MAQ-EAUX 08

– Institut Institut Pasteur d’Algéri d’Algér ie – Mai – Mai 2008 Cours d’Hygiène et de Microbiologie des Eaux Eaux –

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SOMMAIRE Analyse Analyse des d es Eaux Intitulé

Codificat Codificatiion

Version

Date

Reche Reche rche et Dénombre Dénombre ment des Microorganismes Microorganismes revivifiables. Mé thode thode par comptage des colonies colo nies obtenues à 30°C, dans dans les eaux de forage. Reche Reche rche et Dénombre Dénombre ment des Microorganismes Microorganismes revivifiables. Mé thode thode par comptage des colonies colo nies obtenues à 22 et à 37°C, dan da ns les ea ux minérales minérales embouteillées. Reche Reche rche et Dénombreme Dénombremen nt des Coliform Coli formes, es, Coliformes Coli formes thermo tolérants et Escherichia coli dans les eaux par filtration. Reche Reche rche et Dénombreme Dénombremen nt des Coliform Coli formes, es, Coliformes Coli formes thermo tolérants et Escherichia coli dans dans les eaux e aux en milieu liquide. Reche Reche rche et Dénombreme Dénombremen nt des Entérocoques Entérocoques in i ntestinaux testina ux e t Streptocoques fécaux dans les eaux par filtration. Reche Reche rche et Dénombreme Dénombremen nt des Entérocoques Entérocoques i ntestinaux et Streptocoques fécaux dans les eaux en milieu liquide. Reche Reche rche e t Dénombrement Dénombrement de Staphylocoques à coagulase positiv posi tive e dans les eaux. Reche Reche rche et Dénombreme Dénombremen nt de Pseudomonas aeruginosa par filtra filtra tion dans les eaux. Reche Reche rche et Dénombreme Dénombremen nt des Anaérobies Anaérobies Sulfito-Réducteurs par filtra filtra tion par comptage des co lonies lonies à 44°C dans dans les eaux ea ux Reche Reche rche des Salmon Sal mone e lla lla dans les eaux par filtration. filtratio n. Reche Reche rche de Vibrion Vi brion cholérique dans les eaux.

MO.MR.EA

00

02 / 1 / 06

MO.MR.EM

00

02 / 1 / 06

MO.C MO.C TT.MS TT.MS

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02 / 1 / 06

MO.C MO.C TT.ML TT.ML

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MO.S MO.S T.MS T.MS

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MO.S MO.S T.ML T.ML

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MO.SA.MS MO.SA.MS

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MO.PA.MS MO.PA.MS

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MO.ASR.MS MO.ASR.MS

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MO.VC.MS MO.VC.MS

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– Institut Institut Pasteur d’Algéri d’Algér ie – Mai – Mai 2008 Cours d’Hygiène et de Microbiologie des Eaux Eaux – LE PRELEVEMENT AU ROBINET     

ASEPTIE MAXIMUM MAXIMUM FLAMBAGE - DESINFECTION EVACUATIO EVACUATION N DES PREMIE P REMIERS RS LITRES LITRES DEBIT DE REMPLISSAGE VOLUME A PRELEVER

PUITS ET FORAGES  

CONN CO NNAITRE AITRE LA NAPP NAPPE E CONN CO NNAITRE AITRE L'USAGE DE CES C ES EAUX LE TRANSPORT

TEMPERATURE



MULTIPLICATION MORTALITE TEMPERATURE DE 4°C



LES PLUS P LUS COURTS POSSIBLES POSSIBLES

 

DELAIS

EAUX EMBOUT EMBO UTEILLES EILLES 

LE DENOMBREMENT DENOMBRE MENT DOIT AVOIR AVOIR LIEU DANS LES HEURES HEURES QUI SUIV S UIVENT ENT L'EMBOUTEILLAGE L'EMBOUTEILLAGE LES FLACONS

NATURE  

VERRE FLACONS A USAGE UNIQUE

STERILISATION     

PAR LA CHALEUR PAR L'OXYDE D'ETHYLENE PAR LES RAYONS GAMMA CONTROLE DE STERILITE STERILISATION EXTERIEURE

NEUTRALISANTS  

THIOSULFATE THIOSULFATE DE SODIUM (Pastilles) EDTA 3


Mode opératoire / Enregistrement Enregistrement

LOGO

Code : MO.MR.EM Version Version : 00 Recherche Recherche et déno dénombrement mbrement des M icroorganismes icroorganismes revivif revivi fiables à 22 et e t à 37°C 37°C Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3

dans les eau e aux x minéra mi nérales les embouteillées embouteillées.. Sommaire : 1. 2. 3. 4. 5.

Objet et domaine d’application. Définition. Référentiels. Mode opératoire. Lecture Lecture et interprétation.

domaine d’ap d ’app plication. 1. Objet et domaine Cette méthode consiste en la recherche et le dénombrement des microorganismes dans les eaux minérales embouteillées destinés à la consommation humaine par comptage des colonies à 22° e t à 30°C.

2. Définition. Dans le sens de cette méthode, on entend par microorganismes : Bactéries, Levures, Moisissures se développant en aérobiose, lorsque l’essai est effectué selon la méthode spécifiée.

3. Référentiels. Norme Norme NF E N IS IS O 6222 : Dénombrement des micro organismes re vi vifiables : comptage des colonies par ensemencement dans un milieu de culture nutritif gélosé. Norme Norme NF V 08 -010 : Règles Règles gé nérales pour la préparation des dilution di lutions s en vue vue de l’ex l’e xamen microbiologique. Norme Norme NF E N IS IS O 6887-1 : Suspensio Suspension n mère e t dilutio dilutions ns décimales ; 1. règles générales. Norme Norme NF V 08 -057-2 : Microbiologie alimentaire – alimentaire – Directives générales pour po ur la prépara prépara tion des di lutions lutions e n vue vue de l’e xamen microbiologique. microbiologique. Norme Norme XP V 08 -102 : Règles gén gé nérales pour le comptage des colonies et l’expression l’expression des résulta résulta ts. ts. Norme Norme NF IS IS O 7218 : Règles Règles générales pou po ur les examens microbiologiques. microbiologiques. Norme Norme NF IS O 17025 relative aux prescription p rescriptions s générales concernant concernant la compétence compétence des laboratoires d’étalonnage et d’essais d’ essais..

4. Mode Opératoire. Opératoire. -1

-2

A partir de l’eau à analyser (SM analyser (SM = 1) et/ou des dilutions décimales 10 et 10 , porter aseptiquement 1 ml en double dans deux boites de Pétri vides, numérotées et préparées à cet usage comme comme l’indiqu l’indiq ue le sch sc héma n°2 ci-après. Compléter ensuite avec environ 19 ml de gélose TGEA fondue puis refroidie à 45 ± 2°C. Le temps qui s’écoule entre le moment où l’on a distribué l’inoculum dans la boite et celui celui où o ù le milieu est coulé ne doit pas excéder 15 minutes. 4


Faire ensuite des mouvements circulaires et de va-et-vient en forme de « 8 » pour permettre permettre à l’inoculum de se mélanger à la gélose , sur une surface fraîche et horizontale. Laisser solidifier les boites sur paillasse, puis rajouter une deuxième couche d’environ 5 ml de la même gélose ou de gélose blanche. Cette double double co uche uche,, a un rôle protecte protecte ur contre les contaminations externes e xternes diverses. Les boites seront partagées en deux séries di stinctes stinctes : série sera in i ncubée à 22 ± 2°C pendan penda nt 68 ± 4 heures ,  La première série seconde série sera incubée à 36 ± 2°C, pen pe ndant 44 ± 4°C he ures ures..  La seconde

5. Lecture Lecture et interprétati interprétation. on. Les colonies de microorganismes revivifiables apparaissent en masse sous formes lenticulaires lenticulaires et bien bi en distinctes. distinctes. Rete Rete nir les boites contenant moins de 300 colonies, colo nies, au niveau de deux dilutions successives. Il faut qu’une boite renferme au moins 15 colonies. Calculer ensuite la valeur du nombre N, de microorganismes revivifiables à 22 ± 2°C à part et celle du nombre N de microorganismes revivifiables à 36 ± 2°C à part, en tant que que moyenne pondérée, à l’aide de l’équation suiv sui vante :

Σc

N= 1,1 x d où : Σ c : est la somme des colonies dénombrées sur deux boites de dilutions successives retenues. le taux de dilut dil ution ion correspondant à la première première di lution. d : est le Arrondir Arrondir les résultats calculés à deux chiffres chiffres significatifs après la virg virgu ule. Le résultat final de microorganismes revivifiables dénombrés à 22°C et à 37°C par ml x d’eau est noté par un nombre compris entre 1,0 et 9,9 multiplié par 10 où x est la puissance puissance appropriée de 10. Exemple : Un dénombrement dénombrement de microorgan mic roorganismes ismes à 37°C 3 7°C a donné les résultats suivants : -2  à la première dilution dilutio n retenu rete nue e 10 : on a 158 co lonies. lonies. 

-3

à la seconde dilution retenue 10

Σc

N=

158 + 14

= 1,1 x d

: o n a 14 colonies. colonies.

1,1 x 10

-2

172

=

= 15636 156 36 0,011

Arrondir Arrondir à deux chiffres significatifs, soit 16000 ou mieux encore : 4

1,6 x 10 microorganismes par ml d’eau à 22°C ou à 37°C

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Mode opératoire / Enregistrement Enregistrement

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Code : MO.MR.EM Version Version : 00 Recherche Recherche et déno dénombrement mbrement des M icroorganismes icroorganismes revivif revivi fiables à 22 et e t à 37°C 37°C Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3

dans les eaux minérales embouteillées. embouteillées.

1 ml

1ml

Eau à Analyser

1 ml

10

-1

1 ml

10

-2

1 ml

Ajouter environ environ 19 ml de gélose gélose TGEA Laisser solidifier solidifier sur paillass paillasse e puis incuber à :

22 ± 2°C, 2°C, 68 ± 4 heures 1 ml

1 ml

1 ml

Ajouter environ environ 19 ml de gélose gélose TGEA TGEA Laisser solidifier solidifier sur paillass paillasse e puis incub i ncuber er à :

36 ± 2°C, 2°C, 44 ± 4 heures Dénombrer les colonies lenticulaires ayant poussé en masse dans chacune des boites, puis calculer la valeur de N à 22°C puis celle de N à 36°C. Obligatoire Facultatif 6


Mode opératoire opératoire / Enr E nregistrem egistrement ent LOGO

Recherche et dénombrement des Escherichi Esc herichia a coli et des des bactéries bactéries Coliformes. Méthode par filtration. filtration.

Code : MO.CTT.MS Version Version : 00 Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3

Sommaire : 1. 2. 3. 4. 5.

Objet Objet et domaine d’application. Définitions. Référentiels. Mode opératoire. Lecture Lecture et interprétation.

domaine d’ap d ’applicati plication. on. 1. Objet et domaine Il s’agit là d’une méthode de référence qui consiste en la recherche et le dénombrement des Escherichia coli et des bactéries Coliformes éventuellement présents dans les eaux destinées à la consommation humaine, par comptage des colonies obtenues en milieu solide après ap rès 24 à 48 heures d’incubation d’incubati on en aérobiose à 36 ± 2°C puis à 42 ± 2 °C. La présente méthode est recommandée pour les eaux e aux peu pe u co co ntaminées.

2. Définitions. Au sens sens de cette méthode, on entend par Coliformes des bacilles bacilles à Gram négatifs, aérobies ou anaérobies facultatifs, non sporulés, sporul és, ne possédant pas d’oxydase, capables de se multiplier en présence de sels biliaires et capables de fermenter le lactose avec production d’acide et de gaz en 24 à 48 heures à une température comprise entre entre 36 et 37 °C. Les Coliformes thermo tolérants ont les mêmes propriétés que les coliformes mais à 42 ± 2°C. Les Escherichia coli sont des coliformes thermo tolérants ayant la particularité de produire produire de l’indole l’indole à par tir du try tr yptophane présent dans le milieu mi lieu à 42 ± 2°C.

