TRABAJO DE ANALISIS – METODO KJELDAHL 1. VENT VENTA AJAS, DESVENT DESVENTAJ AJAS AS Y RETOS RETOS EN EL MÉTODO MÉTODO KJELDAH KJELDAHL. L. VENTAJAS •
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Un gran punto a favor que tiene este método es su gran aplicabilidad en los diferentes medios o sustancias a los cuales puede ser empleado, es decir, como es posible notar en el texto especialmente en el mbito de los alimentos tiene un campo de acci!n mu" amplio #semillas, lec$e, cereales, quesos, aceites, $uevos, etc%, as& como por e'emplo con los minerales como carb!n " en el estudio de suelos con los fertili(antes, entre otros) *a gran cantidad de variaciones que posee este método para su desarrollo, es decir dec ir,, c!m c!mo o dep depend endie iendo ndo de la det determ ermina inaci! ci!n n qu que e se qu quier iera a rea reali( li(ar ar,, por algunas sustancias existen por e'emplo proporciones directas de sustancias catali(adoras,, reducci!n de los tiempos de digesti!n usando otros compuestos, catali(adoras los efectos de la temperatura, los indicadores para la titulaci!n, la digesti!n por microondas, entre otros) +ermite el anlisis de muestras insolubles " casi completas, es decir que dic$as muestras pueden estar en su forma original, cuando pasan por el proceso de digesti!n, el acido sulfrico concentrado " las altas temperaturas se encargan de descomponer la sustancia)
-ESVENTAJAS +ara la determinaci!n de prote&nas el método tiene un principal problema " es la interferencia causada por los nitr!genos no proteicos #N+N%, esto genera un inconveniente "a que estos se deben separar para determinar el contenido proteico real) As& que se deben usar otras técnicas para determinar la fracci!n de los N+N en la muestra) +ara algunas muestras no se obtendr el .//0 del nitr!geno, en el caso de las especies aromticas, el nitr!geno $eteroc&clico es dif&cil de separar por lo que se debe $acer un proceso de predigestion predigestion)) Algunos de los reactivos catali(ado catali(adores res son contaminan contaminantes tes e incluso t!xicos para el ser $umano, por e'emplo el oxido mercrico #1g2% " en algunos casos otros producen concentraciones de gases que pueden ser da3inos para el medio ambiente) 4ET2S •
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-urante el proceso de destilaci!n, la pérdida del amoniaco puede ser un problema, "a que si no se tiene la precauci!n precauci!n correcta pueden existir existir perdidas por fuga e incluso durante la refrigeraci!n en el condensador puede quedar parte del amoniaco condensado en las paredes) *a deg degrad radaci aci!n !n co compl mpleta eta de la mue muestr stra a pu puede ede com compl plica icarse rse pa para ra cie cierto rtoss aminocidos "a que en algunos solo una fracci!n estequiometrica se disuelve con el acido sulfrico, es por esto que se usa un segundo compuesto #per!xido de $idrogeno% para reali(ar la separaci!n completa del nitr!geno de la muestra) El cam cambi bio o de los com compue puesto stoss t!x t!xico icoss po porr com compu puest estos os de me menor nor im impac pacto to ambien amb iental tal " qu que e no alt altere eren n la sal salud ud de las pe perso rsonas nas)) Al Algu gunas nas sus sustan tancia ciass usadas en el método 5'elda$l $an sido reempla(adas con el tiempo, aunque la eficiencia es menor, el riesgo de enfermar por el uso de estas sustancias disminu"e)
