MICROBIOLOGIA LABORATORIO

Universidad Andrés Bello Facultad Ciencias Biológicas Departamento de Ciencias Biológicas Laboratorio de Microbiología

GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS MICROBIOLOGÍA BIOL 150 2015

CARRERA: ENFERMERÍA

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS 1. Identificación de la Asignatura CURSO

: MICROBIOLOGÍA GENERAL

CÓDIGO

: BIOL 150

CARRERA

: ENFERMERÍA

TIPO DE ACTIVIDAD:

TEÓRICO-PRÁCTICO

HORARIO DE CLASES: Sección 1: Martes: 14:55-16:35 hrs (Módulos 8-9), Viernes: 13:05-14:45 hrs (Módulos 6-7). Sección 2: Viernes: 10:20-12:00 hrs (Módulos 3-4), Lunes: 12:10-13:50 hrs (Módulos 5-6). Sección 3: Viernes: 13:05-14:45 hrs (Módulos 6-7), Martes: 14:55-16:35 hrs (Módulos 8-9). HORARIO LABORATORIO:

Lu 1-2/ Ma 1-2 (08:30-10:10): SECCIONES 4-5-6-7-12-13. Lu 3-4/ Ma 3-4 (10:20-12:00): SECCIONES 8-9-10-11-14-15.

2. Profesores Prof. Coordinador de la asignatura: Dr. Rodrigo Villanueva ([email protected]) Profs. Encargados de Cátedra: Dr. Rodrigo Villanueva/Dra. Paula Rodas ([email protected], Sección 1) Dr. Rodrigo Villanueva/Dra. Paula Rodas (Sección 2) Dra. Pamela Machuca ([email protected], Sección 3) Prof. Coordinadora de Laboratorio: Mg. Camila Miranda ([email protected]) Profs. Laboratorio: Mg. Karina Espinoza ([email protected]) (karinafespinoza [email protected]) Mg. Valeska Herrera ([email protected]) Mg. Luis Saona ([email protected]) Lic. Rhonda Veas ([email protected]) Lic. Pía Viera ( [email protected])  pia.vierav@gmai l.com) Dra. Pamela Machuca ([email protected]) Dr. (C) Ignacio Fuentevilla ([email protected]) ([email protected]) Secciones de laboratorios: Sección 4: Prof. Camila Miranda/Rhonda veas Sección 5: Prof. Rhonda Veas/Camila Miranda Sección 6: Prof. Ignacio Fuentevilla /Pía Viera Sección 7: Prof. Pía Viera /Ignacio Fuentevilla Sección 8: Prof. Pamela Machuca/ Karina Espinoza Sección 9: Prof. Karina Espinoza/Pamela Machuca Sección 10: Prof. Pía Viera /Rhonda Veas Sección 11: Prof. Rhonda Veas/ Pía Viera Sección 12: Prof. Valeska Herrera/Karina Espinoza Sección 13: Prof. Karina Espinoza/Valeska Herrera Sección 14: Prof. Camila Miranda/ Luis Saona Sección 15: Prof. Luis Saona/Camila Miranda

3. Cronograma de las actividades teóricas BIOL 1050T-1 y BIOL 150T-3 Ma 4 de Agosto

BIOL 150T-2 Lu 3 de Agosto

Vi 7 de Agosto

Vi 7 de Agosto

Ma 11 de Agosto

Lu 10 de Agosto

Fisiología Bacteriana

Vi 14 de Agosto

Vi 14 de Agosto

Metabolismo y Crecimiento Bacteriano

Ma 18 de Agosto

Lu 17 de Agosto

Genética Bacteriana I

Vi 21 de Agosto

Vi 21 de Agosto

Genética Bacteriana II

Ma 25 de Agosto

Lu 24 de Agosto

Antimicrobianos y Resistencia I

Vi 28 de Agosto

Vi 28 de Agosto

Antimicrobianos y Resistencia II

Ma 1 de Septiembre

Lu 31 de Agosto

Relación hospedero-parásito hospedero-parásit o

Vi 4 de Septiembre

Vi 4 de Septiembre

Infecciones estafilocócicas estafilocóci cas

Ma 8 de Septiembre

Ma 8 de Septiembre

Ma 22 de Septiembre

Lu 21 de Septiembre

SOLEMNE I Módulos 12 y 13 Infecciones Estreptocócicas Estreptocócica s

Vi 25 de Septiembre

Vi 25 de Septiembre

Infecciones por bacilos Gram +

Ma 29 de Septiembre

Lu 28 de Septiembre

Enterobacterias Enterobacteria s I

Vi 2 de Octubre

Vi 2 de Octubre

Enterobacterias Enterobacteria s II y bacilos no fermentadores

Ma 6 de Octubre

Lu 5de Octubre

Vi 9 de Octubre

Vi 9 de Octubre

Ma 13 de Octubre

Vi 16 de Octubre

Bacterias nutricionalmente exigentes. Neisserias, Neisseria s, Espiroquetas y otras ETS TBC. Bacterias Especiales (Micoplasmas, (Micoplasmas , Clamidias y Rickettsias) Micología. Generalidades

Ma 20 de Octubre

Ma 20 de Octubre

Vi 23 de Octubre

Vi 23 de Octubre

Ma 27 de Octubre

Lu 26 de Octubre

Vi 30 de Octubre

Vi 30 de Octubre

ACTIVIDAD Presentación del Curso Introducción Filogenia y Taxonomía Morfología y Agrupaciones

SOLEMNE II Módulos 12 y 13 Micosis superficiales superficiale s y oportunistas Micosis profundas patógenas Drogas antifúngicas Virología. Generalidades Replicación viral

Ma 3 de Noviembre

Lu 2 de Noviembre

Virus de importancia médica I

Vi 6 de Noviembre

Vi 6 de Noviembre

Virus de importancia médica II y III

Ma 10 de Noviembre

Lu 9 de Noviembre

Vi 13 de Noviembre

Vi 13 de Noviembre

Ma 17 de Noviembre

Lu 16 de Noviembre

Conceptos Generales de parasitología y Enteroparasitosis  Nemátodos Intestinales I Nemátodos Intestinales II Céstodes Intestinales Protozoos Intestinales Helmintos Tisulares

Vi 20 de Noviembre

Vi 20 de Noviembre

Ma 24 de Noviembre Ma 24 de Noviembre Vi 27 de Noviembre

Vi 27 de Noviembre

Mi 9 de Diciembre

Mi 9 de Diciembre

Protozoos Tisulares

SOLEMNE III Módulos 12 y 13 Artrópodos de interés médico Malaria, amebas de vida libre EXAMEN Módulos 7 y 8

4. Cronograma de las actividades prácticas

Fecha

Sección

ACTIVIDAD

10 Agosto

4-6-8-10-12-14

01. Presentación del curso

11 Agosto

5-7-9-11-13-15

01. Presentación del curso

17 y 18 Agosto

4-6-8-10-12-14

02. Procedimientos Básicos

24 y 25 Agosto

5-7-9-11-13-15

02. Procedimientos Básicos

31 Ago y 1 Sept

4-6-8-10-12-14

03. Morfología Bacteriana

7 y 8 Sept

5-7-9-11-13-15

03. Morfología Bacteriana

21 y 22 Sept

4-6-8-10-12-14

04. Muestras Clínicas Gram + y Flora Normal

28 y 29 Sept

5-7-9-11-13-15

04. Muestras Clínicas Gram + y Flora Normal

5 y 6 Oct 2014

4-6-8-10-12-14

05. Muestras Clínicas Gram – y Antibióticos

19 y 20 Oct 2014

5-7-9-11-13-15

05. Muestras Clínicas Gram – y Antibióticos

26 Octubre

4-6-8-10-12-14

06. Levaduras y Hongos Filamentosos

27 Octubre

5-7-9-11-13-15

06. Levaduras y Hongos Filamentosos

16 Nov 2014

4-6-8-10-12-14

07. Parasitología

17 Nov 2014

5-7-9-11-13-15

07. Parasitología

23 Nov 2014

Todas las secciones

00. Controles Recuperativos

23 Nov 2014

Todas las secciones

00. Revisión controles e informes

5. Requisitos de asistencia La asistencia a clases teóricas debe ser superior al 80%. La asistencia a los laboratorios debe ser de 100%. La justificación de inasistencia a alguna actividad se debe realizar en la Dirección de la Escuela de Enfermería. Los alumnos deberán presentar una fotocopia validada del certificado médico o similar al  profesor encargado de cátedra o laboratorio (según corresponda) dentro de los 7 días hábiles después de  presentado el justificativo. Más de un 20% de inasistencia (incluso justificada) equivale a la Reprobación automática del curso. La puntualidad para las actividades prácticas es indispensable, ya que los controles de entrada se realizarán durante los primeros 10 minutos. El alumno que llegue al laboratorio después de ese tiempo será calificado con nota 1,0. Si un alumno llega con un atraso superior a 30 minutos, no podrá realizar la actividad  práctica y la situación será considerada como inasistencia.  No se permitirán cambios de sección en los trabajos prácticos, cada alumno debe permanecer en la sección que le corresponde durante todo el semestre.

5. Condiciones para aprobar el curso: El curso se aprueba con nota final igual o superior a 3.95, según la planilla de cálculo del sistema en Intranet. La nota de presentación se calculará de acuerdo a los siguientes parámetros: TEÓRICO: La ponderación de la parte teórica del curso corresponde al 70% de la nota de presentación , según: Prueba Solemne I: 25%, Prueba Solemne II: 25%, Prueba Solemne III: 20%. PRÁCTICO: La ponderación de la parte práctica del curso corresponde al 30% de la nota de presentación , según: 1) Controles de entrada: 70%, 2) Informes: 30%. El promedio de las actividades señaladas con la ponderación establecida corresponde a la nota de  presentación.

PROMEDIO FINAL: 1) Nota presentación: 70% 2) Examen Teórico!Práctico: 30% Los alumnos que sean sorprendidos en actividades irregulares (copia, uso de torpedos, plagio, etc) en  pruebas solemnes, controles de laboratorio, informes de laboratorio, pruebas parciales o durante el examen final, serán evaluados con nota 1,0 en esa actividad. Particularmente, se considerará plagio la facilitación y/o utilización de información de otros grupos del curso, así como el uso de información de internet sin citar con su respectiva referencia bibliográfica. Los alumnos que presenten bloqueos de cualquier tipo y no aparezcan en las listas oficiales tienen como plazo máximo para regularizar su situación el día Lunes 14 de Septiembre , de lo contrario no podrán hacer ingreso a la sala de clases.

6. Prueba Recuperativa Ante la inasistencia a una Solemne, se considerará el Examen como prueba recuperativa. Sólo tendrán derecho a Prueba Recuperativa aquellas inasistencias debidamente justificadas ante la Escuela de Enfermería.

7. Condiciones de eximición Se eximirán del examen final SÓLO los alumnos que alcancen una nota 4,95  ó superior que NO hayan obtenido ninguna nota roja en las pruebas solemnes ni en los controles e informes del laboratorio (Condiciones establecidas que se rigen según el Reglamento del Alumno de Pregrado, Artículo 40).

8. Metodología de actividades académicas El curso se desarrollará a través de clases teóricas presenciales, distribuidas en 4 horas semanales, con uso de material audiovisual y guías de apoyo. Los trabajos prácticos se desarrollarán en los laboratorios de microbiología con actividades programadas para que cada alumno manipule material microbiológico y aprenda las técnicas básicas de la microbiología, bajo la supervisión de dos profesores por sala. Los controles son de tipo verdadero y falso, donde solo las preguntas falsas se responden de la siguiente manera: Pregunta1:  __F_ El pasto es azul. Respuesta:  El pasto es verde .  No se evaluaran como respuestas correctas si Ustedes justificaran que el cielo es azul. Porque no se le esta  preguntando por el cielo, sino que por el pasto.

Informes: Durante cada trabajo práctico los alumnos deberán entregar un informe de las actividades realizadas, los resultados obtenidos y la correspondiente discusión de estos, para esto los alumnos realizaran un informe  pre-establecido, el cual se completara durante las secciones practicas de laboratorio. Los informes se deben completar con los datos solicitados según corresponda en cada actividad práctica. En los informes se evaluarán los resultados obtenidos (si fueron realizados correctamente los objetivos del practico) y las metodologías utilizadas. Los grupos de trabajo son de DOS PERSONAS, las cuales deben trabajar juntas durante todo el semestre, SIN DERECHO A SEPARARSE.