3. Référentiels.  

    

Norme NF EN ISO 9308 – 9308 – 1 : Recherche et dén dé nombremen ombreme nt des Escherichia coli et des bactéries Coliformes partie 1. Méth Mét hode par filtration fil tration sur membrane. Norme Norme NF T90-413 : Recherche et dén dé nombreme ombreme nt des coliformes et des coliformes the the rmo toléra toléra nts. Méthode générale par ensemenceme ensemenceme nt en milie milieu u liquide (NPP). Norme Norme NF V 08 -051 : Dénombre Dénombre ment des Coliformes par comptage des colonies, méthode de routine. Norme Norme NF V 08 -017 : Dénombre Dénombre ment des Coliformes fécaux et d'Escherichia coli (annexe à NF V 08-015 et NF V 08-016). Norme Norme NF IS O 7218 : Règles Règles générales pou po ur les examens microbiologiques. microbiologiques. Norme Norme XP V 08-102 : Règles Règles généra généra les pou po ur le comptage des colon colo nies et l’expression des rés ultats ultats : cas des dénombrements en milieu solide. Norme Norme NF IS O 17025 : Prescriptio ns générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage et d’essais. 7


4. Mode opératoire. opératoire. La recherche des bactéries coliformes par filtration sur membrane nécessite une préparation a u préalable, qui se déro ule ule selon selo n les étapes étapes sui va ntes : Essai standard. Tout d’abord, il i l faudrait stériliser l’entonn l’entonnoir oir gradué gradué en acier i noxydable noxydable ain ai nsi  que la membrane poreuse à l’ai de d’un bec bunsen. Les refroidi refroidirr tout de suite après, avec avec l’eau l’ea u à analyser si analyser si on o n en dispose en  quantité quantité suffisa nte nte ou bien avec de l’eau distillée stérile. Mettre Mettre e n p lace de façon façon aseptique une membrane de porosité nominale de  0,45 µ entre la membrane poreuse et l’entonnoir l’entonnoir à l’aide d’une pi nce nce stérile. Fixer ce dispositif avec la pi nce nce correspondante correspondante .   Déposer ensuite aseptiq aseptiq uement 100 ou 250 ml m l d’eau d’eau à analyser , selon les types d’eaux d’ eaux à analyser, ana lyser, dev de vant un bec b unse unsen n.  Actionne Actionne r ensuite la pompe à vide pour absorber l’eau absorber l’eau à travers la membrane.  Retirer l’entonnoir Retirer l’entonnoir puis transférer immédiatement et aseptiquement la membrane à l’aide d’une pince à bouts arrondis stérile, sur la sur la surface d’une plaque de gélose TTC préalablement préparée. Cette dernière sera incubée couvercle en bas à 36 ± 2°C pendant 21 ± 3 heures voire 44 ± 4 heures et servira à la recherche des bactéries coliformes, coliformes, suivie de l’identification l’identification bioch bi ochimique imique des Escherichia coli .

Essai rapide rapide . Un deuxième test test dit test rapide peut être effectu e ffectué é parallèlement parallèlement à l’essai  standard et dans les mêmes conditions. Il consiste à filtrer une seconde fois 100 à 250 ml d’eau à analyser selon les types d’eaux à analyser, devant un bec bunsen à travers une seconde membrane qui sera placée dans un premier temps sur une plaque de gélose TSA à la caséine à incuber couvercle en bas d’abord à 36 ± 2°C pendant 4 à 5 heures heures puis tra tra nsférer la membrane sur gélose TBA TBA enrichie enri chie en sels biliaires à incuber à 44 ± 0,5°C pendant 19 à 20 heures. Cette méthode sert à Escherichia coli. la recherche recherche sélecti sélecti ve des Escherichia

5. Lecture Lecture et interprétati interprétation. on. Essai standard. Après la la période d’incubation d’incubation spécifiée, dénombrer les colonies colo nies caractéristiques caractéristiques qui se présentent sous forme de petites colonies lisses légèrement bombées à contours réguliers et pigmentés en jaune jaune orangé ou en jaune ja une (lactose positiv positi ves). Repiquer de faon aléatoire 5 à 10 colonies à des fins de confirmation basée sur le test à l’oxydase l’oxydase d’une part e t la produ prod uction ctio n d’indole d’indole d’autre part. part. Test à l’oxyd l ’oxydase. ase. Pour les besoins de ce test, test, effectuer tout d’abord un repiquage sur gélose TSA à la caséine de 5 à 10 colonies, à incuber à 36 ± 2°C pendant 21 ± 2 heures, puis effectuer effectuer le test de l’une l’une des façons faço ns suivantes :  Imbiber un disque d’oxydase avec une goutte d’eau distillée stérile puis déposer une colonie colonie caractéristiqu caractéristiq ue.  Verser 2 à 3 gouttes du réactif à l’oxy l’oxydase dase p réparé ex e xtemporanément (Tétraméthyl-p-phénylènediamin (Tétraméthyl-p-phénylènediamine e ) sur un papier fifi ltre ltre puis étaler dessus une une partie de la cu c ulture. 8


Dans les deux cas la réaction positive est immédiate et se traduit par un virage au bleu violet foncé. Test à l’ indole. indole. Pour cela, transférer chaque colonie caractéristique séparément (5 à 10) dans un tube contenant 3 ml de bouillon au tryptophane. Bien triturer la colonie dans le milieu puis incuber ce dernier à 44 ± 0,5°C pendant 21 ± 3 heures puis rechercher la production d’indole en ajoutant 2 à 3 gouttes du réactif de Kowacs. La présence d’une coloration rouge à la surface du bouillon traduit la production d’indole à partir du tryptophane présent présent da ns le milieu.

En conclusion, considérée comme bac térie coliforme, toute colonie caractéristique (jaune),  Est considérée dépourvue dépourvue de l’enzyme oxydase et no n productrice d’indol d’i ndole e. Escherichia coli, toute colon considéré comme co mme bactérie Escherichia colo nie caractéristique caractéristiq ue  Est considéré (rouge), dépou dépo urvue de l’e nzyme nzyme oxydase, mais produ prod uc trice d’indole d’indole à 44°C. Calculer ensuite la valeur a du nombre de bactéries coliform co liformes es lactose positiv posi tives es à part celle des Escherichia coli à part ; le résultat rés ultat fina fina l sera sera e xprimé selon l’équation mathématiq mathématique ue suiva suiva nte :

b a=

C A

où : nombre de colonies caractéristiques présumées dans la boite. b : nombre

A : nombre de colonies repiquées. C : no mbre total de colonies trouvées dans la boite.

Essai rapide rapide . Après la période d’incubatio d’incubation n spécifiée, transférer la membrane sur un papier filtre imbibé de réactif de Kowacs puis l’irradier l’irradier sous une lampe UV pendant 10 à 30 minutes. Sont considérés comme des Escherichia coli , les colonies qui prennent une coloration rouge : à dénombrer. Le nombre nombre d’ Escherichia coli sera rapporté rapporté à 100 o u 250 ml d’eau d’eau à analyser.

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Formules des milieux de culture.

1. Gélose lactosée au TTC et à l’hept l’ heptadécyls adécylsu ulfate de sodiu sodi um : Milieu de base. Lactose 20 g Peptone 10 g Extrait Extrait de Levu Le vure re 06 g Extrait Extrait de viande 05 g Bleu de bromothymol 0,05 g Agar agar 15 à 25 g / l Eau distillée 1000 ml Stérilisation 121°C pendant 15 minutes, répartition du milieu mi lieu à raison de 225 ml par falcon. pH fin fi nal après stérilisation stérilisati on à 25°C : 7,2 ± 0,1 2. Solution Solutio n TTC. Chlorure Chlorure de 2,3,5-triph 2,3,5-tri phé é nyltétra nyltétraz zolium (TTC) Eau distillée stérile

0,05 g 100 ml

3. Solutio Solution n d’heptadécylsulfate d’heptadécylsulfate de sodium. Heptadécylsulfat Heptadécylsulfate e de sodium (Tergitol 72) Eau distillée stérile

0,2 g 100 ml

4. Milieu complet. Milieu de base Solutio Solution n TTC Solutio Solution n d’heptadécylsu d’heptadécylsulf lfate ate de d e sodium

100 ml 05 ml 05 ml

Stérilisation 121°C pendant 15 minutes, répartition du milieu à raison de 225 ml par falco falco n. pH fin fi nal après stérilisation à 25°C : 7,2 ± 0,1

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5. Bouillon au tryptophane. Digestat tryptiq tryptiq ue de caséin caséi ne L-Tryptophane L-Tryptophane Chlorure Chlorure de sodium Eau distillée

10 g 01 g 05 g 1000 ml

6. Gélose tryptonée au soja (TSA). (TSA). Digestat tryptiq tryptiq ue de caséin caséi ne 15 g Peptone Peptone de soja so ja 05 g Chlorure Chlorure de sodium 05 g Agar – – agar 15 à 25 g / l Stérilisation 121°C pendant 15 minutes, répartition du milieu à raison de 225 ml par falco falco n. pH fin fi nal après stérilisation à 25°C : 7,2 ± 0,1 7. Gélose tryptonée contenant des sels sels biliaires (TBA) (TBA).. Tryptone Tryptone 20 g Sels biliaires 1,5 g Agar – – agar 15 à 25 g / l Eau distillée 1000 ml Stérilisation 121°C pendant 15 minutes, répartition du milieu à raison de 225 ml par falco falco n. pH fin fi nal après stérilisation stéri lisation à 25°C : 7,2 ± 0,1 8. Réactif à l’indole, essai rapide. p -Diméthylaminobenzaldéhide -Diméthylaminobenzaldéhide 0,5 g Acide chlorhydriq chlorhydriqu ue, c(HCI) = 1 mol/l 100 ml Pour être convenablement utilisé, le réactif doit présenter une coloration jaune clair. 9. Réactif Réac tif à l’oxydase. Tétraméthyl-p -phénylènediamine -phénylènediamine 0,1 g Eau distillée 10 ml Ce réactif n’est pas stable, il convien convie nt de le préparer préparer juste j uste avant le test. Prendre Prendre des précau préca utions relativ relati ves à la protection des ye ux et de la peau.

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Mode opératoire opératoire / Enr E nregistrem egistrement ent

Code : MO.CTT.MS Version Version : 00 Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3

Recherche et dénombrement des Escherichi Esc herichia a coli et des des bactéries bactéries Coliformes. Méthode par filtration.

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Filtration de 250 ml d’eau Eau à analyser

Entonnoir Membrane 0,45 µ

Rampe de

A Pompe

Essai standard

Essai rapide

Milieu TTC

36 ± 2°C 21 ± 3 heures

Filtration à 3 postes

Milieu digestat tryptique tryptique : TSA

36 ± 2°C 4 à 5 heures

Milieu digestat t ryptique ryptique + Sels biliaires TBA 44 ± 0,5° 0,5 °C, 19 à 20 heures heu res

TSA 36 ± 2°C 21 ± 3 heures

Tests Oxydase

B.Tryp 44 ± 0 ,5°C ,5°C 21 ± 3 heures

Test à l’indole

Test à l’indole sur filtre

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Recherche et dénombrement des Coliformes, Coliformes thermo tolérants et Escherichia Escherichia coli en coli en milieu liquide.

Code : MO.CTT.ML Version Version : 00 Date : 02/ 01 / 09 Page : 1 / 3

Sommaire : 1. 2. 3. 4. 5.

Objet Objet et domaine d’application. Définitions. Référentiels. Mode opératoire. Lecture Lecture et interprétation.

d omaine ne d’application. 1. Objet et domai Cette méthode de routine, consiste en la recherche et le dénombrement des bactéries coliformes, coliformes thermo tolérants et des Escherichia coli dans les eaux destinées à la consommation humaine, en milieu liquide par la technique du nombre le plus probable (NPP).

2. Définitions. Au sens sens de cette méthode, on entend par Coliformes des bacilles bacilles à Gram négatifs, négatifs, aérobies ou anaérobies facultatifs, non sporulés, ne possédant pas d’oxydase, capables de se multiplier en présence de sels biliaires et capables de fermenter le lactose avec production d’acide et de gaz en 24 à 48 heures à une température comprise entre entre 36 et 37 °C. Les Coliformes thermo tolérants ont les mêmes propriétés que les coliformes mais à 42 ± 2°C. Les Escherichia coli sont des coliformes thermo tolérants ayant la particularité de produire produire de l’indole l’indole à par tir du try tr yptophane présent dans le milieu mi lieu à 42 ± 2°C. 2 °C.

3. Référentiels.       

Norme NF EN ISO 9308 – 1 : Recherche et dénombrement des Escherichia coli et des bactéries Coliformes Coliformes partie 1. Méthode par filtration filt ration sur membrane. Norme NF T90-413 : Recherche et dénombrement des coliformes et des coliformes the the rmo tolérants. Méthode générale par ensemence ensemencement ment en milieu liquide liquide (NPP). ( NPP). Norme NF V 08-051 : Dénombrement des Coliformes par comptage des colonies, méthode de routin ro utine. e. Norme NF V 08-017 : Dénombrement des Coliformes fécaux et d'Escherichia coli (anne (anne xe à NF V 08-015 et NF V 08-016). Norme Norme NF IS O 7218 : Règles Règles générales pour les e xamens microbiologiques. microbiologiques. Norme Norme XP V 08-102 08 -102 : Règles Règles générales pour po ur le comptage des colonies et l’expressio l’expression n des résultats : cas des dénombrements dénombrements e n mi mi lieu solide. so lide. Norme NF ISO 17025 : Prescriptio Prescripti o ns générales co ncernant la compétence compé tence des laboratoires laboratoires d’étalonnage et e t d’essais. 13


4. Mode M ode opératoire. opératoire.

 



  

La recherche et le dénombrement des bactéries coliformes, coliformes thermo tolérants et des Escherichia coli dans les eaux, en milieu liquide par la technique du NPP, se fait en deux étapes é tapes consécuti consécuti ves : le test de présomption : réservé à la recherche des Coliformes, le test de confirmation : réservé à la recherche des Coliformes thermo tolérants et Escherichia coli.

