5% 10 mL, irgarsan al 0,4% (en etanol 95%) 1 mL, furadantina sódica al 0,1% (en acetona al 30%) 10 mL. AGAR CIN. Peptona 20 g, extracto de levadura 2 g, D-manitol 20 g, piruvato sódico 2 g, cloruro de sodio 1 g, sulfato de magnesio 0,01 g, desoxicolato sódico 0,5 g, agar 15 g, agua 1 litro. Calentar hasta ebullición para disolver los ingredientes y enfriar hasta 50ºC. Añadir los antimicrobianos esterilizados por filtración. Controlar el pH (7,4) y volcar en cajas de Petri estériles. ANTIMICROBIANOS. Irgarsan al 0,4% (en etanol 95%) 1 mL, hidróxido de sodio 5 N 1 mL, rojo neutro al 0,3% 10 mL, violeta cristal al 0,01% 10 mL, cefsulodina al 0,15% 10 mL, novobiocina al 0,025% 10 mL (7).
REFERENCIAS 1. ICMSF. 1998. Microorganisms in Foods. Vol 6: Microbial Ecology of Food Commodities. Blackie Academic & Professional, p 75.
Audisio MC
124 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17.
Holt P.S. 1994. En: Proceedings World’s Poultry Science Association. European Poultry Conference, Glasgow, p 185. Kosugi Y et al. 1986. Avian Dis. 30: 313-318. Fukata T et al. 1987. Poultry Sci. 66: 760-761. Jay JM et al. 2005. Modern Food Microbiology. 7º ed. Springer, New York, p 63. Doyle MP et al, eds. 1997. Food Microbiology. ASM Press, Washington, p 83. Mossel DAA et al. 2003. Microbiología de los Alimentos. 2ª ed. Acribia, Zaragoza, p 516, 606, 610, 631. Floccari ME et al. 2000. J. Food Protect. 63 : 1591- 1593. Workman SN et al. 2005. J. Clin. Microbiol. 43 : 2642-2650. Ge B et al. 2003. Appl. Environ. Microbiol. 69 : 3005-3007. Luangtongkum T et al. 2006. Appl Environ Microbiol 72: 3600-3007. Johnson JR et al. 2003, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 47 : 2161-2168. Código Alimentario Argentino. http//:www.anmat.gov.ar/codigoa /caa1.htm Cap 6. Tumpey TM et al. 2002. J. Virology 76 : 6344-6355. Arrieta Mendoza D et al. 2006. Revista Científica, FCV-LUZ 16: 3947. Hong Y et al. 2003. Appl Environ Microbiol 69: 3492-3499. Oyarzabal OA et al. 2005. Appl Environ Microbiol 71: 3351-3354.
Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 11
125
PESCADOS Y MARISCOS La composición del músculo de pescado es muy variable y depende de la especie, tamaño y estación del año. En general, la carne de pescado contiene 20-25% de proteínas de a lto valor biológico, vitaminas (tiamina, vitamina B 12, riboflavina, ácido pantoténico, ácido fólico, niacina y piridoxina) y minerales (yodo, sodio, potasio, fósforo, calcio, magnesio, hierro, flúor, manganeso, cloro, azufre, etc.). El contenido graso varía con la especie (4 a 8%) y está constituido por triglicéridos y fosfolípidos. Es pobre en hidratos de carbono. El pH del pescado inmediatamente después de su captura es neutro, luego desciende a 6,2-6,5 para luego subir a 6,6-6,7. Este parámetro contribuye a la inestabilidad del pescado luego de su muerte porque estos valores de pH favorecen el desarrollo microbiano. Las capas internas del músculo se consideran, como en los casos anteriores, estériles. Las bacterias del pescado fresco se encuentran en tres puntos principales: limo externo, agallas e intestinos. La microbiota del pescado es psicrotolerante y en el caso de los pescados de mar, halofílica (1). La microoorganismos que acompañan al pez vivo depende del ambiente natural en el que habita y las especies aisladas del intestino son las mismas que las de las aguas donde es capturado. Salvo que se pesquen en aguas contaminadas, raramente son fuente de microorganismos patógenos. La incidencia de microorganismos en gambas, ostras y almejas, depende en gran parte de la higiene de las aguas en las que se capturan. Estos moluscos se alimentan por filtración y tienden a extraer y acumular los virus y bacterias del agua en la que viven (2). DETERIORO
El deterioro de los pescados es debido principalmente a la autolisis, la oxidación química de lípidos, el crecimiento bacteriano y el metabolismo resultante en la formación de compuestos de olor desagradables, siendo estos últimos los más importante. Sin embargo, no todos los microorganismos presentes son igualmente causantes de los cambios de calidad. Audisio MC
126
Los hábitos alimenticios de los peces, la zona geográfica, la estación, la temperatura del agua, el tipo de pez, el lugar donde los pescados son capturados y las condiciones de almacenamiento, que incluyen la temperatura y la composición de la atmósfera del envase, determinan la presencia de los microorganismos específicos de la alteración (3). El principal signo de deterioro es el mal olor que se percibe al examinar las agallas, pues la región branquial es la más susceptible a la alteración microbiana. Los mejores indicadores de la alteración del pescado son la pérdida del brillo de los los ojos y los colores superficiales, cambios en el olor y presencia del limo superficial. Si el pescado no es eviscerado de inmediato, algunos organismos atraviesan las paredes del intestino y llegan a los tejidos internos de la cavidad abdominal. La evisceración y el fileteado pueden extender la microbiota intestinal sobre toda la superficie (1). Photobacterium sp, Shewanella putrefaciens, Brochothrix thermosphacta, Pseudomonas spp, Aeromonas spp y bacterias lácticas son miembros de microbiota de los pescados de agua templada. Sin embargo, S. putrefaciens es el organismo especifico del deterioro de los pescados y mariscos de agua fría marina almacenados sobre hielo, produciendo trimetilamina y sulfuro de hidrógeno. Por otra parte, Photobacterium sp. causa la alteración bajo condiciones de atmósfera modificada (3, 4). Pseudomonas spp y Shewanella spp son los agentes específicos del deterioro de pescados de agua mar templada, mantenidos en hielo. Pseudomonas fluorescens y P. lundensis son las especies predominantes mientras que P. fragi y P. putida son detectadas con menos frecuencia. La temperatura de almacenamiento y la composición de la atmósfera afecta la proporción de las especies mencionadas en la población final del pescado (3). Listeria monocytogenes está presente en el 7 a 18% de los productos pesqueros (5). Otros géneros, en su mayoría psicrotrofos, que suelen ser aislados de los productos de mar son Achromobacter, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Escherichia, Flavobacterium, Micrococcus, Moraxella, Proteus, Serratia, Sarcina y Vibrio (1). También suelen encontrarse especies de Mycobacterium en el pescado congelado (6).
Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 12
127
En las aguas contaminadas con estiercol se ha observado un aumento del número de Acinetobacter spp y otras bacterias resistentes a los antimicrobianos (7). El pescado deshidratado con sal y ahumado (por ejemplo bacalao) posee un actividad de agua tan baja que solo es alterado por mohos y algunas bacterias halofilas, por ejemplo Halobacterium (1). MICROORGANISMOS PATÓGENOS
Los peces capturados en mar abierto están exentos de patógenos entéricos, mientras que los de agua dulce están expuestos a la contaminación procedentes del hombre y otros animales (2). Las bacterias productoras de aminas vasopresoras (escombrotoxina), como histidina y otras, son en su mayor parte enterobacterias mesófilas, entre ellas Proteus morganii, Hafnia alvei y Klebsiella pneumoniae. La conservación del pescado a 0ºC impide la formación de estos compuestos (2). Clostridium botulinum tipo E puede crecer y sintetizar toxinas a 3ºC y la prevalencia en pescado crudo varía de 10 a 40% según las especies y en los productos envasados al vacío es 5%, por lo que constituye un riesgo en la industria pesquera (8). Vibrio parahaemolyticus, V. cholerae y V. vulnificus son las principales especies de vibrios causantes de las infecciones relacionadas a los pescados y mariscos ( 9). También se suelen aislar Salmonella y Shigella aunque no sean contaminantes normales del pez (2). Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista que puede iniciar algunas infecciones en personas con las defensas bajas y las cepas patógenas tienen una alta resistencia a los antibióticos debido a un plásmido (2). Las especies de Aeromonas son patógenos para peces pero A. hydrophila y A. sobria son enterotoxigénicas para el hombre (10). Los patógenos humanos son retenidos por las ostras sin o con mínima inactivación. Como la velocidad de depuración es muy baja pueden representar un peligro para la salud pública si son criadas en aguas contaminadas. Las ostras suelen transmitir ooquistes de Cryptosporidium parvum, quistes de Giardia lamblia, esporos de microsporidios Encephalitozoon spp (11). Audisio MC
128
El pescado alberga numerosos parásitos que, en su mayoría, no suelen afectar al hombre. Sin embargo, Anisakis es un nemátodo que se encuentra en la musculatura de los peces y sobrevive a la congelación. Se ingiere con el pescado crudo, adobado o ahumado en frío, o poco cocinado. Otros parásitos son las tenias Diphyllobothrium Diphyllobothrium latum, en el hemisferio norte, y D. pacificum, en América del Sur, que son transmitidas al hombre por el pescado crudo (2). La intoxicación paralizante es causada por mejillones, ostras, berberechos y almejas que han incorporado a su organismo algas tóxicas. Aparece a la media hora después de la ingestión, causando síntomas neurológicos que en el 20% de los casos conducen a la muerte. Las saxitoxinas son producidas por especies de Gonyaulax, Gymnodinium y Pyrodinium (2). ANALISIS MICROBIOLOGICO MICROBIOLOGICO
Los metabolitos producidos por los microorganismos (trimetilamina y ácidos grasos) se pueden usar como indicadores de una alteración inminente de los productos de pesca. RECUENTO DE ORGANISMOS PSICROTROFOS
Mantener las muestras a 5ºC hasta el momento de procesarlas. Tomar 10 g de la muestra molida, o el material obtenido por extracción de una capa superficial o por hisopado, y colocarlo en una bolsa plástica con 100 mL de peptona al 0,1% u otro diluyente. Agitar y masajear la superficie durante 2 minutos. Si se trata de una muestra congelada colocarla en una bolsa plástica estéril y una vez descongelada extraer con una jeringa estéril 10 mL de líquido. Medir el volumen del líquido remanente. -1 -6 Hacer diluciones decimales (10 a 10 ) en el mismo diluyente. Depositar 0,1 mL de las diluciones en sendas placas de agar para recuento en placa o agar-glucosa-triptona-levadura y distribuir el inóculo con una varilla de vidrio en L. Incubar a 17ºC durante 16 hs y luego 3 días a 7ºC. Contar las colonias de las placas que presentan 30 a 300 de bacterias o de las que muestran 15 a 150 colonias fúngicas. Multiplicar el número obtenido por el factor de dilución 2 correspondiente para obtener las ufc/g o cm (12).
Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 12
129 PRESENCIA-AUSENCIA DE Vibrio cholerae y relacionados
Preparar la dilución 1/10 de la muestra en diluyente e incubar durante 4 - 6 horas a 30ºC. Agregar igual volumen de agua peptona alcalina de concentración doble. Incubar a 37ºC durante 6 horas. Sembrar por agotamiento en estría sobre agar TCBS. Incubar a 37ºC durante 24 horas. Observar las colonias de 2 a 3 mm de diámetro, color amarillo, lisas, con centro opaco, periferia traslúcida, sin halo negro. AGUA PEPTONA ALCALINA (doble concentración) . Triptona 30 g,
extracto de levadura 10 g, cloruro de sodio 20 g, agua 1 litro, pH 8,6. AGAR TCBS. Peptona 10 g, extracto de levadura 5 g, tiosulfato de sodio 10 g, citrato de sodio 10 g, bilis 8 g, sacarosa 20 g, cloruro de sodio 10 g, citrato de hierro 1 g, azul de bromotimol 0,04 g, azul de timol 0,04 g, agar 15 g, agua 1 litro, pH 8,6. Calentar a ebullición para disolver los ingredientes, enfriar a 50ºC y volcar en cajas de Petri estériles (2).
CUADRO 1. Valores de referencia para filetes de pescado fresco y camarones congelados (2)
n=10, c=1 Recuento de psicrotrofos Recuento de colonias a 30ºC Escherichia coli Enterobacteriaceae L. monocytogenes S. aureus Salmonella Shigella Vibrio spp.
enteropatógenos
V. parahaemolyticus
Filetes de pescado fresco m=106 M=107
─
m=10 M=102 m=103 M=104
Camarones precocidos congelados ─
m=105 M=106 ─
─
m=10 M=102 ausente en 25 g m=102 M=103 ausente en 25 g ausente en 25 g
─
ausente en 25 g
ausente en 25 g
─
─
m=102 M=103 ausente en 25 g
Algunos de los análisis indicados en el cuadro 1 no son practicables en los laboratorios de rutina y otros sólo tienen importancia si los productos productos son consumidos crudos (2).
Audisio MC
130 PRESENCIA-AUSENCIA DE Vibrio parahaemolyticus parahaemolyticus
Preparar la dilución 1/10 de la muestra en diluyente salado e incubar durante 4 - 6 horas a 30ºC. Agregar igual volumen de caldo Horie de concentración doble. Incubar a 37ºC durante 24 horas. Sembrar por agotamiento en estría sobre agar TCBS. Incubar a 37ºC durante 24 horas. Observar las colonias de 2 a 3 mm de diámetro, redondas, opacas, verdosas o azuladas, sin centro de color negro y rodeadas de un halo verde. DILUYENTE SALADO. Peptona 1 g, cloruro de sodio 20 g, agua 1 litro.
Esterilizar a 120ºC durante 20 minutos. CALDO DE HORIE. Triptona 10 g, extracto de carne 6 g, cloruro de sodio 60 g, azul de bromotimol 0,06 g, violeta de etilo 0,002 g, agua 1 litro, pH 9,0. Calentar a 100ºC durante 30 minutos. Enfriar y agregar 20 mL de arabinosa al 25% esterilizada por filtración (2). RECUENTO DE Pseudomonas spp.
Preparar la dilución 1/10 de la muestra en solución diluyente y dejar durante 4 - 6 horas a 30ºC. Agregar un volumen igual de caldo NF de doble concentración e incubar a 42ºC por 24 horas. Sembrar 0,1 mL sobre agar CFC e incubar a 25ºC durante 48 horas. Observar las colonias irregulares, incoloras o de tonos verde azulado o pardo. Son bacilos Gram-negativos, con flagelos polares, oxidasapositivos, oxidantes de glucosa y no fermentativos. CALDO NF. Triptona 30 g, cloruro de sodio 10 g, agua 1 litro, pH 7,2.
Esterilizar a 120ºC durante 20 minutos. Enfriar a 50ºC y agregar 100 mL de nitrofurantoína al 0,2% en polietilén-glicol. AGAR CFC. Peptona 16 g, hidrolizado de caseína 10 g, sulfato de potasio 10 g, cloruro de magnesio 1,4 g, agar 15 g, agua 1 litro, pH 7,2. Esterilizar a 120ºC durante 20 minutos. Enfriar a 50ºC y agregar la mezcla de cetrimida 10 mg, fucidina 10 mg y cefaloridina 50 mg disueltos en 5 mL de etanol al 50%. Agitar y verter en cajas de Petri (2).
Se suele mantener a los moluscos bivalvos durante un tiempo en agua potable para que se depuren por sí solos. Resulta imposible hacer un analisis microbiológico de los mejillones, ostras y almejas, por la gran variedad de patógenos que potencialmente trasmiten. Se exige, y es alcanzable, un valor de E. coli menor a 10 ufc/g en el agua del criadero. La Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 12
131
presencia de enterococos en número mayor que 10 2 ufc/g puede ser un índice de la presencia del virus de la hepatitis A (2). PRESENCIA-AUSENCIA DE Aeromonas spp.
Mantener las muestras a 5ºC hasta el momento de procesarlas. Inocular 1 mL de la dilución 1/10 de la muestra en 9 mL de diluyente y dejar durante 6 horas a la temperatura ambiente. Agregar 10 mL de medio de enriquecimiento concentrado. Incubar a 30ºC durante 24 horas. Sembrar por agotamiento en estría sobre agar AD. Incubar a 30ºC durante 24 horas. Después inundar la placa con solución de yodo durante 2 minutos. Si se observan colonias con un halo claro sobre el fondo rojo púrpura se presume la presencia de especies de Aeromonas sp. AGAR AD. Triptona 2,5 g, extracto de levadura 1 g, dextrina 5 g, cloruro
de sodio 1,5 g, cloruro de potasio 1 g, sulfato de magnesio hidratado 0,1 g, cloruro férrico 0,05 g, desoxicolato de sodio 0,005 g, agar 7,5 g, agua 500 mL. Disolver y agregar 4,5 mL de azul de bromotimol al 1% y 4,5 mL de NaOH 5N diluído al 1% (pH 8). Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos. Enfriar a 50ºC, añadir 5 mL de ampicilina al 0,1% esterilizada por filtración y volcar en cajas de Petri (2). PRESENCIA-AUSENCIA DE Shigella spp.
Colocar dos porciones de 25 de muestra en sendos recipientes 225 mL de diluyente estéril, agitar bien e incubar 2 a 4 hs a 30ºC. Añadir, a ambos, igual volumen de medio de enriquecimiento concentrado. Incubar uno a 37ºC y otro a 42ºC. durante 24 horas. Sembrar alícuotas en placas de agar XLDN incubando una a 37ºC y otra a 42ºC. Si se observan colonias sin centro negro pero con halo rojo se presume la presencia de Shigella sp (2).
