Mecanismos patogénicos de
Escherichia coli
Dr. Fernando Navarro García 1). Nataro JP and Kaper JB,
Clinical Microbiology Reviews, 11:142-201 (1998) 2). Kaper JB, Nataro JP and Mobley HLT Nature reviews 2:123-140 (2004)
Escherichia coli Familia Enterobactericeae Tribu Escherichia Bacilo Gram Negativo Anaerobio facultativo predominante en colon Escherich 1884 Serotipificación Kauffman 1944 Tamaño de su genoma 4 X 109 pb
Escherichia coli Patogénica Síndromes clínicos Infección del tracto urinario Meningitis/sepsis Enfermedad entérica (diarrea)
Escherichia coli Diarreogénica 1. E. coli enterotoxigénica (ETEC) 2. E. coli enteropatogénica (EPEC) 3. E. coli enterohemorrágica (EHEC) 4. E. coli enteroagregativa (EAEC) 5. E. coli enteroinvasiva (EIEC) 6. E. coli con adherencia difusa (DAEC)
Patogenicidad de Escherichia coli Diarreogénica
Serotipos característicos de Escherichia coli diarreogénica
Características clinicoepidemiológicas de E. coli Categoría
Síndrome clínico
Distribución geográfica
Edad de incidencia
ETEC
Diarrea acuosa
Países en desarrollo
Niños, viajeros adultos
EPEC
Diarrea acuosa
Países en desarrollo
Bebes menores de 6 meses
EIEC
Disentería
Mundial
Niños mayores de 1 año, preescolares
EHEC
Colitis hemorrágica, HUS
Países en desarrollo, Latinoamérica
Niños de 2 a 7 años
EAEC
Diarrea persistente
Países en desarrollo
Principalmente infantes
DAEC
Diarrea acuosa
Desconocido
Preescolares
Tomado de: M.M. Levine and M.B.Sztein. Chapter 12 in Effects of Microbes on the inmune system Lippincott Williams and Wilkins
Diagnóstico fenotípico •Ensayo de adherencia con células HEp-2 Diagnóstico de EPEC, DAEC y EAEC •Se observan tres patrones de adherencia •Adherencia localizada (LA) BFP •Adherencia agregativa (AA) AAF/I y II •Adherencia difusa (DA) F185
Adherencia Localizada (LA)
Adherencia Agregativa (AA)
Adherencia Difusa (DA)
Fimbrias de adhesión Factores de colonización de E. coli CFA/III fimbriae of ETEC (5-7 nm)
CFA/I fimbriae of ETEC (5-7 nm)
CS3 fibrillar structure of ETEC (2-3 nm)
BFP of EPEC (>10 µm)
P pili of UPEC (10 nm)
Thin, coiled aggregative curli fibres
Virulencia Estrategia de E. coli •Colonización de la mucosa •Evasión de las defensas del huésped •Multiplicación •Daño a los tejidos del huésped Principales Causas de Diarrea •Producción de enterotoxina (ETEC y EAEC) •Invasión (EIEC) •Adherencia intima (EPEC y EHEC)
Toxinas y efectores de E. coli Patogénica (1/2)
Toxinas y efectores de E. coli Patogénica (2/2)
Versatilidad del genoma de E. coli Plasmidos relacionados con virulencia •Fimbrias •Toxinas •Genes reguladores •Moléculas de adhesión Islas de patogenicidad •Locus de adhesión y esfacelamiento (EPEC y EHEC) Elementos individuales •Transposones (tal como ST) •Codificado en fagos (tal como Shiga toxin)
Elementos genéticos móviles en E. coli patogénica
Mecanismo de patogenicidad en E. coli diarreogénica Categoría
Plásmido de virulencia
Interacción con mucosas
Toxinas
ETEC
60 Md
CFA
LT, ST
EPEC
60 Md
BFP, Intimina
EspC*
EIEC
140 Md
IPAs
ShET-2
EHEC
60 Md
Intimina
ShET 1 y 2
EAEC
65 Md
AAF
EAST1, Pet
DAEC
60 Md
F1845, OMP AIDA-1
Ninguna
Tomado de: M.M. Levine and M.B.Sztein. Chapter 12 in Effects of Microbes on the inmune system Lippincott Williams and Wilkins
Factores de Virulencia de E. coli (1/2)
Factores de Virulencia de E. coli (2/2)
ETEC •Elabora al menos un miembro de los dos grupos de enterotoxinas conocidas como ST y LT (termoestable y termolábil), estimulan al intestino y provoca excesiva secreción de fluidos. •Involucrada en brotes epidémicos transmitidos por agua ó alimentos, alrededor de 79,420* casos por año en EU. •Características clínicas : diarrea acuosa o sanguinolenta, dolor abdominal con o sin fiebre, nauseas. •Enfermedad se desarrolla de 1 a 3 días del contacto con la bacteria, usualmente por un periodo de 3 a 4 días.