Test de présomption. A partir de l’eau à analyser, porter aseptiquem porter aseptiqueme e nt : 50 ml dans un flacon contenant 50 ml de milieu BCPL BCP L D/C muni d’une cloche de Durham 5 fois 10 ml dans 5 tubes contenant 10 ml de milieu BCPL D/C muni d’une cloche de Durham 5 fois 1 ml dans 5 tubes contenant 10 ml de milieu BCPL S/C muni d’une cloche de Durham, Durham, comme l’indique l’i ndique le schém sc héma a n° 2. Chassez l’a l’air ir éventuellement présent dans les cloches de Durham et bien mélanger le milieu e t l’inoculum. L’incubation L’incubatio n se fait à 37°C pendant pendant 24 à 48 he ures. Lecture :

 

Seront Seront considérés comme positifs, positifs , les tubes présen prése ntant à la fois : un dégagement de ga z (supé (supérieur rieur au a u 1/10é de la hauteur hauteur de la cloche), un trouble microbien accompagné d’un virage du milieu au jaune (ce qui constitue le témoin de la fermentation fermentatio n d u lactose lactose présent dan da ns le milieu). Ces deux caractères étant témoins de la fermentation du lactose dans les conditions opératoires décrites. La lecture finale se fait selon les prescriptions de la table du NPP qui figure en annexe. Illus Illus tration : Inocul Inoculu um 1 X 50 ml 5 X 10 ml

5 X 1 ml

Test de présomption + + + + + + -

Nombre Nombre Caractéristiqu Carac téristique e 1

3

2

Le nombre caractéristique est donc « 132 » ; ce qui correspond sur la table NPP au nombre 14. On considère alors q u’il ’i l y a 14 Coliformes par 100 ml d’eau à analyser. 14

– Institut Institut Pasteur d’Algéri d’Algér ie – Mai – Mai 2008 Cours d’Hygiène et de Microbiologie des Eaux Eaux – 

Test de de confirmation. confirmat ion.

-

Le test de confirmation est basé sur la recherche de Coliformes thermo tolérants parmi lesquels lesquels on redoute s urtout la présence d’Escherichia d’Escherichia coli . Les coliformes thermo tolérants ont les mêmes propriétés de fermentation que les coliformes coliformes mais à 44°C. Escherichia coli est un coliforme coliforme thermo thermo tolérant qui entre a utre : produit produit de l’indole à partir par tir du try tr yp topha topha ne présent dan da ns le milieu mi lieu à 44°C, donne donne un résulta résulta t positif à l’essai a u rouge de méthyl, ne produit pas de l’acéthyl méthyl carbi carbi nol, n’utilise pas le citrate comme source unique de carbone. Les tubes de BCPL trouvés positifs lors du dénombrement des Coliformes feront l’objet d’un repiquage à l’aide d’une öse bouclée dans tube contenant le milieu Schube Schubert rt muni m uni d’une cloche de Durh D urham, am, comme l’indique l’indique le schéma n°3. Chasser l’air l’air éventuellement éventuellement présent dans les Cloches de Durham et bien mélanger le milieu et l’inoculum. L’incubation se fait cette fois-ci fois-ci au bain marie à 44°C pendant 24 heures. Lecture : Seront Seront considérés comme positifs, positifs , les tubes prése ntant à la fois : dégagement ga zeux, et  un dégagement  un anneau rouge en surface, témoin de la production d’indole par Escherichia coli après adjonction adjonction de 2 à 3 gouttes du d u réactif de Kowacs. La lecture finale s’effectue également selon les prescriptions de la table du NPP en tenant compte du fait que Escherich Escheric hia Coli est à la fois fois producteur de gaz et d’indole d’indole à 44°C. Illustration En reprenant l’exemple précédent relatif au dénombrement des Coliformes, cela suppose suppose que nous avons 6 tu t ubes à repiquer repi quer à savoir :  le flacon de BCPL D/C, 3 tubes sur 5 de BCPL D/C, D /C, et  2 tubes sur 5 de BCPL S/C.  Inoc Inoculum ulum

1 X 50 ml 5 X 10 ml

5 X 1 ml

Test de présomption

Nombre Caractéristique

+ + + + + + -

1

3

Test Test de confirmation Gaz Indole + + + + + +

+ 2

Nombre Caractéristique

1

1

+ + 1

Tableau Récapitulatif 15


Le nomb nomb re caractéristique relatif au a u dénomb dénomb rement des Coliformes fécaux est do nc « 111 », ce qui correspond sur la table du NPP au chiff c hiffre re 5. Le résulta résulta t final sera donc de :

14 Coliformes totaux dans 100 ml d’eau à a nalyser alyser 5 Coliformes fécaux dans 100 ml d’eau à anal yser

Remarque : Etant donné que les Coliformes fécaux font partie des Coliformes totaux, il est pratiquement impossible de trouver plus de Coliformes fécaux que de Coliformes totaux.

16


Mode opératoire opératoire / Enr E nregistrem egistrement ent Recherche et dénombrement des Coliformes, Coliformes thermo tolérants et Escherichia Escherichia coli en coli en milieu liquide.

LOGO


Eau à Analyser


1 X 50 ml

5 X 10 ml

BCPL D/C

5 X 1 ml

BCPL D/C

BCPL S/C

37°C, 24 à 48 heures

+ 1

+

+ + 3

-

-

+

+

-

-

-

2

17


Mode opératoire opératoire / Enregistreme Enregistreme nt Recherche et dénombrement des Coliformes, Coliformes thermo tolérants et Escherichia Escherichia coli en coli en milieu liquide.

LOGO


Test de confirmation

Repiquag Rep iquage e sur s ur milieu Schubert Schubert + cloche c loche

Incuber à 44°C, 4 4°C, 24 heures heures

Ajouter 2 à 3 goutt go uttes es de réactif réactif de Kowacs Kowacs par tube tube

++

1

++ +-

1

--

++ +-

1 18



Recherche et dénombrement des Entérocoques Entérocoques intestinaux. ntestinaux. Partie 2 : méthode méthode par p ar filtration sur membrane. membrane.

Code : MO.SGD.MS Version Version : 00 Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3

Sommaire. 1. Objet et domaine d’application. 2. Définition. 3. Ré Ré férentiels férentiels.. 4. Mode opéra opéra toire. 5. Lecture et interprétation ’application. 1. Objet et domaine d ’application. Cette méthode de référence, consiste en la recherche et le dénombrement des entérocoques intestinaux ou Streptocoques du groupe « D » de la classification de Lance Field, ou encore Streptocoques fécaux dans les eaux destinées à la consommation consommation humaine, par filtration filt ration sur membrane.

2. Définition. Au sens de ce tte méth mét hode, on o n entend ente nd par entérocoqu e ntérocoques es intestinaux des bactéries qu q ui se présentent sous forme de cocci à Gram positive, sphériques ou ovoïdes formant des cha cha înettes înettes,, ne possédant pas de catalase cata lase mais possédant l’an l’a ntigène du d u groupe groupe D. Ils sont capables de se développer en 24 à 48 heures à 37°C sur un milieu sélectif à l’azoture de sodium en donnant des colonies caractéristiques réduisant le TTC et qui de plus hydrolysent l’esculine en 2 heures à 44°C après repiquage d’une colonie sur une une gélose gé lose biliée à l’esculine l’esculine et à l’azoture. l’azoture.


Norme Norme ISO 7899- 2 et Norme NF T 90-416. Recherche Recherche et dénom dé nombrement brement des entérocoques entérocoques intestin i ntestinaux. aux. Partie 2 méthode par filtrati filtration on sur membrane. Norme Norme NF T 90-411. 90 -411. Recherche Recherche et dénombrement des Strept S treptocoq ocoqu ues du groupe D. Méthode générale par ensemencement en milieu liq uide (NPP). Norme Norme NF V 08 -051 : Dénombre Dénombre ment des Coliformes par comptage des colonies, colonies, méthode de rou ro utine. ti ne. Norme Norme NF V 08-017 : Dénombrement des Coliformes fécaux et d'Escherichia coli (annex (annexe e à NF V 08-015 e t NF V 08-016). Norme Norme NF IS O 7218 : Règles Règles générales générales pou po ur les examens microbiologiques. Norme Norme XP V 08-102 : Règles Règles généra généra les pour po ur le comptage des colon colo nies et l’expression l’expression des résulta résulta ts : cas des dénombrements dénombrements e n milieu mi lieu solide. Norme Norme NF IS O 17025 : Prescriptio ns générales concernant la compétence des laboratoires laboratoires d’étalonn d’éta lonnage age et e t d’essais.

19


4. Mode opératoire. La recherche des entérocoques intestinaux ou Streptocoques du groupe « D » par filtration sur membrane nécessite une préparation au préalable, qui se déroule selon les étapes suivantes suivantes :  Tout d’abord, il faudrait stériliser l’entonnoir l’entonnoir gradué en acier inoxydable ainsi que la membrane poreuse à l’aide d’un bec bunsen. Les refroidir tout de suite après, avec l’eau à analyser si analyser si on en dispose en quantité  suffisante o u bien av a vec de l’eau distillée stérile.  Mettre en place de façon aseptique une membrane de porosité nominale de 0,45 µ entre entre la membrane pore use et l’e ntonnoir à l’ai de d’une pince pince stéri le. Fixer ce dispositif a vec la pince corresponda correspondant nte e.  Déposer ensuite aseptiquement 100 ou 250 ml d’eau à analyser, selon les types  d’eaux à analyser, analyser, de va nt un bec bunsen. Actionner Actionner e nsuite nsuite la pompe pompe à vide pour absorber l’ea absorber l’eau u à trav tra vers la membrane.  Retirer Retirer l’entonnoir puis transférer immédiatement et aseptiquement la membrane à  l’aide d’une pince à bouts arrondis stérile, à la surface d’une plaque de gélose SLANETZ et BARTLEY préalable préalable ment préparée. Cette dernière sera sera incu i ncubée bée couvercle en bas à 36 ± 2 °C penda pendan nt 44 ± 4 heures. heures. 

5. Lecture et interprétation Après la période d’incubation spécifiée, les entérocoques intestinaux ou Streptocoques du groupe « D » apparaissent sous forme de petites colonies lisses légèreme légèreme nt bombées à con co ntours réguliers et pigmentées e n rouge, marron ma rron ou rose. Tra Tra nsférer aseptiquement la membrane du milie u de Slan S lane e tz et e t Bartley sur une une plaqu p laque e de gélose Bile esculine azoture (BEA) préchauffée préalablement à 44°C. Cette dernière dernière sera incu i ncubée bée à son tour à 44 ± 0,5°C pendant pe ndant 2 heures. Les colonies caractéristiques prennent alors une coloration noire traduisant ainsi l’hydrol l’hydroly yse de l’esculine présent prése nte e dan da ns le milieu. Compter le le nombre de colonies et le rapporter à 100 ou 250 ml d’eau à analyser.

20


Formules des milieux de culture.

1. Milieu de SLANETZ et BARTLEY. BARTLEY. Milieu Mi lieu de base. Tryptose 20,0 g Extrait Extrait de Levu Le vure re 05,0 g Glucose 02,0 g Hydrogénophosphat Hydrogénophosphate e dipotassique (K 2HPO4) 04,0 g Azoture Azoture de Sodium (Na (Na N3) 0,4 g Agar – – Agar 08 à 18 g Eau distillée 1000 ml Dissoudre les les i ngrédients dans l’eau bouillante jusqu’à dissolu dissol ution complète. 2.

Solution Solutio n TTC Chlorure Chlorure de 2,3,5-triphénylt 2,3,5-triphé nyltétra étraz zolium 01 g Eau 100 ml Dissoudre l’i l’ i ndicateu dicate ur dans l’eau par agita agitation tion.. Stériliser par filtration à 0,2 µ.

3.

Milieu Complet. Milieu de base Solutio Solution n de TTC

1000 ml 10 ml

Stérilisation 121°C pendant 15 minutes, répartition d u milieu à raiso n de 225 ml par falco falco n. pH fin fi nal après stérilisation à 25°C : 7,2 ± 0,1 Après refroidissement refroidissement à 50 o u 60°C, ajouter la solution TTC. TTC. Ajuster Ajuster si nécessaire nécessaire le pH à l’aide d’une d’une solution solutio n de carbona carbona te de sodiu sodi um (100g/l) ou d’hydroxyde d’hydroxyde de sodi um (40g/l) o u d’acide chlorhydriq chlorhydrique ue (36 (36,5g/l). ,5g/l). Les boites coulées peuvent être gardées a u ré ré frigérateur penda pendant nt 2 semaines. 4.