Los crustáceos (camarones, etc) son cocidos, pelados a mano y congelados. Este proceso facilita la recontaminación con estafilococos, listerias y patógenos fecales (1). Las especies de Vibrio son anaerobios facultativos, crecen en medios alcalinos con sales biliares y algunas son halófilas estrictas. V. cholerae, V. mimicus, V. vulnificus y V. parahaemolyticus habitan los ambientes marinos costeros templados (12). Audisio MC
132 CUADRO 2. Características de alguna enterobacterias sobre medios selectivos (2, 12).
Bacteria Shigella
Salmonella
E. coli
Medio Mac Conkey Hektoen XLD Mac Conkey Hektoen XLD Mac Conkey Hektoen XLD
Aspecto de la colonia Incolora Verde Sin centro negro y con halo rojo Incolora Verde Con centro negro y halo rojo Chatas, rosadas con halo más intenso Amarillo Amarillo
El Código Alimentario Argentino establece en el art 276 que los moluscos bivalvos y gasterópodos no deben contener más de 400 unidades ratón de toxinas /100 g de pulpa húmeda (80 µg /100 g) determinado por la técnica de Sommer y Meyer (AOAC 14º ed. Cap 18, ítem 086 a 092) (13). REFERENCIAS 1. ICMSF. 1998. Microorganisms in foods. 6. Microbial ecology of food commodities. Blackie Academic & Professional, London, p 130. 2. Mossel DAA et al. 2003. Microbiología de los Alimentos. 2ª ed. Acribia, Zaragoza, p 518, 620, . 3. Tryfinopoulou P et al. 2002. Appl Environ Microbiol 68: 65-72 4. Norton DM et al. 2001. Appl Environ Microbiol 67:198-205 5. Mediel MJ et al. 2000. Appl Environ Microbiol 66: 3637-3638 6. Petersen A et al. 2002. Appl Environ Microbiol 68: 6036-6042 7. Vogel BF et al. 2005. Appl Environ Microbiol 71: 6689-6697 8. Hyytia E et al. 1999 Appl Environ Microbiol 65: 2057-2064 9. Gonzalez Excalona N et al. 2005. Emerg Infect Dis 11: 129-131 10. Santos Y et al. 1988. Infection and Immunity 56: 3285-3293 11. Graczyk TK et al. 2006. Appl Environ Microbiol 72: 3390-3395 12. Downes FP, Ito K, eds. 2001. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4º ed, APHA, Washington, p 159, 405. 13. Código Alimentario Argentino. Cap 6. http//:www.anmat.gov.ar/ codigoa /caa1.htm
Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 12
133
HUEVOS y OVOPRODUCTOS El huevo de gallina consiste aproximadamente de un 9,5% de cáscara, 63% de clara y 27,5% de yema. La cáscara es bastante porosa, está constituida principalmente por carbonato de calcio y la recubre una cutícula proteica que constituye la barrera más importante contra la invasión bacteriana y regula el intercambio de gases (1). Un par de membranas separan la clara de la cáscara y otra rodea la yema La cámara de aire localizada en el polo ancho del huevo, es relativamente pequeña en el huevo recién puesto y aumenta de profundidad a medida que pasa el tiempo. La clara es una solución coloidal con 10,6% de proteínas, 0,9% de carbohidratos, 0,6% de minerales y trazas de lípidos. Al transcurrir el tiempo después de la postura, va perdiendo su consistencia y el pH se incrementa de 7,6 a 9,3. Varias proteínas que constituyen la clara poseen propiedades inhibitorias: conalbúmina, ovomucoide, lisozima, ovomucina, avidina, ovoflavoproteína. La lisozima disuelve las paredes celulares de las bacterias Gram-positivas (2). DETERIORO
El huevo al momento de la postura generalmente es estéril o posee pocos microorganismos. La contaminación de la cáscara ocurre en la cama de las aves y por el contacto con las heces. Para que un microorganismo produzca alteraciones en el huevo debe penetrar a través de los poros de la cáscara hasta a la membrana interna, crecer sobre la membrana y alcanzar la clara o la yema (3). El almacenamiento a la temperatura de refrigeración no evita totalmente la alteración. Las bacterias asociadas con más frecuencia al deterioro son bacilos Gram-negativos: Pseudomonas fluorescens y otras especies , Acinetobacter, Moraxella, Alcaligenes, Proteus , Escherichia y Serratia (3). Los mohos Penicillium, Cladosporium, Mucor y Alternaria se Audisio MC
134
encuentran entre las especies que producen alteración cuando los huevos son mantenidos en un ambiente muy húmedo (4). Una vez que se quita la cáscara para producir los diferentes ovoderivados, son mayores las posibilidades de contaminación. Los factores que favorecen esta situación son: los métodos de rotura y separación de las cáscaras utilizados, la incorporación de huevos con podredumbre que no hayan sido detectados con la observación al trasluz del ovoscopio, la incorporación de “huevos claros”, que fueron incubados y no embrionaron y el efecto antimicrobiano de la clara desaparece cuando se mezcla con la yema (3). MICROORGANISMOS PATÓGENOS
Las bacterias del género Salmonella están asociadas a las aves y los huevos, siendo éstos los principales vehículos de su distribución e infección en el hombre. Colonizan el tracto gastrointestinal, principalmente el buche y el ciego, y se diseminan entre las aves a través de la ruta fecal-oral. En particular S. Gallinarum, S. Pullorum, S. Enteritidis y S. Typhimurium presentan una afinidad por las aves y son invasoras. Pueden infectar el tracto reproductor de la gallina ponedora y así se transmiten verticalmente al huevo (6). S. Enteritidis, S. Typhimurium producen gastroenteritis en el hombre (1). S . Enteritidis coloniza los tejidos del ovario y oviducto de la gallina (7) y cerca del 80% de las gastroenteritis humanas pueden ser « traced to » los ovoproductos contaminados (8). La cáscara del huevo a la altura del útero es esponjosa y muy porosa, y al salir al exterior y como consecuencia del cambio de presión y de temperatura, permite la succión de bacterias presentes en la cloaca, región sumamente contaminada por su continuo contacto con las heces (3). Por otra parte, algunas bacterias pueden llegar a sobrevir en el agua de lavado, por ejemplo S. aureus, y contaminar el interior de los huevos (9). Pocas células de Salmonella son suficientes para infectar a un pollito recién nacido y un solo huevo contaminado, por transmisión vertical, en la incubadora es suficiente para distribuir ese patógeno hacia todos los huevos e infectar toda la incubadora por transmisión horizontal. Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 13
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En un estudio se recuperaron de las granjas diferentes serovariedades de Salmonella del intestino de las aves (7,4 27,5%), huevos embrionados (0 - 2,8%), pollitos (0 - 19,2%), lauchas (15 - 21,4%), cáscara de huevos incubados (1,2 - 2,4%), contenido de huevos incubados (0,3%), camas (4 - 33%), alimento 1,6 - 5%). Los porcentajes de huevos incubados contaminados por otras bacterias provenientes de piso sucios (22,8 - 25,5%), pisos limpios (2 - 2,6%) y nidales limpios (0 1%). Las bacterias de huevos no incubados, en orden decreciente de frecuencia, fueron Staphylococcus, coliformes, Streptococcus, Bacillus, Salmonella y Proteus (10). Las salmonelas pueden crecen en un amplio rango de temperatura 4 - 54ºC, aunque la mayoría de los serotipos no desarrollan a temperaturas inferiores a 7ºC. Pueden proliferar a pH 4,5 - 9,5 y aún a pH 4 si está acidificado con ácido mineral. No crece en alimentos con a w = 0,93 (11). 1. Valores de referencia para huevos y subproductos desecados o congelados (3, 5). CUADRO
Valores de referencia ufc/mL Criterios Recuento de colonias
Huevo líquido crudo m =104 M =106 n=5, c = 2
Ovoproductos pasterizados
Productos elaborados secos
m =104 M =106 n=5, c = 2
m =104 M =106 n=5, c = 2 m = 10 M =103 n =5, c =1* m = <3 M =10 n =5, c =2*
S. aureus
−
−
E. coli
< 102
−
Coliformes
−
−
m = 10 M =103 n =5, c =2 m = 0, n =10, c =0
Enterobacteriaceae
−
m = 10 M =103 n =5, c =2
Salmonella
m = 0, n =10, c =0
negativo en 25 g
* flan de huevo Audisio MC
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Otros patógenos, como Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes y Yersinia enterocolitica, ocasionalmente suelen estar asociados con los huevos u ovoproductos (1). ANALISIS MICROBIOLOGICO
PRUEBA PRESENCIA-AUSENCIA DE Salmonella a. En el caso de huevos enteros, lavar la cáscara con una solución al 0,1% de dodecil-sulfato de sodio y desinfectar con una dilución al 8% de lavandina comercial (hipoclorito de sodio 5,25%) recién preparada. Cascar y pesar el contenido en condiciones de asepsia. b. Agregar 25 g de muestra a 225 mL de diluyente en una bolsa plástica estéril y homogeinizar en un ‘masticador’ durante 2 minutos, o en un frasco con 20 perlas de vidrio estériles de 2 mm de diámetro y mezclar mediante agitación mecánica o manual. Tomar tantas unidades de 25 g como sean necesarias. Incubar 46 hs a 30ºC. c. Añadir al cultivo anterior un volumen de caldo RV de doble concentración. Incubar a 42,5ºC durante 16-18 hs. d. Con un asa sembrar en estrías el cultivo anterior sobre placas de agar XLDN. Incubar 18-24 hs a 37ºC. Observar las colonias negras con halo rojo. Peptona de soja 9 g, cloruro de sodio 14,2 g, fosfato monopotásico 2,8 g, cloruro de magnesio hexa-hidratado 72 g, verde de malaquita oxalato 0,072 g, agua destilada 1 L. Esterilizar 120ºC durante 15 minutos. AGAR XLDN. Extracto de levadura 3 g, L-lisina.HCl 5 g, xilosa 3,75 g, lactosa 7,5 g, sacarosa 7,5 g, Na desoxicolato 2,5 g, cloruro de sodio 2,5 g, tiosulfato de sodio 6,8 g, citrato férrico amónico 0,8 g, rojo fenol 0,08 g, agar 15 g, agua 1 L. Una vez fundido y enfriado a 50ºC, agregar 10 mL de solucion filtrada por membrana (poros de 0,2 µm) de novobiocina al 0,1%. No esterilizar en autoclave (3, 12). CALDO RV.
El procedimiento para Salmonella de alimentos es diferente de su aislamiento a partir de muestras clínicas pues suelen encontrarse en bajo número y con un estrés fisiológico. Es necesario una revitalización y un enriquecimiento durante no menos de 18 hs cuando se analizan alimentos que han sido sometidos a tratamientos térmicos o de secado (12).
Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 13
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En un estudio comparativo la prueba de PCR luego del enriquecimiento, no detectó Salmonella en un 10% de los casos pero los métodos de cultivo dieron positivo en la totalidad de las muestras (13). En el cuadro 1 se dan valores de referencia para huevo líquido, ovoproductos y productos elaborados. CONFIRMACIÓN Tomar con la aguja algunas de las colonias presuntamente de Salmonella y sembrar por punción los tubos con medio SIM, agar urea y medio de Hugh y Leifson y por estría el de agar Mac Conkey. Incubar 10-24 hs a 37ºC. Peptona 1 g, glucosa 1 g, cloruro de sodio 5 g, fosfato monopotásico 2 g, rojo fenol 0,012 g, agar 15 g, agua destilada 1 L. Esterilizar en autoclave y enfriar a 50ºC, agregar 50 mL de una solución de urea al 40% filtrada por membrana con poros de 0,2 µm (3). AGAR MAC CONKEY. Peptona 20 g, lactosa 10 g, bilis de buey desecada 5 g, rojo neutro 0,03 g, cristal violeta 0,001 g, agar 15 g, agua destilada 1 L. No esterilizar en autoclave (12). AGAR UREA.
Si se empleó otro medio selectivo para el aislamiento, sembrar con una aguja por punción y estría en LIA y TSI. Incubar 24 hs a 37ºC. Peptona 5 g, extracto de levadura 3 g, glucosa 1 g, L-lisina 10 g, citrato férrico amónico 0,5 g, tiosulfato de sodio 0,04 g, púrpura de bromocresol (al 1%) 2 mL, agar 15 g, agua destilada 1 L. Esterilizar a 120ºC. TSI. Triptona 20 g, cloruro de sodio 5 g, lactosa 10 g, sacarosa 10 g, glucosa 1 g, sulfato amónico ferroso 0,2 g, tiosulfato sódico 0,2 g, solución al 2% de rojo de fenol 12 mL, agar 13 g, agua 1 L. Esterilizar a 120ºC. LIA.
Las Salmonella no poseen ureasa ni oxidasa, fermentan glucosa, dan colonias incoloras a veces con el centro opaco en Mac Conkey, son móviles y ennegrecen el agar SIM. Se observa reacción alcalina en el fondo del tubo de LIA. En el medio TSI la superficie inclinada es alcalina y el fondo ácido (12).
El Código Alimentario Argentino en el art. 519 establece que el huevo en polvo, la yema en polvo y la clara desecada deben estar libres de Salmonella viables (15). Audisio MC
138 CUADRO 2. Reacciones bioquímicas y serológicas típicas de Salmonella (1).
Prueba o sustrato Ureasa TSI Glucosa
Positivo Rojo púrpura Fondo amarillo
Hugh Fondo y amarillo Leifson
Negativo
Salmonella*
Sin cambio
Negativo
Fondo rojo Sin cambio
Positivo Positivo
Amarillo y/o Sin cambio Negativo ** gas ,no gas Amarillo y/o Sin cambio, Caldo sacarosa rojo fenol Negativo gas no gas H2S (TSI, LIA ó SIM) Negro No negro Positivo Rojo en la Amarillo en Prueba de indol Negativo superficie la superficie Prueba del rojo de metilo Rojo Amarillo Positivo Prueba de Voges Rosado a Sin cambio Negativo Proskauer rojo No crece, Medio citrato de Crecimiento, medio sin Variable Simmons medio azul cambio Fondo Fondo Descarboxilasa LIA púrpura amarillo Positivo de la lisina caldo Púrpura Amarillo Prueba flagelar No Aglutinación Positivo polivamente aglutinación Prueba somática No Aglutinación Positivo polivalente aglutinación Amarillo y/o Sin cambio, Caldo dulcitol rojo fenol Positivo*** gas no gas Caldo KCN Crecimiento No crece Negativo**** Caldo malonato Azul Sin cambio Negativo***** * el 90% de las especies en 1 - 2 días; ** positivo en subespecie a rizonae *** negativo en subespecies a rizonae, diarizonae, houtenae, indica **** positivo en subespecies houtenae, bongori ***** positivo en subespecies salamae, arizonae, diarizonae Caldo lactosa rojo fenol
El medio selectivo de enriquecimiento tiene por finalidad permitir que crezcan las Salmonella e inhibir el desarrollo de Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 13
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otros microorganismos y en su formulación se utilizan compuestos químicos inhibidores (colorantes, agentes redox, etc.). Se eligen temperaturas y tiempos de incubación que faciliten el desarrollo del género investigado. Finalmente se utilizan medios de aislamiento gelificados con agentes selectivos donde estas bacterias crecen formando colonias características. Una vez aisladas las colonias se procede a su confirmación, pero la identificación final se realiza por serología en los centros de referencia, por ejemplo el Instituto Malbrán de la ciudad de Buenos Aires (14). REFERENCIAS 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15.
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Audisio MC
140
LECHE Y DERIVADOS Se entiende por leche al producto que surge de la secreción normal de las glándulas mamarias de los mamíferos. Cualquier leche que no haya sido calentada a temperaturas de pasteurización se denomina cruda. Existen varias formas de tratamiento para aumentar la vida útil del producto: la pasterización a 63 - 66ºC durante 30 minutos o a 72ºC durante 15 segundos y enfriamiento de inmediato a 10ºC, el tratamiento UHT a 133ºC durante al menos 1 segundo y envasado en recipientes estériles, la filtración, clarificación, homogeinización y envasado seguido de calentamiento a 120ºC durante 10 - 30 minutos (1). La leche es un buen medio de cultivo para el crecimiento de varios microorganismos por su contenido en agua, pH casi neutro, y una amplia variedad de nutrientes como lactosa y diferentes proteínas. Aún cuando la leche posee un alto contenido de lípidos son pocos los microorganismos que los utilizan (2). La leche contiene varios factores antimicrobianos: lisozima, lactoferrina, proteínas de la leche unidas a vitamina B 12 y ácido fólico, lactoperoxidasa e inmunoglobulinas maternas. La lactoferrina tiene la capacidad de quelar el hierro. La lactoperoxidasa cataliza la síntesis de compuestos con efecto inhibidor sobre bacterias pero no levaduras o mohos (1). Los microorganismos son importantes en la leche y los productos derivados porque producen aromas y propiedades físicas deseables en productos lácteos, pero otros pueden generar alteraciones y algunos patógenos o sus toxinas pueden tornar peligrosos a los productos lácteos (2). La diversidad en los microorganismos presentes es la responsable de la gran diferencia en las características organolépticas entre los quesos hechos con leche cruda, respecto a los pasterizados. La microbiota dominante incluye: a) bacterias lácticas (Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Enterococcus, Streptococcus, etc), b) Pseudomonas, c) Micrococcaceae (Micrococcus y Staphylococcus), y d) levaduras. Otros organismos presentes en la leche cruda son Bacillus, Clostridium, Listeria, Enterobacteriaceae (Hafnia , Citrobacter, Serratia), Acinetobacter,
Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 14
141
Alcaligenes, Flavobacterium, Aeromonas, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Propionibacterium (3).