Formas de citar las referencias en el informe: En los informes la bibliografía debe ser escrita de forma correcta, según su procedencia. Algunos ejemplos: 1. Artículos en revistas: Nombre Autores, Año de publicación, Nombre Revista, Volumen, Páginas. Ej: Woese, C.R., 1987, Bacterial evolution, Microbiol. Rev., 51:221!271. 2. Libros: Nombre Autores, Nombre Libro, Año de publicación, Edición, Editorial, Páginas. Ej: Madigan M. T., Martinko J. M., Dunlap P. V. y Clark D. P., Brock. Biología de los Microorganismos. 2009, 12 ed., Editorial Pearson Educación, 125 – 135. 3. Electrónicas: Temas principal, tema específico, fecha de cuando se utilizó, dirección electrónica. Ej: Parásitos Intestinales, Ascaris, sábado 1 de enero 2011, http://www.hnt.cl/p4_hospital/site/pags/20040405111759.html Las citas electrónicas deben provenir de sitios confiables como Universidades, Sociedades Científicas, Sitios de revistas electrónicas, etc. No se permitira la utilizacion de sitios como wikipedia, rincon del vago, etc.

9. Eliminación de nota:  No se eliminará ninguna de las notas obtenidas en las pruebas solemnes, ni en el laboratorio.

10. Normas de disciplina Durante todas las actividades, los alumnos deben cumplir las siguientes condiciones: - Disciplina: Las normas de orden y disciplina deben ser mantenidas durante todas las actividades. Esto significa que no pueden hacer uso de telefonía celular u otra forma de comunicación mientras se encuentren dentro de la sala de clases. Los estudiantes no podrán salir/retirarse de la sala de clases sin previa autorización del profesor encargado. En cuanto a las normas de respeto y sana convivencia, se exigirá un lenguaje adecuado y un comportamiento acorde a un estudiante universitario. !

-

Participación: Se espera participación activa en clases teoricas y practicas, por lo que el alumno debera tener conocimiento de los contenidos que se abordaran en la clase y de materias anteriores. En todas las clases se realizarán interrogaciones orales sorpresas de materia del práctico correspondiente o prácticos pasados, una buena respuesta conlleva a una evaluación positiva, de lo contrario una mala respuesta será evaluada con puntaje negativo, reflejado dicho puntaje en el control. Evaluación: Cada alumno es responsable de traer consigo lápiz, goma y corrector. No se aceptarán  préstamos entre los alumnos mientras se realice la evaluación.

Queda estrictamente prohibido el uso de celulares dentro de la sala, por lo que se solicita apagar ! silenciar estos previo al ingreso a las actividades del curso. Ademas, el uso de grabadoras, mp 3, mp4, etc. durante las evaluaciones y revisiones de las solemnes y controles queda extrictamente prohibido. La asistencia al laboratorio es obligatoria, y de la misma manera es obligatorio el cumplimiento de las siguientes normas: Asistencia con delantal blanco y calzado apropiado (cerrado). En caso que el alumno(a) tenga pelo largo debe asistir al laboratorio con este tomado con un moño tipo tomate. • •

•

 No se puede ingresar ingres ar al laboratorio laborat orio con mochilas, bufandas, pañuelos, etc  por lo que cada alumno al umno debe llevar un candado c andado para dejar sus pertenencias pertenenci as en las gavetas gave tas provistas p or la universidad.

El incumplimiento de cualquiera de estas normas imposibilita al alumno de realizar el trabajo práctico. Por otra parte, se exigirá puntualidad en el horario de salida del trabajo práctico (10:00 a.m. y 11:50 a.m.), el cual tiene una duración de 90 minutos. En caso de no cumplir con este horario, existirá un descuento en la nota de control del entrada del trabajo práctico que se está realizando. El descuento será de 0,1 puntos por cada minuto de retraso, el cual se puede extender hasta 10 minutos (correspondientes al tiempo de recreo).

TRABAJO PRÁCTICO N°1 PROCEDIMIENTOS BÁSICOS NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN LOS TRABAJOS PRÁCTICOS DE MICROBIOLOGÍA Durante el desarrollo de las actividades prácticas se debe mantener una serie de normas, cuyo propósito fundamental es la preservación de la salud del alumno, sus familias y la comunidad. 1. Cada alumno debe usar delantal blanco abrochado para evitar la contaminación de sus ropas. 2. Al comenzar y al terminar las actividades, cada alumno debe lavarse las manos. 3. El alumno debe ingresar al laboratorio con el pelo tomado, se exige moño tipo tomate. 4. Está estrictamente prohibido comer, beber, fumar, masticar chicle, o llevarse cualquier objeto a la boca, por el riesgo de contagio. 5. No ingresar bolsos, pañuelos, bufandas o chaquetas a la sala de trabajos prácticos. 6. Las asas de platino deben ser esterilizadas antes y después de su uso. Al enfriarla, evite salpicar, los aerosoles son muy contagiosos. 7. Toda pipeta Pasteur utilizada debe ser sellada y desechada en las cajas de material cortopunzante. 8. Las placas de Petri sólo deben abrirse en el momento de siembra y a una distancia menor a los 30 cm del mechero Bunsen encendido. 9. Los tubos deben flamearse (la boca del tubo) antes y después de ser utilizados. 10. Frente al derrame de un medio de cultivo o muestra debe informar al profesor, esto también se recomienda frente a cualquier accidente como quemaduras, cortaduras o contacto con material contaminado. 11. Es de primordial importancia el cuidado del microscopio. Éste sólo debe encenderse al momento de la observación de su tinción. La que debe retirarse terminada la observación (y ser eliminada donde corresponde), y para limpiar el objetivo 100 x se utiliza solución limpia lentes y papel tissue. 12. Las superficies de trabajo deben ser descontaminadas antes y después de realizado el trabajo práctico, por lo tanto en su bandeja Usted encontrara un aspersor con Etanol 70 % y algodón. El estudio de bacterias, virus, parásitos y hongos potencialmente patógenos para el hombre, animales u otros seres vivos, involucra riesgos dependientes del agente infecciosos y los procedimientos empleados. Las normas de bioseguridad buscan reducir a un nivel aceptable el riesgo asociado a su manipulación. Deben considerarse  para lograr que el personal que manipula estos agentes infecciosos en el ámbito hospitalario estén mínimamente expuestas a adquirir una enfermedad infecciosa o de otro tipo.

BIOSEGURIDAD: corresponde al conjunto de medidas protectivas, destinadas a proteger la salud de las  personas frente a los posibles riesgos asociados a los agentes biológicos, físicos o químicos quím icos en el laboratorio, como también indirectamente al ambiente.

AGENTE INFECCIOSO: todo microorganismo, incluidos los genéticamente modificados, presentes en forma latente y los portados por el personal de salud, capaces de originar cualquier infección, alergia o toxicidad.

CONTROL DE LA CONTAMINACIÓN EN EL LABORATORIO El laboratorio tiene importancia central en el diagnóstico etiológico, de modo que resulta fundamental evitar la contaminación de las muestras, ya sea desde el operador como desde las otras muestras (contaminación cruzada). Con este fin, se debe trabajar con TÉCNICA ASÉPTICA y utilizando material ESTÉRIL. Algunos conceptos que debemos conocer y manejar son:

DESINFECCIÓN:  proceso que busca eliminar la mayoría de los microorganismos mi croorganismos patógenos, patóge nos, excepto esporas espora s y algunos virus, en objetos inanimados .

ASEPSIA:  proceso que utiliza agentes químicos para impedir infección de piel, mucosas u otros tejidos en seres vivos. Los antisépticos actúan provocando muerte de los microorganismos patógenos o impidiendo su multiplicación.

SANITIZACIÓN O HIGIENIZACIÓN: Proceso que utiliza lavado mecánico o agentes químicos para REDUCIR el número de patógenos presentes en un objeto hasta niveles aceptables para la salud pública.

ESTERILIZACIÓN:  proceso físico o químico destinado a destruir TODA vida microbiana, incluyendo esporas, en materiales u objetos inanimados .

TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN 1.- Métodos Físicos a) Calor Es el método más usado, económico y fácil de controlar. Proceso rápido al cual la totalidad de los microorganismos resulta sensible.

Pasteurización: uso para prevenir infecciones asociadas a productos lácteos (Tuberculosis, Brucelosis, Salmonelosis) y retrasar descomposición de la leche.

Autoclave (vapor saturado a presión): Entre los métodos de esterilización, es el más efectivo y de menor costo; es el método de elección para instrumental médico de uso repetido.

Llama y flameado: utilizado para esterilizar asas de siembra en el laboratorio. A través del flameado se evita la contaminación de tubos y matraces., al someterlos directamente a la llama.

b) Radiaciones Rayos ultravioleta (U.V) : lesionan el DNA bacteriano, inhibiendo la correcta replicación del DNA durante la replicación celular. Se usa principalmente en ambientes de quirófanos, sala de prematuros, esterilización de superficies.

Radiaciones ionizantes : los rayos gamma principalmente, son utilizados para esterilización en frío de materiales desechables como: jeringas, bisturís, catéteres, prótesis, guantes de cirugía y equipos de transfusión.

2.- Métodos Mecánicos Ondas sónicas y ultrasónicas : afectan el metabolismo bacteriano, produciendo desnaturalización de proteínas y muerte celular.

Filtración: usado en el control de microorganismos presentes en sustancias líquidas o gases, mediante su paso a través de sustancias porosas denominadas filtros. Su utilidad principal es la esterilización de sueros o líquidos que contengan proteínas o metabolitos termolábiles.

3.- Métodos Químicos (antisépticos y desinfectantes) La penetración de estos agentes es más rápida en bacterias Gram positivo, debido principalmente a la presencia  protectora de la membrana externa en las bacterias Gram negativo. Los agentes químicos pueden causar ocasionalmente infecciones nosocomiales al encontrarse contaminados con bacterias, siendo el género  Pseudomonas el más habitual. Esto es de suma importancia y para evitarlo es imprescindible que el personal de salud cuente con un acabado conocimiento del tema. El siguiente cuadro resume los principales agentes químicos y su utilidad

AGENTE Alcoholes 70% Cloro Yodo/povidona yodada

ACCIÓN Sobre formas vegetetivas (no esporas). Desnaturaliza  proteínas. Bactericida. Actúa oxidando grupos sulfhidrilos libres.

APLICACIÓN Piel y superficies inertes

Útiles de cocina, chatas,  patos, baños, unidades de diálisis Bactericida. Actúa sobre formas vegetativas y esporas, Piel heridas, material hongos y algunos virus. Interfiere procesos de oxido – quirúrgico reducción y fosforilación bacterianos.