2. ¿POR QUÉ EL MÉTODO KJELDAHL SE USA HOY EN DÍA EN TODO EL MUNDO? El método 5'elda$l es usado fundamentalmente porque permite $acer la determinaci!n del nitr!geno en una gran cantidad de especies o sustancias diferentes, lo cual para el mbito industrial tiene un gran recibimiento " empresas de todo el mundo lo usan) Esto llevo a que con el tiempo se fueran reali(ando me'oras especificas para cada tipo de uso " as& mismo las reacciones involucradas " los materiales usados fueran me'orndose para la exacta medici!n del nitr!geno) 6on esto se $a llegado al punto en que el método 5'elda$l sea relativamente fcil de llevar a cabo en un laboratorio) 3. DESRIBA LA EVOLUI!N HIST!RIA DEL MÉTODO KJEHLDAL. El primer método para determinar nitr!geno en una muestra orgnica fue el método de -umas postulado en .78., pero su uso se limitaba por la gran cantidad de tiempo requerido, las complicaciones en el mane'o de los gases de combusti!n, algunos de ellos contaminantes, adems del uso de mercurio #sustancia toxica% para $acer la volumetr&a que permit&a medir la cantidad de nitr!geno de la muestra, entre otros problemas) Aun as& describen otros autores que esta era la técnica ms factible para la época) Esto llevo a buscar un método que en lugar de la liberaci!n de gases se reali(ara en un medio acuoso) Es por esto que se pens! en medir las cantidades de nitr!geno no como sustancia libre #gas N 9% sino en forma de amoniaco) En .7:. se uso el método de ;ill " Varrentrapp el cual reempla(o al método de -umas) En este método el nitr!geno producido por la combusti!n, transformado en amoniaco, es llevado a un tubo con exceso de $idr!xido de bario " acido clor$&drico, formando una me(cla de clor$idrato de amonio el cual se precipitaba con cloruro de platino, formando cloroplatinato el cual era pesado " a partir de él se calculaba la cantidad de nitr!geno) As& mismo aunque se resolv&an algunos problemas también se presentaban otros, principalmente "a que en el tubo de combusti!n exist&a la presencia de aire lo cual generaba que parte del nitr!geno pudiese escapar " por lo tanto no ser medido) +ara .7:<, Eugene +éligot, altero el método de ;ill " Varrentrapp, cambiando el tubo de combusti!n por un =frasco> o matra( " el $idr!xido de bario por cal sodada #agua de cal%) +ero aun as& segu&a existiendo el problema de la perdida de nitr!geno) ?eulen, en .@9:, reali(o una modificaci!n al proceso de la cal sodada obteniendo me'ores resultados la $idrogenaci!n catal&tica a 8B/C6 con n&quel) ;anDl"n en .77 $i(o una me'ora al método de ;ill " Varrentrap) En su variaci!n a3adi! permanganato de potasio para incrementar el efecto oxidativo de la cal sodada) +ara .78< Fer(elius propuso por primera ve( el uso del acido sulfrico para descomponer las me(clas orgnicas pero fue $asta .7:B que dic$o acido se uso como método de digesti!n antes de usar la precipitaci!n a cloroplatinato para determinaci!n de urea) Todos estos cambios en los métodos de determinaci!n de nitr!geno llevaron llevaron a que en .778 Jo$an 5'elda$l creara el método que lleva su nombre)
". OMPARE EL MÉTODO KJELDAHL ONTRA OTROS MÉTODOS PARA DETERMINAI!N DE PROTEÍNAS
?étodos diferentes al método D'elda$l tienen ciertas venta'as ligadas a el tiempo de aplicaci!n o a reactividad con respecto a muc$os otros tipos de sustancias especialmente a su cuan espec&ficos son para estudios de tipo medico o de tipo ms prctico " no tan preciso) ?uc$os métodos basados en el anlisis espectrofotométrico que se lleva a cabo con la absorvancia de sustancia anali(ada dependen en su gran ma"or&a de la concentraci!n de la muestra as& como de las reacciones que se llevaron a cabo para lograr encontrar las especies nitrogenadas) Algunos de los métodos ms usados o destacados para determinar prote&nas, diferentes al método 5'elda$l, son •
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?GT2-2 -E FHU4ET Esta técnica se basa en la reacci!n de una prote&na con una molécula de cobre #HH% #6uI9% produciendo un color purpura que es cuantificable a través de espectrofotometr&a) VENTAJAS Este método no depende de la composici!n de los aminocidos, es decir que reaccionara igual para todas las pruebas que se realicen a muestras diferentes) *igado al método esta la reacci!n del Fiuret #reacci!n de dos moléculas de urea para formar el compuesto Fiuret% se aplica a todos los péptidos " prote&nas) As& mismo, debido a su fcil reali(aci!n es posible $acer varias repeticiones de determinaci!n) -ESVENTAJAS *a sensibilidad del método es mu" ba'a #entre .///.