BACTERIAS LACTICAS
Son bacilos o cocos, gram-positivos, no esporulados y en general catalasa-negativos, con una amplia distribución y adaptabilidad a diferentes ambientes. Pueden producir un pH 4,0 en los alimentos con carbohidratos fermentables, inhibiendo el desarrollo de otras bacterias. Aunque son mesofílicas pueden crecer a 5-45ºC (4). El género Lactobacillus se divide en tres grupos: a) homofermentativos obligados (L. acidophilus, L. delbrueckii subespecie bulgaricus, etc) son termobacterias que no fermentan pentosas, b) heterofermentativos facultativos ( L. casei, L. plantarum, etc) que fermentan pentosas, c) heterofermentativos obligados ( L. brevis, L. reuterii, etc) que producen CO 2 de glucosa (5). Los cocos comprenden también a Aerococcus, Carnobacterium, Pediococcus, Tetragenococcus y Vagococcus, además de los géneros ya nombrados (6). Hay tres grupos genéticamente diferentes de estreptococos: a) Streptococcus en la ubre y la cavidad oral, b) Enterococcus (E. faecalis, E. faecium, etc) propios del intestino y c) Lactococcus, en la leche (7). Los enterococos están con frecuencia en los quesos de leche cruda contribuyendo a las características organolépticas, entre ellos E. casseliflavus, E. faecalis y E. durans. Pero E. faecium y Streptococcus bovis , que predominan en el intestino vacuno, no se suelen encontrar en la leche ni en el queso (8). Aproximadamente el 10% de la leche cruda contiene diversos fagos de Lactococcus lactis, algunos de los cuales son sensibles a la pasterización, pero el 34% de las cepas industriales son resistentes a la infección por fagos (9). Las bacterias lácticas poseen propiedades terapéuticas, mostrando una variedad de efectos beneficiosos. La fermentación de la leche por los lactobacilos genera una mayor disponibilidad, digestibilidad y asimilación de sus nutrientes, aumentan la concentración de vitamina B1, ácido láctico, galactosa, ácidos grasos y elementos esenciales como Ca, P, Mn, Fe y Zn (10). L. acidophilus actúa disminuyendo el colesterol en sangre (11). L. helveticus produce leche fermentada rica en inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina (12). Audisio MC
142
La hidrolisis de la lactosa mediante la ß-galactosidasa y la fermentación de los productos, resultan ser beneficiosas para las personas intolerantes a la lactosa (13). Las bacterias del ácido láctico y sus metabolitos presentan propiedades anticancerígenas que pueden deberse a: inhibición de células tumorales, supresión de las bacterias productoras de βglucosidasa, β-glucuronidasa y azorreductasa responsables de la liberación de sustancias cancerígenas a partir de sustratos inocuos, o degradación de sustancias cancerígenas como las nitrosaminas (14, 15). Son conocidas las propiedades probióticas, con impacto en la salud humana, de la leche fermentada comercial con cepas de L. casei y L. acidophilus (16, 17, 18). El 51,2% de las células de L. casei ingeridas con la leche fermentada sobreviven en el íleo y el 28,4% en el colon (19). DETERIORO
La leche cruda puede ser alterada por bacterias psicrotrófas, que, en general, son bacilos, no esporulados, gram-negativos, proteolíticos, con algunas cepas lipolíticas. Los más frecuentes son Pseudomonas fluorescens y P. putida que provocan cambios en el aroma y el sabor del producto refrigerado. Otras especies son P. fragi, P. aeruginosa, P. stutzeri y Burkholderia cepacia . Llegan a través del suelo, forraje, agua, los otros animales y también por los utensilios de ordeño y tanques de transporte o almacenamiento mal lavados. También la leche pasteurizada puede verse contaminada por la exposición al aire o equipos contaminados. El tiempo de generación de estas bacterias en la leche cruda es de 8-12 hs a 3ºC y se reduce a 5,5-10 hs a 5ºC, y si inicialmente había 1 ufc/mL en 5 días la leche puede estar totalmente alterada (20). Los bacilos coliformes producen gas a partir de la lactosa mientras que determinadas especies de Streptococcus, Alcaligenes y Enterobacter son responsables de la viscosidad y P. aeruginosa y Serratia marcescens pueden conferir, respectivamente, color azul y rojo. Es muy difícil producir leche cruda libre de coliformes. No obstante, los altos recuentos son indicadores de malas prácticas de producción, transporte o almacenamiento (5). En la leche pasteurizada la presencia de bacterias coliformes es inaceptable porque la temperatura de procesamiento las Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 14
143
destruyen así como a la fosfatasa. También la presencia de coliformes puede indicar recontaminación post-pasteurización por los equipos sucios o defectuosos, los operarios o los envases mal desinfectados. Los miembros de los géneros Bacillus y Clostridium llegan a la leche porque se encuentran presentes en las superficies externas de la vaca, el suelo, el forraje o el estiércol. El número, de cien a varios miles por mL, depende de los cuidados en la limpieza y desinfección de las superficies del animal antes del ordeñe. El deterioro de las leches ultrapasterizadas es causado por los esporulados aeróbicos ( Bacillus cereus, B. licheniformis, B. sporothermoduans, Paenibacillus spp.), pero los anaeróbicos no parecen ser un problema debido al potencial de reducción relativamente alto (5). Por otra lado, la maquinaria y/o equipamiento que se utilizan para recolectar la leche contribuyen en un alto porcentaje a la microflora de la leche cruda sino son bien desinfectados. Alcaligenes, Chromobacterium, Flavobacterium, Pseudomonas son algunos organismos que llegan a la leche por esta vía. Los productos lácteos presentan propiedades diferentes a la de la leche fluída porque se han concentrado algunos nutrientes o se han removidos otros, modificando la a w, el pH y el potencial redox, entre otros parámetros. Por ejemplo, el yogurt tiene pH 4,3 y los quesos pH >5,2, pero éstos tienen una actividad de agua reducida (0,90-0,95) y son sólidos (2). Algunas cepas de Lactobacillus plantarum suelen formar gran cantidad de D-lactato durante el curado de ciertos quesos, provocando un depósito cristalino blanco en la superficie (21). Algunas levaduras de los géneros Candida Kluyveromyces, Debaryomyces, Rhodotorula y Yarrowia producen enranciamiento de los productos lácteos y/o formación de gas. Los quesos son susceptibles a la acción de los mohos ( Penicillium, Aspergillus, Alternaria, Mucor, Geotrichum, Fusarium, Cladosporium y otros ) (22). MICROORGANISMOS PATÓGENOS
La microbiota normal de la ubre, glándula mamaria de la vaca, está compuesta principalmente por bacterias como Streptococcus, Staphylococcus y Micrococcus (alrededor del 50%) seguido por Corynebacterium spp, Escherichia coli y otros. Audisio MC
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Las condiciones anormales debidas a infecciones, enfermedades o prácticas lecheras deficientes pueden afectar la microflora de la leche que procede de la ubre. Las vacas enfermas de mastitis esparcen un gran número de microorganismos y células somáticas en la leche. Staphylococcus aureus, los estreptococos S. agalactiae, S. dysgalactiae, S. uberis y E. coli son las bacterias asociadas con más frecuencia a los casos de mastitis. También han sido aislados Listeria monocytogenes , Staphylococcus epidermidis , P. aeruginosa y Corynebacterium bovis (23). Las Brucella abortus, B. melitensis y B. ovis causan la brucelosis en vacas, cabras y ovejas provocando abortos y se debe mantener la vigilancia veterinaria para evitar la difusión de la zoonosis (24). Después de atravesar la barrera protectora de las mucosas, las brucelas llegan a los ganglios linfáticos donde son fagocitados por los leucocitos macrófagos y polimorfonucleares. Como están protegidas contra la digestión, son capaces de sobrevivir y multiplicarse dentro de estas células. Pueden colonizar casi todos los órganos y tejidos, especialmente bazo, hígado y médula ósea. Durante la eliminación de las brucelas en las células destruídas, se liberan endotoxinas que provocan fiebre. Debido a que no es probable la multiplicación en la leche, el control más eficaz es eliminar del rebaño a los animales enfermos de brucelosis (25). Las vacas enfermas también pueden introducir Mycobacterium bovis y M. paratuberculosis. Los agentes infecciosos como Salmonella spp, Campylobacter spp o Yersinia enterocolitica suelen ser encontrados en la leche como resultado de contaminación con materia fecal. M. paratuberculosis ha sido aislado del 1,6% de envases comerciales de leche pasterizada a 71,7ºC durante 15 segundos, proveniente de tambos con el 10-19,7% de vacas con infección entérica subcrónica (26). También Listeria monocytogenes puede sobrevivir a la pasterización llevada a cabo a esa temperatura (27). L. monocytogenes fue hallada en 19,6% y L. innocua en el 8,5% de la leche del tanque de almacenamiento en una usina láctea (28). Bacillus cereus puede producir citotoxinas en crema batida a 8ºC pero no en leche fluída (29). Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 14
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El personal que realiza ordeñe manual, práctica poco usual actualmente, pueden introducir en la leche micrococos y estafilococos procedentes de sus vías respiratorias (5). Algunas cepas de Lactobacillus buchneri y L. brevis pueden descarboxilar histidina y tirosina conduciendo a la acumulación de aminas vasopresoras en quesos (30). ANALISIS MICROBIOLOGICO
El Código Alimentario Argentino (CAA) establece límites microbiológicos para leche pasterizada y en polvo, quesos y otros productos (cuadros 1, 2 y 3). Los límites para leche cruda certificada son ausencia de patógenos y E. coli, bacterias coliformes <10 /mL y bacterias mesófilas < 10 4/mL en el momento de la recepción por el consumidor (art 557) (31). CUADRO 1. Criterios microbiológicos para leche según art. 556, 558, 559 y 567 del CAA (31).
Leche Recuento en placa de bacterias mesófilas /mL Recuento a 30ºC de coliformes /mL Recuento a 45ºC de coliformes /mL S aureus coagulasa positiva /g Salmonella spp /25g E coli
Fosfatasa y peroxidasa Aflatoxina M1
entera pasterizada <5.104 invierno; <105 verano <50 ─
ultrapasterizada entera en polvo n=5 c=2 m=10 M=103 n=5 c=2 m<3 M=10 n=5 c=1 m<3 M=10
n=5 c=2 m=3.104 M=105 n=5 c=2 m=10 M=100 n=5 c=2 m<3 M=10 n=5 c=1 m=10 M=100
─
─
─
─
n=10 c=0 m=0
ausencia en 1 mL
─
─
negativas
negativas
─
0,5 µg/L
0,5 µg/L
5,0 µg/L
Un método rápido para detectar bacterias en leche consiste en la filtración de una dilución a través de una membrana de Audisio MC
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polisulfonas que las retiene, y la tinción con azul de toluidina permitiendo la visualización de las mismas. El tratamiento con etanol-ácido acético (pH 2,8-3,0) decolora las gram-negativas (32). También la citometría de flujo de la leche cruda aclarada enzimáticamente, es una análisis rápido con un límite de detección de 104 bacterias/mL (33). Un método específico para la detección de patógenos en la leche, tal como Listeria monocytogenes , consiste en un enriquecimiento y cultivo en placa, seguido de la extracción de ADN y la detección por PCR (34). Una técnica más accesible es el ensayo inmunológico conocido como ELISA, usado para detectar Brucella spp (31), Salmonella spp (35) y otros patógenos en leche. CUADRO 2. Criterios microbiológicos para quesos con distintos grado de humedad según el art 605 del CAA (31).
Humedad Coliformes totales /g (30ºC) Coliformes /g (45ºC) Estafilococos coagulasa positiva /g Salmonella
spp /25g Listeria monocytogenes
/25g Mohos y levaduras
n=5 c=2 m=2.102 M=103 n=5 c=2 m= 102 M=5.102 n=5 c=2 m=102 M=103
>36% y <46% n=5 c=2 m=103 M=5.103 n=5 c=2 m= 102 M=5.102 n=5 c=2 m=102 M=103
>46% y <55% n=5 c=2 m=5.103 M=104 n=5 c=2 m=103 M=5.103 n=5 c=2 m=102 M=103
>46% y <55% * n=5 c=2 m=104 M=105 n=5 c=2 m=103 M=5.103 n=5 c=2 m=102 M=103
n=5 c=0 m=0
n=5 c=0 m=0
n=10 c=0 m=0
n=10 c=0 m=0
−
n=5 c=0 m=0
n=5 c=0 m=0
n=10 c=0 m=0
−
−
−
−
<36%
* cuartirolo, cremoso y criollo, ** con bacterias lácticas vivas
Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 14
>55% ** n=5 c=3 m=100 M=103 n=5 c=2 m= 10 M=102 n=5 c=2 m= 10 M=102 n=10 c=0 m=0 n=10 c=0 m=0 n=5 c=2 m=5.102 M=5.103
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CUADRO 3. Criterios microbiológicos para varios productos lacteos según art 576, 592 y 603 del CAA (31).
Productos Coliformes /g a 30ºC Coliformes /g a 45ºC S aureus coagulasa positivo Salmonella spp/25 g Mohos y levaduras /g
leches fermentadas n=5 c=2 m=10 M=100 n=5 c=2 m<3 M=10 ─ ─
n=5 c=2 m=50 M=200
manteca salada n=5 c=2 m=10 M=100 n=5 c=2 m<3 M=10 n=5 c=1 m=10 M=100 n=5 c=0 m=0 ─
dulce de leche ─ ─
n=5 c=2 m=10 M=100 ─
n=5 c=2 m=50 M=100
DETECCION y RECUENTO DE Staphylococcus aureus
Realizar un hisopado de manos y/o fosas nasales del operador. Hacer estrías con el hisópo sobre una placa de agar Baird Parker. -1 -2 b. Preparar las diluciones de la muestra (10 y 10 ). Sembrar 0,1 mL de cada dilución en sendas placas del medio de cultivo y extender con una varilla de vidrio doblada en L. Incubar a 37ºC durante 24 - 48 hs. Observar las colonias circulares, lisas, planas, pequeñas, negras, rodeadas de una zona opaca y con frecuencia una zona clara alrededor de la opaca. Determinar número de ufc/mL. Tomar varias colonias que presenten las características típicas y repicarlas en caldo infusión de cerebro y corazón. Incubar a 37ºC durante 24 hs. Hacer una coloración de Gram y observar los cocos en racimos gram-positivos. Realizar la prueba de catalasa y la de coagulasa, ambas serán positivas. a.
AGAR BAIRD PARKER. Peptona de caseína 10 g; extracto de carne 5 g,
extracto de levadura 1 g, piruvato de sodio 1 g, glicina 1,2 g; cloruro de litio 0,5 g, agar 15 g, agua 1 L, pH 6,8. Esterilizar a 120°C durante 15 minutos. Agregar al medio fundido y enfriado a 50°C, 50 mL de la emulsión de yema de huevo al 20% y 5 mL de telurito de potasio al 2%, mezclar y volcar en cajas de Petri. PRUEBA DE COAGULASA. En un tubo pequeño colocar 0,3 mL de plasma de conejo u otro animal, y añadir 0,1mL del cultivo. Incuba a 37ºC y observar la coagulación a las 4, 6 y 24 hs (2).
Audisio MC
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RECUENTO DE Lactobacillus Y Enterococcus
Con un sacabocado estéril tomar una porción de queso, descartar los extremos y pesar asépticamente, añadir cloruro de sodio al 0,85% o citrato de sodio al 2%, estéril y a 40ºC, para -1 -2 -3 obtener la dilución 10 . Preparar las diluciones 10 y 10 . b . Tomar 1 mL de la muestra líquida y agregarlo a 9 mL de diluyente. Homogeinizar y hacer diluciones decimales. c. Sembrar 0,1 mL en la superficie de las placas de medio de cultivo extendiendo con una varilla en L. Colocar las placas de MRS invertidas en el interior de una lata y sobre las mismas una vela encendida, tapar herméticamente. Cuando la llama se ha consumido, la disminución del oxígeno estimula el desarrollo de estas bacterias. Incubar a 37ºC durante 2448 hs. Incubar las placas de MSS a 37ºC durante 24-48 hs sin ningún tratamiento especial. Observar las colonias circulares, pequeñas, con bordes definidos, blancas, opacas, chatas y determinar el número de ufc/g ó mL. a.
MEDIO DE MAN, ROGOSA, SHARPE (MRS) . Peptona de carne 10 g, extracto
de carne 10 g, extracto de levadura 5 g, glucosa 20 g, tween 80 1 mL, acetato de sodio 5 g, citrato triamónico 1 g, fosfato dipotásico 2 g, sulfato de magnesio 0,2 g, pH 6,6. Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos, enfriar a 50ºC y volcar en cajas de Petri (2). MEDIO SELECTIVO PARA STREPTOCOCCUS (MSS). Peptona de carne 5 g, tripteína 14 g, glucosa 5 g, citrato de sodio 1 g, cloruro de sodio 4 g, azida sódica 0,22 g, sulfito de sodio 0,22 g, L-cisteína 0,22 g, pH 6,5-7,0. Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos, enfriar a 50ºC y volcar en cajas de Petri.
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11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35.