*http://www.cdc.gov
Factores de Colonización de ETEC •CFAs (CS, coli surface antigen) •Codificados en plásmidos
cfa (I ) a
b
c
Nombre original
CS
Diámetro (nm)
CFA/I* CSI* CS2* CS4* CFA/III+ Longus+ CS3♠ CS5 ♠
CFA/I CSI CS2 CS4 CS8 CS21 CS3
7 7 7 6 7 7 2-3
CS5
5
*Rigids rods, + Bundle-Forming, ♠ Fibrillar
d
ETEC
ETEC
Enterocito
Diarrea acuosa
ETEC Toxina Termolábil (LT) •Tóxinas oligoméricas •LTI expresada por cepas patógenas para humanos y animales. •80% de identidad con CT •Proteína de 86 kDa •Gen elt reside en plásmido •subunidad A de 28 kDa •Cinco subunidades ídénticas B de 11.5 kDa •LTII Animales, rara en humanos •57 a 55% de identidad a LTI y CT •Gen etx
LT1
Mecanismo de Acción de LT Cl-
NaCl
Células de las criptas
Células absorbentes
Fosforilación de proteínas
A B
Cinasa A NAD
GDP
β γ
cAMP
ADPr
Proteínas G
α
ATP
GTP GTP
α
adenilato ciclasa “activada”
Toxina termoestable (ST) •Toxinas monoméricas con residuos de cisteínas •Genes encontrados en plásmidos •STa: ETEC, Y. enterocolítica, V. cholerae No-O1 •Variantes STIa ó STp y STIb o STh NaCl Cl•Idénticos en 13 residuos necesarios para enterotóxicidad STa •Incrementa niveles de GMPc •STb: Encontrada solo en ETEC •Induce daño histológico
Receptor/ Guanilate cyclase C
GTP cGMP
Enterocito
G-kinase
Pruebas en ETEC
Detección de LT Células Y1 adrenales
Detección de ST Asa ligada de conejo
EPEC
Patotipo productor de diarrea infantil en países en desarrollo. Histopatológicamente lesión A/E “attaching and effacing” •Adhesión intima Bacteria y membrana celular. Se producen cambios en el citoesqueleto con acumulación de actina. Estructura semejante a un pedestal. •Hafnia alvei, Citrobacter rodentium, EHEC. Las lesiones A/E contiene altas concentraciones de filamentos de actina polimerizados (F-actina) además de proteínas como talina, ezrina y cadenas ligeras de miosina.
Genes de Patogenicidad
LEE Cromosoma
escRSTU
escCJ escV escN
tir
orfU
eae
espADB
Type III secretion apparatus
EPEC
EAF bfp A G pilin
B OMP
C
U
perA B C
EAF probe
Modelo de patogénesis de EPEC
1.
Adherencia localizada •
2. 3.