Gélose Gélose à la Bile, Bi le, à l’Esculine l’Esculine et à l’Azoture. Tryptone Tryptone Peptone Extrait de levure Bile de bœuf déshydratée Chlorure Chlorure de sodium (NaCl) Esculine Esculi ne Citrate d’ammoni d’ammoni um ferrique Azoture Azoture de sodium (NaN3) Agar – – Agar Eau

17,0 g 03,0 g 05,0 g 10,0 g 05,0 g 01,0 g 0,5 g 0,15 g 08 à 10 g 1000 ml

Stérilisation 121°C pendant 15 minut mi nutes, es, répartition du milieu à raison de 225 ml par falco falco n. pH fin fi nal après stérilisation à 25°C : 7,2 ± 0,1

21



Recherche et dénombrement des Entérocoques Entérocoques intestinaux. ntestinaux. Partie 2 : méthode méthode par p ar filtration sur membrane. membrane.

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Filtration de 250 ml d’eau

Eau à Analyser

Entonnoir Membrane Membrane 0,45µ

Pompe

Rampe de Filtration à 3 postes

Gélose SLANETZ et BARTLEY 36 ± 2°C, 2°C, 44 44 ± 4 heures heures (en cas de colo nies caractéristiques)

Gélose Bile, Esculine, Azoture. 44 ± 0,5°C, 2 he ures ures

Compter le le nombre nombre de colonies caractéristiques et le le rapporter rapporte r à 100 ou 250 m l d’eau à analyser.

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Recherche et dénombrement des Entérocoques intestinaux. Méthode générale par en ensemencem semencement ent en e n milieu liquide (NPP).

Code : MO.SGD.ML Version Version : 00 Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3

Sommaire : 1. 2. 3. 4. 5.

Objet Objet et domaine d’application. Définition. Référentiels. Mode opératoire. Lecture Lecture et interprétation.

1. Objet et domaine d ’application. ’application. Cette méthode de référence, consiste en la recherche et le dénombrement des entérocoques intestinaux ou Streptocoques du groupe « D » de la classification de Lance Field, ou encore Streptocoques fécaux dans les eaux destinées à la consommation consommation humaine, par filtration filt ration sur membrane.

2. Définition. Au sens de ce tte méth mét hode, on o n entend ente nd par entérocoqu e ntérocoques es intestinaux des bactéries qu q ui se présentent sous forme de cocci à Gram positive, sphériques ou ovoïdes formant des cha cha înettes înettes,, ne possédant pas de catalase cata lase mais possédant l’an l’a ntigène du d u groupe groupe D. Ils sont capables de se développer en 24 à 48 heures à 37°C sur un milieu sélectif à l’azoture de sodium en donnant des colonies caractéristiques réduisant le TTC et qui de plus hydrolysent l’esculine en 2 heures à 44°C après repiquage d’une colonie sur une une gél gé lose biliée à l’esculi l’esculin ne et à l’azoture. l’azoture.


Norme Norme NF T 90-411. 90 -411. Recherche Recherche et dénombrement des Strept S treptocoq ocoqu ues du groupe groupe D. Méthode Mét hode généra généra le par en e nsemencement en milieu liquide (NPP). Norme Norme ISO 7899- 2 et e t Norme NF T 90-416. 90 -416. Recherche et dénombrement des entérocoques entérocoques int i ntesti estin na ux. ux. Partie 2 méthode par filtration sur membrane. me mbrane. Norme Norme NF V 08 -051 : Dénombre Dénombre ment des Coliformes par comptage des colon colo nies, méthode de routi routin ne. Norme Norme NF V 08-017 : Dénombrement des Coliformes fécaux et d'Escherichia coli (annex (annexe e à NF V 08-015 e t NF V 08-016). Norme Norme NF IS O 7218 : Règles Règles générales générales pou po ur les examens microbiologiques. Norme Norme XP V 08-102 : Règles Règles généra généra les pou po ur le comptage des colon colo nies et l’ex l’expressio pression n des rés ultats : cas des dénombremen dénombrements ts en milieu solide. Norme Norme NF IS O 17025 : Prescriptio ns générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage et d’essais.

23


4. Mode opératoire. La recherche recherche et le dénombrement dénombrement des de s Streptocoques du groupe « D » dan da ns les eaux ea ux,, en milieu liquide liquide par la tec hnique hnique du NPP, se fait e n deux de ux é tapes consécutives consécutives :  le test de présomption : réservé à la recherche présompti présompti ve des Streptocoques.  le test de confirmation : réservé à la confirmation réelle des Streptocoques du groupe « D ». 

  

Test de présomption. A partir de l’eau à analyser, porter aseptiquement : 50 ml dans dans un flacon flaco n contenant 50 ml de milie u ROTHE ROTHE D/C. 5 fois 10 ml dans 5 tubes t ubes contenant 10 ml de milie u ROTHE D/C 5 fois 1 ml dans 5 tubes contenant 10 ml de mi lieu ROTHE S/C. Bien mélanger mélanger le milieu et l’inoculum. L’incubation L’incubation se fait à 37°C pendant 24 à 48 heures. Lecture :

-

Seront Seront con co nsidérés comme présomptifs p résomptifs les tubes présentant un troubl tro uble e microbien ; seulement seulement ces der niers : ne doiv doi vent en aucun cas faire l’objet de dénombrement doivent par contre, absolument faire l’objet d’un repiquage sur milieu LITSKY EVA dans dans le but d’être just d’être justement ement confirmés. Illus Illus tration : Inocul Inoculu um 1 X 50 ml 5 X 10 ml

5 X 1 ml

Test de présomption + + + + + -

24

– Institut Institut Pasteur d’Algéri d’Algér ie – Mai – Mai 2008 Cours d’Hygiène et de Microbiologie des Eaux Eaux – 

Test de confirmation.. Le test de confirmation est basé sur la confirmation des Streptocoques du groupe « D » év é ventuellement présents dans dans le test de présomption. Les tubes tubes de ROTHE trouvés positifs feront do nc l’objet l’objet d’ un repiquage à l’aide d’une d’une öse bouclée bouclée dans tube contenant le milieu LITSKY EVA. Bien méla méla nger le milieu et l’i noculum. L’incubation L’incubation se fait cette fois-ci fois -ci à 37°C, pen pe ndant 24 heures. Lecture : Seront Seront considérés comme positifs, positifs , les tubes prése ntant à la fois : trouble microbien, et  un trouble pastilllle e violette iole tte (blanchâtre) au fond des t ubes.  une pasti La lecture finale s’effectue également selon les prescriptions de la table du NPP qui figure figure en e n an a nnexe nexe . Illustration En reprenant l’exemple précédent relatif au test de présomption, cela suppose que no us avons 5 tu t ubes à repiquer à savoir :  2 tubes tubes sur 5 de ROTHE D/C, et  3 tubes tubes sur 5 de ROTHE S/C. Inoc Inoculum ulum

1 X 50 ml 5 X 10 ml

5 X 1 ml

Test de présomptio n + + + + + -

Test de confirmation Trouble Pastille Pasti lle violette

Nombre Nombre Caractéristique

0 + +

+ + 2

+ +

+ + -

1

Tableau Récapitulatif Le nombre nombre caracté caracté ristique relati relatiff a u dén dé nombrement des Streptocoques Streptocoq ues fécaux est donc « 021 », ce qui q ui correspond correspond sur la table du NPP au chiff c hiffre re 3. Le résulta résulta t final sera donc de :

3 Streptocoqu Streptocoques es fécaux dans 100 ml d’ eau à analy a nalyser ser

25



Recherche et dénombrement des Entérocoques intestinaux. Méthode générale par en ensemenceme semencement nt en e n milieu liquide (NPP).



Eau à Analyser

1 X 50 ml

ROTHE D/C

5 X 10 ml

ROTHE ROTHE D/C

5 X 1 ml

ROTHE S/C

37°C, 37° C, 24 à 48 heures heures

26


Mode opératoire opératoire / Enr E nregistrem egistrement ent Recherche et dénombrement des Streptocoques Streptocoques du group g roupe e D. Méthode générale par en ensemencem semencement ent en milieu liquide (NPP).

LOGO


Test de confirmation

Repiquage Repiquage su s ur milieu L ytski Ev E va (1 öse)

37°C, 24 heures he ures

0

+

+ 2

-

+

-

1

27



Recherche et dénombrement des Spores de bactéries anaérobies sulfitoréductrices réductrices et de Clo C lostridiu stridium m sulfitosulfitoréducteurs. Méthode par incorporation en gélos g élose e en tubes profonds. profonds.

Code : MO.ASR.MS Version Version : 00 Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3

Sommaire. 1. 2. 3. 4. 5.


1. Objet et domaine d ’application. ’application. Cette méthode méthode consiste en la recherche et le dé nombrement nombrement des spores des bactéries bac téries anaérobies sulfito-réductrices et de Clostridium sulfito-réducteurs dans les eaux destinées à la consommation humaine, par incorporation en gélose en tubes profonds.

2. Définition. Au sens sens de cette méthode, o n entend par bactéries anaérobies anaérobies sulfito- réductrices réductrices des bactéries qui se présentent sous forme de bacilles à Gram positif et qui en se développant à température de 36 ± 2°C en 24 à 48 heures en gélose profonde de type gélose Tryptose Sulfite Cyclosérine ou Tryptose Sulfite Néomycine ou encore gélose Viande Foie, donnent des colonies caractéristiques qui sont de couleur blanche entourées d’une auréole noire. Cette dernière est le témoin de la réduction du sulfite de sodium (Na 2SO3) qui se trouve dans le milieu, en sulfure qui en présence de Fe2+ qui donne FeS (sulfure de fer) de couleur noire. La présence de spores de bactéries ASR dans les eaux, sans flore d’accompagnement, constitue généralement un véritable indice de contamination ancienne.

3. Référentiels. 



   

Norme Norme NF T 90-415. Recherche et dénom dé nombrement brement des spores de bactéries bacté ries anaérobies anaérobies s ulfito-réd ulfito-rédu uctrices et de Clostridi Clostridium um sulfito-rédu sulfito- réducte cteur urs. s. Méthode générale générale par i ncorporation ncorporation en gélose e n tubes profonds. Norme Norme NF T 90-417. Recherche et dé nombrement des spores de microorganismes anaérobies sulfito-réducteurs sulfito-réducteurs et de Clostridiu Clostridi um. Partie.2 Méthode par filtration sur membra membra ne. Norme Norme ISO 6461 – 6461 – 2. Recherche et dénombrement des spores de micro organismes organismes anaérobies sulfito-réducteurs Clostridia. Clostridi a. Méthode Méthode par pa r filtration. Norme Norme NF IS O 7218 : Règles Règles générales générales pou po ur les examens microbiologiques. Norme Norme XP V 08 -102 : Règles gén gé nérales pour le comptage des colonies et l’expression l’expression des résulta résulta ts : cas des dénombrements dénombrements e n milieu mi lieu solide. Norme Norme NF IS O 17025 : Prescriptio ns générales co ncernant la compétence des laboratoires laboratoires d’étalonnage et d’essais. d’ essais. 28


4. Mode opératoire. A partir de l’eau à analyser : analyser : 

Transférer environ 25 ml dans un tube stérile, qui sera par la suite soumis à un chauffage de l’ordre de 75°C pendant 15 minutes, dans le but de détruire toutes les formes végétatives des bactéries anaérobies sulfito-réd uctrices é ventuellement présentes. Un autre flacon rempli d’une autre eau servira de témoin de température.



Après chauffage, refroidir immédiatement le flacon destiné à l’analyse l’ analyse,, sous l’eau de robinet.



Répartir ensuite le contenu de ce tube, dans 4 tubes différents et stériles, à raison de 5 ml par tube. t ube.



Ajouter environ 18 à 20 ml de gélose Tryptose Sulfite Cyclosérine ou Tryptose Sulfite Néomycine ou encore gélose Viande Foie, fondue puis refroidie à 47  1°C, additionnée additionnée de leurs additifs additi fs spécifiques. spécifiques.



Mélanger doucement le milieu et l’inoculum en évitant d’introduire des bulles d’air et de l’oxygène. l’ oxygène.



Laisser solidifier sur sur paill pai llasse asse pendant 30 mi nutes nutes e nviron, nviron, puis incuber à : o o

44  4°C, pendant 20  4 heures, heures, dans le cas de la gélose gé lose TSC ou TS TS N. 36  2°C, pendant 44  4 heures, dans le cas de la gélose Viande Foie.

5. Lecture et interprétation. 



La première lecture doit absolument être faite à 16 heures car très souvent les spores des bactéries anaérobies sulfito-réductrices sont e nvahissantes nvahissantes auquel cas on se trouvera en face d’un tube complètement noir rendant ainsi l’interprétation difficile voire impossible et l’analyse sera à refaire en utilisant des di lutions -1 -2 décimales de 10 voire 10 , la deuxième lecture lecture se fera fera à 24 heures et la troisième et dernière à 44  4 heures. Dénombrer toute colonie noire de 0,5 mm de diamètre, ayant poussé en masse et rapporter le nombre total des colonies dans les quatr e tubes à 20 ml d’eau à analyser.