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150
PRODUCTOS EN ENVASES HERMÉTICOS Los alimentos que son colocados en latas, frascos de vidrio y bolsas con cierre hermético, están protegidos del pasaje de gases o microorganismos y pueden permanecer inalterados indefinidamente si han sido sometidos a un tratamiento térmico adecuado y si el cierre permanece intacto (1). La calidad de las conservas y su vida de estante dependen de la materia prima y los aditivos usados. La carga microbiana del producto final está relacionada con la microbiota presente en la materia prima y la eficacia del proceso de envasado. Los alimentos tratados por el calor, estables a temperatura ambiente, se dividen en dos clases: los que son completamente estériles (la mayoría de origen animal) y los que contienen un pequeño número de endosporos bacterianos viables, aunque en estado latente (muchas de origen vegetal). A esta última clase se la llama conserva con esterilización comercial (2). La supervivencia microbiana durante el procesamiento por calor depende de la temperatura alcanzada, la duración del tratamiento y la composición del alimento, además del tipo de organismos presentes en la materia prima (3). Con respecto a la composición del alimento cabe considerar el efecto de varios parámetros: a) pH (a medida que descienden los valores aumenta el poder microbicida del calor), b) concentración de cloruro de sodio (hasta 4% favorece la termorresistencia bacteriana y a mayores valores el efecto es inhibitorio), c) concentración de carbohidratos y grasa (a medida que aumentan mayor es la termorresistencia de los microbios), d) contenido de agua (los gérmenes toleran más el calor seco que el calor húmedo) (1). Si bien las conservas son los productos alimenticios más resistentes al deterioro no están exentas de posibles alteraciones debido a causas físicas, químicas o microbiológicas, siendo la más apreciable el abombamiento o hinchazón de la tapa y/o la base por la formación de gas en el interior (3). Manual de Microbiología Agrícola – capítulo 15
151 DETERIORO
Las conservas alteradas por el desarrollo microbiano suelen presentar ablandamiento del producto enlatado, descomposición, olor repugnante, sabor amargo, líquido turbio o decoloración. En las conservas de frutas o verduras que por su termosensibilidad deben someterse a tratamientos térmicos suaves, comúnmente el deterioro se debe a una microbiota heterogénea entre la que se destacan Lactobacillus spp, Leuconostoc spp y Streptococcus thermophilus. Cuando las bacterias lácticas son heterofermentativas, producen abombamiento por la formación de CO 2. La asociación microbiana alterante de los pescados enlatados, conservados mediante adición de cloruro de sodio, reducción de pH y con frecuencia conservantes autorizados, está constituída principalmente por especies de lactobacilos y Pediococcus. Un ejemplo de este tipo de alimentos son los filetes de anchoas en aceite o salmuera (2). En los alimentos con poca acidez, como las hortalizas, los agentes de deterioro son de origen bacteriano, pero algunas bacterias lácticas pueden desarrollar en ambientes tan ácidos como una conserva de tomates. En las conservas de productos con mucha acidez, como las frutas, los agentes de alteración predominantes son los mohos y levaduras. Ambos suelen ser sensibles al calor, sin embargo algunas especies de mohos tienen ascosporas resistentes, por ejemplo Byssochlamys fulva presenta un valor D entre 1 y 12 minutos a 90ºC según el sustrato (4). Por otra parte, los contaminantes que pueden aparecer luego del tratamiento térmico, debido a los defectos en los cierres y/o la contaminación del agua de enfriamiento o las cintas transportadoras, son S. aureus y enterobacterias (2) Entre las bacterias forman endosporos muy resistentes al calor están los productores de gas Paenibacillus polymyxa y P. macerans que suelen estar asociados con el deterioro de las conservas de arvejas, espinacas, chauchas, espárragos y tomates. Las especies que no sintetizan gas, como Bacillus subtilis y P. megaterium, son responsables de la alteración de las conservas neutras o poco ácidas (3). Las especies de Clostridium se desarrollan sin problemas en ambientes anaerobios, tales como los recipientes cerrados al Audisio MC
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vacío o aquellos donde el oxígeno residual fue consumido por los organismos aerobios acompañantes. En los productos poco ácidos, C. butyricum y C. pasteurianum causan la fermentación butírica con producción de gases que dan lugar a la hinchazón del envase. Este tipo de deterioro se suele observar en los productos ricos en carbohidratos, como los tomates, peras, manzanas, ananás y otros, sometidos a un tratamiento térmico inferior a 100ºC (1). Se conocen tres tipos de alteraciones producidas por los microorganismos termófilos: a) agriado debido a la fermentación causada por Bacillus coagulans y Geobacillus stearothermophilus que origina ácidos orgánicos, b) producción de gases (H 2, CO2) por Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum que conduce al abombamiento, c) formación de H 2S por Desulfotomaculum nigrificans y C. bifermentans dando mal olor y ennegrecimiento debido a los sulfuros (3). Clostridium botulinum produce una potente neurotoxina y su ingestión da lugar al botulismo, una intoxicación grave y muchas veces mortal. Las conservas afectadas no siempre tienen alterados los caracteres organolépticos. Esta bacteria no desarrolla en alimentos con pH ≤ 4,5 (1). Hay 7 serotipos de neurotoxinas, de A hasta G. Las toxinas A, B y E están relacionadas con frecuencia a los casos humanos, el tipo F pocas veces y los C y D solo ocasionalmente. El tipo G no ha sido observado en intoxicaciones humanas pero fue aislado del suelo en la Argentina ( C. argentinensis). Las neurotoxinas son proteínas grandes, antigénicas, que producen una parálisis muscular flácida. Se pueden utilizar reacciones inmunológicas para la detección de las mismas en los alimentos, en lugar de la prueba biológica con ratones (5). Sin embargo el bioensayo con ratones es altamente sensible con un límite cercano a 10 pg/mL, equivalente a una unidad ratón. Este método requiere animales vivos y no es específico a menos que se use el antisuero correspondiente al serotipo de la toxina, en la neutralización para los animales testigo (6). El Código Alimentario Argentino (CAA) en el art. 926 establece que los productos en envases herméticos deben sufrir un tratamiento que garantice la inactivación de los endosporos Manual de Microbiología Agrícola – capítulo 15
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de C. botulinum, lo cual se podrá comprobar en los registros del tratamiento térmico provistos por el fabricante. En el capítulo XI indica que las conservas de palmitos, pimientos, tomates, aceitunas, duraznos, damascos, peras y otras serán envasados con el agregado de ácidos cítrico, tartárico, láctico o málico para obtener un pH inferior a 4,5. En el art. 280 dice que las conservas de origen animal después del tratamiento térmico adecuado en tiempo y temperatura, deberán permanecer a 30ºC durante un tiempo no menor de 15 días (7). ANALISIS MICROBIOLÓGICO
Las conservas deben estar libres de células somáticas bacterianas, mohos y levaduras viables, así como de toxinas, sin deterioro de sus propiedades organolépticas. El número de envases tomados al azar durante el muestreo depende del tamaño del lote, comúnmente 200. Se examinan para detectar defectos en el cierre y abombamiento. Si se encuentran tres o más envases defectuosos se rechaza el lote, pero si se detectan uno o dos se vuelve a muestrear el lote para examinar los envases. RECUENTO DE BACTERIAS ESPORULADAS DEL AGRIADO -1
-4
Hacer las diluciones de 10 a 10 y calentar los tubos a 80ºC durante 10 minutos. Sembrar 0,1mL de cada dilución sobre sendas placas de agar glucosa púrpura, extendiendo con una varilla de vidrio en L. Luego cubrir con una capa gruesa del medio de cultivo fundido y a 50ºC. Incubar las placas invertidas a 55ºC durante 48 horas. Contar las colonias en cada placa y calcular el número multiplicando por el factor de dilución correspondiente. Las colonias de B. coagulans son de color amarillo pálido, rodeadas de una zona ácida. G. stearothermophilus puede crecer formando colonias puntiformes. Repicar en agar glucosa triptona de pH 5 e incubar a 55ºC durante 48 horas. Crece B. coagulans pero no las otras especies (2)
Si esta selección revela 1% o más productos defectuosos, se rechaza el lote, pero si es menor se hace la prueba de incubación a 20 latas tomadas al azar. Los alimentos pocos Audisio MC
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ácidos y las carnes curadas se colocan a 30-37ºC durante al menos 10 días, los muy ácidos se mantienen a 25ºC por más tiempo. Si el producto se comercializa en zonas cálidas se incuba la mitad de los envases a 55ºC (8). PRUEBA DE INCUBACION
Incubar a 30ºC un número de envases, tomados rigurosamente al azar, colocando cada uno sobre una caja de Petri provista de una hoja circular de papel de filtro para absorber cualquier material expulsado durante la prueba. Observar diariamente y las latas hinchadas o las que pierden contenido se examinan sin demora. Lavar las superficies con agua jabonosa, enjuagar y desinfectar con etanol 70%. Colocar sobre el envase un largo clavo que pasa a través del vástago de un embudo invertido, para evitar salpicaduras hacia el operador quien llevará un protector de los ojos. Golpear el clavo con un solo golpe vertical y luego abrir las latas bajo condiciones de asepsia. Inspeccionar la consistencia del contenido, sentir el olor y tomar el pH, comparándolo con el de un envase idéntico al no incubado, como testigo. Tomar 10 g y agregar 90 mL de diluyente en un frasco con perlas de vidrio o en una bolsa para ‘stomacher’. Homogeneizar y dejar sedimentar. Tomar 10 µL y extenderlo sobre un área de 1 2 cm . Secar, fijar y colorear según Gram. Sobre otro extendido hacer la coloración de endosporos. Diferenciar y contar los principales tipos morfológicos de los organismos observados en diez o más campos microscópicos separados. Conociendo la superficie del campo microscópico, calcular el número aproximado de células de cada uno de los grupos de bacterias presentes en 1 g de la muestra. Repetir las mismas operaciones con las muestras incubadas a 55ºC (2).
Las verduras ácidas y las frutas enlatadas con un pH inferior a 4,5 no presentan ningun problema microbiológico en relación con la salud pública. Sin embargo suele requerirse la realización de pruebas de incubación cuando no se disponen de los registros del tratamiento térmico y la integridad de los envases (8). Manual de Microbiología Agrícola – capítulo 15
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El CAA en los art. 280, 926 y 1340 establece que las conservas de origen animal y vegetal y los alimentos dietéticos en envases herméticos, respectivamente, deben ser sometidos a la prueba de incubación. La mitad de las muestras, extraídas estadísticamente, serán colocadas a 35ºC durante 14 días y la otra mitad a 55ºC durante 7 días. Después de incubadas y enfriadas no presentarán hinchazón ni modificaciones en sus propiedades organolépticas y pH (7). Los filetes de anchoas en aceite o en salmuera después de una incubación a 17ºC durante tres días, no deben exceder las 104 ufc de lactobacilos y levaduras /g y si el pH máximo está muy por debajo de 4,5 no son necesarias más pruebas (2). ESPORULADOS TERMOFILOS SULFITO-REDUCTORES
Mezclar 20 g de muestra con 80 mL de agua estéril. Llevar a ebullición y mantener la temperatura durante 5 minutos. Agregar 5 mL a cada uno de 5 tubos con 25 mL de agar sulfito fundido y a 50ºC. Dejar gelificar y cubrir con 3 mL de agar-agua estéril. Incubar a 57ºC durante 24-48 horas. Contar las colonias negras inmersas en el medio y referir los resultados a 10 g de muestra. AGAR SULFITO. Extracto de carne 8 g, peptona de caseína 5 g,
peptona de carne 5 g, almidón 1 g, extracto de levadura 1 g, clorhidrato de cisteína 0,5 g, glucosa 1 g, agua 1 litro. Esterilizar a 120ºC durante 20 minutos. Enfriar a 50ºC y agregar 7,5 mL de sulfito de sodio al 10% recien preparado en agua estéril y 5 mL de citrato férrico-amónico al 20% esterilizado en autoclave (1).
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AGUA Y BEBIDAS SIN ALCOHOL AGUA
El agua purificada o la mineral natural, pueden ser envasadas tal cual o como ingredientes de otras bebidas (aguas saborizadas y jugos diluídos, gasificados o no). Después de la desinfección, el agua de suministro público suele tener un recuento de bacterias heterótroficas <10 a 100 ufc/mL. Luego entra en el sistema de distribución y almacenamiento donde ocurren cambios cuali y cuantitativos en la calidad microbiológica (1). Las bacterias crecen cuando el cloro o el ozono se ha disipado y predominan los bacilos gram-negativos ( Pseudomonas, Flavobacterium, Burkholderia, Moraxella Acinetobacter) (2). El porcentaje de bacterias pigmentadas es muy variable, pero en el agua embotellada puede llegar a ser la población dominante (Flavobacterium y Pseudomonas pigmentadas, a veces Chromobacterium, Mycobacterium y otros) (1). Ocasionalmente Pseudomonas aeruginosa coloniza las instalaciones de la planta embotelladora (3). El agua mineral natural embotellada suele contener proteobacterias (97%), actinobacterias (2%) y otras (1%), predominando Burkholderia, acompañada de Aquabacterium, Bradyrhizobium, Caulobacter, Hydrogenophaga, Limnobacter, Polaromonas, Rhodoferax, entre otras (4). Legionella puede sobrevivir en agua de bebida (5) así como Aeromonas (6) y Asaia es un miembro de las bacterias acéticas que ha sido a veces aislado de agua con sabor frutal (7). Se ha observado la presencia de quistes de Giardia y ooquistes de Cryptosporidium en el 17 y 27% de las aguas de bebida, respectivamente, pero sólo un 10% eran viables (8). ANALISIS MICROBIOLOGICO
El desarrollo de coliformes no fecales que están naturalmente en el suelo, el agua dulce y la vegetación, significa que hubo contaminación con los organismos
Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 16
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transportados por el aire o las superficies en contacto con el producto no desinfectadas. Los coliformes fecales indican contaminación con aguas cloacales y la posibilidad de estar asociados a patógenos Los organismos comunes que aparecen durante el análisis del agua embotellada no suelen tener significado sanitario. Un recuento bajo (menor que 100 ufc/mL) en el momento del envasado sirve como indicador de las buenas prácticas de manufactura, pero la presencia de coliformes demuestra la falta de las mismas y es índice de un problema potencial para la salud. El criterio para agua embotellada, dado por la Comisión del Codex Alimentarius, expresa que en las regiones tropicales es muy probable observar una prueba de coliformes falsamente positiva, debido a otras bacterias nativas de esos lugares (2). El Código Alimentario Argentino (CAA) establece en el capítulo XII, que el agua potable de suministro público no debe contener E. coli ni P. aeruginosa en 100 mL y el número más probable (NMP) de coliformes no mayor que 3 en igual volumen (art 982). Si el número de bacterias mesófilas en los tanques de almacenamiento es mayor que 500 ufc/mL se exige la higienización (9). Los coliformes, fecales o no, pueden no ser índices efectivos de la presencia de quistes de protozoos (parásitos o de vida libre) y virus de mamíferos, porque algunos de éstos son más resistentes a la desinfección que los coliformes (2). Clostridium perfringens y los colifagos somáticos se suelen usar como indicadores de la eficiencia del tratamiento aplicado al agua de bebida durante el control de virus y quistes de protozoos (10). El agua mineral natural debe estar libre de parásitos, estreptococos fecales, E. coli y P. aeruginosa en 250 mL, y de anaerobios esporulados sulfito-reductores en 50 mL (CAA art. 985). El agua saborizada o mineralizada artificialmente debe cumplir esos mismos requisitos. El art. 983 del CAA expresa que las plantas embotelladoras deben llevar un registro de los controles analíticos físicos, químicos y microbiológicos realizados. El agua gasificada en sifones a la salida de la línea de llenado debe tener un residuo mínimo de 0,2 mg de cloro activo o de ozono /L (art. 1017) (9). Carrillo L
158 ANALISIS DE AGUA a.
Dejar que el agua caiga gota a gota del grifo. Flamear la boca del mismo hasta que las gotas se evaporen. Dejar que el agua corra libremente durante 2 minutos y luego recoger la muestra en un recipiente estéril. b. Tomar un envase original sellado c. Recoger la muestra desde los llenadores en una botella preesterilizada. Mezclar 100 mL de muestra con 100 mL de caldo TGSB y dejar 1 hora a la temperatura ambiente. Agregar 20 mL del suplemento e incubar a 30ºC durante 24 horas. Si no se observa desarrollo dejar otras 24 horas. Sembrar 0,1 mL del cultivo en la superficie de cada placa de medio extendiendo con una varilla de vidrio en L. Incubar una placa de agar VRBL a 30ºC y la otra, junto con las de agar KEA y agar NC, a 42ºC durante 24-48 hs. Si no hay crecimiento se considera que el agua es apropiada para el consumo. CALDO TGSB. Triptona 17 g, peptona de soja 3 g, cloruro de sodio 10 g, fosfato de potasio 2,5 g, glucosa 10 g, agua 1 litro, pH 7,3. Esterilizar en autoclave a 120ºC durante 20 minutos. SUPLEMENTO. Sales biliares 50 g, cloruro de sodio 10 g, púrpura de bromocresol 0,1 g, agua 1 litro, pH 7,4. Esterilizar a 120ºC durante 20 minutos. AGAR VRBL (para coliformes) . Peptona 20 g, lactosa 10 g, sales biliares 1,5 g, cloruro de sodio 5 g, rojo neutro (sol. hidroalcohólica al 1%) 3 mL, violeta cristal (sol. acuosa al 0,1%) 1 mL, agar 15 g, agua estéril 1 litro, pH 7,1. Calentar a ebullición hasta disolución completa, enfriar a 50ºC y volcar en cajas de Petri. AGAR KEA (para Enterococcus spp). Triptona 20 g, extracto de levadura 5 g, cloruro de sodio 5 g, esculina 1 g, citrato de sodio 1 g, citrato férrico amónico 0,5 g, azida de sodio 0,15 g, sulfato de kanamicina 0,02 g, agar 15 g, agua 1 litro, pH 7,0. Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos. Enfriar a 50ºC y volcar en cajas de Petri. AGAR NC (para P. aeruginosa ). Triptona 20 g, sulfato de potasio 10 g, cloruro de magnesio 1,4 g, cetrimida 0,2 g, ácido nalidíxico 15 mg, agar 15 g, agua 1 litro, pH 7,2. Calentar a ebullición hasta disolución completa, enfriar a 50ºC y volcar en cajas de Petri (11).