EAF, BFP
Transducción de señales Adherencia intima
Adherencia localizada de EPEC
Isla de patogenicidad LEE
Secreción: Secreta cinco proteínas: EspA, EspB, EspD y EspF (sistema tipo III) Están codificadas en una isla de patogenicidad de 35.6 kb llamada LEE Tir (receptor para intimina), adhesina de EPEC, codificada dentro de LEE EspA, EspD y EspB forman un translocón
Sistema de secreción tipo III en EPEC
Señales de transducción EPEC Isla de patogenicidad LEE 35 kb Proteínas del sistema de secreción tipo III (sec, esp) EspA, EspB, EspD, Intimina Aumento de Ca+2 intracelular en células epiteliales Fosforilación de proteínas (PKC y Miosina) •aumenta la permeabilidad de la uniones estrechas intracelulares
Fosforilación de tirosina Hp90 es parte de la lesion A/E y su distribución se presenta bajo la bacteria adherida, en la parte superior del pedestal.
Señales de transducción EPEC
Adherencia Intima EPEC •Intimina, proteína de membrana externa de 94 a 97 kDa. •Genes eae presentes en EPEC, EHEC, C.
Rodentium y H. alvei. •Región Carboxilo terminal, sitio de unión al receptor en la célula epitelial Tir. •Resultados con voluntarios demostraron que la intimina participa activamente en la patogenicidad. •Podría jugar un papel preponderante en la inmunidad a la reinfección.
Adherencia Intima EPEC
EPEC Lesión A/E
Pedestales: EPEC Lesión A/E
Proteínas EPEC Esenciales para el fenotipo A/E EspA 25 kDa EspB 38 kDa EspD 40 kDa Proteína EspC Auto transportadoras, sistema de secreción Tipo IV MUTACION EN GEN NO AFECTA 1998 Señales de transducción Daño A/E Cualquier otro fenotipo patogénico
Proteína EspC •espC marco de lectura abierta con 3,924 pb. •Molécula precursora de 140 kDa, secretada por el sistema tipo V como una proteína activa de 110 kDa. •No está presente en LEE •PAI espC, G-C (40.5%)
EspC
Motivo de serina proteasa
MNK Péptido señal
GGDSGSG
Dominio pasajero
Dominio β
Tomado de : Stein et al. 1996. J. Bacteriol. 178:6546-54 Mellies, J. et al. 2001. Infect. Immun. 69:315-324.
Enterotoxicidad de EspC
espC pJML174
Tomado de : Mellies, J. et al. 2001. Infect. Immun. 69:315-324.
EspC de EPEC •Produce efectos citotoxicos sobre células epiteliales. •Se une y degrada a fodrina in vitro. •EspC necesita ser internalizada para producir daño al citoesqueleto, la internalización se lleva a cabo a las 8 horas. •El daño al citoesqueleto producidos por EspC se debe probablemente a su motivo de serín proteasa. •EspC se internaliza por receptores en la membrana de las células epiteliales, aunque la naturaleza del receptor se desconoce.
Efectos de EspC en células epiteliales Citotoxicidad
Citoesqueleto
Internalización Transfección
d
e
r
Regulación de factores de virulencia de EPEC
EHEC Colitis hemorrágica (HC) •Dolor abdominal, diarrea acuosa, diarrea con sangre y fiebre escasa. •Brote de enfermedad por alimentos en 1983 asociado con hamburguesas mal cocidas. Sindrome urémico hemolítico (HUS) •Diarrea inicial aguda indistinguible de HC. •Falla renal aguda, trombocitopenia, anemia hemolítica Escherichia coli O157:H7 •SLT (Shiga like toxin) “SLTEC” •Verotoxina “VTEC” •Lesion A/E
EHEC
Genes de patogenicidad
Cromosoma
Plasmido 60 MDa
EHEC Stx EAST1 Enterohemolisina OMP intimina 94 a 97 kDa
Genoma de EHEC secuenciado
Shiga like toxin Principal factor de virulencia de EHEC •Stx1 y Stx2 •Toxina identica a Stx1 de S. dysenteriae I •Estructura A-B clásica de la familia de toxinas Shiga •Subunidad B se une a un receptor glicolipido (Gb3). Subunidad A •Peptido A1 contiene la actividad enzimática. •Se trasloca a el citoplasma, actua en la subunidad ribosomal 60S (N-glicosidasa adenina de 28s rRNA). Efectos •Hemorragia y edema en la lamina propia. •Necrosis focal e infiltración de neutrófilos. •Se infiltra en torrente sanguíneo. •Inflamación de células endoteliales glomerulares y deposición de plaquetas y fibrina.