29


Identification de ntification bioc himique. himique. Certains auteurs préconisent l’identification biochimique de toute colonie suspecte car très souvent il y a développement de colonies de Staphylocoques et de Bacillus à côté, q u’on prendrait prendrait à tord pour des colo nies d’anaérobies d ’anaérobies sulfito-réductrices. sulfito-réductrices. Pour cela il s’agit de casser le tube à l’aide d’une lime métallique à 1 cm au dessus de la colo colo nie su s uspecte et de prendre exactement le centre de la dite colonie. Le centre de la colonie noire suspecte (qui est en réalité blanche mais entourée d’une auréole auréole noire) sera alors déposé soigneuseme soigneuseme nt dans un tube co co ntena ntena nt du bouillon bouillon T G Y ou T Y préalablemen préalablementt régénéré régénéré à 80°C pendant 15 mi mi nutes. nutes. Placer ensuite ce tube dans un agitateur (Vortex) pour bien mélanger la colonie dans le milieu puis l’incuber l’incuber à 36 3 6  2°C en anaérobiose pendant 24 à 48 he ures. Après la période d’in d’i ncubation, cubation, constater le tr ouble ouble du milieu, puis réaliser les étapes suivantes : 

Etat frais.



Coloration de Gram.



S’il S’ il s’agit de bacilles baci lles Gram positifs, posi tifs, faire un isolement iso lement s ur deux boites boi tes de au san sa ng de mo uton frais : o l’une l’une sera i nc ubée à 36  2°C en aérobiose, o l’autre sera incubée à 36 36  2°C e n a naérobiose.

gélose

Après 24 à 48 heures heures d’incubation : o o o o o

o

sélectionner sélectionner les boites bo ites ay a yant poussé strictement en anaérobiose, noter le type d’hém d’ hémol oly yse, faire une une coloration colora tion de Gram puis une réaction catalase, catalase, s’assurer s’assurer qu’il s’agit s’agi t bien d’une souche pure, sinon purifier, puis puis en e nsemencer une Galerie biochimique Api 20 A à incuber à 36  2°C en anaérobiose. Lecture Lecture et ident i dentificatio ificatio n.

30



Recherche et dénombrement des Spores de bactéries anaérobies sulfitoréductrices réductrices et de Clo C lostridiu stridium m sulfitosulfitoréducteurs. Méthode par incorporation en gélos g élose e en tubes profonds. profonds.


Eau à Analyser

25 ml d’eau d’eau à analy a nalyser ser

Chauffage Chauffage à 75°C, 15 minutes Refroidissement Refroidissement brutal sous l’ea u de robinet Répartir Répartir à raison raiso n de 5 ml par t ube dans 4 tu t ubes

Ajouter Ajouter environ 18 ml de gélose TSC, TSN ou VF fond fond ue puis refroidie à 47  2 °C Laisser solidifier puis incuber incuber selo n protocole

3

+ 3 + 2 + Soit 12 Spores d’ASR dans 20 ml

4 31



Recherche et dénombrement des Spores de bactéries anaérobies sulfitoréductrices. réductrices. Méth Mé thode ode par filtra filtratio tion. n.


Sommaire. 1. 2. 3. 4. 5.

1.


Objet et domaine d ’application. ’application. Cette méthode méthode consiste en la recherche et le dé nombrement des spores des bactéries anaérobies sulfito-réductrices et de Clostridium sulfito-réducteurs dans les eaux destinées à la consommation humaine, par incorporation en gélose en tubes profonds.

2.

Définition. Au sens sens de cette méthode, o n entend par bactéries anaérobies anaérobies sulfito- réductrices réductrices des bactéries qui se présentent sous forme de bacilles à Gram positif et qui en se développant à température de 36 ± 2°C en 24 à 48 heures en gélose profonde de type gélose Tryptose Sulfite Cyclosérine ou Tryptose Sulfite Néomycine ou encore gélose Viande Foie, donnent des colonies caractéristiques qui sont de couleur blanche entourées d’une auréole noire. Cette dernière est le témoin de la réduction du sulfite de sodium (Na 2SO3) qui se trouve dans le milieu, en sulfure qui en présence de Fe2+ qui donne FeS (sulfure de fer) de couleur noire. La présence de spores de bactéries ASR dans les eaux, sans flore d’accompagnement, constitue généralement un véritable indice de contamination ancienne.

3.

Référentiels.  



  

Norme Norme ISO 6461 – 6461 – 2. Recherche et dénombrement des spores de micro organismes organismes anaérobies sulfito-réducteurs Clostridia. Clostridi a. Méthode Méthode par pa r filtration. Norme Norme NF T 90-415. Recherche et dénom dé nombrement brement des spores de bactéries anaérobies anaérobies s ulfito-réductrices et de Clostridi Clostridium um sulfito-rédu sulfito- réducte cteur urs. s. Méthode générale générale par i ncorporation ncorporation en gélose e n tubes profonds. Norme Norme NF T 90-417. Recherche et dénom dé nombrement brement des spores de microorganismes anaérobies anaérobies sulfito-réduct s ulfito-réducte e urs et de Clostridi um. Partie.2 Méthode par filtration sur membra membra ne. Norme Norme NF IS O 7218 : Règles Règles générales générales pou po ur les examens microbiologiques. Norme Norme XP V 08 -102 : Règles gén gé nérales pour le comptage des colonies et l’expression l’expression des résulta résulta ts : cas des dénombrements dénombrements e n milieu mi lieu solide. Norme Norme NF IS O 17025 : Prescriptio ns générales concernant la compétence des laboratoires laboratoires d’étalonnage et d’essais. d’ essais. 32


4. Mode opératoire . La recherche des spores des bactéries anaérobies sulfito-réductrices par filtration sur membrane nécessite une préparation au préalable, qui se déroule selon les étapes suivantes :  Tout d’abord, il i l faudrait stériliser l’entonn l’entonnoir oir gradué gradué en acier i noxydable noxydable ain ai nsi que la membrane membrane poreuse à l’aide l’ai de d’un bec b unsen. unsen. Les refroidi refroidirr tout de suite après, avec avec l’eau l’ea u à analyser si analyser si on en dispose en quantité  suffisante ou bien a vec de l’eau distillée stérile. Mettre Mettre e n p lace de façon façon aseptique une membrane de porosité nominale de 0,2 µ  entre la membrane poreuse poreuse et l’entonnoir à l’aide d’une d’une pinc pi nce e stérile. Fixer ce dispositif avec la pi nce nce correspondante correspondante .  Déposer ensuite aseptiquement 100 ml, de va nt un bec bunsen.  Actionne Actionne r ensuite la pompe à vide pour absorber l’eau absorber l’eau à travers la membrane.  Retirer Retirer l’entonnoir, enle ver la membrane à l’aide l’aide de pinces stériles puis la placer  dans dans une une boite de façon faço n à ce q ue la face quadrillée adhère au fond de la boite tout en évitant les bulles d’air sous le filtre.  Verser par la suite environ 18 ml de gé lose TSC, TS TS N ou à défaut gélose VF, fondue puis refroidie à 47 ± 1°C. Remarque : si on utilise de la gélose VF, il faudrait au préalable chauffer l’eau à une une température de 75°C pendant 15 minutes dans le but d’éliminer les formes végétatives. 

Après solidification sur paillasse, cette boite sera incubée couvercle couvercle en e n bas à 36 ± 2°C pendant 20 ± 4 heures puis 44 ± 4 he ures.

5. Lecture et interprétation Compter les colonies caractéristiques noires aussi bien après la première période d’incubation soit après 20 ± 4 heures heures qu’après la seconde période d’incubation soit après 44 ± 4 heures. Rapporter Rapporter le no mbre total de colonies à 100 m l d’eau à analyser.

33



Recherche et dénombrement des Spores de bactéries anaérobies sulfitoréductrices. réductrices. Méth Mé thode ode par filtra filtratio tion. n.



Eau à Analyser


Pompe


Déposer la membrane filtran filtrante te 0,2 µ, face quadrillée quadri llée sur le fond de la boite boi te Ajouter environ 18 ml de Gélose TSC, TSN ou VF Laisser solidifier sur paillasse Incuber à 36 ± 2 °C, 20 ± 4 h puis 44 ± 4 heures (en cas de colonies caractéristiques)

Compter le nombre nombre de colonies colo nies caractéristiques et le rapporter à 100 ml d’eau à analyser.

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Recherche et Salmonella dans les eaux. eau x. Méthode Méthode par filtra filtratio tion. n.

Code : MO.SL.MS Version Version : 00 Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3

Sommaire. 1. 2. 3. 4. 5.


’application. 1. Objet et domaine d ’application. Cette méthode consiste en la recherche et l’identification l’identification des Salmonella présentes dans dans les eaux ea ux destinées à la cons co nso o mmatio mmatio n humai humaine, ne, par filtration.

2. Définition. Au sens sens de cette méthode méthode,, on entend par Salmonella, des bactéries qui se présentent présentent sous forme de bacilles à Gram négatif et qui en se développant à température de 36 ± 2°C en 24 à 48 heures, sur milieu Hektoen, forment de petites colonies, lisses à contours contours réguliers, pigment pigme ntées ées en vert ou o u e n bleu vert à centre ce ntre noir. Les Salmonella se divisent di visent e n deux grands gra nds groupes groupes : les mineures mi neures et les maje majeures ures qui sont sont hautement hautement pathogènes pat hogènes (voir (voir cours). co urs).

3. Référentiels.  

    

Norme NF EN ISO 9308 – 9308 – 1 : Recherche et dén dé nombremen ombreme nt des Escherichia coli et des bactéries Coliformes partie 1. Méth Mét hode par filtration fil tration sur membrane. Norme Norme NF T90-413 T90-413 : Recherche et dén dé nombreme ombreme nt des coliformes et des coliformes thermo tolérants. Méthode générale par e nsemencement nsemencement en milieu liquide (NPP). Norme Norme NF V 08 -051 : Dénombre Dénombre ment des Coliformes par comptage des colonies, méthode de routin routi ne. Norme Norme NF V 08 -017 : Dénombre Dénombre ment des Coliformes fécaux et d'Escherichia coli (anne (anne xe à NF V 08-015 et NF V 08-016). 08 -016). Norme Norme NF IS O 7218 : Règles Règles générales pou po ur les examens microbiologiques. microbiologiques. Norme Norme XP V 08-102 : Règles Règles généra généra les pou po ur le co co mptage des co co lonies et l’expression des rés ultats ultats : cas des dén dé nombremen ombreme nts en milie u solide. solide. Norme Norme NF IS O 17025 : Prescriptio ns générales concernant la compétence des laboratoires laboratoires d’éta lonnage lonnage et e t d’essais.

35


4.

Mode opératoire. La recherche des Salmonella par filtration sur membrane nécessite une préparation au préalable, qui q ui se déroule selon les étapes suiv sui vantes : Tout d’abord, il i l fau fa udrait stériliser l’entonn l’entonnoir oir gradué en acier i noxydable noxydable ain ai nsi que la  membrane poreuse à l’aide d’un d’un bec bunsen. Les refroidir tout de suite après, avec l’eau à analyser si on en dispose en  qua qua ntité s uffisante ou bien avec de l’eau distillée stérile. Mettre en place de façon aseptique une membrane de 0,45 µ entre la membrane  poreuse poreuse et l’entonnoir l’entonnoir à l’aide d’une pi nce nce stérile.  Fixer ce dispositif la pince correspondante. Déposer ensuite 250 ml, 500 ml ou plus selon disponibilité jusqu’à 1 voire 5 litres  d’eau à analyser, devant un bec bunsen. Actionne Actionne r ensuite la pompe à vide pour absorber l’eau absorber l’eau à travers la membrane.  Retirer la membrane à l’aide d’une pince stérile puis la placer dans un flacon  contenant contenant le milieu Eau E au Peptonée Tamponnée Tamponnée.. Bien mélanger le filtre dans le milieu, puis incuber ce dernier à 36 ± 2°C pendant  20 ± 2 heures. Cette étape constitue l’enrichissement primaire. Après incubatio incubation, n, procéder à un e nrichissem ric hissement ent secondaire en transférant transférant 1 ml de  l’enric l’enrich hissement primaire sur le mi mi lieu Rappapport Vassiliadis. Bien mélanger le milieu et l’inoculum, puis incuber ce dernier dernier à 42 ± 0,5°C pendant  20 ± 4 heures voire 44 ± 4 he ures ures.. l’incubation, n, procéder à l’isolement s ur milie u Hektoen ou XLD à incuber à  Après l’incubatio 36 ± 2°C pendant 20 ± 2 he ures.

5. Lecture et interprétation. Repérer les colonies caractér ca ractéristiq istiqu ues. Faire une identification biochimique basée essentiellement sur ONPG, TSI, Urée  Indole, LDC… Si nécessaire faire une identification antigénique basée essentiellement sur  l’agglutination à l’aide des sérums de groupe OMA et OMB ou bien s’adresser à un laboratoire laboratoire compét compé tent en vue d’une confirmation. 