La técnica de análisis mediante la filtración por membrana permite el examen de grandes volúmenes de agua y tiene una precisión mayor que la del NMP. Es conveniente para aguas
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poco contaminadas y las fuertemente mineralizadas que pueden dar falsos resultados en medios líquidos. NMP DE COLIFORMES
Sembrar 10 mL de muestra en 5 tubos con 10 mL de medio doble concentración, 1 mL en c/u de 5 tubos con medio simple y 0,1 mL en c/u de otros 5 tubos con medio simple. Incubar a 35ºC durante 48 horas. CALDO MAC CONKEY. Peptona 5 g, extracto de carne 3 g, lactosa 5 g, púrpura de bromocresol (al 0,5%) 4 mL, agua 1 litro (simple) ó 500 mL (doble concentración), pH 7,2 (12). CONFIRMACIÓN. Confirmar al menos el 10% de los tubos positivos (2) en agar VRBL donde los coliformes dan colonias de color púrpura.
CUADRO 1. Número más probable por 100 mL de muestra (2). Tubos positivos NMP Tubos positivos /100mL 10 mL 1 mL 0,1 mL 10 mL 1 mL 0,1 mL 0 0 0 <2 4 3 0 0 0 0 2* 4 3 1 0 1 0 2 4 4 0 1 0 1 2 5 0 0 1 0 2 4* 5 0 1 1 1 0 4 5 1 0 1 2 1 6* 5 1 1 2 0 2 4 5 1 2 2 0 0 7* 5 2 0 2 1 1 7 5 2 1 2 1 0 9* 5 2 2 2 2 0 9 5 3 0 3 0 1 8 5 3 1 3 0 2 11 5 3 2 3 1 3 11 5 4 0 3 1 0 14* 5 4 1 3 2 1 14 5 4 2 3 2 2 17* 5 4 3 3 3 3 17* 5 4 4 4 0 0 13 5 5 0 4 0 1 17 5 5 1 4 1 0 17 5 5 2 4 1 1 21 5 5 3 4 2 0 22 5 5 4 4 2 1 26* 5 5 5 * resultados obtenidos en el 4% de las pruebas, los otros en el 95%
Carrillo L
NMP /100mL 27 33* 34* 23 31 33 46 63* 49 70 94* 79 110 140 130 170 220 280* 350* 240 350 540 920 1600 >1600
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Se debe poner especial cuidado al montar la unidad de filtración. Las membranas, comúnmente con poros de 0,45 µm, se colocan humedecidas en agua estéril para evitar roturas y el vacío de succión no debe ser mayor que 40 cm de Hg. El soporte de la membrana puede ser de acero inoxidable, vidrio o plástico esterilizable en autoclave, y está conectado al sistema de vacío a través de un kitasato. El equipo debe estar estéril en el momento de la filtración. Los medios de cultivo para membranas suelen ser algo más concentrados que los normales y se vuelcan sobre los discos absorbentes, de unos 48 mm de diámetro, que retienen 1,8-2,2 mL de líquido (12). RECUENTO DE BACTERIAS POR FILTRACION CON MEMBRANA
Filtrar 100 mL de muestra por la membrana estéril de 45 mm de diámetro. En condiciones de asepsia, colocar la membrana sobre un disco absorbente estéril embebido en el medio TST (o en su defecto sobre agar para recuento) evitando dejar englobadas burbujas de aire. Incubar a 35ºC durante 72 horas, porque algunas bacterias presentes en el agua suelen tener una prolongada fase de adaptación al medio de cultivo. Las colonias tendrán varios grados de verde. TSF. Triptona 15 g, peptona de soja 5 g, cloruro de sodio 5 g, verde intenso (CI nº42053) 0,25 g, agua 1 litro, pH 7,3. Esterilizar a 120ºC durante 15 mInutos (13). BEBIDAS SIN ALCOHOL
La mayoría están gasificadas con 1,5 a 5 volúmenes de dióxido de carbono y el rango de pH oscila de 2,5 a 4,0. El acidulante más usado es ácido cítrico, pero las colas (pH 2,52,8) comúnmente contienen ácido fosfórico. La mayoría de las bacterias, incluyendo las especies patógenas, mueren rápidamente en el ambiente ácido de estas bebidas, aunque algunos organismos lácticos suelen crecer cuando hay suficientes nutrientes. Los endosporos bacterianos pueden sobrevivir, pero no son capaces de germinar en la mayoría de los casos. Aunque los mohos son acidúricos, crecen solamente si hay oxígeno disuelto, y ésta puede ser la situación en algunas bebidas carbonatadas (2). Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 16
161 DETERIORO
Las levaduras constituyen el grupo más importante en el deterioro de la bebidas sin alcohol, pues toleran la acidez y pueden multiplicarse bajo condiciones anaeróbicas, llegando a producir suficiente dióxido de carbono para reventar la botella o lata. La estabilidad de las bebidas a base de jugo, o concentrado, de frutas también depende del tipo de fruta usado en su formulación. Las bebidas con jugos de frutas son, además, susceptibles al deterioro por bacterias lácticas, principalmente especies de Lactobacillus y Leuconostoc, las que en general son resistentes a los ácidos benzoico y sórbico. Los jugos de fruta, debido a sus propiedades intrínsecas, en particular el pH ácido y los bajos contenidos de nitrógeno y oxígeno, imponen un ambiente adverso para muchos microorganismos, pero son excelentes sustratos para las levaduras y en menor medida para los hongos y las bacterias lácticas (14). La mayoría de las especies de levaduras pueden fermentar los azúcares a etanol pero solamente unas pocas crecen en completa ausencia de oxígeno. A pH 3,0 Saccharomyces cerevisiae y Zygosaccharomyces bailii muestran fermentación alcohólica aeróbica, pero en condiciones anaeróbicas Z. bailii crece muy lento (15). Otras especies de levaduras, como Pichia anomala, también son capaces de tolerar altas concentraciones de conservantes, así como una carbonatación alta, y suelen a desarrollar en bebidas a base de frutas (16). Las soluciones concentradas de saborizantes, endulzantes y otros ingredientes de las bebidas sin alcohol no suelen ser la fuente de levaduras y bacterias lácticas que causan alteración, pues son procesadas para que sean comercialmente estériles (2). Las especies predominantes en jugos de naranjas contaminados después de la pasterización son Candida intermedia y Candida parapsilosis. En los jugos no pasterizados la mayoría corresponde a especies de Hanseniaspora, aunque suelen observarse otras levaduras como Geotrichum citri-aurantii y Pichia fermentans (17). Paecylomyces fulvus y Penicillium glabrum han sido aislados de agua mineralizada (18) y bebidas carbonatadas (19). Carrillo L
162 CONTROL
La conservación depende del control de la contaminación y la aplicación de varios factores sinérgicos que previenen el crecimiento microbiano. Las fuentes específicas de contaminación incluyen las materias primas, los contenedores y el equipamiento de procesamiento o transporte, así como los operarios, particularmente cuando no son seguidas las buenas prácticas de manufactura. La limpieza cuidadosa durante las horas de cierre evita la contaminación excesiva. Todas las áreas corrientes debajo de las de operaciones de mezclado son especialmente vulnerables a la acumulación microbiana. El método tradicional es usar cloro para desinfectar después de la limpieza, pero resulta más efectiva la circulación de agua caliente (alrededor de 85ºC) a través de las líneas durante al menos 20 minutos. Este procedimiento debe ser hecho dentro de las 24 horas previas al inicio de las operaciones. El pH bajo y los altos niveles de carbonatación de las colas las hace resistentes al crecimiento de microorganismos del deterioro. Las otras bebidas carbonatadas con frecuencia contienen ácido benzoico, ácido sórbico o una combinación de ambos, para evitar las levaduras (2). Debido al pH bajo, una pasteurización a 66ºC durante 10 segundos, suele ser suficiente para inactivar muchos microorganismos en el jugo de naranja. El enfriamiento es el procedimiento comúnmente usado para extender la durabilidad de algunos jugos de frutas pero también pueden ser congelados, concentrados y/o irradiados para prevenir el deterioro. La conservación del jugo de naranjas concentrado puede ser realizado con la adición de dióxido de sulfuro (230 mg/L) o con ácido sórbico (800 mg/L) (8). ANALISIS MICROBIOLOGICO
El muestreo debe ser diseñado para identificar los lugares específicos de contaminación en una planta embotelladora. Cuando se analiza el llenador, el tamaño de la muestra debería ser una vuelta completa a causa de que, con frecuencia, sólo una de las válvulas contribuye a la contaminación.
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El agua de enjuague (con o sin cloro) que pasó a través de las válvulas del llenador, o la bebida terminada, puede ser recogida por el procedimiento normal de llenado usando envases corrientes. Cuando el producto es muestreado en el depósito o comercio, es necesario un tamaño de muestra igual a 3 veces el número de válvulas del llenador, para garantizar que la vuelta completa del llenador sea analizada. Debido a que los equipos de alta velocidad suelen llenar un gran número de envases por minuto, es importante recoger un tamaño de muestra estadísticamente válido para detectar las válvulas contaminadas. Las muestras también pueden ser recogidas a lo largo de la línea, desde el cuarto de jarabe al llenador. Para esto deben ser insertadas llaves de muestreo en el sistema, en ubicaciones claves para tomar las muestras adecuadas. Se debe evitar la contaminación durante el muestreo, así como también la muerte de los posibles contaminantes, por ejemplo debido al flameado. Los hisopos deben ser pasados por las ubicaciones clave con el fin de detectar la concentración de los organismos del deterioro. Las llaves de muestreo suelen estar ubicadas a los lados de los proporcionadores de agua y jarabe, la bomba de mezclado, las mirillas de vidrio de los distintos tanques, y las líneas de jarabe, agua y azúcar. Las muestras son recogidas con hisopo de las mirillas de vidrio, las juntas, las llaves, los colectores de jarabe, las mangueras y acoples, el coloreador del jarabe, y las bombas portátiles. Entre el muestreo y el análisis no debe pasar más de 24 horas en el caso de las agua. Se registra el tiempo y la temperatura durante la espera. No puede hacerse sobre muestras viejas de bebidas pues a veces los microbios crecen durante la espera. El CAA establece en el art 996 que las bebidas sin alcohol en base a jugos de frutas u hortalizas, infusiones o macerados de sustancias vegetales, deben ser preparadas con agua que cumple el art 982 ó 985. Pueden ser adicionados de ácido sórbico (0,3-0,8 g/L, según contengan o no gas carbónico) o
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ácido benzoico (0,5 g/L) o bien el equivalente en las sales de estos ácidos. Los jugos vegetales, así como las bebidas no gasificadas con 20% de jugo o con extractos, infusiones, maceraciones o percolaciones de ciertos vegetales, pueden contener hasta 1 g/kg de dichos ácidos o su equivalente en las respectivas sales (art 1006, 1007 y 1040) (9). RECUENTOS DE COLIFORMES POR FILTRACION Coliformes
Filtrar 100 mL de muestra por la membrana y transferir el filtro al medio de cultivo. Incubar a 35ºC durante 48 horas. M-ENDO. Triptosa 10 g, tiopeptona 5 g, tripticasa 5 g, extracto de levadura 1,5 g, lactosa 12,5 g, cloruro de sodio 5 g, fosfato dipotásico 4,375 g, fosfato monopotásico 1,375 g, laurilsulfato de sodio 0,05 g, desoxicolato de sodio 0,1 g, sulfito de sodio 2,1 g, fucsina básica 1,05 g, agua 1 litro, pH 7,2. Hidratar en 1 litro de agua que tiene 20 mL de etanol 95%. Calentar a ebullición, enfriar rápido y distribuir en envases estériles. Se coloca 1,8-2,2 mL en cada disco absorbente. Coliformes fecales
Colocar la membrana sobre el medio TSM e incubar 4-5 hs a 35ºC a 35ºC, transferir al medio TB e incubar 24 horas a 44,5ºC en un recipiente cerrado. Mezclar volúmenes iguales de las soluciones a y b del reactivo de indol. Con 1 mL mojar un papel de filtro en una caja. Depositar la membrana sobre el papel sin dejar atrapado aire y dejar 10-15 minutos. Regresar la membrana al medio TB. Contar las colonias rosadas o sea que las dan una prueba de indol positiva. TSM. Triptona 15 g, peptona de soja 5 g, cloruro de sodio 5 g, sulfato de magnesio 1,5 g, agua 1 litro, pH final 7,3. Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos. Colocar la membrana e incubar 4-5 horas a 35ºC y luego transferir a m-FC e incubar 24 hs a 44,5 ± 0,5ºC en recipiente cerrado. TB. Triptona 20 g, sales biliares nº 3 1,5 g, agua 1 litro, pH 7,2. Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos. REACTIVO DE INDOL PARA MEMBRANAS. a. 4-dimetilaminobenzaldehído 2,5 g, etanol (95%) 90 mL, ácido clorhídrico concentrado 10 mL. b. Persulfato de potasio 1 g, agua destilada 100 mL. Ambas se mantienen a 4ºC durante unas pocas semanas (13).
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Los jugos cítricos y los triturados o cremogenados de frutas u hortalizas, pueden contener un máximo de 100 ufc de mohos y/o levaduras /g (art. 1050 y 1061). Los jugos de tomate (pH < 4,5) y de ananá (pH < 4,1) no deben contener más de 20 campos positivos en el recuento microscópico de mohos según Howard-Stepheson (art 1061 y 1064) (9). RECUENTOS DE MOHOS Y LEVADURAS POR FILTRACION
Filtrar 100 mL de muestra por la membrana y transferir el filtro al medio YM-11. Incubar a 25ºC durante 3-5 días. Contar las colonias con tonos de azul. YM-11. Peptona de soja 20 g, triptona 20 g, glucosa 5 g, cloruro de sodio 5 g, fosfato dipotásico 2,4 g, azul tripan 0,03 g, cloranfenicol 0,1 g, agua 1 litro, pH 7. Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos (13). ANALISIS DE ENVASES
Volcar 100 mL de diluyente estéril y mover el envase para que tome contacto con toda la superficie interna. Colocar 1 mL en una caja de Petri, volcar 15 mL de agar para recuento fundido y a 50ºC, mezclar por rotación sobre la mesada. Repetir la operación usando agar McConkey. Incubar a 35ºC durante 24-48 horas. Multiplicar por 100 los números de colonias para obtener las ufc de bacterias heterótrofas y de coliformes /envase (2). ANALISIS DE TAPAS Humedecer un hisopo con diluyente estéril y pasar dos veces por la superficie interna del cierre. Insertar el hisopo en un tubo con 10 mL de diluyente. Mezclar bien. Colocar 1 mL en una caja de Petri, volcar 15 mL de agar para recuento fundido y a 50ºC, mezclar por rotación sobre la mesada. Repetir la operación usando agar McConkey. Incubar a 35ºC durante 24-48 horas. Multiplicar por 10 los números de colonias, para obtener las ufc de bacterias heterótrofas y de coliformes /tapa
Los envases plásticos retornables a la salida del proceso de higienización, según el art 196 bis del CAA, no deben contener coliformes y el recuento de bacterias mesófilas aerobias tiene un límite de 1 ufc por mL del volumen interno del envase (9).
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Los niveles de levaduras totales en el agua de enjuague de la válvula llenadora no deben superar las 15 ufc/100 mL, salvo las colas donde se suele admitir no más de 100 ufc/100 mL. Cuando se trata de más de cien vávulas, se aplica el siguiente programa: n=30 c=3 m=15 ufc/100 mL y M= 50 ufc/100 mL (2). REFERENCIAS 1. Reasoner DJ et al. 1989. Appl Environ Microbiol 55: 912. 2. Downes FP, Ito K, eds. 2001. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4º ed, APHA, Washington, p 53, 569 y 573. 3. Morais PV et al. Appl Environ Microbiol 63: 851. 4. Loy A et al. 2005. Appl Environ Microbiol 71: 3624. 5. Moore JE et al. 2002. Appl Environ Microbiol 68: 4130. 6. States SJ et al. 1987. Appl Environ Microbiol 53: 979. 7. Kuhn I et al. 1997. Appl Environ Microbiol 63: 2708. 8. Le Chevalier MW et al. 1991. Appl Environ Microbiol 57: 2617. 9. Código Alimentario Argentino. Cap 4 y 12. http//:www.anmat.gov. ar/codigoa /caa1.htm 10. Payment P, Franco E. 1993. Appl Environ Microbiol 59: 2418. 11. Mossel DAA et al. 2003. Microbiología de los Alimentos. 2ª ed, Acribia, Zaragoza, p 650. 12. Guinea J et al. 1979. Análisis Microbiológico de Aguas. Omega, Barcelona, p 21. 13. Andrews WH, ed. 1996. Microbiological Methods. Subcap 17.2 en: Official Methods of Analysis. AOAC, Washington. 14. ICMSF. 1998. Microorganisms in Foods. Vol 6. Blackie Academica & Professional, London, p 440. 15. Rodrigues F et al. 2001. Appl Environ Microbiol 67: 2123. 16. Déak T, Beuchat LR. 1996. Handbook of Food Spoilage Yeasts. CRC Press, Boca Ratón, p 65. 17. Arias CR et al. 2002. Appl Environ Microbiol 68: 1955. 18. Ancasi EG et al. 2006. Rev Arg Microbiol 38: 93. 19. Pitt JI, Hocking AD. 1997. Fungi and Food Spoilage. Blakie Academic & Professional, London, p 205, 242.