TÉCNICAS BÁSICAS DE MICROBIOLOGÍA El objetivo principal del práctico es la adquisición de conocimientos básicos en lo que respecta a la manipulación de cultivos bacterianos. Esto incluye manejo del concepto de esterilidad, siembra en medios líquidos, en medios sólidos (diferenciales, selectivos, etc) y siembra en condiciones anaeróbicas. El cumplimiento de las tareas en microbiología clínica exige la realización de tres actividades: la primera de ellas, aislamiento e identificación de microorganismos, se inicia con el cultivo de las muestras de distinto origen, en medios específicos y en condiciones definidas, y va seguido de examen microscópico y pruebas  bioquímicas al microorganismo aislado; la segunda actividad, involucra el conocimiento de la resistencia o sensibilidad a antibióticos, biotipificación y serotipificación; y por último, la tercera actividad involucra la identificación epidemiológica o comparación de los aislamientos de la misma especie con el fin de hacer el control de la infección o análisis de población. Para poder realizar la primera de estas actividades, es imprescindible contar con un cultivo puro  que debe ser mantenido en condiciones de laboratorio, para esto es necesario e indispensable emplear material completamente estéril (Tabla Nº 1). Para poder mantener las bacterias en condiciones de laboratorio se utiliza otro procedimiento importante en el área de la microbiología que es la siembra o cultivo. Esta consiste en colocar a los microorganismos en un ambiente adecuado para que se desarrollen y multipliquen. En el laboratorio este medio ambiente lo constituyen los medios de cultivo corrientes o básicos y especiales, operación que debe realizarse en forma aséptica. Generalmente las muestras contienen una flora mixta, que se manifiesta por el desarrollo de distintas especies bacterianas: algunas son saprófitas (flora normal) o contaminantes del proceso de muestreo y otras son las que tienen un rol patógeno. Obtener una cepa bacteriana aislada significa, por lo tanto, obtener un cultivo en estado de pureza, condición indispensable para poder estudiar sus características morfológicas y bioquímicas y lograr así su identificación correcta. Si en la placa de agar ha crecido más de un tipo de bacterias, se debe realizar el aislamiento de UNA colonia a otro medio de cultivo semejante o a medios selectivos. En el caso de los medios líquidos, una vez obtenido el crecimiento bacteriano, se debe realizar un aislamiento de UNA gota o UNA asada del cultivo a un medio sólido para obtener colonias aisladas y puras (Tabla Nº 2). Si fuese necesario, las colonias se someterán a uno o más re-aislamientos, hasta obtener cultivos puros, es decir que todas las colonias sean similares, presenten la misma morfología y microscópicamente correspondan a un solo tipo de bacteria. Sólo en este momento se puede proceder a la identificación de la especie bacteriana mediante el traspaso de UNA sola colonia a una batería de medios de identificación.

MORFOLOGÍA BACTERIANA: ANÁLISIS MACROSCÓPICO Una etapa importante y básica en el estudio de las características de una bacteria, es la observación de su morfología. Como consecuencia del pequeño tamaño que presentan no es posible distinguirlas a simple vista y, debido a esto es que tenemos que estudiar poblaciones bacterianas, llamadas colonias. Para obtener estas colonias es necesario proporcionarles a las bacterias los requerimientos necesarios de materia orgánica, iones inorgánicos y factores de crecimientos entre otros a través de un medio de cultivo. Cada colonia corresponde

en su origen a una sola bacteria que se ha multiplicado y desarrollado en un medio de cultivo sólido , hasta formar una población que se represente como una colonia visible. Por lo tanto una colonia esta formada  por millones de bacterias. El crecimiento de las bacterias en medios líquidos, no da origen a la formación de colonias. El desarrollo se evidencia mediante la turbidez del caldo, sedimento y otras características. Cabe destacar que la morfología macroscópica de las colonias (análisis macroscópico) permite un acercamiento en la identificación de los géneros bacterianos que poseen características propias de desarrollo de sus colonias, según su forma, elevación, margen, superficie, brillo, color y hemólisis (en agar sangre). Muchas especies bacterianas presentan colonias que son muy parecidas lo que hace imposible diferenciarlas solo con la observación macroscópica de estas por lo que se hace necesario además una observación microscópica de las células que conforman estas colonias. Esto datos proporcionan una orientación sobre las pruebas bioquímicas para la identificación definitiva de las colonias. En la siguiente figura se observan algunas características macroscópicas de colonias bacterianas, frecuentemente utilizadas para la descripción de una bacteria o microorganismo.

Figura Nº 1: Criterios macroscópicos para la descripción de una colonia bacteriana.

   l   a    i   r   e    t   a   m   e    d   o   p    i    T

  n    ó    i   c   a   z    i    l    i   r   e    t   s    E

  a    í   g   o    l   o    i    b   o   r   c    i    M   e    d   o    i   r   o    t   a   r   o    b   a    L    l   e   n   e   n    ú   m   o   c   o   s   u   e    d    l   a    i   r   e    t   a    M

  n    ó    i   c   a   z    i    l    i   r   e    t   s   e   o   p    i    T

  e    l    b   a   z    i    l    i    t   u     e    R

  e    l    b   a   z    i    l    i    t   u     e    R

  e    l    b   a    h   c   e   s   e    D

  e    l    b   a    h   c   e   s   e    D

  e    l    b   a   z    i    l    i    t   u     e    R

  e    l    b   a   z    i    l    i    t   u     e    R

  e    l    b   a    h   c   e   s   e    D

  e    l    b   a    h   c   e   s   e    D

  a    d   a   z    i    l    i    t   u   r   e   s   e    d   s    é   u   p   s   e    D

   í    S

   í    S

  o    N

   i    S

   i    S

   i    S

  o    N

   i    S

  a    d   a   z    i    l    i    t   u   r   e   s   e    d   s   e    t   n    A

   í    S

   í    S

  o    N

  o    N

   i    S

   i    S

  o    N

  o    N

  o   r   e    h   c   e   m    l   e    d   a   m   a    l    l   a    l   a   o    t   c   e   r    i    D

  o   r   e    h   c   e   m    l   e    d   a   m   a    l    l   a    l   a   o    t   c   e   r    i    D

  a   c    i   m    í   u    Q

  o   r   e    h   c   e   e   e   e   v   v   M   v   a   a   a    l    l   a    l   c   c   c   o    t   o   m    t   o    t   a   u   u   l   u    A    A   L    A

  e   v   a    l   c   o    t   u    A

  a   c    i   m    í   u    Q

  e    t   n   e    b   r   o   s    b    A    l   e   p

  o   c    i    t   s    á    l   p   e    d

   *

  o   n

  o    i   r    d    i   v   e    d   s   a    d

  o   c    i    t   s    á    l   p   e    d   s   a    d

   *

  o    i   r    d    i   v   e    d   r   u   e

   *    *

  s   e

  o    i   r    d    i   v   e    d

  o   r    l   a   r    t   a    i   p   v   a   e    t   s   e   e    d    d   n  ,   e    l    t   a   e    t   r   n   p   o   o   z    t    i   r   n   o   e    i    h   m   a    i    d   m  .   r   r   e   o   i   o   c    f   r   o   e   r   n   f   e   n   p   e    i    t   o   r   s    d   o    E   n   m  .    i    l   e   o    i   r    l    t   r   c   a    l   x   e   e   r   r   e   r   u   e   s   c   n   r   a   o   a   r   p   c   o   e   e   t   v    b   o    l   e   n   o   v    d   e   e   e   s   d    d  ,   a   s   r   e   o   s   e    t   n   a   c   n   a   a   r   m    t   e   e   e   m   d   n   e    i   r  ,   m   p   t   a   a    l   e    t   a   e   p    i    d   n   i   e    E   p   a   m  .    l   s   n   e   r    l   e    i    i   n   r    l   v    ó    é    i    t   o   s   v   c   e   n   a   r   a   e   e   y   s   p   e  ,    l    d   o   e   e    l   p   b   a   r   a   e    i   p   d    t   e   n   e   e   s   p   r   s   o   e   a   s   y    t    l   a   a   e   c   c   u   o   o   v   d    b   n   n   e   u   o   u   g   s  .   e   s   s   r   o   o   l   a   e   b   c   u    i    l   e   m   a   t    á   n    l    l    t    f   e   e   e  ,   e   d   m  s    b   r   a   o   s   t   e   i   r    d   o   r   o   e   r   e    d   s   s   t   n   n   l   a    i    i  ,    l    l    i   s    l    i   r   a   c   o    é   e   n   d    t   r   e   e   s    i   e   a    d   r   o   l   a   s    b   r   e    t    l   o   u   d   n    t   o   n   n   s   c   o   o   n   c   u   m   e   r   e   s   p   i   n   a   a   n   e   c    t   o   s   a    d   t   g   e   n   e   r   u   i   o   p   s    d   o   e   r   e   a   s   i   c   s   t   e   e    l   u   m   a   i   p    i   r   p   q   e

ACTIVIDADES PRÁCTICAS (PRIMERA SESIÓN)

1. De medios Sólidos a medios Sólidos (técnica de aislamiento en cuadrantes). 1.1. Desde placa Petri a placa Petri: a. Rotular el tubo de agar con los datos correspondientes (Nombre del microorganismo, Grupo y Fecha).

 b. Flamear el asa en argolla (loop) para su esterilización. c. En la placa Petri con la muestra, enfriar el asa en las zonas del agar donde no existan colonias.

d. Tomar una muestra con el asa desde el medio sólido con la bacteria en estudio, la muestra se tomara una sola vez ( Con

solo tocar la colonia estará tomando la cantidad de bacteria suficiente para poder sembrar ). e. Colocar la tapa de la placa sobre el mesón cerca del mechero. f. Tomar la placa por su base y realizar la siembra mediante estrías, para ello: i. Deslizar el asa con la muestra en forma de zig – zag en un pequeño sector de la  placa. Flamear el asa. ii. A partir del sector ya sembrado en la placa, deslizar el asa hacia el sector contrario de la placa nuevamente en forma de zig – zag. Flamear el asa. iii. A partir de las últimas líneas realizadas, deslizar el asa hacia el sector contrario de la placa en forma de zig-zag. Flamear el asa. iv. Repetir el procedimiento descrito en iii.) hasta completar la placa. Tener cuidado de que cuando se hacen las estrías en ii.) y iii.) no tocar las que ya se encuentran en la placa. g. Tapar la placa y flamear el asa para su esterilización.

Figura Nº 2: Siembra desde medio solido a medio solido (placa de Petri

2. De medios Sólidos a medios Líquidos. 2.1. Desde placa Petri a tubo con medio líquido: a. Rotular el tubo de caldo con los datos correspondientes (Nombre microorganismo, Grupo, Fecha).

 b. Flamear el asa en argolla (loop) para su esterilización. c. Enfriar el asa en las zonas del agar donde no existan colonias. d. Tomar una muestra con el asa desde el medio sólido con la bacteria en estudio ( Con solo tocar la colonia estará tomando la cantidad de bacteria suficiente para poder sembrar). e. Flamear la boca del tubo con medio líquido.

f. Introducir el asa dentro del tubo con caldo y agitar vigorosamente. g. Flamear la boca del tubo y el asa para su esterilización.

A

B

C

D

18 – 24 Hrs.

Figura Nº 3: Siembra desde agar en placa Petr i a Tubo con caldo de cultivo.

3. De medios Líquidos a medios Sólidos 3.1. Desde tubo con cultivo bacteriano líquido a placas de Petri: a. Rotular la placa en el reverso ( por donde se encuentra el agar ) con los datos correspondientes.

 b. Flamear el asa en argolla (loop) para su esterilización. c. En la placa Petri con la muestra, enfriar el asa en las zonas del agar donde no existan colonias.

d. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo e introducir el asa hasta el fondo. Posteriormente, agitar suavemente el asa y retirarla. e. Flamear y tapar la boca del tubo. f. Colocar la tapa de la placa sobre el mesón cerca del mechero.

g. Tomar la placa por su base y realizar la siembra mediante estrías, para ello: v. Deslizar el asa con la muestra en forma de zig – zag en un pequeño sector de la  placa. Flamear el asa. vi. A partir del sector ya sembrado en la placa, deslizar el asa hacia el sector contrario de la placa nuevamente en forma de zig – zag. Flamear el asa. vii. A partir de las últimas líneas realizadas, deslizar el asa hacia el sector contrario de la placa en forma de zig-zag. Flamear el asa. viii. Repetir el procedimiento descrito en iii.) hasta completar la placa. Tener cuidado de que cuando se hacen las estrías en ii.) y iii.) no tocar las que ya se encuentran en la placa.

h. Tapar la placa y flamear el asa para su esterilización.

A

B

C

D

18 – 24 Hrs. 4. Figura Nº 4: Siembra desde cultivo bacteriano líquido a agar en placa Petri.

5. De medios Líquidos a medios Sólidos (Zig-zag superficie). 5.1. Desde tubo de cultivo bacteriano líquido a tubo con Agar tendido: a.  b. c. d.

Rotular el tubo de agar con microorganismo, Grupo y Fecha).

los

datos

correspondientes

(Nombre

del

Homogenizar el tubo con la muestra por agitación. Flamear el asa en punta para su esterilización. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo y enfriar el asa en las paredes de este. Introducir el asa hasta el fondo y agitar suavemente para luego retirarla. Flamear y tapar la boca del tubo con el cultivo bacteriano. Destapar el tubo con agar tendido y flamear la boca del tubo.

e. f. g. Introducir el asa hasta el fondo. Posteriormente, en un sólo movimiento, deslizar el asa con movimientos en zig-zag ascendentes por la superficie del medio de cultivo.

h. Flamear y tapar la boca del tubo. i. Flamear el asa para su esterilización.