Remarque : Au cas où la q ua ntité d’eau à a nalyser n’est pas très suffisante, transférer 10 ml directement sur Milieu Eau Peptonée Tamponnée à incuber à 36 ± 2°C pendant 20 ± 2 heures. Cette étape constitue l’enrichissement l’enrichissement primaire.  Poursuivre Poursuivre les autres autres étapes comme co mme décrit décrit ci -dessus. -dessus. 

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Mode opératoire opératoire / Enr E nregistrem egistrement ent Recherche et Salmonella dans les eaux. eau x. Méthode Méthode par filtra filtratio tion. n.

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Code : MO.SL.MS Version Version : 00 Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3

Filtration de 250 ml à 5 litres d’eau

Eau à Analyser

Entonnoir Membra Membra ne 0,45µ

Rampe Rampe de

Filtration Pompe

à 3 postes

Eau Pep Tamp 36 ± 2°C 2°C pendant pe ndant 20 ± 2 heures h eures

1 ml

M ilieu ilieu RV 42 ± 0,5° 0 ,5°C pendant pend ant 20 ± 4 heures voire 44 ± 4 heures. Gélose Hektoen ou XLD

36 ± 2° 2 °C pendant pend ant 20 ± 2 heures. heu res. ONPG, TSI, Urée Indole, LDC, LDC , Agglutination Agglutination (OMA, OMB O MB …) 37



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Code : MO.VC.ML Version Version : 00 Recherche Recherche de Vibrion cholérique cholérique dans les eau e aux. x. Métho M éthode de en milieu liquide. Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3

Sommaire. 1. 2. 3. 4. 5.


1. Objet et domaine d’application. Cette méthode consiste en la recherche et l’identification l’identification des Vibrionacae présents dans dans les eaux ea ux destin desti nées à la cons co nso o mmatio mmatio n humai humaine, ne, e n milieu liquide.

2. Définition. Au sens sens de cette méthode, on entend par les Vibrionacae, des bactéries qui se présentent sous forme de Bacilles à Gram Négatifs droits ou incurvés (BGN), très mobiles, possédant une oxydase, aéro-anaérobies facultatifs, fermentant le glucose sans sans production de gaz ni d'H2S, hautement pathogènes. (Voir cours).

3. Référentiels.    

Norme Norme ISO / TS 21 872-1. Recherche de Vibrions Vi brions pathogè pathogèn nes par voie digesti ve. Vibrion paraheamolyticus , autres vibrions. Norme Norme NF IS O 7218 : Règles Règles générales pou po ur les examens microbiologiques. microbiologiques. Norme Norme XP V 08-102 : Règles Règles généra généra les pou po ur le comptage des colon colo nies et l’expression des rés ultats ultats : cas des dén dé nombremen ombreme nts en milie u solide. solide. Norme Norme NF IS O 17025 : Prescriptio ns générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage et d’essais.

4. Mode opératoire. Jour Jour 1. E nrichissem ric hissement ent primaire. primaire . L’enrichissement primaire s’effectue sur le milieu Eau Peptonée Alcaline 10 fois concentré contenant 50 ml de milieu, auquel on ajoute aseptiquement 4 50 ml d’eau à analyser analyser au a u point et au moment mome nt du prélèvement. prélèvement. Ce dernier dernier sera par la suite i ncubé ncubé à 36 ± 2°C pendant 20 ± 4 heures. Jour Jour 2. E nrichissem ric hissement ent secondaire et Isolemen soleme nt. Après incubation, incubation, le flacon constituant l’enrichissement p rimaire fera l’objet : d’une d’une part, d’un e nrichissement secondaire sur milieu EPA en tu t ube auquel a uquel o n  ajoute ajoute 1 m l par tube. d’autre d’autre part, d’un d’ un isolement sur gélose GNAB 1.  Dans les les deux cas, l’in l’i nc ubation batio n se fait à 36 ± 2°C pendant 20 ± 4 heures. 38


Jour Jour 3. Lecture Lec ture des boites et Ide Ident ntification. ification.  D’une D’une part, le tube d’EPA fera l’objet d’un d’ un isolement sur GNAB G NAB 2 qui sera i ncubé ncubé à son tour à 36 ± 2°C pen pe ndan da nt 20 ± 4 he ures ures..  D’autre part, la boite de gélose GNAB 1 subi ra une lecture en tenant compte du fait que les Vibrions se présentent le plus souvent sous forme de grosses colonies lisses, transpare transpare ntes et très très caractéristiq caractéristiq ues. Identification de ntification morphologique morphologique et bioc himique. Cinq colonies caractéristiques et distinctes distinct es feront l’objet d’une identification morpho morpho logique logique et e t biochimiq biochimiq ue basée essen esse ntiellement su s ur : Etat frais (bacilles, mobilité),  Coloration de Gram (bacilles Gram négatifs), négatifs),  Oxydase Oxydase (+),  Enseme Enseme ncement ncement d’un tu t ube de KI K IA qui q ui sera incubé à 37°C, 24 h  (Saccharose, (Saccharose, Glu Gl ucose, Gaz et H2S), Ensemencement d’un tube de gélose nutritive inclinée qui sera incubé à 36 ± 2°C  pendant pendant 20 ± 4 he ures. q ui ser vira à l’aggluti l’aggluti nation atio n sur lame, comme s uit : 

Si l'agglutination avec l'eau physiologique et au sérum polyvalent O1 est négative, faire une mini-galerie biochimique basée sur l'étude des acides aminés en vue de différencier les Vibrions, des Pleisiomonas et des Aéromonas selon le tableau suivant :

Vibrions Aéromonas Aéromonas Pleisiomonas

LDC + +

ODC + +

ADH + +

S'il s'agit du genr ge nre e Vibrion, répo ndre : Vibrion Vi brion NON Agglu Aggl utinabl ti nable e (NAG). 

Si l'agglutination avec l'eau physiologique et au sérum polyvalent O1 est positive, il s'agit d'un vibrion rough (a uto agglutin aggluti nable).



Si l'agglutination avec l'eau physiologique est négative et positive au sérum polyvale polyvalen nt O1, répo ndre : Vibrion Vi brion cholérique cholérique .

39



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Code : MO.VC.ML Version Version : 00 Recherche Recherche de Vibrion cholérique cholérique dans les eau e aux. x. Métho M éthode de en milieu liquide. Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3

Eau à Analyser

450 ml

Bouillon EPA 10X [ ]

36 ± 2°C pendant pe ndant 20 ± 4 he ures. 1 ml Deuxième e nrich ric hissement

Isolem so leme e nt sur GNAB 1

36 ± 2°C pendant pe ndant 20 ± 4 he ures. Oxydase Gram Etat frais KIA KIA LDC, ODC, ADH GN in i nclinée Aggluti Agglutin nation atio n

GNAB 2 36 ± 2°C pendant pen dant 20 ± 4 h

Suite Idem 40



Recherche Recherche de Staphylocoques Staphylocoques à coagulase positive dans les eaux destinées à la consommation humaine. Méthode par filtration sur membrane.

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Sommaire. 1. 2. 3. 4. 5.

Objet Objet et domaine d’application Définition. Référentiels. Mode opératoire. Lecture Lecture et interprétation

1. Objet et domaine d ’application. ’application. Cette méthode de référence, consiste en la recherche et le dénombrement des Staphylocoques à coagulase positive dans les eaux destinées à la consommation humai humaine, ne, par filtration fi ltration sur me mbrane.

2. Définition. Au sens sens de cette méthode, o n entend entend par Staphylocoques à coagulase coagulase positive, bactéries qui se présentent sous forme de cocci à Gram positive, sphériques, isolées ou regroupées formant ainsi des grappes de raisin, possédant l’enzyme catalase et la coagulase. Ils sont capables de se développer en 24 à 48 heures à 36 ± 2°C sur un milieu sélectif Chapman au mannitol. L’espèce type type du genre est Staphylococcus aureus , elle est pathogène et la plus redoutée.

3. Référentiels. 

  

Norme Norme NF T 90 421. Recherche et dénombrement dénombrement des Staphylocoques Staphylocoques à coagulase positive dans les eaux destinées à la consomma consomma tion humaine. Méthode par filtration. Norme Norme NF IS O 7218 : Règles Règles générales générales pou po ur les examens microbiologiques. Norme Norme XP V 08-102 : Règles Règles généra généra les pou po ur le comptage des colon colo nies et l’expression l’expression des résulta résulta ts : cas des dénombrements dénombrements e n milieu mi lieu solide. Norme Norme NF IS O 17025 : Prescriptio ns gén gé nérales concernant la compétence des laboratoires laboratoires d’étalonn d’éta lonnage age et e t d’essais.

41


4.

Mode opératoire. La recherche des Staphylocoques à coagulase positive ou plus particulièrement Staphylococcus aureus , par filtration sur membrane nécessite une préparation au préalable, préalable, q ui se déroule déroule selon selo n les étapes suiva suiva ntes :  Tout d’abord, il i l faudrait stériliser l’entonn l’entonnoir oir gradué en acier i noxydable noxydable ain ai nsi que la membrane poreuse à l’aide d’un bec bunsen. Les refroidir tout de suite après, avec l’eau à analyser si analyser si on en dispose en quantité  suffisante o u bien av a vec de l’eau distillée stérile.  Mettre en place de façon aseptique une membrane de porosité nominale de 0,45 µ entre entre la membrane pore use et l’e ntonnoir à l’ai de d’une pince pince stéri le. Fixer ce dispositif avec la pi nce nce correspondante correspondante .  Déposer ensuite aseptiquement 100 ou 250 ml d’eau à analyser, selon les types  d’eaux à analyser, analyser, de va nt un bec bunsen. Actionne Actionne r ensuite la pompe à vide pour absorber l’eau absorber l’eau à travers la membrane.  Retirer Retirer l’en l’e ntonnoir puis transférer tra nsférer immédiatement et aseptiqu aseptiq uement la membrane à  l’aide d’une pince à bouts arrondis stérile, à la surface d’une plaque de gélose Chapman Chapman au a u mannito mannitoll préalablement préparée. Cette dernière sera incubée couvercle couvercle en e n bas à 36 ± 2 °C penda pendant nt 44 ± 4 heures. heures. 

5.

Lecture et interprétation Après la période d’in d’i ncuba cubation tion spécifiée, spécifi ée, les Staphylocoques à coagulase positive ou plus particulièrement Staphylococcus aureus , apparaissent sous forme de petites colonies lisses légèrement bombées à contours réguliers et pigmentées en soit en jaune jaune ( fermentation d u mannitol) ou en blanc. Prendre 3 à 5 colonies au hasard, une demi colonie servira au test à la catalase, l’autre demi demi sera triturer dans dans un tube contena contenant nt d u bouillo n BHI BH IB, à incuber à 36 ± 2°C penda pendan nt 20 ± 4 he ures. Staphylococcus aureus , aureus , possède ces deux enzymes. enz ymes. Test Test à la catalase. Placer séparément deux gouttes d’une solution de peroxyde d’hydrogène à 20 volumes sur une lame de microscope. Prélever une demi colonie avec une tige de verre (pipette Pasteur) ou en plastique (surtout pas de fil métallique) et l’émulsionner doucement doucement dans une une des de ux gouttes. Observer immédiatement et après 5 minutes s’il y a appar ition ition (catalase positive) ou absence (catalase négative) de bulles d’oxygène. Dans le cas où il y a doute, recouvrir chacune des gouttes avec lamelle de microscope et comparer l’apparition des bulles sous les deux lamelles. Les observations peuvent se faire macroscopiquement macroscopiquement ou à l’aide d’u d’ un microscope à faible grossissement. Test Test à la coagulase libre. Après incubation incubation du bouillon BHIB BHIB , ajouter stérilement stérilement 0,1 ml de cette culture culture à 0,3 ml de plasma de lapin contenu dans da ns un tube stérile à hémolyse, hémol yse, et inc i ncuber uber de no no uveau à 36 ± 2°C pendant 2 à 6 he ures. Examiner la coagulation du plasma de lapin sinon ré-incuber et examiner de nouveau à 20 ± 4 heures. Considérer que la réaction à la coagulase est positive quand le coagulum occupe plus des trois quart du d u volume volume i nitialement nitialement occupé par le liquide. liquide. 42


Le tableau suivant résu rés ume qu q uelques caractères bioch bi ochimiques imiques de différentes espèces de Staphylocoques Staphylocoques.. Staphylocoque Staphylocoque Catalase Catalase Coagulase Coagulase Mannito Mannitoll en anaérobie Résistance à la Novobiocine (5 Micro-gr )

aureus aureus + + +

S

intermedi intermediu us + + -

S

saprophytic saprophyticu us + -

epidermitis + -

R

S

Coagulase

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Recherche Recherche de Staphylo S taphylocoque coques sà coagulase positive dans les eaux destinées à la consommation humaine. Méthode par filtration filtration sur membrane. membrane.

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Eau à Analyser


Pompe


Gélose Chapman au mannitol Incuber à 36 ± 2°C, 20 ± 4 h puis 44 ± 4 heures Distinguer les colonies caractéristiques

Catalase

Coagulase

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Recherche de d e Pseudomonas aeruginosa aeruginosa dans les le s eaux destinées destinées à la consommation humaine. Méthode par filtra filtration tion sur membrane. membrane.