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HONGOS COMESTIBLES Las setas que se comercializan frescas o conservadas en nuestra zona son las especies cultivadas conocidas como champiñones ( Agaricus bisporus o A. bitorquis) y gírgola ( Pleurotus ostreatus). Esta última, junto con especies silvestres del género Suillus se expenden secas. En el capítulo XVI del Código Alimentario Argentino se consideran los géneros Agaricus, Boletus, Lactarius, Psalliota y Tuber. Las setas y trufas conservadas deben ser acidificadas con ácidos orgánicos y sometidas a esterilización comercial (art 1250). La fase líquida de las encurtidas, saladas o fermentadas y con vinagre, debe tener un pH < 3,5 (art 1251) (1). Las especies silvestres con valor gastronómico del Mercosur son: Agaricus campestris, Boletus loyo, Lactarius deliciosus, Lepista nuda, Morchella intermedia, Morchella elata, Phlebopus bruchii, Ramaria flava var. subtilis, Suillus granulatus y Suillus luteus. Las especies cultivadas son Agaricus bisporus, Agaricus bitorquis, Lentinula edodes y Pleurotus ostreatus. A. campestris y L. nuda crecen sobre suelos ricos en residuos orgánicos. Morchella está asociada con Austrocedrus chilensis y Lomatia hirsuta. P. bruchii es simbionte de Fagara coco, mientras que Lactarius y Suillus lo son de varias especies de Pinus. Ramaria y B. loyo micorrizan con especies de Nothofagus (2). Cabe señalar que las especies silvestres deben ser recolectadas por especialistas, debido a que entre los géneros señalados se encuentran especies tóxicas o se parecen a otros hongos tóxicos. DESCRIPCIONES (3-5)
Agaricus bisporus (J.Lange) Imbach = champiñón El sombrero de forma globosa que evoluciona con el tiempo a convexo o extendido. Sus dimensiones varían entre los 3 y los 13 cm de diámetro. Tiene una cutícula de color blanco, pulverulenta al tacto, en la que aparecen manchas crema con la edad y escamas casi inapreciables. El margen está incurvado y evoluciona a plano o elevado con el desarrollo. El
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contexto es blanco, firme, consistente y cuando se corta adopta un suave color rosáceo. Tiene sabor dulce y olor aromático. Las láminas están apretadas, son libres, de color blanco rosáceo que cambia a marrón violáceo oscuro e incluso a ser negro. Las aristas son ligeramente más claras. El pie es cilíndrico, espeso, de longitud proporcionada con el sombrero y color blanco, posee un anillo persistente que se situa en la parte media o algo más abajo. La esporada es de color marrón púrpura. Las esporas son elipsoidales a ovoides, lisas, de 5-7,7 x 4-6 µm. Tiene basidios bispóricos y cistidios marginales evidentes y abundantes.
Agaricus bitorquis (Quél.) Sacc. = champiñón El sombrero convexo y después extendido, miden de 4 a 18 cm de diámetro. La cutícula es blanco a blanco sucio, seca, lisa u ocasionalmente escamosa. El margen está incurvado y se extiende más allá de las láminas. El contexto es blanco, grueso, firme, que no se tiñe por el roce. Tiene sabor y olor suave. Las láminas están apretadas, tienen color pálido luego rosa grisáceo, pardo rojizo y finalmente pardo negruzco. El pie mide 2-10 x 1-3 cm, es firme, sólido, cilíndrico, tiene color blanco. Posee dos anillos persistentes, el de arriba es prominente y el de abajo parece una vaina. La esporada es color chocolate. Las esporas son elipticas, lisas, miden 5-7 x 4-5,5 µm. Tiene basidios tetraspóricos.
Agaricus campestris (L.) Fr. = champiñón silvestre El sombrero evoluciona desde la forma globosa de su juventud a la convexo extendida en su madurez. Su tamaño varía entre 3 y 10 cm de diámetro. Tiene una cutícula gruesa, separable, de color blanco, en la que aparecen escamas más o menos apreciables, de un color gris cremoso. El margen es estrecho, fino que se vuelve incurvado. El contexto es consistente, blanco que al corte toma un suave color rosado, tiene sabor y olor muy agradables. Las láminas son libres, apretadas de color blanco rosáceo que evoluciona a marrón oscuro y más tarde a negro. El pie es cilíndrico, espeso, tenaz, ligeramente más delgado en la base, de color blanco, mide 1 a 2 cm de diámetro y hasta 7 cm de
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largo, tiene un anillo simple, fugaz pero siempre dejando restos y membranoso, que se situa en la parte superior del pie. La esporada tiene color marrón oscuro. Las esporas son ovoides, lisas, de 7-8 x 4-4,5 µm. Los basidios son tetraspóricos.
Boletus loyo Phil. ex Speg. = Boletus loyus Espinosa = boleto El sombrero tiene 10 a 20 cm de diámetro, al comienzo hemisférico, luego convexo a plano convexo. La cutícula es seca, poco viscosa cuando húmeda, vellosa, de color rojo vinoso a púrpura, con tonos amarillo cuando se rompe en polígonos irregulares en los ejemplares maduros. El margen es entero con un pseudovelo membranoso. Al corte, el contexto se muestra espeso, consistente, de color amarillo crema, pero púrpura bajo la cutícula y la base del pie. Tiene olor y sabor a nueces frescas. Los tubos tienen 8 a 15 mm de largo, tiene color amarillo intenso y en la madurez oliva a pardo oliva. Los poros tienen 1 mm de diámetro y son redondos, de mismo color que los tubos. El pie mide 4-7 x 8-15 cm, es robusto, claviforme a ventrudo, superficie seca, levemente vellosa o pulverulenta, sin reticulaciones, de color amarillo hacia el ápice cuando joven, tornándose de color rojo vinoso a púrpura en la madurez. La esporada es color pardo oliva. Las esporas miden 10-13 x 4,5-5 µm, son fusiformes, lisas, de paredes delgadas. Los basidios miden 7-11 x 30-45 µm, son claviformes, tetrasporados e hialinos. Los cistidios miden 5-11 x 40-55 µm, son fusiformes con un contenido pardo amarillento o hialinos.
Lactarius deliciosus L.:Fr. = níscalo o robellón El sombrero en su nacimiento es convexo, luego extendido y finalmente deprimido con forma de embudo, es quebradizo, carnoso, y mide hasta 25 cm de diámetro. El margen es liso y enrrollado hasta su vejez. La cutícula no es separable y tiene un típico color anaranjado, con circulos concentricos más claros u oscuros, pero en la madurez aparecen manchas verdes. Tiene la cutícula ligeramente aterciopelada y en tiempo húmedo algo viscosa. Todo el hongo tiene un latex anaranjado. El contexto es consistente, macizó, granuloso, de sabor dulce ligeramente
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acido y olor agradable, tiene color blanco al corte, pero vira de inmediato al anaranjado y posteriormente al verde. Las láminas llegan hasta el pie y baja por él, son apretadas, con borde entero, y de color naranja que vira a verde en las zonas que se raspan. El pie mide 3,5 x 8 cm, es corto con respecto al sombrero, cilíndrico, quebradizo como el yeso, de color anaranjado, con circulos más oscuros. La esporada es color crema. Las esporas son ovoides, con verrugas, hialinas, y miden 8-9 x 6-7 µm. Los basidios son tetraspóricos.
Lentinus edodes (Berk.). Sing. = Lentinula edodes (Berk.) Earle = shiitake El sombrero mide 5 a 25 cm, es amplio, hemisférico, convexo y plano en la madurez, de color pardo a pardo oscuro. El margen del píleo es liso a irregular, está enrollado al principio, luego incurvado, aplanándose con la madurez y a menudo ondulado. Las láminas son de color blanco, lisas al principio y luego de bordes irregulares. El pie es fibroso, central o excéntrico, flexible y resistente. Las esporas miden 5-6,5 x 3-3,5 µm y son de color blanco, ovoides a oblongas elipsoideas. El basidio es tetraesporado. El contexto carece de hifas esqueléticas y posee sólo hifas generativas (6).
Lepista nuda (Bull.:Fr.) Cooke = Rhodopaxillus nudus (Bull.:Fr.) Maire El sombreros es grueso, carnoso, convexo a plano, umbonado en la madurez, y mide de 5 a 15 cm de diámetro. La cutícula lisa y húmeda al tacto, es separable del contexto, tiene color violeta amatista a gris violáceo o pardo violáceo, con el ápice generalmente de pardo oscuro. El margen es incurvado, sin estrias y delgado. El contexto es blanco violáceo, más oscuro en contacto con la cutícula, con sabor dulzaíno u aroma frutado, agradable, y ácido. Las láminas están apretadas, adheridas al pie, tienen color violáceo o amatista. El pie mide 1-2 x 5-10 cm, es cilíndrico, con base claviforme a bulbosa, carnoso, fibroso, violáceo, con la base de color más intenso por el micelio, y no presenta anillo o cortina.
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Las esporas son elipsoidales, verrucosas, hialinas, y miden 3,5-5 x 6-8 µm. Los basidios son tetraspóricos y no presenta cistidios.
Morchella intermedia Boudier El cuerpo fructífero mide 4 a 11 cm de altura. El sombrero es cónico u oval, alveolado con estrias, de color gris tornándose pardo con el tiempo. El contexto es firme. El pie es cilíndrico, bulboso en la base, liso o algodonoso, blanco a crema, separado del sombrero por profundas hendiduras. La esporada es blanco-crema. Las ascosporas miden 13-18 x 21-26 µm, son elípticas, hialinas, lisas, con una o dos gótulas.
Morchella elata Fr. El cuerpo fructífero mide 4 a 11 cm de altura. El sombrero es cónico, alveolado, mide 2,5-7 cm de alto y 1,5-3,0 cm de ancho. Los alveolos fusiformes miden 6-30 x 2-6 mm, separados por costillas longitudinales, de color castaño oscuro, casi negro, pulverulentas. El pie es más corto que el sombrero, mide 17-50 x 6-10 mm, ensanchándose hacia la base hasta alcanzar unos 25 mm, donde tiene surcos longitudinales, es hueco y tiene color ocre claro en seco, furfuráceo a escamoso. Los ascos son cilíndricos, no amiloides, de 280-315 x 17-23 µm. Las paráfisis son robustas, ligeramente ensanchadas en el ápice, de 9,6-14,4 µm de diámetro. Las esporas son lisas, elipsoidales, con gútulas de 19-30 x 13-18 µm.
Phlebopus bruchii (Speg.) Heinem. & Rammeloo = Boletus bruchii Speg. = hongo del coco El sombrero mide 4 a 7,5 cm de diámetro, es convexo a levemente hendido en su centro, color castaño oscuro a negruzco en la madurez, afelpados, con el margen algo recurvado a recto, Los tubos son amarillos con tintes oliva, miden hasta 4 mm de largo, con poros de 4 x 5 mm. El contexto es blancuzco, algo más amarillento por debajo de la cutícula, algunas veces oscuro hacia la base del pie, tornándose azul o vináceo. El sabor es agradable. El pie mide 3-4 x 6-7,5 mm, es sólido, levemente atenuado hacia la base donde presenta un color castaño grisáceo oscuro.
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Las esporas miden 5-6 µm, son subglobosas, lisas con el ápice obtuso, lisas, de color amarillo a castaño grisáceo cuando maduras. Los basidios miden 10-12 x 28-32 µm, claviformes, con 4 esporas. No presenta cistidios.
Pleurotus ostreatus (Jacq.:Fries) Kumm = gírgola El sombrero mide entre 5 y 15 cm, es liso, convexo a plano convexo, con forma de ostra, y margen delgado y enrrollado, tiene color variable, desde gris claro hasta pardo. El contexto es de color blanco, flexible y resistente en los ejemplares viejos, tiene olor y sabor agradables. Las láminas son de color blanco a crema, desiguales y están apretadas, bajando por el corto pie. La esporada tiene color blanca a crema. Las esporas son cilíndricas hialinas, lisas, y miden 3-4 x 8-11 µm. Los basidios son tetraspóricos, claviformes y largos y no se observan cistidios. Este hongo es un alimento de alta calidad que posee propiedades medicinales. Tiene sustancias con actividad antiinflamatoria, antiviral, antimicrobiana, antitumoral y anticolesterolhémica (7). Puede ser utilizada en la industria alimenticia pues produce polisacáridos extracelulares con propiedades espesantes, acomplejantes, encapsulantes, floculantes, gelificantes y emulsificantes (8).
Ramaria flava var. subtilis (Coker) Corner = Clavaria flava Fr. var. subtilis Coker El cuerpo fructífero mide 8-18 cm de altura, es blancocrema, algunas veces amarillo hasta ocre. Las terminaciones de las ramas pasan de amarillento hasta color durazno. El contexto, al secarse, se torna ligeramente rojizo o vinoso. Las esporas miden 10-14 x 4,5-6,5 µm, rugosas a verrugosas. Los basidios miden 55-75 x 8,5-10 µm, con cuatro esterigmas. Las hifas tienen menos que 14 µm de diámetro, sin fíbulas.
Suillus granulatus (L.:Fr.) O. Kuntze El sombrero es hemisférico y luego convexo-extendido, mide 5-12 cm de diámetro. La cutícula es muy viscosa y fácilmente separable del contexto, tiene color amarillo-crema, ocre a pardo amarillento. El margen es delgado, incurvado a Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 17
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plano en la madurez. Los tubos cortos, de color blanquecino, que se vuelven amarillo claro. Los poros son poligonales, exudando cuando el tiempo es húmedo unas gotitas lechosas y pegajosas. Al corte el contexto es blanquecino hasta amarillo pálido. Tiene sabor dulzón y olor agradable. El pie mide 4-10 x 1-2,5 cm, es cilíndrico, compacto, duro, amarillo-pálido, sin anillo, con granulaciones poco marcadas y sutiles en la zona apical, amarillento a pardo rojizo. La esporada es amarillo ocre. Las esporas son fusiformes a elipsoidales, lisas, no amiloides, de color amarillo, mide 8-10 x 2,5-3,5 µm. Los basidios son claviformes, tetraspóricos y miden 16-30 x 6,5-7,5 µm. Los cistidios son claviformes a fusiformes, muy abundantes, y excretan las gotitas lechosas. Sin fíbulas.
Suillus luteus (L.:Fr.) S.F.Gray = hongo de Chile El sombrero es hemisférico, mide 4-12 cm de diámetro. La cutícula es muy viscosa, separable con facilidad de la carne, color pardo amarillento a pardo rojizo, cubierta por un mucus de tonalidades violáceas con fibras radiales. El margen es incurvado a plano en la madurez. Los tubos tienen color amarillo pálido, amarillo limón o amarillo oro, separable con facilidad del contexto. Los poros son pequeños y angulosos. El contexto almacena gran cantidad de agua, tiene color blanquecino y es amarillo pálido bajo la cutícula y los tubos, sin coloraciones azuladas. El olor y el sabor es poco remarcable. El pie es cilíndrico, curvado en la base, mide 3,510,5 x 1-2,5 cm, tiene color blanco o amarillo pálido, con gránulos finos, dispersos, resinoides, pardo rojizo en la parte superior. El anillo es membranoso, está en posición apical y en tiempo seco queda unido al margen del sombrero. La esporada es ocre amarillento. Las esporas miden 7-11 x 3-3,5 µm, son fusiformes a elipsoidades, amarillas, lisas y no amiloides. Los basidios miden 20-25 x 5,5-7 µm, son claviformes, tetraspóricos. Los cistidios son claviformes. La cutícula no tiene fíbulas. REFERENCIAS 1. Código Alimentario Argentino. Cap 16. http//:www.anmat.gov.ar/ codigoa /caa1.htm
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3. 4. 5. 6. 7. 8.
Deschamps JR. 2002. Hongos silvestres comestibles del Mercosur con valor gastronómico. Documento de Trabajo N° 86, Universidad de Belgrano. http://www.ub.edu.ar/investigaciones/dt_nuevos /86_deschamps.pdf Miles PG, Chang ST. 1999. Biología de las setas. World Scientific. Bogotá. Mendaza R, Díaz G. 1981. Las setas. Vizcaina, Bilbao. Gamundí . 1993. Stamets P, Chilton JS. 1987. The mushroom cultivator. Agarikon Press Olimpia, Washington. Ooi VEC, Lui F. 2000. Current Medicinal Chemistry, 7: 715. Wasser SP, Weis A.L. 1999. Int. J. of Med. Mushrooms. 1 :31.