Figura Nº 5: Siembra desde cultivo bacteriano líquido a Tubo con agar tendido.

6. De medios Líquidos a medios Sólidos. 6.1. Desde tubo con cultivo bacteriano líquido a tubo con agar blando (Por pinchadura). a. Rotular el tubo con los datos correspondientes.  b. Homogenizar el tubo con la muestra por agitación. c. Flamear el asa en punta para su esterilización. k. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo y enfriar el asa en las paredes de este. Introducir el asa hasta el fondo y agitar suavemente para luego retirarla. l. Flamear y tapar la boca del tubo con el cultivo bacteriano. d. Efectuar la siembra del tubo con el cultivo bacteriano al tubo con el medio estéril;  para ello: i.- Destapar el tubo estéril e introducir el asa cargada sin tocar las paredes, picando el medio de cultivo al centro sin llegar al fondo del mismo. ii.- Retirar el asa con  precaución para producir el menor desgarro posible. e. Flamear la boca del tubo y tápelo. f. Flamear el asa para su esterilización. g. Incubar el tubo sembrado a la temperatura adecuada. h. Ver ejemplo del procedimiento en la Figura N°4.

7. De medios Líquidos a medios Sólidos. 7.1. Desde tubo con cultivo bacteriano líquido a tubo con agar semi tendido (Pinchadura en el fondo y zig-zag en la superficie). a. Rotular el tubo con los datos correspondientes.  b. Homogenizar el tubo con la muestra por agitación. c. Flamear el asa en punta para su esterilización. k. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo y enfriar el asa en las paredes de este. Introducir el asa hasta el fondo y agitar suavemente para luego retirarla. l. Flamear y tapar la boca del tubo con el cultivo bacteriano. d. Efectuar la siembra del tubo con el cultivo bacteriano al tubo con el medio estéril; para ello: i.- Destapar el tubo estéril e introducir el asa cargada sin tocar las paredes, picando el medio de cultivo al centro sin llegar al fondo del mismo. ii.- Al retirar el asa con precaución para producir el menor desgarro posible, en la superficie tendida pasar el asa en forma de zig-zag. e. Flamear la boca del tubo y tápelo. f. Flamear el asa para su esterilización.

Figura Nº 7: Siembra desde cultivo bacteriano líquido a Tubo con agar semi tendido.

8.

Técnicas de esterilización 7.1. Flameado a. Dividir una placa por la mitad.  b. Tomar un asa y abrir una placa de agar nutritivo y deslizarla suavemente por una mitad del c.

agar. Cerrar la placa. Flamear el asa para su esterilización, enfríela en la tapa y deslícela suavemente por la otra mitad del agar.

d. Cerrar la placa. e. Incubar la placa a 37ºC.

9.

Desinfección y Asepsia

8.1. Cloro a. Dividir una placa de agar nutritivo en dos.  b. Tomar una tórula estéril y humedecerla en suero fisiológico. c. Deslizarla rápidamente por un sector del mesón de trabajo, alejado del mechero (más de 30 cm). d. Deslizarla suavemente sobre una mitad del agar nutritivo (Zig-Zag). e. Humedecer la misma tórula con la solución de cloro, espere tres minutos. f. Ahora pasar la tórula por la otra mitad del agar (Zig-Zag). g. Incubar la placa a 37ºC por 24hr.

8.2 Yodo a.  b. c. d.

Dividir una placa en dos, por una mitad deslizar suavemente uno de sus dedos por el agar. Tome un trozo de algodón con yodo y aplíquelo en el dedo que utilizó, espere unos segundos. Pasar el dedo suavemente por la otra mitad de la placa. Incubar la placa a 37ºC.

8.3 Alcohol a. Repita los pasos realizados para la actividad del cloro.  b. Escoja otro lugar del laboratorio de amplia exposición. c. Incubar la placa a 37ºC.

ACTIVIDADES PRÁCTICAS (SEGUNDA SESIÓN) OBJETIVOS 1.

Comparar colonias bacterianas desarrolladas en distintos medios de cultivo sólido (Placas de Agar).

2.

Describir colonias de acuerdo a criterios macroscópicos.

3.

Practicar preparación de frotis bacterianos y el uso correcto del microscopio.

En la segunda sesión de trabajo práctico Ud. debe: 1. Observar y describir las colonias desarrolladas en la placa de agar, considerando los siguientes aspectos: forma, borde, elevación, superficie, características físicas (textura, color y brillo) (Figura N°1).

2. Observar el crecimiento bacteriano en los medios de cultivo líquidos y sólidos sembrados en la primera sesión. Describa lo observado. 3. Observar las placas de agar sometidas a los procesos de: esterilización, desinfección y asepsia. Describa lo observado en ambas mitades del agar. 4. Realizar análisis de morfología microscópica

4.1 Preparación de frotis bacteriano a partir de una colonia. a. Colocar con el asa una gota de agua en el centro de la lámina (del tamaño de una arveja).  b. Flamear el asa para su esterilización. c. Enfriar el asa en un sector del agar donde no exista crecimiento bacteriano. d. Obtener una pequeña muestra desde la placa. e. Mezclar la muestra con la gota de agua y esparcirla por la superficie del portaobjeto, suavemente, formando una capa delgada. f. Fijar el frotis exponiéndolo a la llama del mechero hasta que se seque.

4.2 Tinción simple a. Cubrir un frotis bacteriano con Azul de Metileno al 1%  b. Dejar reposar 2 minutos para permitir la difusión del colorante c. Lavar suavemente con agua. d. Secar con papel absorbente e. Observar al microscopio con aumento de 100X oil (USAR ACEITE DE INMERSIÓN). f. Describa lo que observa: forma, agrupación, color.

MICROSCOPIO ÓPTICO: •

•

Sistema óptico OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo. o OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta. o CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación. o o DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador. o

Sistema mecánico SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo. o PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación. o CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular o binocular. o REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los o objetivos. o TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que consigue el enfoque correcto.

USO CORRECTO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO CON ACEITE DE INMERSIÓN 1. Colocar la preparación sobre la platina del microscopio 2. Verificar que el condensador esté arriba y el diafragma abierto, ya que el objetivo de inmersión requiere mucha más luz que los objetivos secos. 3. Enfocar primero con los objetivos secos en orden creciente (4x, 10x, 40x), eligiendo la zona de interés. 4. Colocar el revólver a mitad de camino, entre el objetivo 40x y el de inmersión 100x (línea negra)

EVITANDO CUALQUIER CONTACTO DE LOS OBJETIVOS SECOS CON EL ACEITE DE INMERSIÓN. 5. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre la preparación 6. Cuidadosamente colocar el objetivo 100x en contacto con el aceite, el objetivo deberá estar  prácticamente tocando el portaobjetos, y el aceite deberá ocupar este pequeño espacio 7. Observe con los oculares, y ajuste el foco utilizando sólo el micrométrico 8. Una vez terminada la observación microscópica, LIMPIAR

CUIDADOSAMENTE EL OBJETIVO,

RETIRANDO EL ACEITE CON UN PAPEL LIMPIALENTES (PAPEL SUAVE) IMPREGNADO EN XILOL. 9.- Una vez terminado el trabajo práctico su microscopio debe quedar limpio y apagado, con la platina abajo y el revólver puesto con el objetivo menor (4x)

TRABAJO PRÁCTICO N°2 MORFOLOGÍA BACTERIANA MEDIOS DE CULTIVO Un medio de cultivo es una preparación sólida o líquida hecha específicamente para el crecimiento, almacenamiento o transporte de bacterias. Los medios líquidos pueden ser usados en tubos de ensayo o en  botellas de vidrio. Los medios sólidos se obtienen de una solución de nutrientes solidificada con agar (polisacárido obtenido de ciertas algas marinas que actúa como agente gelificante) o gelatina y se usan en  placas Petri. El agar es el agente gelificante más comúnmente usado ya que no es atacado por la mayoría de las bacterias y no se funde a 37ºC (Tº usada para la incubación de las bacterias). Los componentes esenciales, cualquiera sea el medio de cultivo y la variedad de microorganismos que se desea cultivar, son: agua, componentes nitrogenados (proteínas, aminoácidos y/o sales inorgánicas que contengan nitrógeno) y fuentes de energía (carbohidratos, proteínas o sales inorgánicas).

Algunos Medios de cultivo muy utilizados en clínica: -

Agar nutriente (corriente) : Es un medio básico usado con propósitos generales para el cultivo de

muchos tipos de bacterias. Puede enriquecerse o hacerse selectivo por la adición de sustancias adecuadas. - Agar

sangre: Es un medio enriquecido y diferencial. Se prepara en base a agar nutriente enriquecido con

5-10% de sangre. Es usado para el cultivo de bacterias nutricionalmente exigentes, como  Bordetella  pertussis (agente causal de tos convulsiva) y también para detectar hemólisis. Al calentar el agar sangre a 70-80ºC hasta obtener un color café se obtiene otro medio de cultivo denominado agar chocolate, que es más apropiado que el agar sangre para el crecimiento de ciertos patógenos, como por ejemplo  Neisseria  gonorrhoeae. - Agar

McConkey: Es un medio selectivo y diferencial, ya que contiene sales biliares y cristal violeta para

inhibir el crecimiento de Gram + (selectivo) y lactosa para distinguir aquellas bacterias que la fermentan de las que no (diferencial). En agar McConkey las bacterias entéricas que utilizan lactosa (tales como E. coli) forman colonias rojas debido a que los productos acídicos que se forman a partir de lactosa afectan el indicador de pH del medio (rojo neutro); en cambio, las especies entéricas que no usan lactosa (por ejemplo muchas cepas de Salmonella spp.) forman colonias incoloras.

Clasificación de los medios de cultivo 1.- Según estado físico: a. Sólidos (solidificados por adición de agar al medio líquido o de alguna proteína coagulada).  b.

Líquidos

c. Semisólidos

2.- Según contenido nutricional: a. Corrientes : bajo contenido nutricio (ej.: caldo de carne, agar, gelatina).  b.

Mejorados (o enriquecidos) : por adición al medio corriente de: sangre, proteínas, hidratos de carbono,

extracto de órganos o levadura. c.

Sintéticos y mínimos : Los primeros son medios de fórmula perfectamente conocida, en la cual se

emplean concentraciones exactas de sus componentes. Obedecen a propósitos bien definidos. Los segundos son también sintéticos, pero a su fórmula que no permite el crecimiento bacteriano se le adiciona uno o dos sustratos o elementos, sobre los cuales se desea conocer la actividad de una bacteria en estudio, sin interferencia de otro elemento. Al adicionar el sustrato, la bacteria crecerá sólo si esa sustancia es utilizada.

3.- Según su empleo con propósitos de diagnóstico o taxonómicos. a.

Selectivos : Son aquéllos que permiten, a la vez que evitan o retardan, el crecimiento de otros

microorganismos. La selección se efectúa mediante el control de los ingredientes del medio. ej.: cristal violeta es selectivamente bacteriostático para las bacterias Gram positivo, por lo tanto este colorante puede ser incorporado a un medio para examinar patógenos entéricos que son predominantemente bacilos Gram negativo. ej.: Agar sangre con azida de sodio, agar Petragnani.  b.

Diferenciales : Son medios nutricios que contienen un sustrato y un indicador de pH que permiten

apreciar si fue o no metabolizado este compuesto, lo cual permite con un conjunto de pruebas de este tipo clasificar una bacteria, es lo que se llama "Taxonomía sobre base de pruebas bioquímicas". Muchos de estos medios sólidos diferenciales contienen uno o más hidratos de carbono fermentables y un indicador adecuado para la determinación de la producción de ácidos o compuestos alcalinos. ej.: citrato (Simmons), agar triple azúcar hierro (TSI). Los cambios producidos en el medio por un organismo o grupo de organismos son característicos, diferenciándolos de este modo de otras cepas o grupos. Los medios diferenciales permiten identificar reacciones de fermentación de los cultivos puros de bacterias o su capacidad para utilizar productos nutritivos. ej.: Voges-Proskauer, caldo urea. c.