EHEC citotoxicidad in vivo e in
vitro
Síndrome disentérico
Monocapa de células Vero
Epidemiología Reservorio •Ganado vacuno, ovejas, carneros, gatos, perros, gallinas, cerdos. •Anualmente se reportan 200,000 casos y 250 muertes por EHEC. Transmisión Periodo de incubación de 3 a 4 días. •Alimentos y bebidas. •Persona a persona. Diagnóstico •Aislamiento de la bacteria en agar SMAC. •Serotipificación •ELISA •Detección de stx, fliC, eae, pO157
EAEC Definición •No secreta enterotoxina LT o ST. •Patrón de adherencia agregativo (AA). Patogénesis •Aumenta la secreción de moco. •Localización de la bacteria entre el moco y la célula. •Toxina PET (plasmid encoded toxin). •Fimbrias AAF/I y AAF/II Modelo •Colonización y localización inicial. •Aumento en la secreción de moco. •Elaboración de citotoxina PET.
Detección y Diagnóstico Patrón de adherencia agregativa •Aislamiento del microorganismo. •Ensayo en células HEp-2. •Serotipos asociados a EAEC.
Plásmido •Sondas de DNA. •PCR.
Adhesión de EAEC en intestino
Structural subunit of the fimbria
Role of the fimbria on the adhesion to intestinal mucosa
Daño a celulas epiteliales por EAEC
Factores tóxicos EAEC Enterotoxina 1 termoestable de EAEC (EAST1) produce incremento en la secreción de iones, codificada en el pAA, 6 kDa Pic (proteína implicada en la colonización intestinal) 116 kDa, motivo de serín-proteasa, mucinasa, cromosomal Pet (toxina codificada por plásmido)
Efecto enterotóxico de EAST1
PET Toxina de 104 kDa Codificada por el plásmido pAA en la bacteria Posee un motivo serín-proteasa (GDSGSP) Sistema de secreción tipo V (proteínas autotransportadoras) Miembro de la subfamilia SPATE
(serín-proteasas autotransportadoras de Enterobacteriaceae)
Alignment of Pet protein with its closest homologs, EspP, EspC, and SepA
Dr. Fernando Navarro-García
Pet - Plasmid encoded toxin Serine protease domain
Signal
Cleavage
β-domain
α-domain
Cleavage
Fernando Navarro Garcia
AUTOTRANSPORTER PROTEIN Signal peptidase
Extended Nterminal signal sequence
Serine protease active site (GDSGSP)
(AXB) Signal peptidase recognition site
Outer membrane protease
RGD motif Walker RGD motif A box
C-terminal motif ([Y/W/V/I/f]-X-[F/W])
Autoproteolysis
Role in virulence
N-terminal signal sequence
α-domain
antiparallel β-sheet structure
β-domain
Dr. Fernando Navarro-García
Type IV Secretion A
B
C
External milieu Outer membrane β-barrel formation Translocation of α-domain
Periplasm Cleavage of signal sequence
Inner membrane Cytoplasm
GSP machinery
Polyprotein Fernando Navarro Garcia
Morphologic effect of Pet protein on epithelial cells
Dr. Fernando Navarro-García
Proteolytic activity of Pet protein on zymogram gel pCEFN1 pCEFN1
– +
PMSF
203 116
Pet
83 48
33 28
SDS-PAGE
Zymogram
Dr. Fernando Navarro-García
Construction of Pet S260I mutant A
α-domain
β-domain
B
Role in virulence?