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Sommaire. 1. 2. 3. 4. 5.

Objet Objet et domaine d’application. d’application. Définition. Référentiels. Mode opératoire. Lecture Lecture et interprétation

1. Objet et domaine d’application. Cette méthode de référence, consiste en la recherche Pseudomonas aeruginosa dans les eaux desti desti nées à la con co nsommation humaine, humaine, par filtrat fil tratio ion n sur membra ne.

2. Définition. Au sens sens de cette méthode, o n entend par Pseudomonas aeruginosa, une bactérie qui se présente sous forme de bacille à Gram négatif possédant l’enzyme oxydase et capable de produire de l’ammoniac à partir par tir de l’acétamide. Pseudomonas aeruginosa, est également une bactérie hautement pathogène et résistante résistante à p lusieurs lusieurs a ntibi ntibiotiqu otiques. es. (Voir cour co urs). s).

3. Référentiels.    

Norme Norme NF EN 12780. Détection et déno déno mbrement mbrement de Pseudomonas aeruginosa dans les eaux desti desti nées à la cons co nso o mmatio mmation n humai humain ne. Méthode par filtrat fil tratio ion. n. Norme Norme NF IS O 7218 : Règles Règles générales pou po ur les examens microbiologiques. microbiologiques. Norme Norme XP V 08 -102 : Règles gén gé nérales pour le comptage des colonies et l’expression des rés ultats ultats : cas des dén dé nombremen ombreme nts en milie u solide. solide. Norme Norme NF IS O 17025 : Prescriptio ns générales concernant la compétence des laboratoires laboratoires d’étalonnage et d’essais. d’ essais.

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4. Mode opératoire. La recherche de Pseudomonas aeruginosa par filtration sur membrane nécessite une préparation a u préalable, qui se déroul déro ule e selon selo n les étapes étapes suiv sui va ntes : Tout d’abord, il i l faudrait stériliser l’entonn l’entonnoir oir gradué en acier i noxydable noxydable ai nsi nsi que la  membrane poreuse à l’aide d’un bec bunsen. Les refroidir tout de suite après, avec l’eau à analyser si analyser si on en dispose en quantité  suffisante o u bien av a vec de l’eau distillée stérile. Mettre en place de façon aseptique une membrane de porosité nominale de 0,45 µ  entre entre la membrane pore use et l’e ntonnoir à l’ai de d’une pince pince stéri le. Fixer ce dispositif avec la pi nce nce correspondante correspondante .  Déposer ensuite aseptiquement 100 ou 250 ml d’eau à analyser, selon les types  d’eaux à analyser, analyser, dev de va nt un bec bunsen. bunsen . Actionne Actionne r ensuite la pompe à vide pour absorber l’eau absorber l’eau à travers la membrane.  Retirer Retirer l’en l’e ntonnoir puis transférer tra nsférer immédiatement et aseptiqu aseptiq uement la membrane à  l’aide d’une pince à bouts arrondis stérile, à la surface d’une plaque de gélose au Cétrémide préalablement préalablement préparée .  Cette dernière sera incubée couvercle couvercle en e n bas à 36 ± 2 °C penda pendant nt 44 ± 4 heures. heures.

5. Lecture et interprétation Après la la période d’incubation d’incubation spécifiée : les colo colo nies pigmentées pi gmentées en ble u vert vert do nc productrices productrices de p yocy oc ya ni ne son so nt  considérées d’emblée comme des colonies de Pseudomonas aeruginosa : compter le nombre de colonies. co lonies. 

Les colonies qui présentent une fluorescence fluorescence so us UV, nécessitent une confirmation confirmation bi ochimique ochimique basée essentiellement essentiellement su s ur un repiquage sur bouillon à l’acétamide l’acétamide qui sera in i ncubé à 36 ± 2 °C pendant pendant 20 ± 4 heures. Après incubation, la production d’ammoniac à partir du bou bo uillon à l’acétamide, après avoir ajouter une à deux gouttes du réactif de Nessler est caractérisée par une décoloration du jaune au rouge brique, et est en faveur de Pseudomonas aeruginosa : compter le nombre de colonies.



Les colonies présentant une pigmentat pi gmentation ion br un rougeâ rougeâtre tre sans fluorescence, fluorescence, nécessitent également une confirmation biochimique basée d’abord et avant tout sur sur l’oxydase l’oxydase.. Les colonies o xydase xydase positives seront ensuite repiquées d’une part, sur bouillon à l’acétamide qui sera incubé à 36 ± 2°C pendant 20 ± 4 heures et d’autre d’autre part pa rt,, sur milieu King B. Après incubation incubation : o La production d’ammoniac à partir du bouillon à l’acétamide, après avoir ajout a jouter er une à deux gou go uttes du réacti réactiff de Nessler Nessler est caractérisée par une une décoloration du jaune au rouge brique, et est en faveur de Pseudomonas aeruginosa : compter le nombre de colonies. o

L’apparition d’une fluorescence sur milieu milieu King B exposé aux UV (360 nm) est en faveur de Pseudomonas aeruginosa : à compter.

46


6. Expression des résultats. Le nombre total de colo nies de Pseudomonas aeruginosa N, présent dans le volume d’eau à analyser analyser (100 ou o u 250 ml) est calcul ca lculé é par p ar l’équation l’équation mathématique suivante :

N = P + F (cF / nF) + R (cR / nR)

Où : colo nies bleu b leu vert (pyocya (pyocya nine), ine) , caractéristiques de P : Nombre total de colo

Pseudomonas aeruginosa.

F : Nombre total de colon colo nies fl uorescentes. uorescentes. Nombre de colonies fluoresc f luoresce e ntes ntes testées pour la production d’acétamide. nF : Nombre cF : Nombre Nombre de colonies f luoresce luoresce ntes positives pour la production d’acétamide. R : Nombre total de colonies colo nies pigmentées e n Brun-ro Bru n-rougeât ugeâtre re nR : Nombre de colonies Brun-rou Brun- rougeâtre geâtre testées pour la production d’acétamide, d’oxydase et de f luorescenc luorescence e sur milieu Kin Ki ng B. Brun- rougeâtre geâtre positives pour la production d’acétamide, cR : Nombre de colonies Brun-rou d’oxydase et de f luorescenc luorescence e sur milieu Kin Ki ng B.

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Recherche de d e Pseudomonas aeruginosa aeruginosa dans les eaux destinées destinées à la consommation humaine. Méthode par filtra filtration tion sur membrane. membrane.

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Filtration de 100 ou o u 250 ml d’eau

Eau à Analyser


Pompe


Gélose au Cétrémide 36 ± 2°C, 20 ± 4 h puis 44 ± 4 heures

Colonies Bleu Vert (à compter)

Colonies F luorescentes

Colonies Brun-rougeâtre Brun -rougeâtre Oxydase (+)

King B Bouillon à l ’acétamide 36 ± 2°C, 2°C, 20 ± 4 h puis 20 ± 4 heures 48


Table NPP 1 X 50 ml

5 X 10 ml

5 X 1 ml

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 4 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5

0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 0 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5

Nombre Limites de confiance caractéristique Inférieure Supérieure <1 1 2 1 2 3 2 3 4 3 5 5 1 3 4 6 3 5 7 9 5 7 10 12 8 11 14 18 21 13 17 22 28 35 43 24 35 54 92 160 >240

<0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 1 2 <0,5 1 3 3 2 3 4 5 6 4 5 7 9 12 15 8 12 18 27 39

4 6 4 6 8 6 8 11 8 13 13 4 8 11 15 8 13 17 21 13 17 23 28 19 26 34 53 66 31 47 59 85 100 120 75 100 140 220 450

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SOMMAIRE Anal Analyse yse des Boissons Boissons Intitulé

Codificat Codificatiion

Version

Date

Reche Reche rche et Dénombre Dénombre ment des Microorganismes Microorganismes revivifiables. Mé thode thode par comptage des colonies colo nies obtenues à 30°C, dans dans les boi ssons. ssons. Reche Reche rche et Dénombre Dénombre ment des Levures et Moisissures dans les boissons. Mé Mé thode par comptage des colonies.

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Mode opératoire opératoire / Enregi E nregistrement strement Recherche Recherche et déno dénombrement mbrement des M icroo icroorganis rganismes. mes. M éthode éthode par comptage comptage des colonies obt ob tenues à 30°C, 30°C, dans les boissons.

Code : MO.M MO.MR. R. BS BS Version : 00 Date : 02 / 1 / 06 Page : 1 / 3

Sommaire : 1. 2. 3. 4. 5.


’application. 1. Objet et domaine d ’application. Cette méthode consiste en la recherche et le dénombrement des microorganismes revivifiables dans les boissons et boissons gazeuses destinées à la consommation humai humaine ne par co co mptage des colonies à 30°C.

2. Définition. Dans le sens de cette méthode, on entend par microorganismes revivifiables : Bactéries, Levures, Moisissures se développant en aérobiose, lorsque l’essai est effectué effectué selon selo n la méthode spécifiée.

3. Référentiels. Norme Norme NF V 08 -051 : Microbiologie des aliments. Reche Reche rche et dénombrement des micro-organismes rev re vivifiables. Méthode par comptage des colon colo nies obtenu obte nues es à 30°C. Norme XP V 08 -102. Règles générales générales pour po ur le comptage des colonies et  Norme l’expressio l’expression n des résultats. Norme NF V 08 -002 : Microbiologie alimentaire – alimentaire – Directi ves générales pour les  Norme e xamens microbiologiques. Norme NF V -057-2 Microbiologie alimentaire alimentaire – – Directi ves générales pour la  Norme préparation des dilutions dilutions e n vue de l’ex l’e xamen microbiologique microbiologique . Norme NF IS O 17025. Prescriptions géné géné rales co co ncernant la compétence compétence des  Norme laboratoires laboratoires d’étalonnage et e t d’essais. 

4. Mode Opératoire. A partir des dilutions dilutions décimales allant de 10-3 à 10-1, porter aseptiquement 1 ml dans une une boite de Pétri vide préparée à cet usage et numé numé rotée. Compléter e nsuite avec environ 19 ml de gélose gé lose TGEA TGEA o u TDYM fondue puis refroidie à 47°± 1°C. Le temps qui s’écoule entre le moment où l’on a distribué l’inoculum dans la boite et celui celui où o ù le milieu est coulé ne doit pas ex e xcéder 15 mi nutes. 51


Faire ensuite des mouvements circulaires et de va-et-vient en forme de « 8 » pour permettre à l’inoculum de se mélanger à la gélose, sur une surface fraîche et horizontale. Laisser solidifier sur paillasse, puis rajouter une deuxième couche d’environ 4 ml de la même gélose ou de gélose blanche. Cette double couche a un rôle protecteur contre les contaminations diverses. Les boites seront i ncubées ncubées couvercle couvercle e n bas à 30°C pe ndant 70 ± 2 heures heures avec : première lecture lecture à 20 ± 4 heures, heures, deuxième deuxième lecture à 40 ± 4 he he ures, e t troisième et dernière lectu lect ure à 70 ± 2 heures. heures.

5. Lecture et interprétation. Retenir les boites contenant moins de 300 colonies, au niveau de deux dilutions successiv successives es,, mais i l fa fa ut qu’une boite renferme au moins 15 colon colo nies. Calculer le nombre N, de microorganismes revivifiables dénombrés à 30°C par ml de produit produit en e n tant qu q ue moyenne pondérée, à l’aide l’ai de de l’équatio l’équation n suiv sui vante :

Σc

N= 1,1 x d où : Σ c : est la la somme des colonies comptées sur les deux boites retenu re tenues es.. d: est le le taux ta ux de dilut di lution ion correspondant à la première di lution. lution. Arrondir Arrondir les résultats calculés à deux chiffres chiffres significatifs. Le résultat final de microorganismes dénombrés à 30°C par ml de produit est noté par un nombre compris entre 1,0 et 9,9 multiplié par 10x où x est la puissance puissa nce appropriée appropri ée de 10. Exemple : Un dénombrement dénombrement de microorganismes à 30°C a donn d onné é les résultats suivants : -2 dilutio n retenu rete nue e 10 : on a 158 co lonies. lonies.  à la première dilution 

-3

A la seconde dilu dil ution tio n retenue 10

: on a 14 co lonies. lonies.

Σc 158 + 14 172 N = --------------------------- = ---------------------------------------------- = ----------------------------- = 15636

1,1 x d

1,1 1,1 x 10

-2

0,011

Arrondir Arrondir à deux chiffres significatifs, soit 16000 o u mieux :

1,6 x 10 4 microorganismes par ml de produit.

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Mode opératoire opératoire / Enregi E nregistrement strement LOGO

Recherche Recherche et déno dénombrement mbrement des Levures et Mois M oisissures issures dan d ans s les boissons. Méthode par comptage des colonies.

Code : MO.LM. MS Version : 00 Date : 02 / 1 / 06 Page : 1 / 3

Sommaire : 1. 2. 3. 4. 5.