Selectivo-diferencial : Contienen en una sola fórmula los elementos de los medios selectivos y

diferenciales. De esta forma es posible observar el proceso de aislar y clasificar. Ej.: Medio Nº 110 para Staphylococcus, éste contiene 7.5% de NaCl, en circunstancias que la concentración salina de la mayoría de los medios es 0,25 a 0,5 g%. Este ingrediente evita el desarrollo de casi todas las demás bacterias. Además, las pruebas de la gelatina y la fermentación del manitol permiten diferenciar las diversas cepas de Staphylococcus. Otro medio selectivo-diferencial es el agar McConkey.

MORFOLOGÍA BACTERIANA: ANÁLISIS MICROSCÓPICO La observación al microscopio de las bacterias nos permite conocer una serie de características complementarias a la morfología de colonia entre las que encontramos: forma, disposición o agrupación,  presencia o ausencia de estructuras (cápsulas, esporas, flagelos), movilidad, etc.

Existen numerosas técnicas para la observación microscópica de los microorganismos. En el laboratorio son fáciles de realizar las siguientes:

1. Observación de bacterias vivas: Para observar las bacterias vivas, sin teñir, se utiliza el microscopio de fase contrastada. Este tipo de microscopio se desarrolló para hacer posible observar células pequeñas sin teñir. Se basa en utilizar y aumentar la pequeña diferencia de índice de refracción que existe entre las células y el medio que las circunda. Esta diferencia puede ser usada para crear una imagen con mucho mayor contraste que la que se obtiene en el microscopio de campo claro. Este microscopio usa un lente objetivo especial y en el condensador se inserta un diafragma especial; además para aumentar el contraste se insertan filtros verdes o azules. a. En fresco: Este método de examen permite observar el microorganismo al estado vivo y evita las deformaciones artificiales de su morfología que producen las técnicas de coloración. Su aplicación más importante se refiere al estudio de la movilidad de los microorganismos.  b. Con fondo oscuro: Se basa en el fenómeno de Tyndall, de reflexión luminosa. Para la observación se sustituye el condensador de Abbé por el condensador de fondo oscuro, o de ultra. Se ilumina la  preparación en forma oblicua, incidiendo los rayos luminosos directamente sobre los microorganismos sin  penetrar en el objetivo del microscopio. Se emplea para la observación de bacterias muy pequeñas o de aquellas que difícilmente se observan al microscopio de campo claro por su falta de contraste con el medio. c. Gota colgante: Consiste en suspender el microorganismo a observar en un líquido y depositar una gota de la suspensión sobre un cubreobjeto el cual se coloca sobre un portaobjeto, luego se procede a la observación microscópica.

2. Observación de bacterias muertas: a. Tinción simple: Se utiliza un sólo colorante para revelar la presencia de microorganismos y su forma en general. Son de poco uso en bacteriología.  b. Tinción negativa: Se tiñe el fondo mientras que las células permanecen sin teñir (transparentes), observándose como entidades claras sobre un fondo oscuro. Ejemplo de este tipo de tinción es la tinción de cápsula en la que se usa tinta china. c. Tinciones especiales: Se utilizan para observar alguna estructura en particular como nucleoide, flagelo, esporas, etc. d. Tinciones diferenciales: Las bacterias son diferentes entre sí, tanto en su estructura física como en su composición química, de modo que reaccionan en forma diferente frente a los colorantes. Estas tinciones se utilizan para diferenciar los distintos grupos de bacterias. La Tinción de Gram es la tinción diferencial más importante usada en bacteriología. Otra muy utilizada es la Tinción de Ziehl Neelsen. Algunas estructuras bacterianas que pueden ser diferenciadas por métodos de tinción son esporas y cápsula: a. Observación de esporas: Esta tinción es un ejemplo de tinción especial. Algunos géneros bacterianos como

 Bacillus

y

Clostridium,

producen endosporas como una forma de resistencia a condiciones

ambientales adversas, por ejemplo sequedad o falta de nutrientes. Las endosporas o esporas se caracterizan

 por ser altamente resistentes al calor, a las ra diaciones y a la desecación. La resistencia de la espora se debe a la estructura proteica (rica en aminoácidos azufrados) de sus capas externas, lo que también las hace resistentes a tinción. Por este motivo las esporas se tiñen en caliente.  b. Observación de cápsula: se trata de una tinción negativa usando tinta china que permite determinar la  presencia de cápsulas polisacarídicas.

El estudio macro y microscópico de una muestra bacteriana permite obtener una orientación preliminar de su identidad y dirige al desarrollo de pruebas bioquímicas específicas que permitirán una identificación más certera y precisa. La técnica de mayor importancia en el área de la microbiología, es la tinción de Gram (Figura Nº 2), pues divide a las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivo y Gram negativo. Además permite diferenciar forma (cocos, bacilos) y la agrupación bacteriana (pares, cadenas, racimos). La tinción de Gram consiste en teñir un frotis de bacterias con cristal violeta, y luego tratarlas con una solución mordiente (fijadora) de Yodo-Ioduro. Todas las bacterias se tiñen en estas condiciones. Sin embargo, sólo algunas son capaces de retener el colorante al tratarlas con un agente decolorante como etanol o una solución decolorante de etanol-acetona. Las bacterias que retienen el colorante son Gram positivo; las que se decoloran son Gram negativo y para observarlas deberán teñirse con un colorante de contraste (safranina). Por lo tanto, las Gram positivo se verán de color violeta y las Gram negativo de color rojo o rosado.

La diferencia en la reacción frente a la tinción de Gram se debe a la diferencia en la composición química de las estructuras externas de las bacterias (pared celular). Las bacterias Gram positivo tienen una capa gruesa de peptidoglicán o mureína, mientras que las Gram negativo tienen menor cantidad de peptidoglicán y tienen una membrana externa (además de la membrana citoplasmática). La explicación más aceptada es que, luego de la acción de la solución decolorante, las bacterias Gram positivo son capaces de retener el colorante gracias al peptidoglicán. En cambio, las Gram negativo, pierden parte de los lípidos de su membrana externa por acción del decolorante (un solvente orgánico como por ejemplo alcohol), lo que sumado a la menor cantidad de peptidoglicán, hace que se decoloren. Es importante destacar que la etapa crítica en la tinción es la de decoloración, por lo que se debe tener especial cuidado en realizarla en forma adecuada. También es importante señalar que las bacterias Gram positivo pueden observarse como Gram negativo en algunas condiciones: en cultivos viejos (de más de 24 ó 48 horas), a pH ácido y en condiciones de decoloración muy prolongada. Un género bacteriano que representa una excepción a la tinción de Gram (no se tiñen) es Mycobacterium (bacilos ácido-alcohol resistentes), cuyas especies, como  M. tuberculosis (Bacilo de Koch) y  M. leprae (Bacilo de Hansen) deben ser teñidos con la tinción de Ziehl Neelsen. Son bacterias que se tiñen con dificultad, pero una vez teñidas, el colorante no se libera, aún por acción de decolorantes enérgicos como una solución de alcohol y ácido clorhídrico. Esta resistencia se debe a la gran cantidad de lípidos que tiene su cubierta, incluyendo ácidos grasos de alto peso molecular que constituyen entre el 20 y 40% del peso seco de la bacteria. El contenido inusualmente alto en lípidos le confiere a este

grupo propiedades como: hidrofobicidad (las bacterias tienden a formar grumos en medio líquido), resistencia a la acción de anticuerpos y complemento, crecimiento lento debido a la dificultad de absorción de nutrientes a través de esta pared celular lipídica.

Figura Nº 2: Técnica Tinción Gram. 1. Cubra el frotis con Cristal violeta por 2 minutos 2. Agregue solución de lugol por 1min. 3. Decolore con alcohol-acetona y lave con agua 4. Cubra con safranina 1% por 1min. Lave con agua y seque con papel

   D    A    D    I    L    I    T

   U

   O    I    P    I    C    N    I    R

   P

  s   e   n   o    i   c   n    i    T   e    d   o   p    i    T   n   e   m   u   s   e    R   o   r    d   a   u    C

   S    O    V    I    T    C    A    E

   R

  :   a   c    i   s    á    l   c   a   n   a    i   r   e    t   c   a    b   n    ó    i   c   a   c    i    f    i   s   a    l    C

  o   v    i    t    i   s   o    P   o   v   m    i    t   a   a   r   g   e    G    N   s   o    l   y    i   o   c   a   v    b    i    t    i   e   s    d   o   s    P   a   r   m   o   a   p   r   s    G    E

   )    l    )   o   u    j   z   o   a   r    (    (   a    t   e    t   e   s    l   a   r   o    t    i   v   n   o    l   a   c    t   s   n    i   o   r   c   c   n   n   e   e    ñ   n    i   e    t    i    t   e   e   r   s   o   o   v   v    i    i    t    t    i   s   a   o   g   e   p   n   m   m   a   r   a   r    G    G

  a   n    i   n   a   r    f  ,   a    l    S   o  ,   g   a   u    L   n   o  ,    t   a   e    t   e   c    l   o    A    i   –    V    l   o    l   a    h    t   s   o    i   c   r    l    C    A

   )   s   e    l    i    b    á    l    A    A    B    (   a    i    d   r   a   c   o    N

  s   o   s   a   c   s   e    )   a   a    i   a   s   c   n    f   u    i   s    (   c    d   u   e    f   e   r    d   a   p   e    l    )    t   e   n   a    d   e   e    d   r   e    t   s   s    i   v    (   s   o   e    i   c   a   r   r    l   o    ó   o    d   p   c    i   s   c    i   e    á   a   n   m   s    l   o   e    ó    i    d    ñ   n    i    i   c    T    U    á

  a   n    i   n   a   r    f   a    S  ,   a    t    i   u   q   a    l   a   m   e    d   e    d   r   e    V

  s   a   r   o   p   s

  o   n   e    l    i    t   e    M   e    d    l   u   z    A  ,   o   c    i   r    ú    f    l   u    S   o    d    i   c    A  ,   a   n    i   s   c   u    F

  s   e    l    i    b    á    l   m   a   r    G   s   a    i   r   e    t   c   a    B

   )   a    j   n   a   r   a   n   a    i   c   n   e   c   s   e   r   o   u    l    f    (   o   n   a    i   r   e    t   c   a    b    A    N    D    l   e   e    ñ    i    T

  a   n    i    d    i   r   c    )   a    A    i   c   e   n    d   e   a   c   s    j   e   r   n   a   o   r   u   a    l    N    f    (

  a   n    i    d    i   r   c   a   e    d

   )    *    R    A    A    B    (   s   a    i   r   e    t   c   a    b   o   c    i    M

   )   n   e   s    l   e   e    N    l    h   e    i    Z   e   u   q    d   a    d    i    l    i   s    b    i   a    i   s   r   n   e   e    t   s   c   a   r    b   o   o   c   y   a    i   m    M    (

  e    d    d   e   r   a   p   a    l   e    ñ    i    T

  a   a   n    i   s   c   u    f   e    )   a    d    i   e   s   c    t   u   n    f   e    (    t   s    d    i   e   s   r   e   r   a    l   p   o   e    h    d   o   c   s   o    l   c   a   -    i    l   o    ó    d   c    i   c    i   m    á   n   s   o    ó    i    d   n    i   c    U    á

   )   a    l    l    i   r   a   o   m   a    d    i   a   c    i    á   c    l   a   n   e   a   c   n   s   e    i   r   o   m   a   u    d    l    f    (   o   r     a    d   e   n   r    i   a   p   m   a    l   r   a   u   e   a    d   e   o    d    i   c   n    l    ó    ó    i    i   n   c    U   m

  a    t    i   u   q   a    l   a    M   e    d   e    d   r   e    V  ,   a   n    i   s   c   u    F

  o   n   e    l    i    t   e    M   e    d    l   u   z    A  ,   o    d    i   c    A   –    l   o    h   o   c    l    A  ,   a   n    i   s   c   u    F

  o    i   s   a    t   n   a    i   o    P   m   a   e    d    d   o   o    R    t   –   a   a   n   a   n   g    i   n   a   m   a   r   m   u   r   e    A    P

  n

  a   n    i   m   a    d   o   r

   l   a    t   n   e   m   e    l   e   o    l   u   c   s    ú   p   r   o   c  ,   p   p   s   a    l    l   e   n   o    t   r   a    B

  a    i    d   y   m   a    l    h    C

  e    d

   )   a    i   s   c   u    f    (

  a    l    l   e   n   o    t   r   a    B

Utilidad clínica de la tinción de Gram:

Este examen permite al clínico sospechar el agente causal de una infección, que muchas veces sirve de  base para el inicio de terapia antibiótica. La sensibilidad analítica (número mínimo de bacterias que la técnica puede detectar) es de 100.000 bacterias /ml de muestra. La sensibilidad clínica (probabilidad que un paciente que tenga una infección tenga un test positivo) varía según tipo de muestra: Líquido cefalorraquídeo (meningitis) : 75 % Líquido pleural (empiema pleural) : 50-80% Líquido peritoneal (peritonitis) : 25-50% Líquido articular (artritis séptica) : 50% Se debe solicitar en toda muestra clínica De gran importancia en infecciones mixtas por bacterias aeróbicas y anaeróbicas, pues si bien los anaerobios no crecen en los medios habituales, sí se observan en la tinción de Gram.