N-terminal signal sequence
Autoproteolysis?
β-domain N-terminal sequence Native Pet NLNKRMGDLR... Pet S260I mutant 1019NLNKRMGDLR... 1019
Serine protease active site
(GDSGSP) Native Pet 260
Cterminal antiparallel β-sheet structuremotif
60I Na tiv eP et
S2
D
Pe t
1.6
N ativ e Pe t p ro te in S 260I m u tan t
1.4 1.2
proteinase K
O.D . (280 nm)
S2 Pe t
C
60I
(GDIGSP) Pet S260I mutant
1.0 0.8 0.6 Pe t p rotein
0.4 0.2 0.0 0
20
40
60
80
100
120
140
Fractio n N o .
Dr. Fernando Navarro-García
Enterotoxic and Cytotoxic Activities of Pet Protein Hep-2 cells
HT29 cells
4
A
∆PD (mv)
3
Pet
2 1 0 -1
B
PetS260I
100
26 0I Pe tS
Pe t
1
0
pS PO RT
∆Isc (µA/cm 2)
200
Fernando Navarro García
Both Pet and its mutant are internalized but only Pet produces cytoskeletal damage
Untreated Hep-2 cells stained with anti-Pet
Pet-treated Hep-2 cells
S260I-treated Hep-2 cells
Hep-2 cell cytoskeleton visualised by FAS
Pet-treated Hep-2 cells
S260I-treated Hep-2 cells Dr. Fernando Navarro-García
Fodrin is cleavaged by Pet and occurs within 11th repetitive unit 109 kDa
Espectrinα II (Fodrin) (Fodrin)
1 NH2
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
1529 AAs 809 AAs GST 8 9 10 11 12 13 14 COOH Fodrin-GST NH2 Fodrin ( 8-14)
A
C 0 10 m 30 in 1 hmin 2h 4h 6h 8h
8h
37 kDa 4h 6h
0 10 m 30 in m 1 h in 2h
250
W M C
72 kDa
22 COOH
150 100 75 50 37 25
B
SDS-PAGE
Immunoblot
C
Inmunocolocalization of Pet, fodrin and actin within HEp-2 cells
A
B
C
E
F
G
D
H 20 µm
Portada mostrando la interacción de Pet y fodrina dentro de células epiteliales
Pet Efectos enterotóxicos •En preparaciones de yeyuno de rata 4Incremento en la secreción de iones por las células epiteliales (cámara de Ussing, ↑ ISC y ↑ PD) 4 Acortamiento de las vellosidades 4 Exfoliación de células 4 Liberación de moco
Efectos citotóxicos Liberación de los contactos focales 4 Redondeamiento de la célula 4 Contracción del citoesqueleto 4 Pérdida de las fibras de estrés 4
Ambos efectos no son producidos cuando se bloquea la actividad de serín-proteasa
EIEC Definición •Bioquímica, genéticamente, patológicamente relacionada a Shigella spp. •Invasión del epitelio colónico. Invasividad •Mediada por pInv 140 MDa •Locus cromosomal mxi y spa aparato de secreción tipo III. •IpaA,B,C,D necesarias para el fenotipo de invasividad. •VirG provoca nucleación de los filamentos de actina y movimiento a través del citoplasma.
EIEC genes de virulencia
EIEC Cromosoma Plasmido 140 MDa
SS tipo III
EIEC modelo de patogénesis •Penetración de la célula epitelial. •Lisis de la vacuola endocítica. •Multiplicación intracelular. •Movimiento direccional a travéz del citoplasma. •Traslocación a células adyacentes.
Polimerización de actina por bacterias
Diagnóstico EIEC
Prueba de Sereny. Sonda pMR17 derivado pInv. Sonda ial derivada pInv. PCR ial. ELISA para detectar
ipaC.
Fimbrias de adhesión