1. Objet et domaine d ’application. ’application. Cette méthode consiste en la recherche et le dénombrement des Levures et des Moisissures dans toutes les catégories de denrées alimentaires, par comptage des colonies colonies sur s ur milieu solide.

2. Définitions. Les Levures et Moisissures sont des champignons hétérotrophes, organismes eucaryotes uni ou multicellulaires. La structure de la cellule est celle d’une cellule eucaryote. Les Levures sont des champignons unicellulaires qui constituent un groupe morpho morpho logique logique et e t phy p hysiologique siologique relativ rela tivement ement homogène. homogène. Les Moisissures Moisissures sont des cham c hampig pig nons filamente ux uni uni ou o u multicellulaires. multicellulaires.

3. Mode opératoire. Par cette méthode, méthode, les Levures et Moisissures sont recherchées recherchées et dénombrées dénombrées dans toutes les catégories de denrées alimentaires, selon le protocole suivant, en recherchant les Levures à part et les Moisissures à part, comme le montre les schémas schémas n°1 et e t 2 ci-après. 3.1 Recherche Recherche et Dén Dé nombreme ombreme nt des Levures. A partir des dilutio dilutions ns retenues, transférer transférer 1 ml de l’échantillon pour essai si le produit est liquide, ou 1 ml de la suspension mère si le produit est solide, dans une boite de Pétri, préalableme préalableme nt préparée et numérotée pour cet usage. usage. Dans les mêmes conditions, et de la même manière, transférer à l’aide d’une nouvelle pipette, 1 ml de la première dilution décimale de l’échantillon pour essai si le produit est liquide, ou 1 ml de la seconde dilution décimale, si le produit est solide, dans une boite de Pétri, préalablement préparée et numérotée pour cet usage. 53


Dans les mêmes conditions, et de la même manière, transférer à l’aide d’une nouvelle pipette, 1 ml de la seconde dilution décimale de l’échantillon pour essai si le produit est liquide, ou 1 ml de la troisième dilution décimale, si le produit est solide, dans une boite de Pétri, préalablement préparée et numérotée pour cet usage. Couler dans chacune des boites de Pétri, environ 15 ml de gélose Sabouraud au Chloramphénicol, Chloramphénicol, fondue, refroidie et mai ntenue à 47 ± 2°C da ns un bai n d’eau. d’ea u. Mélanger soigneusement milieu et inoculum et laisser le mélange se solidifier sur une paillasse fraîche et hori zontale. Après solidification complète complète du mélan méla nge et uniquement uniquement dans da ns le cas où o n suspecte le produit à analyser de contenir des microorganismes dont les colonies envahissent la surface du milieu, couler à la surface du milieu ensemencé environ 4 ml de le gélose blanche fondue, refroidie et maintenue à 47 ± 2°C dans un bain d’eau. Retourner les boites ainsi préparées puis les incuber selon accord, à 30°C pendant 70 ± 2 h ou plus. 3.2 Recherche Recherche et Dén Dé nombreme ombreme nt des Moisissures. Moisissures. A partir des dilutions dilutions décimales, décima les, 10-3 à 10-1, ensemencer respectivement et par étalement 0,1 ml dans une série de trois boites de Pétri contenant de la gélose Sabouraud Sabouraud au Chloramph Chlora mphé é nicol. Laisser les boites sur paillasse pendant 15 minutes à température ambiante, pour permettre permett re la diffusion de l’inoculum puis les incuber à 30°C pendant 70 ± 2 heures ou plu pl us. Dans le souci de ne pas se trouver en face de boites envahies par les Moisissures, on doit effectuer des lectures et des dé nombreme ombreme nts tous les jours.

4. Lecture Lecture et interprétation. interprétation. 4.1. Cas des Levures Après la période d’incu d’incubation bation spécifiée, compter les colonies de Levures ayant poussé en profondeur dans chacune des boites contenant entre 15 et 150 colonies, puis calculer la valeur du nombre N de Levures présentes dans la prise d’essai en tant que moyenne pondérée à partir des deux dilutions successives à l’aide de l’équatio l’équatio n suivante :

Σ c

N= 11xd où : Σ c : est la somme des colonies comptées dans deux boites de dilution s uccessiv ccessi ves. d : est es t la valeur de la première dilution retenu rete nue e parmi les deux boites. Exemple Exemple : (concernant les Levures) o

-1

à la la SM soit (10 (10 ) : 80 colonies de Levures, Levures, -2

à la seconde dilution (10 ) : 15 colonies de Levures, o N = 80 + 15 / 1,1 x 0 ,1 = 863,63 2 Après arro arro ndissement, le résultat est de : 9.10 Levures par gr de produit o

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4.2. Cas des Moisissures Après la période d’incuba d’incubation tion spécifiée, compter les colonies de Moisissures ayant poussé en surface dans chacune des boites contenant entre 15 et 150 colonies, puis calculer la valeur du nombre N de Moisissures présentes dans la prise d’essai en tant que moyenne pondérée à partir des deux dilutions successives à l’aide de l’équation suivante :

Σc N= V x 1,1 1 ,1 x D Où :

Σ c : est

la somme des colonies co lonies de Moisissures Moisissures prése prése ntes ntes sur les deux boites

retenues. D : est le le ta ux de dilution correspondant à la première première di lution retenue retenue (la suspension mère est une dilution) le volume étalé su s ur c haque boite. V : est le Arrondir Arrondir les résultats calculés à deux chiffres chiffres significatifs. Pour cela : si le dernier chiffre est inférieur à 5, le chiffre précédent n’est n’est pas modifié,  si le dernier chiffre est supérieur ou égal à 5, le chiffre précédent est augmenté  d’une unité. Procéder de proche en proche proche ju j usqu sq u’à ce que q ue l’on ait deux de ux chiffres chif fres sig sig nificatifs. Exemple. Un dénombrement direct d’un produit solide après ensemencement avec 0,1 ml de produit produit a donné les résultats suivants : -1 à la la SM soit (10 (10 ) : 45 co lonies lonies de Moisissures, Moisissures,  

-2

à la seconde dilution (10 ) : 6 colonies colo nies de Moisissu Moisi ssures, res,

La vale valeu ur du N sera calculée ainsi :

45 + 6 N=

51 =

-1

0,1 x 1,1 x 10

= 4636,36 0,011

Après arro arro ndissement, le résultat est de : 3

4,6 x 10 Moisissures par gr de produit

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Remarques Remarques importantes : 1. Opérer de la même même façon faço n et dans les mêmes conditions, conditions , avec avec le dilu di lua a nt (TSE), (TSE ), c'est-à-dire c'est-à-dire qu’il faut prendre 0,1 ml du diluant (TSE), les étaler avec un étaleur à part et les incuber dans les mêmes conditions que les boites tests, cette boite constitue constitue le témoin diluant ( TD). 2. Incuber Incuber tell te lle e quelle, une une boite du milie milie u utilisé utilisé à savoir le milie milieu u Sabouraud Sabouraud au au chloramphénicol, chloramphénicol, cette der nière sera sera incu i ncubée bée également telle quelle dans les mêmes co co nditions de température, elle constitue alors, le témoin du milie milie u (TM). 3. Au moment de la lecture, commencer commencer obligatoirement par les les deux boites témoins (TM et TD), TD), si l’une d’entre elles est contaminée, l’analyse est ininterprétable donc à refaire.

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Mode opératoire opératoire / Enregi E nregistrement strement LOGO

Recherche Recherche et déno dénombrement mbrement des Levures et Mois M oisissures issures dans dans les boissons. boissons . Méthode par comptage des colonies.


LOGIGRAMME : LEVURES A partir des dil utions décimales :

10 -1 1ml

10 -2 1ml

10 -3 1 ml

Ajouter Ajouter e nsuite environ 15 ml de gélose Saboura Saboura ud au Cmp. Laisser solidifier sur paillasse pendant 15 mn, puis Incuber Incuber à :

30°C, 72 ± 2 heures heu res

Dénom Dé nombrer brer les colon colo nies caractéristiques, puis p uis calculer calculer la valeur N.

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Mode opératoire / Enregistrement Enregistrement LOGO

Recherche Recherche et déno dénombrement mbrement des Levures et Mois M oisissures issures dans dans les boissons. boissons . Méthode par comptage des colonies.


LOGIGRAMME : MOISISSURES A partir des dilution di lutions s décimales :

10 -1 0,1ml

10 -2 0,1ml

10 -3 0,1 ml

Etalement Etalement à la surface de la gélose Sabou S abouraud raud au Cmp. C mp. Laisser diffuser Laisser diffuser l’inoculum sur paillasse pendant 15 m n, puis Incu Inc uber à :

30°C, 72 ± 2 heures heure s

Dénombrer les colo nies caractéristiques, puis calculer la valeur N.

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Contrôle Microbiologique Microbiologique des boissons 1. Introduction. Les jus de fruits sont des produits dont les caractéristiques sont généralement assez peu favorables au développement des contaminants à incidence sanitaire. A titre d’ex d’e xemple, leurs prin pri ncipales caractéristiques caractéristiques son so nt : • leur bas pH, • leur faible concentration en o xygèn xygène e, • leur forte concentration en e n acides aminés, • leur forte concentration en sucres, • leur forte concentration en e n vitamines. Ces caractères limitent considérablement considérablement le nombre d’espèces susceptibles susceptibles de s’ y multiplier multiplier : le plus pl us souvent elles ne permettent que la m ultiplication ultiplication des levures. 2. Quelles peuvent être les différentes altérations ? A. Modification de l’aspect. d’une opalesce opalesce nce ou d’un trouble dans les boissons boissons limpides • Apparition d’une (levures). • Formation Formation d’ un anneau (levures). • Apparition de flocons surtout dans les sirops, ( levures). • Apparition de dépôt (levures). • Augme Augme ntatio ntation n de viscosité, gélification (bactéries lactiq ues). ues). Diminution n du trouble dans les boisson boi ssons s naturelleme naturelleme nt trou t roubles, bles, • Diminutio Décoloration Décoloration de boisson boi ssons s aux colorants naturels naturels (levu (le vures res ou de bactéries). •

B. Au gm gmentation entation de la pression dans les ré cipients. Ce phénomène peut avoir différentes co nséque séque nces qu q ui vont d u bombage bombage de contenants non rigides jusqu'à l’éclatement même (levures, bactéries lactiques ou Clostridium). C. Modification de l’odeur et du goût . Diminution n du goût (levu (le vures), res), • Diminutio Odeur et goût de bière bi ère (levure), • Odeur • Goût aigre (bactéries lactiques ou acétiques), • Odeur Odeur de moisi (moisissures), • Le seuil seuil d'altération se situe sit ue le plus souvent entre entre 50 000 et 100 000 microorganismes organismes par ml. 3. La prévention des altérations : Les efforts de prévention doivent porter sur : • La réduction réduction voire l'élimination des contaminations. Cette der nière s'obtie s'obtient nt par :  la maîtrise maîtrise des Poin Poi nts Critiqu Critiq ues,  la mise en place des BPF. netto yage et de désinfection désinfectio n.  La mise en place de protocoles de nettoyage • Le blocage de la multiplicat m ultiplication ion des co ntami ntamin na nts é ve ntuellement présents.

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4. Quels sont les a gents gents d'a d'a ltération ? Dans 90 % des cas, il s'agit de levures car : * elles supporte supporte nt des bas pH, * elles peuvent utiliser l'azote inorganique, * elles n'ont pas besoin de Vitamin Vi tamine e B, B, * elles tolèrent un taux de CO2 élevé, é levé, * elles résistent à de fortes concentrations en s ucres. Dans 10 % des cas restants, il s'agit de Clostridium butyricum, le plus souvent responsable du bombage des boites 5. Le Contrôle Microbiologique proprement dit doit porter sur : * Les matières premières (eau, sirop de s ucre, ucre, jus de fruits), f ruits), * La chaîne de fabrication (point (poi nts s critiqu cri tiques), es), * Les produits finis. Il comporte : * La recherche recherche de micro-o rganismes rganismes capables d'altérer la santé publique, * La recherche recherche de micro-organismes mi cro-organismes capables d'altérer la qualité hygiéniq hygiéniqu ue du du produit produit ai nsi q ue ses caractèr ca ractères es organ o rganoleptiques. oleptiques. Dans le cas des jus de fruits conditionnés en Tetra pack, le Contrôle C ontrôle microbiologique des produits finis consiste en : • Un test de Stabilité, • Une prise de pH, de Stérilité. • Un test de En Concl Co nclusion, usion, •

Les jus de fruits sont des boi ssons ssons rafraîchissantes très sélectives de par leurs caractéristiques caractéristiques "physico-chimiques", généralement ils ne posent pas de problème problème d'ordre sa nitaire o u hygiénique hygiénique mais unique unique ment des problèmes problèmes de conservation.

•

Elles s'alt s'a ltèrent èrent rarement ra rement sous l'action des levures o u de bactéries lactiqu lacti ques, es, deux groupes bie n adaptés adaptés aux conditions sélectives du milieu. mi lieu.

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MAQ-EAUX 08

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