ACTIVIDADES PRÁCTICAS Primera sesión práctica OBJETIVOS 1. Sembrar y describir colonias bacterianas desarrolladas en medios de cultivo sólido (Placas de Agar) de acuerdo a criterios macroscópicos. 2. Practicar diferentes tinciones de frotis bacterianos: tinción de Gram, tinción de cápsula y tinción de esporas. 3. Observar endosporas y su disposición en formas vegetativas de  Bacillus spp. 4. Observar la presencia de cápsula en  Klebsiella spp.

SIEMBRA DOS BACTERIAS EN DISTINTOS MEDIOS SOLIDOS 1.- Siembre mediante técnica de aislamiento dos de las muestras disponibles en el laboratorio tanto en agar sangre como en agar McConkey y deje incubar a 37ºC por 24hrs.

OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS 1. Tinción de Esporas. Procedimiento: a. Con el asa, colocar una gota de agua (del tamaño de una arveja) sobre el portaobjeto.  b. Esterilizar el asa y obtener una pequeña muestra desde la placa de  Bacillus spp. c. Mezclar la muestra con la gota de agua y fijar en el mechero hasta que se seque completamente (sin hervir). d. No olvidar esterilizar el asa después de usarla. e. Poner 4 capas de papel sobre el frotis y, a continuación agregar solución colorante Verde de malaquita. El colorante tiene que atravesar las 4 capas de papel y ponerse en contacto con el frotis bacteriano. f. Esta tinción se realiza en caliente: con una pinza de madera debe colocar la muestra encima de la llama del mechero hasta observar emisión de vapor durante 3 min. No sobrecaliente para evitar que se queme su muestra o se rompa el portaobjeto. g. Si la emisión de vapor desde la muestra cesa, hay que reponer el colorante nuevamente. h. Lavar con agua de tal manera que escurra suavemente todo el colorante Verde de malaquita y el papel. i. Cubrir el frotis con el colorante de contraste Safranina, durante 1min.  j. Lavar con agua. k. Secar cuidadosamente con papel absorbente y observar con lente de inmersión.

Papel

Verde Malaquita

Figura Nº 3: Procedimiento Tinción de Esporas.

Figura Nº 8: Localización y morfología de las esporas en  Bacillus

NOTA: Las bacterias se observan rosadas mientras que las esporas (de menor tamaño que las bacterias) son

 pequeñas esferas verdes. Es posible observar esporas libres y esporas intracelulares. En estas últimas se determina si se encuentran al centro o hacia un extremo de la célula y, si la espora deforma o no al bacilo.

2. Tinción de Cápsula. Procedimiento:

a. En una esquina del portaobjeto colocar una gota de Tinta china del tamaño de una arveja.  b. Esterilizar el asa y tomar parte del cult ivo de la bacteria Klebsiella spp. c. Mezclar la tinta china con la bacteria, esterilizar el asa y repetir 3 ó 4 veces (sólo agregar la bacteria). La Tinta china impide ver si la solución tiene o no suficiente bacteria, por lo mismo es necesario mezclar con suficiente cultivo. d. Tenga cuidado de no ensuciar su cultivo bacteriano con Tinta china; asegúrese de esterilizar el asa  previamente y de enfriar ésta en las paredes del tubo. e. Realizar un frotis extendiendo la suspensión de manera que quede una capa delgada. Esto se realiza tomando un cubreobjeto y, esparciendo la mezcla a lo largo del portaobjeto que contiene la mezcla Tinta china bacteria. Ver figura. f. Fijar suavemente en el mechero. g. Durante 3 min cubra completamente con colorante de contraste, Fucsina. h. Lave con agua, seque con papel absorbente y observe con lente inmersión.

A

B

C

D

F E

Fucsina

Bacteria Cápsula

Figura Nº 9: Procedimiento Tinción de Cápsula.

Segunda sesión práctica 1. Análisis Macroscópico

Analisis macroscópico de las siembras en agar sangre y agar MacConkey, según los criterios enlistados en la figura Nº1. 2. Análisis Microscópico mediante tinción de Gram

1. Realice tinción de Gram a las muestras que Ud. sembró y observe al microscopio. Preparación de frotis bacteriano a partir de una colonia.

a. Flamear el asa para su esterilización.  b. Colocar con el asa una gota de agua en el centro de la lámina (aprox. 0,5 cm de diámet ro). c. Flamear el asa para su esterilización. d. Enfriar el asa en un sector del agar donde no existan colonias. e. Obtener una pequeña muestra desde la placa. f. Mezclar la muestra con la gota de agua y esparcirla por la superficie del portaobjeto. g. Fijar el frotis exponiéndolo a la llama del mechero hasta que se seque.

Tinción frotis mediante Gram

a. Verificar, con el dorso de la mano, que el vidrio no esté demasiado caliente.  b. Cubrir el frotis completamente con cri stal violeta y dejar en reposo por 2 min. c. Dejar escurrir el cristal violeta y agregar sobre la muestra una solución de Lugol. Dejar con Lugol por 1 min. d. Lavar el lugol alternativamente con alcohol-acetona y agua dejando escurrir suavemente, hasta que se decolore completamente. (Debe primero lavar con el decolorante alcohol-acetona y luego con agua) e. Cubrir con colorante de contraste, Safranina al 1%, por 1 min. f. Lavar con agua, dejar escurrir y secar suavemente con papel absorbente.

2. Observar en el microscopio óptico con aumento de 100X y aceite de inmersión. Caracterizar según criterios microscópicos (afinidad tintorial, morfología y agrupación) los microorganismos.

TRABAJO PRÁCTICO N°3 FLORA NORMAL Y MUESTRAS CLÍNICAS DE BACTERIAS GRAM POSITIVO Como en la mayoría de los animales, el organismo humano posee lugares que normalmente se mantienen estériles y otros donde cohabitan, también normalmente, una gran diversidad y una cantidad sorprendente de microorganismos, aún en las personas más sanas. La sangre, el líquido cefalorraquídeo, la médula ósea y las vías aéreas inferiores (bronquios y alvéolos), entre muchos otros, carecen de microorganismos debido a los mecanismos de defensa que presentan. Pero en la boca, faringe, intestinos, vagina, oídos, piel, nariz o conjuntivas residen diversos microorganismos que conforman la flora normal (microbiota comensal) del ser humano. La

colonización

microbiana

del

individuo,

comienza

con

el

nacimiento.

Los

primeros

microorganismos en establecerse son aquellos transferidos desde la vagina materna y del área perineal, hacia la  piel, la boca, la nariz y región faríngea del niño. Las biotas características de éstas y otras áreas, se desarroll an  posteriormente y probablemente se derivan y seleccionan de diversas fuentes ambientales. Zona del intestino inferior: Rico en gran cantidad de sustancias alimenticias, que favorecen el crecimiento de saprófitos. Zona boca, región orofaríngea y vulva: Con sustancias provenientes del exterior o acumulación de restos celulares, o bien gran cantidad de pliegues que favorecen la existencia de anaerobios. Zona de la piel: Que difiere de los otros ambientes por su menor humedad y alto contenido lipídico, que tiende a seleccionar una biota algo diferente. Se debe enfatizar que los anaerobios estrictos exceden en número a las formas facultativas y aerobias por un factor de 10 a 100 o más. Existe una interacción permanente entre los componentes de la flora y el hospedero, que provoca fluctuaciones en la biota, tanto cualitativas como cuantitativas. Los efectos de estas fluctuaciones incluyen los beneficiosos, inaparentes, hasta los perjudiciales. Algunos de los microorganismos más frecuentemente encontrados en los cultivos de las diferentes regiones del cuerpo y, que se consideran integrantes de la flora normal, son: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mitis, Streptococcus salivarius, Streptococcus mutans,  Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, bacterias coliformes como  Escherichia coli,  Proteus mirabilis,  Pseudomonas aeruginosa, bacteroides, espiroquetas, lactobacilos y, clostridios como Clostridium tetani.

La flora transitoria de la piel se encuentra representada principalmente por bacterias Gram positivo, como Streptococcus del grupo A, Staphylococcus aureus y, flora fúngica como Candida albicans.

Innumerables bacterias son filtradas a medida que el aire que los transporta pasa a través de la nasofaringe, la tráquea y los bronquios; la mayoría de estos microorganismos son atrapados en la secreciones mucosas y deglutidos. Así, los senos nasales, la tráquea, los bronquios y los pulmones son habitualmente estériles. La

nasofaringe es el hábitat natural de bacterias y virus patógenos que causan infecciones en la nariz, garganta,  bronquios y pulmones. Algunas personas se convierten en portadores nasales de estreptococos y estafilococos descargando estos microorganismos en grandes cantidades desde la nariz hacia el aire.  Normalmente existe un equilibrio entre los microorganismos de la flora y el hospedero; sin embargo este equilibrio puede romperse por: - Aumento de la masa crítica - Traslado desde el sitio original - Ruptura de barreras mecánicas por traumatismos.

Esto produce una proliferación e invasión de los microorganismos, dando origen a una infección endógena. Por lo general, se requieren algunos determinantes para que se produzcan estas enfermedades, como son: - Deficiencia en el estado inmunitario del huésped. - Tratamiento inmunosupresor o con corticoides. - Cirugías. - Uso de antibióticos. Como ejemplos de infección endógena se pueden mencionar: - Infección urinaria por Enterobacterias. - Endocarditis bacteriana por microorganismos de la boca ( Streptococcus grupo viridans) - Diarrea por sobreinfección de Clostridium difficile, debido al uso prolongado de antibióticios.

ETAPAS DEL DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO

Para llegar a la identificación de una bacteria es necesario seguir una serie de pasos. El primero implica la toma de muestra, siguiendo los procedimi entos adecuados según la sospecha clínica. El segundo paso corresponde al examen microscópico directo, con o sin tinción. El tercer paso es el aislamiento del agente, para lo cual se debe disponer de medios de cultivo adecuados donde la muestra y las bacterias, que ésta pudiese o no contener, puedan encontrar los nutrientes y factores adecuados  para propiciar su crecimiento y desarrollo. El cuarto paso consiste en identificar el agente, para ello se recurrirá a determinar su morfología bacteriana como su posible agrupación, y se aplicará distintas pruebas bioquímicas y fisiológicas destinadas a conocer sus características metabólicas. Por último se debe realizar las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana.

TOMA DE MUESTRA EXAMEN MICROSCÓPICO DIRECTO (Gram o Ziehl-Neelsen)

AISLAMIENTO DEL AGENTE IDENTIFICACIÓN FISIOTAXONÓMICA DEL AGENTE Tinción: Morfología y agrupación Pruebas Bioquímicas

SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA INFORME SELECCIÓN, RECOLECCION Y TRANSPORTE DE MUESTRAS PARA ESTUDIOS MICROBIOLÓGICOS En la recuperación del o los microorganismos causantes de la infección, lo más importante es la correcta recolección de una muestra para su estudio microbiológico. Esta recolección comprende cuatros pasos importantes:

1. Seleccionar el sitio anatómico más adecuado para tomar la muestra. 2. Usar la técnica más apropiada. 3. Poner la muestra recolectada en un envase que favorezca la viabilidad de los microorganismos causantes del proceso infeccioso, y que además impida la filtración o derrame de la muestra, como medida de protección para el personal que posteriormente la manipula.