//// microgramos de prote&na en la muestra%, por lo que se usa solo para muestras con una alta concentraci!n " no en la cual la turbide( de la muestra no altere la medida, "a que para la espectrofotometr&a la cuantificaci!n tendr algunos problemas ?GT2-2 -E *2;4K Esta técnica me(cla bsicamente el método de Fiuret con el 4eactivo de Lolin 6iocalteu, caracter&stico de grupos 21 reductores que, 'unto con los comple'os cuproproteicos de la reacci!n del Fiuret, reducen el reactivo de Lolin, el cual vira a color a(ul oscuro) VENTAJAS Al ir un paso ms all del método de Fiuret $ace que la sensibilidad aumente #entre 9B.// microgramos% " permita $acer determinaciones ms exactas) +aralelo a esto esta su tiempo de duraci!n, entre . " .)B $oras, el cual es relativamente corto con respecto al método de 5'elda$l que puede tomar ms tiempo con respecto a la muestra anali(ada "a que la digesti!n alarga el tiempo de anlisis) -ESVENTAJAS *a sacarosa, l&pidos, buffers fosfato, sulfato de amonio, compuestos con sulfidrilo, monosacridos " $exoaminas interfieren en la reacci!n) As& mismo este método no es aplicado a un gran campo "a que se traba'a con muestras acuosas que no necesariamente $an sido tratadas anteriormente como en la digesti!n de 5'elda$l, esto reduce su uso espec&ficamente a anlisis médicos, por e'emplo la cuantificaci!n de nitr!geno proteico en la orina) 2tra complicaci!n es que el color var&a con diferentes prote&nas, lo cual genera que deban estandari(arse las muestras con patrones blanco, as& como con la concentraci!n, el color tampoco depende de esta) Esto puede complicar el anlisis "a que para especies diferentes en una misma muestra el estudio debe
reali(arse ms a fondo para estandari(ar " caracteri(ar espec&ficamente las especies presentes) #. REAIONES INVOLURADAS EN EL MÉTODO KJELDAHL •
-HMESTH2N
#prote&na% N19#619%#p%6221 I #qI.%1 9S2: #pI.%629 I N1:1S2: I #q%S29 I #p%192 •
-ESTH*A6HON #N1:%9S2: I Na21 Na9S2: I 9N18 I 9192
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4E62*E66HON N18 I 18F28
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⇋
N1:I I 19F28
THTU*A6HON N1:19F28 I 16l N1:6l I 18F28 4EA66H2NES H?+*H6HTAS EN *A THTU*A6H2N
#.%
N1:19F28 N1:I I 16*
#9%
19F28 I 1I
#8%
62NSTANTES -E EPUH*HF4H2 +¿ ¿ H ¿ −¿ H 2 BO 3
¿
¿ ¿ K e =
⇋
[ H
3
BO3
¿
]
N1:I I 19F28
→
N1:6l I 1I ⇋
18F28
+¿ ¿ NH 4 ¿ −¿ H 2 BO 3
¿
¿ +¿ ¿
H ¿ +¿
¿
H ¿
[ NH ] [ H BO ] 3
3
3
¿ +¿ NH 4
¿
¿ −¿ H 2 BO 3
¿
¿ ¿ ¿ K e =¿
62NSTANTE -E THTU*A6H2N
+¿ ¿ NH 4 ¿
[ H
3
BO3
]
¿ +¿ ¿ H ¿
[ NH H BO ] 4
2
3
¿ +¿ NH 4
¿
¿
[ H
3
BO3
]
¿ +¿ ¿
H ¿ +¿
NH 4
¿
¿ −¿ ¿ H 2 BO 3 ¿ +¿ ¿
H ¿ −¿ H 2 BO 3
¿
¿ ¿ ¿ K T =¿
*a reacci!n anterior no tiene el ion espectador cloro #6l %, adems la especie que se titula es el acido b!rico #1 8F28%)
$. ¿POR QUÉ SE PRE%IERE USAR &IDO B!RIO EN EL MÉTODO KJELDAHL? ¿POR QUÉ SE TITULA ON &IDO Y NO ON BASE? El acido b!rico #18F28% es usado para titular el amoniaco debido a que con este solo se necesita una soluci!n estandari(ada, mientras que si se usa un acido fuerte como el 16l o 19S2: se necesitan dos soluciones estndar, el $idr!xido de sodio " el acido fuerte) No solo por a$orro de reactivos, sino porque los clculos son obtenidos directamente usando acido b!rico " se tiene un menor error asociado a la cantidad de nitr!geno de la muestra) A través de las graficas proporcionadas por el texto se puede distinguir que la titulaci!n con acido es ms eficiente "a que a pesar de la concentraci!n el p$ en el punto de equivalencia tiende a tener una tendencia central que es aproximadamente B,9B,8Q as& mismo con los compuestos cidos como titulantes se tiene que el error asociado a la
titulaci!n es menor =cercano a cero>) -e esta forma, teniendo el acido b!rico como receptor del amoniaco se tiene la venta'a que no acta como un buffer cuando se encuentra cerca al p1 en el punto de equivalencia " debido a esto la reactividad de la reacci!n aumenta " es ms fcil la titulaci!n, aunque segn el texto esto puede suponer también un problema, referente a la retenci!n del amoniaco en la muestra)