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OTROS PRODUCTOS AZÚCAR
Durante el proceso de fabricación, los jugos de la caña de azúcar se van concentrando paulatinamente hasta que se separa el azúcar en estado cristalino de las melazas residuales. Cuanto más puro sea el producto, más pobre será como medio de cultivo. La sacarosa puede alterarse por inversión, fermentación ácida u oxidación por bacterias, levaduras y mohos. Entre los microorganismos presentes en la caña de azúcar se encuentran Leuconostoc, Enterobacteriaceae , Lactobacillus, Flavobacterium, Xanthomonas, Pseudomonas, Micrococcus, Bacillus y Corynebacterium. Uno de las bacterias más molestas en la refinería de azúcar es Leuconostoc mesenteroides que hidroliza la sacarosa y sintetiza dextrano, pues esta sustancia viscosa puede llegar a taponar cañerías (1). Las levaduras hallados en el azúcar crudo son osmófilas. La más importante es Zygosaccharomyces rouxii, pero suelen hallarse también Pichia, Torulopsis, Candida y otras (2). El refinado del azucar destruye los microorganismos patógenos, si estuvieran presentes. Sobreviven los endosporos de bacilos aerobios o anaerobios, tales como Bacillus coagulans, B. stearothermophilus, Clostridium thermosaccharolyticum y C. nigrificans. BACTERIAS ESPORULADAS TERMOFILAS ANAEROBIAS
Disolver 20 g de muestra de azúcar en 100 mL de agua estéril. Llevar a ebullición por 5 minutos y distribuir, sin agitar, 20 mL entre seis tubos de medio PE-2, previamente calentados para eliminar el aire. Cubrir con 3 mL de agar-agua fundido y 50ºC. Incubar a 55ºC durante 72 horas. Observar la producción de gas y las arvejas que suben al tope, indicando crecimiento. Las bacterias del agriado chato cambian el color púrpura a amarillo. Extracto de levadura 3 g, peptona 20 g, púrpura de bromocresol (al 2% en etanol) 2 mL, agua 1 litro. Colocar 20 mL de cada tubo con tapa a rosca, agregar 10 semillas de arveja y esterilizar a 120ºC durante 15 minutos (3). MEDIO
PE-2.
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Durante el almacenamiento a granel y el envasado son incorporados bacterias, mohos y levaduras, pero no pueden crecer. Sin embargo, suelen ocasionar alteraciones en otros productos donde el azúcar es un ingrediente. En general, el recuento de bacterias es menor que 10 2 ufc/g y el de levaduras menor que 1 ufc/g. No se han asociados casos de intoxicaciones o infecciones transmitidas por la carga microbiana del azúcar (1). La industria de las bebidas especifica para azúcar seca granulada: menos que 200 ufc bacterias mesófilas, 10 ufc levaduras, y 10 ufc mohos en 10 g. Los límites establecidos por la industria azucarera para cinco muestras examinadas después del calentamiento son: endosporos de bacterias termófilas totales no más que 125 ufc en 10 g, endosporos del agriado chato no más de 50 ufc en 1 g, endosporos de bacterias anaerobias termófilas pueden estar presentes en 3 de las 5 muestras, pero en ninguna en más de 4 de los 6 tubos inoculados por el método corriente (3). JARABES
Son soluciones acuosas azucaradas concentradas, con una actividad de agua entre 0,65-0,70, tales como: a) jarabes concentrados de sacarosa (66,5-68% p/v), b) jarabes de sacarosa parcial o totalmente hidrolizados para producir una mezcla de glucosa y fructosa, c) jarabes de glucosa obtenidos por hidrólisis química o enzimática de almidones, d) jarabes de fructosa producidos por isomerización enzimática de la glucosa (1). Los microorganismos que pueden deteriorar los jarabes son aquellos que toleran altas presiones osmóticas como las levaduras osmófilas Zygosaccharomyces rouxii, Z. bailii , Torulaspora delbrueckii, Candida lusitanae y Schizosaccharomyces sp. que crecen lentamente (2). Éstas llegan a los mismos por prácticas poco higiénicas y pueden multiplicarse por la formación de condensados, en las paredes y tapa de los tanques, que originan gradientes de concentración (1). La industria de las bebidas especifica para jarabes: menos que 100 ufc organismos mesófilos, 10 ufc levaduras y 10 ufc mohos en el equivalente a 10 g de azúcar seca (3). El Código Alimentario Argentino (CAA) establece en los art 1020 a 1038, que los jarabes para refrescos deben tener un densidad no menor de 1,30 a 15ºC (4). Audisio MC, Carrillo L
178 RECUENTO DE LEVADURAS OSMOFILAS -1
-2
Preparar las diluciones 10 y 10 en el diluyente hipertónico. Colocar alícuotas de 1 mL en sendas cajas de Petri estériles. Volcar 20 mL de agar glucosa 60% recién preparado y a 50ºC. Mezclar por rotación sobre la mesada. Colocar en una bolsa cerrada junto a un vaso de agua para mantener la humedad (no invertir las cajas). Incubar a 30ºC durante 1-2 semanas. Contar las pequeñas colonias y multiplicar por el factor de dilución correspondiente. Hacer un preparado en fresco para observar la morfología. Peptona 0,1 g, glucosa 30 g, agua estéril 100 mL. Llevar a ebullición y enfriar antes de usar. AGAR GLUCOSA 60%. Extracto de levadura 5 g, agar 15 g, agua 400 mL. Esterilizar a 120ºC durante 15 minutos. Agregar 600 g glucosa y agitar hasta disolver. Enfriar a 50ºC y usar (2). DILUYENTE HIPERTONICO.
MIEL
El tipo de miel depende del follaje y de las flores disponibles para las abejas. En un 70-80% son azúcares simples (fructuosa y glucosa), predigeridos por el aporte enzimático de la abeja y contiene minerales, aminoácidos, ácidos orgánicos, aminas, enzimas y vitaminas (5). Además posee sustancias antimicrobianas capaces de inhibir a las enterobacterias (6). La mezcla de néctar-enzimas se almacena en la celdas hexagonales de los panales hasta que el contenido de agua se haya reducido aproximadamente al 17%. Cuando se alcanza ese nivel, las celdas se sellan con una delgada capa de cera y puede permanecer inalterada indefinidamente. Las mieles suelen ser pasteurizadas con el objetivo de mantenerla líquida todo el año, dado que en estado natural cristaliza la glucosa a 14ºC, pero a más de 40ºC se inactivan la muchas de las sustancias importantes de la miel. Las principales fuentes de microorganismos de la miel, en la colmena, son las abejas y el néctar que recolectan de diferentes flores. Entre las levaduras osmófilas se destaca Z. rouxii. Estas pueden producir el deterioro de la miel por fermentación cuando la actividad agua es mayor que 0,65.
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En la miel que se encuentra en maduración (humedad > 18%) predominan especies de Gluconobacter y Lactobacillus, los que desaparecen espontáneamente al bajar la a w = 0,65 (3). También suele haber endosporos como los de Paenibacillus larvae subsp. larvae, causante de la loque americana en las abejas, y Clostridium botulinum. Se han asociado casos de botulismo en infantes con el consumo de miel. Las esporas de C. botulinum pueden germinar y producir toxinas en los intestinos de los niños pero nunca se ha detectado toxina preformada en la miel (7). A veces suele encontrarse esporas de Ascosphaera apis que causa la enfermedad de las abejas conocida como de la cría yesosa (2). El CAA establece en el art. 783 que la miel no tendrá indicios de fermentación y debe cumplir con los criterios siguientes: a) coliformes totales/g: n=5, c=0, m=0; b) Salmonella spp/ 25 g: n=10, c=0, m=0; c) Shigella spp/ 25 g: n=10, c=0, m=0; d) mohos y levaduras ufc/g: n=5, c=2, m=10, M=100 (4). POLEN
El CAA indica en el art. 785 que no debe contener gérmenes patógenos y admite un máximo 150.10 3 ufc de organismos aerobios no patógenos /g y 10 2 ufc de hongos /g (4). MERMELADAS, COMPOTAS, JALEAS
Tienen una actividad de agua entre 0,75 y 0,85, por lo tanto solamente son sensibles a la alteración por mohos y levaduras osmófilos. Suele permitirse la incorporación de ácido benzoico o sórbico, los que controlan a estos agentes de alteración a pH 4,5. La alteración se puede evitar mediante el llenado en caliente y el cierre aséptico. Como estos productos se alteran lentamente una vez abierto el envase, en el rótulo deben estar las instrucciones al consumidor para conservarlos refrigerados. Los productos con un contenido bajo de azúcar, preferidos por muchos consumidores, deben contener conservadores o ser almacenados a temperatura baja y, debido a su a w alta, tienen una vida útil limitada (5). CHOCOLATE
Los productos con cacao tiene una actividad de agua menor que 0,50 lo que impide el desarrollo de microorganismos, sin Audisio MC, Carrillo L
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embargo suelen transportar endosporos de Bacillus y esporas de mohos. La ICMSF estableció los siguientes límites microbiológicos para cacao: recuento de bacterias totales n=5, c=2, m=10 4 y M=106; mohos n=5,c=2, m=102 y M=104 (8). Los límites de referencia para el cacao que se usa como bebida y el que incorpora a los postres son, respectivamente, bacterias aerobias mesófilas 105 y 104 ufc/g, endosporos aerobios 10 5 y 104 ufc/g, enterobacterias no detectadas en 0,1 y 1 g, mohos y levaduras 102 ufc/g, y para el empleado en postres congelados también levaduras osmófilas 10 ufc/g (5). El art 787 bis del CAA expresa que los baños de repostería no deben contener Salmonella spp en 25 g, E. coli en 0,1 g, S. aureus en 0,1 g, clostridios sulfito-reductores en 0,1 g, y los siguientes valores máximos de ufc/g para recuento total en placa 2.10 5, coliformes 10, mohos y levaduras 100g, aflatoxinas 5 µg /kg (4). ALIMENTOS DESHIDRATADOS
La mayoría tienen una actividad de agua entre 0,20 y 0,40, siendo totalmente resistentes a la colonización microbiana. Sin embargo, esto no significa que estén exentos de microorganismos patógenos pues algunas bacterias sobreviven con escasa o ninguna reducción de las ufc durante tiempos prolongados. Por tal motivo ocasionalmente aparece Salmonella . Los riesgos debido a los microorganismos transportados por los alimentos secos son: a) que se multipliquen después que el alimento ha sido reconstituído, b) que sirvan de fuente de contaminación al entorno del alimento. Los problemas provienen de un procesamiento no adecuado. En el secado es importante el control higiénico constante del equipo y el ambiente de la fábrica, con énfasis especial en el suministro del aire, además del transporte y el envasado adecuado, y el cuidado personal de los operarios (3). Los límites de referencia correspondientes a los alimentos secos para consumidores debilitados son ausencia de Salmonella, Campylobacter y Shigella en 25 g, ausencia de E. coli y S. aureus en 10 g, B. cereus 102 ufc/g, Clostridium spp. 10 ufc/g, Enterobacteriaceae 1 ufc/g, esporas de mohos 10 2 ufc/g. En casos especiales se agrega recuento de colonias (a 30ºC) 10 4 ufc/g, Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 18
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endosporos de bacterias aerobias 10 4 ufc/g, Enterococcus spp. 102 ufc/g, C. perfringens 10 ufc/g (5). La ICMSF estableció los siguientes límites microbiológicos para sopas de origen animal, desecadas, que no se someterán a cocción: recuento de bacterias totales n=5, c=1, m=10 4 y M=106; coliformes o enterobacterias n=5, c=2, m=10 y M=10 3; C. perfringens n=5, c=1, m=102 y M= 104; Salmonella n=10, c=0 y m=0. Para sopas de origen vegetal: recuento de bacterias totales n=5, c=1, m=104 y M=106; C. perfringens n=5, c=1, m=102 y M= 104; S. aureus n=5, c=1, m=102 y M= 104; Salmonella n=10, c=0 y m=0 (8). El CAA en el art 440, indica que en los caldos deshidratados no debe estar presente Salmonella en 25 g, pero se admiten los siguientes valores máximos de ufc/g en recuentos de: bacterias mesófilas aerobias 105, coliformes 103, E. coli 10, S. aureus coagulasa positiva 100, endosporos de C. perfringens 10. En el art 442 especifica para las sopas dehidratadas que se cocinan, la ausencia de Salmonella en 25 g y admite los siguientes valores máximos de ufc/g en recuentos de: S. aureus coagulasa positiva 100, endosporos de C. perfringens 10, pero no establece límites para bacterias mesófilas aerobias, coliformes y E. coli. Cuando se trata de productos que no se cocinan, se establecen los siguientes valores máximos de ufc/g en recuentos de: bacterias mesófilas aerobias 105, coliformes 103 y E. coli 10 (4). Respecto a los alimentos para regímenes especiales o dietéticos, si se consumen después de añadir un líquido, el art. 1340 dice que no debe contener Salmonella en 25 g, E. coli en 1 g ni S. aureus coagulasa positiva en 0,1 g, pero se admiten los siguientes valores máximos por g en: recuento de bacterias aerobias (a 37ºC) 5.104 ufc, coliformes (a 37ºC) NMP 100, mohos y levaduras 103 ufc (a base de cereales) ó 10 2 (a base de lácteos). Si tales productos se cocinan se exige la ausencia de Salmonella en 25 g, E. coli en 1 g ni S. aureus coagulasa positiva en 0,1 g, y se admiten los siguientes valores máximos por g en: recuento de bacterias aerobias (a 37ºC) 2.10 5 ufc, coliformes (a 37ºC) NMP 500, mohos y levaduras 10 4 ufc (a base de cereales) ó 103 (a base de lácteos). Cuando estos alimentos se expenden listos para el consumo no deben contener Salmonella en 25 g, E. coli en 0,1 g ni S. aureus coagulasa positiva en 0,01 g, pero se admiten los Audisio MC, Carrillo L
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siguientes valores máximos por g en: recuento de bacterias aerobias (a 37ºC) 5.104 ufc, coliformes (a 37ºC) NMP 100, mohos y levaduras 103 ufc (a base de cereales) ó 10 2 (a base de lácteos) (4). ALIMENTOS CONGELADOS
No plantean problemas de alteración si se almacenan y distribuyen a −10ºC. Pero el tratamiento, antes y durante la congelación, requiere prácticas correctas de elaboración y distribución, así como una descongelación apropiada en los casos que así lo requieran. Los valores de referencia en los productos cocinados y congelados, en ufc/g, son: recuento de colonias (a 30ºC y 7ºC) 103, Enterobacteriaceae (a 30ºC) 1, S. aureus 10, Clostridium spp. (a 30ºC) 10, recuento microscópico de células microbianas 10 5, y ausencia de L. monocytogenes en 25 g (5). En algunos alimentos las cifras bajas de enterococos indican la eliminación real de los patógenos más resistentes, suponiendo que hubieran estado presentes (3). La ICMSF estableció los siguientes límites microbiológicos para platos precocinados y verduras en salsa que se expenden congelados: recuento de bacterias totales n=5, c=2, m=10 5 y M=106; coliformes n=5,c=2, m=102 y M=104; E. coli (NMP) n=5, c=2, m= <3 y M= 10 2 (8). HELADOS, POSTRES HELADOS
El contenido microbiano de estos productos refleja la calidad de los ingredientes usados en su elaboración: leche, crema, sólidos de leche no grasos, azúcar, chocolate, frutas y nueces, ovoproductos, emulsificantes y estabilizantes. Los recuentos totales luego de la pasterización de la mezcla son bajos, pero sobreviven los formadores de endosporos y algunas de las bacterias termodúricas. Los ingredientes incorporados después de la pasterización pueden ser una importante fuente de contaminantes, por ejemplo coliformes. Aunque no puedan multiplicarse, los organismos sobreviven en los helados si estaban en la mezcla antes del enfriamiento, por ejemplo Listeria monocytogenes y Salmonella (3). Los valores de referencia para helados, en ufc/g, son: Enterobacteriaceae 100, S. aureus 100, recuento de colonias (a Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 18
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30ºC) 104, y ausencia de desoxirribonucleasa termoestable en 1 mL (5). En el art 1076 del CAA se indica que las mezclas fluídas para congelar y obtener los distintos tipos de helados, deben ser sometidas a tratamiento térmico de 60-65ºC durante 30 minutos como mínimo, para la destrucción de gérmenes patógenos y/o toxinas termolábiles. De acuerdo al art. 1078, los helados de elaboración industrial no deben contener Salmonella en 50 g ni otros gérmenes patógenos o toxinas microbianas, pero se admite los siguientes valores máximos de ufc/g en recuentos de: bacterias totales (a 30ºC) 105, coliformes 100, coliformes fecales 1, S. aureus coagulasa positiva 100, mohos y levaduras 100. En cuanto a los de elaboración artesanal, no deben contener Salmonella en 50 g ni otros gérmenes patógenos o toxinas microbianas, pero se admite los siguientes valores máximos de ufc/g en: recuentos de bacterias totales (a 30ºC) 2.105, coliformes 1,5.102, coliformes fecales 1, S. aureus coagulasa positiva 5.102, mohos y levaduras 100 (4). RECUENTO DE ORGANISMOS LIPOLITICOS -1
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Preparar las diluciones 10 y 10 en el diluyente. Depositar 0,1 mL sobre una placa de medio de Sierra modificado o agar tributirina y extender con una varilla en L. Incubar a 30ºC durante 48 horas. Contar las colonias rodeadas de un halo azul oscuro en el primer medio o las que tienen halo claro en el segundo, y multiplicar por el factor de dilución correspondiente. Peptona 10 g, cloruro de sodio 5 g, cloruro de calcio 0,1 g, extracto de carne 3 g, citrato ferroso 0,2 g, agar 15 g, agua 1 litro. Esterilizar a 120ºC durante 20 minutos. Enfriar a 50ºC, agregar asépticamente 5 mL solución de azul victoria B (0,1 g en 150 mL agua estéril) y 1 mL de tween 80 (9). AGAR TRIBUTIRINA. Peptona 5 g, extracto de levadura 3 g, tributirina 10 g, agar 15 g, agua 1 litro, pH 7,5. Esterilizar a 115ºC durante 15 minutos. Agitar para emulsionar y volcar en cajas de Petri estériles (10). MEDIO DE SIERRA MODIFICADO.
