Descripción: cuestionario con respues acerca de libro de costos
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Descripción: los componentes de la distribución física internacional son los costos indirectos y directos
ps
Metodos directos e indirectos para calcular la curva de crecimiento microbiano
procesos inmunologicos en la salud humana
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Analisis de costos y presupuestos
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TEMA 14 Métodos inmunológicos para la identificación microbiana
Tema 14. Métodos M étodos inmunológicos para la identificac identificación ión microbiana 1. Introducción 2. Detección de antígenos 2.1. Obtención de anticuerpos 2.2. Marcado de las inmunoglobulinas 2.3. Técnicas de detección 2.3.1. Aglutinación indirecta 2.3.2. Inmunofluorescencia Inmunofluorescencia 2.3.3. Enzimoinmunoanálisis Enzimoinmunoanálisis (ELISA) 3. Detección de anticuerpos 3.1. Clases de antígenos 3.2. Muestras de suero 3.3. Pruebas serológicas 3.3.1. Aglutinación directa 3.3.2. Inmunofluorescencia Inmunofluorescencia 3.3.3. Enzimoinmunoanálisis Enzimoinmunoanálisis (ELISA)
1. Introducción Antígenos y anticuerpos son complementarios •
antígeno
posible detectar anticuerpo específico (suero)
•
anticuerpo
posible detectar antígeno específico (muestra)
Pruebas para detección de anticuerpos: pruebas serológicas (suero) Reacciones inmunológicas •
•
•
portaobjetos tubos convencionales (plástico o vidrio) 12 x 100 mm placas de microtitulación (micropocillos 8 mm ø y 12 mm alto)
2. Detección de antígenos Algunas de estas técnicas son muy útiles para el diagnóstico •
rápidas (confirmadas por otras)
•
técnicas de referencia (elevada eficacia)
Muy útiles para identificación de virus y clamidias (más rápidas, sencillas, económicas y sensibles que el cultivo) (algunas automatizadas) Se investiga un único microorganismo en cada prueba (caro y laborioso) •
•
establecer cuidadosa evaluación clínica del paciente solicitar la prueba para detectar microorganismo responsable (mayor probabilidad)
2.1. Obtención de anticuerpos Anticuerpos •
policlonales (animales inmunizados)
•
monoclonales (producidos
in vitro )
Todos los anticuerpos pueden fijarse a través de su fragmento Fc a: •
base de un pocillo de plástico
•
superficie de una membrana
Anticuerpo Sitio de unión
Antígeno •
partículas inertes (látex, gelatina, oro coloidal)
Fragmento o región Fc
2.2. Marcado de las inmunoglobulinas Inmunoglobulinas marcadas sirven para detectar antígenos y otros anticuerpos Marcado del fragmento Fc con: •
Enzimas (β-galactosidasa, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano) - actúan sobre sustrato - transformación en producto coloreado (o diferente color)
•
Sustancias fluorescentes (isotiocianato de fluoresceína, rodamina, umbeliferona, lantánidos) - producen luz cuando son excitadas por radiación incidente
2.3. Técnicas de detección Si el microorganismo buscado no está en la muestra •
los anticuerpos no se unen a él
•
no se produce señal
Si el microorganismo está presente en la muestra •
los anticuerpos se unen a él
•
se producirá el efecto o la señal correspondiente - aglutinación - cambio de color del sustrato - fluorescencia - luz
2.3.1. Aglutinación indirecta Anticuerpos adheridos por región Fc a: •
•
partículas grandes de látex (poliestireno, 1-5 µm) otras partículas inertes
Facilita la observación de la aglutinación: •
formación de grumos (de gran tamaño)
Permite detección de antígenos solubles (polisacárido) Realizable sobre portaobjetos
2.3.1. Aglutinación indirecta Rápida (minutos) Generalmente menos sensible que enzimoinmunoanálisis Salvo excepciones no muy adecuada para detectar antígenos víricos (menor cantidad que bacterianos)
2.3.2. Inmunofluorescencia Directa (IFD) Anticuerpos marcados con sustancias fluorescentes •
se fijan a los microorganismos
Microscopio de fluorescencia •
microorganismo brillante sobre fondo oscuro
Virus •
•
no pueden ser observados (pequeño tamaño) se pueden detectar proteínas víricas (producidas durante multiplicación) - anticuerpos específicos para esas proteínas
2.3.2. Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) Utiliza dos anticuerpos: - Primero •
no marcado
•
se une al antígeno
- Segundo •
•
•
dirigido contra el primero (anti-anticuerpo) está marcado permite revelar diferentes anticuerpos específicos no marcados
2.3.2. Inmunofluorescencia
2.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA) ELISA: enzyme linked immunosorbent assay Método directo Anticuerpos fijados en base de pocillo de placa de microtitulación o membrana de nitrocelulosa (específicos del antígeno buscado). Se añade muestra al pocillo: antígeno presente Se añade segundo anticuerpo •
dirigido contra el antígeno
•
marcado con enzima
reacción Ag - Ac
2.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA) Técnica en pocillos
Técnica sobre nitrocelulosa
2.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA) Método indirecto (“sandwich”) Anticuerpos (generalmente monoclonales) fijados en base de pocillo de placa de microtitulación o membrana de nitrocelulosa (específicos del antígeno buscado). Anticuerpo anti-Ig unido a enzima
Se añade muestra al pocillo •
antígeno presente
reacción Ag - Ac
Se añade un segundo anticuerpo •
•
Sustrato incoloro
Anticuerpo de detección
Producto coloreado
generalmente policlonal dirigido contra el antígeno
Antígeno diana
Se añade un tercer anticuerpo •
dirigido contra el segundo anticuerpo
•
marcado con enzima
Anticuerpo de fijación (o de captura)
2.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA) Se añade sustrato (incoloro)
Enzima
Sustrato sin color
Actúa enzima sobre sustrato Aparece color •
Segundo anticuerpo (o tercero)
se puede medir intensidad (colorímetro)
Si no existe antígeno buscado •
no es retenido en el pocillo
•
es eliminado mediante lavado
•
al añadir sustrato no se produce color
Producto coloreado
3. Detección de anticuerpos Método de diagnóstico indirecto Detectan anticuerpos formados frente al microorganismo (en suero del paciente) Técnicas semejantes a las descritas para la detección de antígenos La mayoría permiten cuantificar los anticuerpos del suero 3.1. Clases de antígenos Naturales •
microorganismos íntegros
•
extractos antigénicos (más o menos purificados) obtenidos de ellos
Recombinantes •
se obtienen por ingeniería genética
3.2. Muestras de suero Extraer sangre (5-10 mL) Dejarla coagular (temperatura ambiente, 20 minutos) Centrifugar 1.000-1.200 g, 10 minutos (separar el suero) Guardar suero 4-6ºC (una semana; -20ºC (años, si se evita descongelar y congelar repetidamente) 3.3. Pruebas serológicas Todos los resultados se refieren a anticuerpos totales Aglutinación directa, inmunofluorescencia y enzimoinmunoanálisis (más utilizadas) 3.3.1. Aglutinación directa Portaobjetos, tubos de ensayo o placas de microtitulación Antígeno (suspensión del microorganismo); si hay anticuerpos en el suero, se produce aglutinación
