PRACTICA N° 11: AISLAMIENTO DEL ADN INTRODUCCION
ADN es la abreviatura del ácido desoxirribonucleico. Constituye Constituye el material genético de los organismos. Es el componente químico primario de los cromosomas y el material del que los genes están formados. a extracci!n de ADN requiere una serie de etapas básicas. En primer lugar tienen que romperse la pared celular y la membrana plasmática para poder acceder al n"cleo de la célula. A continuaci!n debe romperse también la membrana nuclear para de#ar libre el ADN. $or "ltimo %ay que proteger el ADN de en&imas que puedan degradarlo y para aislarlo %ay que %acer que precipite en alco%ol. En este este inform informe e de labora laborator torio io mostra mostramos mos'' concep conceptos tos básico básicoss del ADN( ADN( Defini Definici! ci!n' n' comp compos osic ici!n i!n'' estr estruc uctu tura ra'' su extr extrac acci ci!n !n en célul células as vege vegeta tale less y)o y)o anim animal ales es y otros otros conocimientos relacionados a esta práctica* también contiene el proceso de la práctica reali&ada en el laboratorio' los resultados que obtuvimos en los dos tipos de células' algunas conclusiones a las que llegamos y un cuestionario donde %emos resuelto algunas de nuestras dudas.
MARCO TEORICO
El ADN +,cido Desoxirribonucleico-' conocido también como la molécula de la vida o la molé molécu cula la de la %ere %erenc ncia ia'' es la molé molécu cula la que que cont contie iene ne toda toda la info inform rmac aci! i!n n +gen +genes es-necesaria para que se desarrolle un ser vivo y para que funcione como tal. $ero el ADN no es un mero almacén de informaci!n' sino que también' y gracias al proceso de replicaci!n' es capa& de transmitirla de una generaci!n a la siguiente en el proceso de la divisi!n celular. ue aislado por primera ve& en el invierno de /012 por 3o%ann riedric% 4iesc%er ' 4iesc%er ' médico sui&o que estudiaba la composici!n química de los gl!bulos blancos que obtenía del pus de venda#es quir"rgicos. En uno de sus experimentos' al utili&ar los n"cleos aislados de los leucocitos' aisl! un precipitado con propiedades que no correspondían a sustancias lipídicas y que no era destruido por proteasas +en&imas que degradan las proteínas-. Esto le indu#o a pensar que se trataba de otro tipo de sustancia' de composici!n desconocida %asta la fec%a' y la llam! nucleína. nucleína. $osteriorme $osteriormente' nte' demostr! que la nucleína tenía carácter carácter ácido y aisl! la misma misma sustan sustancia cia en otras otras célula célulass y en esperm esperma a de salm!n salm!n.. Esta Esta nucleí nucleína na aislad aislada a corresponde al ADN y a las proteínas %ist!nicas %ist!nicas sobre las que se enrolla. ueron necesarios 56 a7os más para que se dilucidara la composici!n química exacta y la estructura del ADN. ¿Dónde se encuentra el ADN en los seres !os"
El ADN se encuentra en las células. En el caso de las células procariotas' como las bacterias' está en el citoplasma en forma de molécula circular. En las células eucariotas podemos diferenciar dos tipos de ADN seg"n su locali&aci!n( el ADN del n"cleo formado por varias moléculas lineales +dependiendo de la especie-' y el ADN mitocondrial' formado por algunos miles de copias de ADN circular. circular.
Co#$os!c!ón %u&#!ca
Desde el punto de vista químico' el ADN es un polinucle!tido' es decir' un polímero de unidades llamadas nucle!tidos que se unen las unas a las otras mediante un enlace químico fosfodiéster llamado enlace nucleotídico. Cada nucle!tido está formado por una molé molécu cula la de ácid ácido o fosf fosf!r !ric ico' o' una una base base nitr nitrog ogen enad ada a +A' +A' 8' C y 9- y la pent pentos osa a desoxirribosa. as siguientes imágenes muestran los cuatro nucle!tidos que componen el ADN. os grupos fosfatos en disoluci!n' que es como se encuentran en la célula' presentan carga negativa' por lo que el ADN es una molécula con carga negativa. Estructura
a estructura secundaria del ADN fue propuesta en /2:; por
in C%argaff' 4aurice
os polinucle!tidos se forman entre las bases nitrogenadas de adenina' guanina ' citosina y timina por enlaces covalentes de tipo fosfodiéster. Así se forma un esqueleto de polidesoxiribosa@fosfato' de forma que queda un extremo con @B libre y un extremo : con un grupo fosfato libre.