4. Enviar la muestra en forma rápida y expedita al laboratorio, y en el caso de que esto no sea  posible, asegurarse que sea almacenada a la temperatura y en los medios de transporte adecuados. Una muestra mal recolectada puede inducir a error en el aislamiento del microorganismo etiológico real, y la recuperación de contaminantes

puede llevar a indicar una antibioticoterapia incorrecta y a veces incluso

 perjudicial. Debe recordarse entonces, que “la calidad del trabajo realizado en el laboratorio no puede ser superior a la calidad de la muestra recibida”.

Ya que el proceso de toma de muestra se inicia al lado del paciente siendo éste parte activa, es necesario explicarle el porqué del procedimiento y el tipo de técnica a realizar, para lograr así su colaboración y  participación, lo que lleva a la obtención de la muestra en óptimas condiciones.

Recolección y transporte de la muestras: Preparación del sitio. En todos aquellos casos en que la muestra se obtenga con aguja o por aspiración, se debe desinfectar la piel. Esto se logra limpiando la piel con alcohol al 70%, seguido por povidona yodada, la

que se deja actuar un minuto (esperando que se seque). Si el paciente presenta hipersensibilidad al yodo, se debe usar solo alcohol. Volumen.

Si es posible obtener muestras líquidas (mediante aguja o aspiración) no debieran usarse tórulas. El

volumen de muestra que se envía al laboratorio es generalmente menor de lo requerido. No existe consenso sobre los volúmenes mínimos para cada tipo de muestra. Envase y aparatos recolectores.

Existen diferentes métodos de recolección, desde la tórula hasta aparatos

recolectores de muestra. Las tórulas deben ser de un material que no inhiba el crecimiento bacteriano (alginato de calcio o polyster). Éstas, luego de tomada la muestra, se introduce en un envase estéril con un medio de transporte. Para muestras líquidas, lo más adecuado es usar envases plásticos estériles, o tubos con tapa rosca. Técnicas de recolección. Con

el fin de obtener una muestra óptima para la recuperación del agente etiológico

es necesario seguir las instrucciones dadas más adelante. Medio de transporte.

 No deben usarse tórulas sin medio de transporte (excepto para ciertas técnicas

específicas) porque esto lleva a la desecación de la muestra y a la pérdida de la viabilidad bacteriana. Los medios de transportes recomendados cuando se usan tórulas, en el caso de las secreciones, son del tipo tampón (Stuart, Amies). Contiene tioglicolato de sodio, el cual provee un ambiente reducido y es útil para suprimir cambios oxidativos en el medio de transporte,. De esta manera se favorece la viabilidad de los microorganismos durante su envío al laboratorio. PROCEDIMIENTOS DE ENFERMERIA EN LA TOMA DE MUESTRAS MICROBIOLOGICAS DE DISTINTAS ZONAS ANATOMICAS

INFECCION TRACTO URINARIO (ITU) (Orina, secreción uretral y prostática) UROCULTIVOS Muestra Miccional:

Realizar aseo perineal prolijo, separando los labios en la mujer y retrayendo el prepucio

en el varón durante el procedimiento. Eliminar el primer chorro de orina, a fin de arrastrar mecánicamente la flora externa del tracto genitourinario. Recibir 2 a 3 ml del segundo chorro en receptáculo estéril y sin interrumpir la micción. Tener presente de  poner un tapón vaginal en la mujer a fin de evitar contaminación con la flora vaginal. Con el objeto de no alterar el recuento bacteriano la muestra debe ser sembrada dentro de las primeras dos horas de tomada. Debe mantenerse refrigerada a 4ºC y trasladarla manteniendo la cadena de frío. Muestra por punción de catéter urinario:

Desinfectar el sitio de punción del segmento proximal del catéter

con alcohol 70%, aspirar con jeringa estéril entre 2 a 5 ml de orina, vaciar en tubo estéril y transportarla al laboratorio de la misma forma que la muestra miccional. Muestras por punción suprapúbica:

Antisepsia de la piel en el sitio de punción, aspirar con técnica aséptica

entre 2 a 5 ml de orina y proceder a su traslado al laboratorio de igual forma que los casos anteriores.

Secreción uretral: Previo aseo genital, exprimir uretra y recibir la secreción en tórula estéril, colocar en medio

de transporte y enviar a estudio. La muestra debe tomarse a primera hora de la mañana o después de una hora de orinar. Secreción prostática:

La técnica de recolección es exprimir la próstata a través de un masaje prostático por vía rectal e impregnar una tórula estéril con el fluido obtenido. Colocar en medio de transporte.

INFECCION RESPIRATORIA INFERIOR (IRI) (Neumonía, TBC) TOMA DE MUESTRAS NO INVASIVAS

Previo a la toma de muestra, realizar aseo bucal y posterior a tos voluntaria profunda recoger la muestra en receptáculos estériles o placa de Petri, Enviar de inmediato al laboratorio, si no es posible mantenerla refrigerada transitoriamente a 4º C por no más de dos horas. Es recomendable facilitar la expectoración con kinesiterapia respiratoria o drenaje postural. En pacientes intubados realizar la aspiración endotraqueal con sonda estéril y técnica aséptica, introducirla evitando su contaminación con gérmenes exógenos y aspirar depositando el contenido en tubo estéril para su estudio que puede ser cualitativo o cuantitativo. Este último tiene mejor perfil de especificidad, por cuanto se debe de rigor al momento de realizar el diagnóstico etiológico en pacientes conectados a ventilación mecánica. TOMA DE MUESTRAS INVASIVAS

Cuando se trata de identificar el agente etiológico de neumonía nosocomial, las muestras que tienen mejor rendimiento; pero también mayores riesgos para el paciente, son aquellas tomadas por broncoscopías (lavado  broncoalveolar, aspirado telescopado protegido), Toracocentesis y Biopsia. Lavado bronqueoalveolar: Realizar el procedimiento a través de broncoscopía y con técnica aséptica aspirar

entre 15 a 50 ml de lavado. Transportarlas de inmediato en tubo estéril al laboratorio para su estudio. Aspirado telescopado protegido: Por broncoscopía introducir cepillo a través del catéter protegido frotar la

zona alterada y enviar en tubo estéril de inmediato al laboratorio para estudio semicuantitativo. * Toracocentesis : Realizar el procedimiento con técnica aséptica, aspirar 10 ml si es posible. Transportar de

inmediato al laboratorio para su estudio. Biopsia pulmonar: realizar el procedimiento con técnica aséptica, enviar un trocito de tejido en tubo estéril o

en medio de transporte con caldo específico. Trasladar la muestra de inmediato para su estudio. *Corte recomendado para cultivos cuantitativos en secreciones respiratorias para neumonía es: Con recuento > 10 elevado a 6 UFC/ml en muestra por aspirado traqueal Con recuento > 10 elevado a 3 UFC/ml en muestra por cepillado protegido Con recuento > 10 elevado a 4 UFC/ml en muestra por lavado bronqueoalveolar INFECCION RESPIRATORIA ALTA (IRA) Secreción faríngea: Deprimir la lengua y frotar con tórula estéril amígdalas, pilares anteriores y pared

 posterior de la faringe. Colocar en el medio de transporte y enviar de inmediato al laboratorio, si no es posible la muestra se mantiene transitoriamente a temperatura ambiente.

Secreción nasal: Introducir tórula estéril más o menos 2,5 cms en mucosa nasal, rotar y colocar en medio de

transporte. Enviar al laboratorio de inmediato o mantener la muestra transitoriamente a temperatura ambiente

INFECCION DE HERIDA OPERATORIA (IHO)

(Superficial, profunda abscesos cerrados) Infección superficial: son aquellas que comprometen dermis, epidermis y celular subcutáneo. Infección profunda: son aquellas que incluyen fascia y músculo, pudiendo comprometer o no cavidades u

órganos. Toma de muestra superficial: Limpiar la herida con suero fisiológico o Ringer, frotar con tórula estéril el

centro y los bordes internos de la superficie cruenta, colocar en medio de transporte y enviar al laboratorio para su siembra y estudio Toma de muestra profunda : Limpiar la superficie cruenta con suero fisiológico o Ringer, tomar la muestra

con tórula de la parte más profunda de la herida, colocar en medio de transporte y enviarla al laboratorio. Si se sospecha anaerobios: Desinfectar con antisépticos la superficie y los bordes de la herida, aspirar de la

zona profunda de la herida 0,5 ml de secreción y enviar en la misma jeringa sellada al laboratorio, teniendo la  precaución de eliminar toda burbuja de aire de su interior. Si no es posible aspirar material, introducir tórula en lo más profundo de la herida y colocarla en tioglicolato. De mayor rendimiento que lo anterior es tomar un trocito de tejido (6 mm) con pinza estéril y dejarlo caer en el tioglicolato o en suero fisiológico e incluso en tubo estéril sin ningún preservante. Abscesos cerrados: Desinfectar el sitio de punción con antiséptico, aspirar material en lo posible 10 ml y

vaciar a tubo estéril para enviar al laboratorio. Si se sospecha de anaerobios enviar en la misma jeringa sellada, eliminando todo el aire remanente. COMENTARIO

Las muestras de pus tienen muy mal rendimiento, ya que el pH ácido de este material destruye rápidamente los microorganismos, siendo difícil su aislamiento posterior a la siembra. INFECCIONES SUPERFICIALES DE PIEL Y MUCOSAS Secreción conjuntival: Limpiar la superficie externa del ojo con suero estéril, frotar con tórula humedecida el

 borde interno de la conjuntiva y colocarla en el medio de transporte para su envío al laboratorio. Secreción ótica: Limpiar el canal auditivo con jabón antiséptico, tomar la muestra con tórula estéril y

colocarla en el medio de transporte para su envío al laboratorio. Secreción umbilical RN: Tomar muestra directa de la zona umbilical sin previa limpieza, colocar en medio de

transporte y enviar al laboratorio.

COMENTARIO.

Las muestras tomadas por punción ocular u ótica deben ser enviadas en la misma jeringa o en caldo de cultivo tioglicolato.

INFECCIONES GINECO – OBSTETRICAS Endocervix: Previo aseo genital, introducir tórula hacia el canal cervical y rotar, colocar la tórula en medio de

transporte y enviar al laboratorio. Si se sospecha de  Neisseria gonorrh oeae (gonococo), inocular en placa de Thayer Martin en Z la que debe ser solicitada previamente al laboratorio para su siembra inmediata. Enviar al laboratorio en receptáculo con una fuente que consuma oxigeno. Endometritis: A través de especulo y previo aseo genital, aspirar muestra con jeringa con catéter protegido.