La ICMSF estableció los siguientes límites microbiológicos para helados simples: recuento de bacterias totales n=5, c=2, m=104 y M=2,5.105; coliformes n=5,c=2, m=10 y M=10 3; S. aureus n=5 c=1 m=1 y M=10; Salmonella n=10, c=0, m=0; y para helados Audisio MC, Carrillo L
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complejos: recuento de bacterias totales n=5, c=2, m=2,5.10 4 y M=2,5.105; coliformes n=5,c=2, m=102 y M=103; S. aureus n=5 c=1 m=10 y M=102; Salmonella n=10, c=0, m=0 (8). La ICMSF estableció los siguientes límites microbiológicos para postres congelados: recuento de bacterias totales n=5, c=2, m=104 y M=106; coliformes n=5,c=2, m=102 y M=104; E. coli (NMP) n=5, c=2, m= <3 y M= 10 2; estafilococos n=5 c=2 m=<10 y M=103 (8). Los polvos o mezclas usados en la preparación de postres para helar (art 818), así como los polvos para preparar helados (art. 1071 bis), no deben contener Salmonella en 25 g ni otros gérmenes patógenos, pero se admite los siguientes valores máximos de ufc/g en recuentos de: bacterias totales (a 30ºC) 5.10 4, coliformes 10, coliformes fecales 1, S. aureus coagulasa positiva 10, B. cereus 100, mohos y levaduras 50 (4). MARGARINA, MANTECA
La margarina es una emulsión de agua en grasa, lo mismo que la manteca, con una actividad agua de 0,92 y un pH inferior a 4,5. Dado que el agua está dispersa en la fase lipídica continua, la movilidad de los microorganismos contaminantes está limitada por la separación de la gotas y la escasez de nutrientes en las mismas (1). El deterioro de la margarina es producido principalmente por mohos de los géneros Penicillium, Geotrichum, Cladosporium y otros, secundado por bacterias y levaduras lipolíticas como Candida parapsilosis, por lo que se suele adicionar ácido benzoico o sórbico (2). Los valores de referencia para margarina recien elaborada, expresados como ufc/mL de suero son: Enterobacteriaceae 1, esporas de mohos 1, levaduras no lipolíticas 100, levaduras y bacterias lipolíticas 5, bacterias no Lactobacillaceae 104, Salmonella 10-1 (5). La margarina, según el art 551 del CAA, no debe contener E. coli en 1 g, pero se admite los siguientes valores máximos por g en recuentos de: bacterias lipolíticas 50 ufc, bacterias proteolíticas 50 ufc, coliformes 10 ufc, mohos y levaduras 50 ufc (4). La alteración de la manteca se debe, sobre todo, a la oxidación y enranciamiento por hidrólisis de la grasa, pues la pasterización de la crema de leche, a 85ºC durante 15 segundos, destruye a la Manual de Microbiología de los Alimentos – capítulo 18
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mayoría de los contaminantes. Sin embargo ocasionalmente suele hallarse Shewanella, Flavobacterium y Pseudomonas en el producto no salado, así como algunos mohos y levaduras lipolíticos. Si el pH de la manteca es > 4, se debe analizar para poner de manifiesto la ausencia de E. coli en muestras de 1 g (5). Los límites de referencia para manteca son en ufc/g: bacterias proteolíticas 100, coliformes 10, enterococos 10, mohos y levaduras 20 (3). La crema artificial, de acuerdo al art 552 del CAA, no debe contener Salmonella en 25 g ni otros gérmenes patógenos, pero se admiten los siguientes valores máximos por g en recuentos de: bacterias totales (a 30ºC) 104 ufc, bacterias termófilas 5.10 3 ufc, coliformes 10 ufc, coliformes fecales 1 ufc, S. aureus coagulasa positiva 10 ufc, B. cereus 100 ufc, mohos y levaduras 50 ufc (4). RECUENTO DE ORGANISMOS PROTEOLITICOS -1
-2
Preparar las diluciones 10 y 10 en el diluyente. Depositar 0,1 mL sobre una placa de agar leche y extender con una varilla en L. Incubar a 30ºC durante 48 horas. Contar las colonias rodeadas de un halo claro y multiplicar por el factor de dilución correspondiente. Reconstituir la leche descremada en polvo (10% sólidos) y calentarla en baño de agua hirviente durante 30 minutos, en tres días sucesivos. Mezclar con igual volumen de agar nutritivo de doble concentración estéril, fundido y a 50ºC. Volcar en cajas de Petri estériles (10). AGAR LECHE.
MAYONESA
El pH de este producto está entre 3,6 y 4,0, principalmente debido al agregado de 0,5-1,2% de ácido acético y, ocasionalmente otros ácidos orgánicos. El contenido de aceite varía de 65 a 80%, el de sal entre 9 y 11%, y el azúcar representa 7 a 10%. La actividad de agua se aproxima a 0,92, y suele incluir benzoato de sodio y sorbato de potasio. Los agentes comunes de deterioro son Lactobacillus, Zygosaccharomyces y Moniliella (9), acompañados de especies de Bacillus y Micrococcus (3). Si están presentes microorganismos Audisio MC, Carrillo L
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que asimilan el ácido acético puede ocurrir una alcalinización secundaria que permitiría el crecimiento de todos los organismos viables transportados por el alimento. La mayonesa suele ser el vehículo de especies de Salmonella en brotes de enfermedad alimentaria. El uso de huevo líquido pasterizado resuelve este problema, pero si se emplean huevos con cáscara el pH se debe ajustar a < 4 con ácido acético (5). La mayonesa, según el art 1280 del CAA, no debe contener E. coli en 1 g, pero se admiten los siguientes valores máximos por g en recuentos de: bacterias totales 10 3 ufc, coliformes 10 ufc, mohos y levaduras 20 ufc (4). RECUENTO DE LEVADURAS ACIDOFILAS -1
-2
Preparar las diluciones 10 y 10 en solución de peptona al 0,1%. Colocar alícuotas de 1 mL en sendas cajas de Petri estériles. Volcar 20 mL de agar malta acético recién preparado y a 50ºC. Mezclar por rotación sobre la mesada. Colocar en una bolsa cerrada junto a un vaso de agua para mantener la humedad (no invertir las cajas). Incubar a 30ºC durante 1-2 semanas. Contar las pequeñas colonias y multiplicar por el factor de dilución correspondiente. Hacer un preparado en fresco para observar la morfología (2).
REFERENCIAS 1. ICMSF. 1998. Microorganisms in food. Vol 6: Microbial Ecology of Food Commodities. Blackie Academic & Professional, London, p. 418. 2. Pitt JI, Hocking AD. 1997. Fungi and Food Spoilage. 2ª ed. Blackie Academic & Professional., London, p 36, 467, 502. 3. Downes FP, Ito K, eds. 2001. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4º ed. APHA, Washington, p 250, 487, 541, 546. 4. Código Alimentario Argentino. http//:www.anmat.gov.ar/codigoa /caa1.htm Cap 10. 5. Mossel DAA et al. 2003. Microbiología de los Alimentos. 2º ed. Acribia, Zaragoza, p 415, 510, 549, 552. 6. Fangio MF et al. 2007. Rev Arg Microbiol 39: 120. 7. Midura TF et al. 1979. J Clin Microbiol 9 : 282. 8. ICMSF. 1981. Microorganismos de los Alimentos. Vol 2. Acribia, Zaragoza, p 110, 113, 120, 128. 9. Salkinoja-Salonen MS et al. 1999. Appl Environ Microbiol 65: 4637. 10. Collins CH et al. 1999. Microbiological Methods. ButterworthHeinemann, Oxford, p 86.
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Indice de técnicas Aeromonas, presencia Aflatoxinas, presencia Agar AD agua Baird Parker base con C N base resistencia CIN CFC citrato Simmons Czapek glicerol dicloran cloranfenicol dicloran glicerol eosina azul metileno estreptomicina talio glucosa 60% glucosa, purpura triptona levadura Gorodkowa Hugh y Leifson KEA leche LIA Mac Conkey - MUG - sorbitol-TC malta malta levadura malta glucosa sal malta acético MRS MSS MYP NC nutritivo PALCAM papa glucosa
131 98 131 87 147 44 44 45 123 130 113 39 39 81 81 112 112 178 27 81 45 27 158 185 137 137 112 114 39 45 81 81 148 148 86 158 63 121 39
Agar papa sacarosa 39 papa zanahoria 45 PCS 122 recuento 56 sulfito 87 TCBS 129 TGSB 158 tributirina 183 triptona glucosa 88 TSGY 112 TSI 137 urea 137 VRBG 120 VRBL 158 XLDN 136 Agua, idoneidad 67 análisis 158 Agua peptona alcalina 129 Aire, control 56 Alfa-naftol, solución 113 Ascosporas, producción 45 Azúcares, asimilación 44 Azul láctico 80 lactofenol 33 Bacillus cereus, recuento 86 Bacillus del limo 88 Bacterias aerobias esporuladas del agriado153 esporuladas del limo 88 mesófilas, recuento 111 psicrótrofas, recuento 127 recuento membrana 160 recuento microscópico 154 Bacterias anaerobias esporuladas sulfito-reductoras 155 termófilas 176 Bacteriostáticos, residuos 63 Brochothrix thermosphacta,
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188 recuento 112 Caldo BOS 123 base fermentación 45 base resistencia 45 glucosa 113 Horie 130 infusión cerebro-corazón121 MacConkey 159 M-Endo 164 nitrato 27 NF 130 PALCAMY 121 PCS 122 PE-2 176 RV 136 sin vitaminas 44 TB 164 TSF 160 TSM 164 urea 45 YM-11 165 Calidad agua 67 Campylobacter jejuni, presencia 122 Carnes preparación muestras 111 diluciones 111 hisopado superficies 111 Catalasa, prueba 26 Cicloheximida, resistencia 45 Clostridium perfringens, recuento 87 Coagulasa, prueba 147 Coliformes, NMP 159 recuento 159 en membrana 164 Coliformes fecales recuento membrana 164 Control del aire 56 Creatina alcalina 113 Cristal violeta, solución 25 Diluciones decimales 111 Diluyente 63 Indice de técnicas
con cisteína 87 hipertónico 178 salado 130 tensoactivo 81 DON, presencia 97 Eficacia lámpara UV 63 Emulsión yema de huevo 121 Endosporos, tinción 26, 86 Enterobacteriaceae, recuento 120 características 132 Enterococcus recuento 148,158 Escala Mac Farland 63 Escherichia coli recuento 112 identificación 113 Escherichia coli O157:H7, presencia 114 Envases, análisis 165 Filtración por membrana bacterias aerobias 160 Flagelos, tinción 26 colorante 26 Fumonisinas, presencia 99 Gram, tinción 25 Griess, reactivo 27 Glóbulos polihidroxibutirato, tinción 86 Hongos, observación microscópica 33 Hisopado de superficies 111 Howard, recuento 80 Incubación, prueba 154 Indol, prueba 113, 164 Kovac, reactivo 113 Lactofenol 33 Lactobacillus, recuento 148 Lámpara germicida, eficacia 63 Levaduras acidófilas 186 ascosporas 44 asimilación fuentes C 44
189 Levaduras asimilación fuentes N 44 fermentacion 45 identificación 44 observación 33 osmófilas 178 productos ácidos 81 salados 81 secos 81 psicrotrofas 127 recuento 81 en membrana 165 resistencia acidez 45 aw baja 45 cicloheximida 45 vitaminas, necesidad 44 ureasa 45 Líquido de montar 33 Listeria monocytogenes, presencia 121 Mac Farland, escala 63 Medio enriquecimiento concentrado 114 M-Endo 164 mínimo concentrado 67 MRS 147 MSS 147 PE-2 176 Sierra modificado 183 SIM 113 TB 164 TSF 160 TSM 164 YM-11 165 Microaerofilia 122 Microcultivo 38 Microorganismos, recuento lipolíticos 183 proteolíticos 185 psicrotrofos 128 Mohos, identificación 39 microcultivo 38
Mohos observación 33 productos ácidos 81 salados 81 secos 81 recuento 81 en membrana 165 recuento microscópico 80 Mordiente con fucsina 26 Muestras, preparación 111 Nitratos, reducción 27 Nitrogenados, compuestos asimilación 44 NMP, coliformes 159 tabla 159 Oxidasa, prueba 26 Oxidación-fermentación, prueba 27 Pseudomonas, recuento 130 aeruginosa, presencia 158 Preparación muestras 111 Productos envasados prueba incubación 154 Prueba de incubación 153 Reactivo de Kovac 113 Indol para membranas 164 Recuento microscópico80,154 Residuos bacteriostáticos 65 Resistencia acidez 45 actividad agua baja 45 cicloheximida 45 Rojo metilo, solución 113 Safranina, colorante 25 Salmonella, presencia 136 confirmación 137 reacciones 138 Sangre lisada 122 Shigella, presencia 131 Solución α-naftol 113 alcalina creatina 113 rojo metilo 113 Superficies, vigilancia 56
Manual de Microbiología de los Alimentos
190 Staphylococcus aureus, detección 147 recuento 147 Tapas, análisis 165 Ureasa 45 UV germicida, eficacia 63 Verde malaquita, colorante26 Vibriocholerae y relacionados presencia 129
Indice de técnicas
Vibrio parahaemolyticus presencia 130 Vigilancia de superficies 56 Violeta cristal, colorante 25 Vitaminas, necesidad 44 Yersinia enterocolitica, presencia 123 Yema de huevo, emulsión121 Yodo, solución 25
191
Indice Aeromonas, presencia
131 Aflatoxinas 98 Agua envasada 158 análisis microbiológico 156 envases y tapas 165 valores de referencia 157 Alimentos congelados 182 deshidratados 180 Aves 117 análisis microbiológico 122 deterioro 118 patógenos 119 valores de referencia 122 Azúcar 176 Bacterias 19 esporuladas anaerobias 176 del agriado 153 sulfito-reductoras 155 termófilas 155, 176 Gram-negativas 21 Gram-positivas 23 identificación 28 lácticas 141 patógenas 21 pruebas 26 recuento mesófilas 111 recuento por filtración 160 recuento psicrótrofas 128 tinciones 25 Bacillus cereus, recuento
86 formadores de limo 88 Bebidas sin alcohol 160 análisis microbiológico 163 envases y tapas 165 control 162 deterioro 161
Brochothrix thermosphacta
recuento Calidad analítica
112 53
Campylobacter jejuni
presencia 122 Carnes rojas 102 análisis microbiológico 108 deterioro 103 patógenos 107 valores de referencia 108 Chocolate 179 Clostridium perfringens
recuento Coliformes NMP coliformes recuento por filtración Compotas Control aire idoneidad del agua lámpara UV residuo bacterostático superficies Criterios microbiológicos Desoxinivalenol Diagrama de flujo
87 159 164 179 56 67 53 65 56 9 97 4
Enterobacteriaceae
recuento
120 Enterococcus, recuento148,156 Envasados herméticos 150 análisis microbiológico 153 deterioro 151 prueba de incubación 154 Escherichia coli
identificación presencia recuento Frutas almacenamiento
Manual de Microbiología de los Alimentos
113 114 112 71 74
192 Frutas análisis microbiológico 79 conservación 76 deterioro 71 patógenos 75 valores de referencia 80 Fumonisinas 99 Garantía de calidad 53 documentación 69 equipamiento 59 laboratorio 54 metodología 68 muestras 58 personal 57 productos químicos 66 Granos 84 análisis microbiológico 85 valores de referencia 85 Harinas 85 análisis microbiológico 85 valores de referencia 86 Helados 182 postres 182 Hongos comestibles 167 Hortalizas 71 almacenamiento 74 análisis microbiológico 79 conservación 76 deterioro 71 patógenos 75 valores de referencia 79 Huevos 133 análisis microbiológico 136 deterioro 133 patógenos 134 valores de referencia 135 Indicador 15 Índice 14 Jaleas 179 Jarabes 177 Lactobacillus, recuento 148 Leche 140 análisis microbiológico 145 deterioro 142 Indice
Leche patógenos valores de referencia Levaduras acidófilas ambiente géneros comunes identificación osmófilas, recuento recuento recuento por filtración Listeria monocytogenes
143 145 40 186 42 41 43 178 80 165
presencia 121 Manteca 184 Marcadores 14 Margarina 184 Mariscos 125 análisis microbiológico 128 deterioro 125 patógenos 127 valores de referencia 129 Mayonesa 185 Mermeladas 179 Micotoxinas 89 afecciones humanos 94 incidencia 95 límites 96 mohos toxigénicos 90, 95 prevención 99 producción 91 Microorganismos lipolíticos 183 proteolíticos 185 Miel 178 Mohos, estructuras 31 géneros comunes 34 identificación 39 microcultivo 38 observación 33 recuento 80 recuento por filtración 165 Ovoproductos 133 análisis microbiológico 136 deterioro 133