Estructura secundar!a
8iene un empaquetamiento espacial pero no se altera. Dentro de la estructura secundaria %ay modelos( .El modelo de la estructura secundaria del ADN en forma de doble %élice dextr!gira +forma B). as dos %ebras son antiparalelas es decir si una presenta la direcci!n :@' la otra posee la direcci!n @:. El con#unto se pliega sobre sí mismo obligado por los puentes de %idr!geno entre diferentes regiones de la molécula' %asta adoptar la conformaci!n más estable' que es la de doble %élice. Este enrollamiento entre las ; %ebras de la doble %élice es dextr!giro es decir gira a derec%as y de tipo plectonémico' como si estuvieran tren&adas. as secuencias de bases son complementarias' pues %ay una correspondencia entre las bases de ambas cadenas .a adenina s!lo puede estar frente a la timina y la guanina frente a la citosina. Así las bases p"ricas están enfrentadas a las bases pirimidínicas y la uni!n se reali&a por puentes de %idr!geno en los pares AF8 y tres en los pares 9@C a correspondencia entre las bases es la causa de que las dos cadenas de la doble %élice de ADN posean secuencias complementarias. Además los pares de bases están %ori&ontales %ori&ontales y el e#e los atraviesa por el centro. 4odelo hélice A: En este modelo los pares de bases nitrogenadas están inclinados %acia el exterior pero la %élice al igual que la del ADN G es dextr!giro 4odelo hélice z: En este modelo las cadenas de ADN no se enrollan en forma de doble %élice sino en forma de &ig@&ag. E'tracc!ón del ADN
El primer paso en cualquier protocolo de separaci!n es el rompimiento del material inicial' ya sea de origen viral' bacteriano' vegetal o animal. El método utili&ado para romper la célula debe ser tan leve como sea posible con el fin de causar el menor da7o posible al ADN. a lisis celular se puede %acer por acci!n mecánica' pulveri&ando el te#ido con %ielo seco o nitr!geno líquido' también se puede utili&ar la degradaci!n en&imática de la pared celular +si está presente- y lisis con detergentes de las membranas celulares. Heguido al rompimiento celular la mayoría de métodos involucran una desproteini&aci!n' lo cual se lleva a cabo con un solvente orgánico' seguido de una precipitaci!n con isopropanol o etanol y posterior solubili&aci!n con agua o tamp!n. Existen diferentes técnicas para la extracci!n del ADN' aunque todas conservan el uso de los mismos principios y fundamentos. $ara obtener ADN a partir partir de leucocitos leucocitos totales +obtenidos +obtenidos de sangre sangre periféricaperiférica-'' células células en cultivo' te#idos animales' vegetales' levaduras y bacterias* se usa generalmente una técnica de cuatro pasos secuenciales( •
El primer paso consiste en la lisis de las células y los n"cleos.
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ueg uego' o' la sepa separa raci ci!n !n del del ADN ADN a part partir ir de sang sangre re tota totall invo involu lucr cra a la lisi lisiss de eritrocitos' seguida por una lisis de leucocitos y de sus n"cleos. as proteínas celulares son entonces removidas por un paso de precipitaci!n salina' y inalmente el ADN gen!mico es concentrado por precipitaci!n con isopropanol.
El ADN purificado por medio de este proceso' está listo para ser utili&ado en diferentes aplicaciones' las cuales involucran( amplificaciones +$C?-' digesti!n con endonucleasas de restricci!n' Hout%ern blot y Dot blot. Existen otras técnicas que permiten la obtenci!n de ADN gen!mico a partir de muestras s!lidas y líquidas' que permiten la separaci!n simple' rápida' segura y eficiente del ADN. Esta separaci!n se basa en la utili&aci!n del isotiocianato de guanidina' como soluci!n de lisis celular' lo cual permite una precipitaci!n selectiva del ADN con etanol y solubili&aci!n en agua o en 0 m4 de NaB. Este procedimiento se puede reali&ar en 6 minutos' recobrando un 56I a un /66I del ADN. E'tracc!ón del ADN en las $lantas
El ADN gen!mico de las plantas es más difícil de extraer a causa de la pared celular de la planta' que se elimina por %omogenei&aci!n o mediante la adici!n de celulasa para degradar la celulosa que forma la pared celular. Además' los metabolitos presentes en la célula vegetal pueden interferir con la extracci!n de ADN gen!mico por la contaminaci!n de la muestra de ADN durante el proceso de precipitaci!n. E'tracc!ón de ADN an!#al
os leucocitos de sangre periféricos son una fuente principal de ADN gen!mico en animales' pero la recogida de muestras es difícil ya que la sangre debe ser retirada del animal. a sangre contiene una serie de compuestos como proteínas' lípidos' gl!bulos blancos' gl!bulos ro#os' plaquetas y plasma' que pueden contaminar la muestra de ADN. El contaminante principal del ADN de animal extraído por muestras de sangre es %emo' el componente no proteíco de la %emoglobina.
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Hilv Hilvia ia Kuesa Kuesada da 4ora 4ora.. ;665 ;665.. 4anu 4anual al de exper experim imen ento toss de labo laborat ratori orio o para para bioquímica. Costa ?ica. ?ica. Editorial Lniversidad Nacional A Distancia.
9%isla 9%islain' in' 4.' M%ang' M%ang' D.$. D.$.' Berrera Berrera'' 4.?. 4.?. /220. /220. $rotoc $rotocolo oloss de abora aborator torio io de Giología 4olecular( 8ipificaci!n genética. $er". Centro Jnternacional de la $apa +CJ$-.
Dora onseca 4endo&a' Beidi 4ateus Arbeláe&' Nora Contreras Gravo. ;6/6. $rácticas de aboratorio de Giología 4olecular( Hu Aplicaci!n en 9enética Gásica. Colombia. Editorial Lniversidad Del ?osario.