Enviar de inmediato en la misma jeringa tapada o dejar caer el exudado en tioglicolato. NO REFRIGERAR. Douglas: Aspirar por punción del fondo de saco vaginal previo aseo genital. Enviar en la misma jeringa tapada

como para estudio de anaerobios. Secreciones vaginales: Para estudio bacteriológico y de hongos. A través de un especulo frotar con tórula

estéril la mucosa vaginal e impregnarla de flujo de los fondos de saco, colocar en medio de transporte y enviar al laboratorio. Para Trichomonas, introducir suero fisiológico tibio, recoger y vaciar en tubo estéril de 3 a 5 ml. Enviar de inmediato al laboratorio. Líquido Amniótico: Obtener por punción, previa desinfección con antiséptico y enviar al laboratorio en la

misma jeringa o en tubo estéril entre 5 a 10 ml de muestra. Placenta y tejidos fetales: Durante el acto quirúrgico, obtener tejido o aspirados. Enviar en tubo estéril o caldo

tioglicolato como para estudio de anaerobios. Trompas y ovarios : Obtener muestra durante la cirugía y enviar tejido o aspirado de la misma forma que para

estudio de anaerobios. COMENTARIO

En caso de Endometritis Puerperal, los cultivos microbiológicos no son necesarios para su notificación ya que es suficiente el criterio clínico, por otra parte la etiología es polimicrobiana y predecible. En caso de brotes de endometritis puerperal, los cultivos se realizan a fin de detectar Streptococcus beta hemolitico grupo A u otro agente no habitual. MUESTRAS DE FLUIDOS, CAVIDADES NORMALMENTE ESTERILES Y CATETERES Líquido cefalorraquídeo

Previa desinfección de la zona con antiséptico y con técnica aséptica, obtener entre 2 a 3 ml de muestra y en tubo estéril enviar de inmediato al laboratorio, si no es posible enviarla al momento, transitoriamente debe mantenerse a temperatura ambiente. NO REFRIGERAR. Líquido ascítico

Aspirar idealmente 10 ml de muestra a través de punción abdominal con técnica aséptica, vaciar a frasco de hemocultivo y simultáneamente 1 ml en tubo estéril seco para tinción en laboratorio. Lecha Materna

Limpiar el pezón previo a extracción de la muestra, descartar los primeros ml y recoger entre 2 a 5 ml en tubo estéril. Enviar de inmediato al laboratorio. Cateter

La cateterización venosa se define como la inserción de un catéter biocompatible en el espacio intravascular, central o periférico, con el fin de administrar soluciones, medicamentos, nutrición parenteral, medios de contraste y realizar pruebas diagnósticas, entre otros. Para cultivar catéteres vasculares, existen 2 técnicas. 1.- Cortar de forma aséptica la punta del catéter e introducirla en un tubo con caldo corriente. Esta técnica tiene la desventaja de que no es posible realizar el recuento de colonias, y por lo cual, no se puede asegurar que en un cultivo positivo en estas condiciones, no corresponda a una contaminación con flora de piel. 2.- Cortar de forma aséptica la punta y el segmento intracutáneo del catéter. Introducir en un frasco o tubo estéril y enviar al laboratorio antes de 2 horas. En el laboratorio y usando una pinza estéril, hacer rodar el catéter sobre una placa de agar sangre, al menos 4 veces hacia adelante y hacia atrás (técnica de Maki). Es una técnica semicuantitativa que permite realizar el recuento de colonias y, basándose en este recuento, recuento, determinar con mayor exactitud si un cultivo positivo corresponde a contaminación con flora de piel o a infección relacionada con el catéter.

Figura Nº 10: Catéter venoso venoso central tunelizado. Catéter venoso central implantable.

INFECCION GASTRO INTESTINAL (IGI) Coprocultivos

Introducir tórula limpia en la zona más alterada de las deposiciones recién emitidas (mucus o sangre) y colocarlas en el medio de transporte (tubo tapa roja). Las muestras pueden tomarse directamente del recto, del  pañal o receptáculo limpio. Para leucocitos fecales: Enviar deposiciones frescas en tubo limpio y seco sin medio de transporte. Las

muestras tomadas por rectoscopía o colonoscopías tienen mayor rendimiento, por cuanto de ser posible es recomendable obtener las muestras de esta forma. Para Clostridium difficile: Enviar 5 a 10 ml de deposiciones recién emitidas en tubo o frasco limpio y seco. Aspirado gástrico en RN

Aspirar por sonda nasogástrica de 1 a 3 ml de contenido y colocar en tubo estéril. Sólo se justifica esta muestra en las primeras 24 horas de vida.

FISIOTAXONOMÍA DE BACTERIAS GRAM POSITIVO La fisiología bacteriana estudia el comportamiento de las bacterias vivas a través de las alteraciones que se producen en el medio de cultivo. Estas manifestaciones han permitido establecer diferencias entre ellas, las que han sido utilizadas en su clasificación en diferentes géneros y especies. Las técnicas de identificación bioquímica de las bacterias diferencian géneros y especies bacterianos en base a la detección de: a. Utilización de fuentes de carbono : Glucosa, Lactosa, Sacarosa, Manitol, Sorbitol, Citrato.  b. Formación de productos finales o intermediarios del metabolismo microbiano : Indol, CO2, Ácido sulfhídrico (H2S), Acetilmetilcarbinol. c. Presencia de enzimas : Catalasa, Ureasa, Oxidasa, Coagulasa. d. Sensibilidad a compuestos químicos o antibióticos : Bacitracina, Optoquina, Novobiocina.

Para cocáceas Gram positivo se utilizan fundamentalmente los dos últimos métodos, en cambio para bacilos Gram negativo se emplean los tres primeros . En este trabajo se analizarán dos de las Familias de Bacterias Gram positivo más importantes, como son las  Micrococcaceae  Micrococc aceae y Streptococcaceae (figura

1).

 Micrococc aceae comprende los géneros  Micrococcus  Micrococc us,  Staphylococcus  Staphylo coccus y  Planococcus  Planococ cus. Son La Familia  Micrococcaceae

 bacterias Gram positivo, esféricas (cocos) agrupadas agr upadas en racimo. r acimo. Son catalasa positivo, reacción que diferencia la Familia Micrococcaceae  Micrococc aceae de otros cocos Gram positivo como Streptococcus.

Agrupación de algunas cocáceas Gram +

 Micrococc us son saprófitas, se encuentran habitualmente en la piel de mamíferos, en Las especies del género  Micrococcus

el suelo y el agua. Tienen metabolismo estrictamente aerobio, a diferencia de las especies del género

 Staphylococcus que son aerobios o anaerobios facultativos. Otra característica que diferencia ambos géneros,

es la propiedad de Staphylococcus de fermentar glucosa en anaerobiosis, no así los  Micrococcus que no tienen esta propiedad (Tabla 1). Las principales especies del género  Staphylococcus son: Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis. Staphylococcus aureus es patógeno para el hombre. Produce una variedad de toxinas y enzimas responsables

de su patogenicidad. Algunas enzimas son: a. Hialuronidasa : Rompe el cemento celular facilitando la invasión de los tejidos por las bacterias.  b. Fibrinolisina: Disgrega coágulos de fibrina. c. Coagulasa : Secretadas al medio extracelular y otras permanecen unidas a membrana, coagulando el plasma. d. Nucleasas : Hidrolizan DNA.

Las toxinas  producidas por S. aureus causan los síntomas asociados a las enfermedades estafilocócicas. Estas toxinas son:

a. Alfa toxina: hemolisina que produce lisis total de los glóbulos rojos. Es una proteína antigénica de peso molecular 30.000.  b. Leucocidina o toxina de Panton - Valentine. Causa desgranulación de los leucocitos y macrófagos. c. Exfoliatina : producida por algunas cepas. Causa el síndrome de piel quemada. d. Enterotoxinas : producida por algunas cepas. Causan intoxicaciones alimentarias.

Aislamiento y Caracterización:

El medio de cultivo utilizado para el aislamiento de S. aureus depende de si la muestra es un alimento o una muestra clínica.

Para muestras clínicas como pus, heridas, secreciones, etc. se utiliza: a. AGAR SANGRE: medio enriquecido y diferencial que contiene sangre desfibrinada de cordero o conejo. Permite el abundante desarrollo de las especies de Staphylococcus y además visualizar la producción de hemolisinas, por lisis de los glóbulos rojos alrededor de las colonias (figura 2). S. aureus: produce halos de hemólisis completa alrededor de las colonias, producida por la alfa toxina. S. epidermidis : no produce hemólisis o lo hace débilmente.  Micrococcus: no produce hemólisis.

Tipos de hemólisis en agar sangre

 b) AGAR MANITOL SALADO O MEDIO DE CHAPMAN : medio selectivo y diferencial que contiene manitol, NaCl al 7,5% y el indicador de pH rojo de fenol.  Micrococcus y Staphylococcus son halotolerantes, es decir, son capaces de crecer en esta concentración de NaCl. Además se evidencia la fermentación de manitol, la que se observa por el viraje del indicador a amarillo. S. aureus:

da colonias amarillas cremosas rodeadas de una zona amarilla (producto de la fermentación)

S. epidermidis:  Micrococcus:

generalmente no fermenta el manitol

no fermenta el manitol.

En ambos medios (Agar Sangre y Agar Manitol Salado) se debe confirmar mediante tinción de Gram la  presencia de cocos Gram positivo en racimo, ya que otras especies pueden dar colonias semejantes. Una vez aisladas las colonias y habiendo observado su aspecto y características en medios selectivos se realiza las pruebas bioquímicas para confirmar el diagnóstico. Si se sospecha que la colonia corresponde a Staphylococcus aureus, se

realiza la prueba de COAGULASA .

La enzima es un activador del fibrinógeno a fibrina, además, la pared de Staphylococcus aureus posee receptor de fibrinógeno lo que permite la formación de puentes entre bacteria y bacteria, formándose un coágulo. Diferencia Staphylococcus aureus de otros Staphylococcus coagulasa negativo. Ésta es una prueba de PATOGENICIDAD, la cual se puede realizar de dos formas, según el tipo de enzima: a) Técnica en tubo: detecta la coagulasa libre. Consiste en incubar plasma de conejo con gotas de cultivo líquido de Staphylococcus. La reacción positiva se observa como la aparición de un coágulo a las 4 horas.  b) Técnica en portaobjeto: detecta la coagulasa unida a membrana. A partir de un cultivo de Staphylococcus en medio sólido, se hace una suspensión abundante sobre una gota de agua. Esta suspensión debe ser lo más homogénea posible. Sobre ésta se coloca una o dos gotas de plasma de conejo y se homogeniza. La reacción  positiva se observa como aglutinación de las bacterias a los 20 segundos. Comercialmente, existe un kit de aglutinación, que será empleado en el laboratorio. Test comercial de aglutinación:

sirve para diferenciar Staphylococcus aureus de otros Staphylococcus. La

metodología consiste en poner una gota de un reactivo latex sobre un círculo de la tarjeta; a continuación se

emulsiona sobre ésta la colonia sospechosa, se agita durante unos segundos y si hay formación de grumos visibles se considera positiva. Siempre se debe realizar un control negativo incluído en el kit (figura 3).

Partículas de latex con anticuerpo  Anticuerpo (Antígeno específico)

Bacterias

Aglutinación de las partículas

= reconocen el antígeno bacteriano.( proteína A)

A su vez el Género  Streptococcus corresponde a cocos Gram positivo, anaerobios facultativos que se disponen en pares o cadenas y

son catalasa negativo reacción que los diferencia de la Familia  Micrococcaceae. Bajo

ciertas condiciones de cultivo las células son ovoides o alargadas. Se encuentran en diferentes superficies y mucosas del hombre y de algunos animales como cavidad oral, faringe, piel, tracto intestinal. Algunas especies son utilizadas en la industria lechera para la elaboración de quesos, leches fermentadas y yoghurt (Streptococcus lactis).

Los miembros del género Streptococcus se clasifican de acuerdo a: 1.- ACTIVIDAD

HEMOLÍTICA: según el tipo de hemólisis que presenten al ser cultivadas en placas de agar

sangre de conejo o de cordero. a) Beta  b)

hemolíticos: producen halos limpios de hemólisis alrededor de las colonias.

Alfa hemolíticos:  producen halos de hemólisis incompleta de color verdoso (S. viridans) alrededor de las

colonias. c) Gama

hemolíticos: no producen hemólisis

2.-SEGÚN

CONSTITUCIÓN ANTIGÉNICA DE LA PARED CELULAR : clasificación de Lancefield. Se

 basa en la composición química y antigénica de un hidrato de carbono presente en la pared celular y permite clasificar a los Streptococcus spp. en grupos serológicos que van desde la A hasta la U. Ambas clasificaciones se asocian entre sí, así tenemos por ejemplo estreptococos

beta hemolíticos del grupo

A como Streptococcus pyogenes, que es el más patógeno del género.  Streptococcus pyogenes  produce varias toxinas y enzimas responsables de su poder patógeno. Es el agente

causal de infecciones locales purulentas como amigdalitis, faringitis, otitis, etc. Además provoca enfermedades sistémicas como fiebre puerperal y escarlatina.

 Streptococcus pneumoniae o pneumococo es otra especie importante de este género, agente causante de

neumonia lobar en el hombre. Es un diplococo no perfectamente esférico, tiene forma de cabeza de lanza (lanceolado). Su forma virulenta se encuentra rodeada por una cápsula. Es habitante normal de la faringe del hombre. Para su aislamiento las placas deben incubarse en un ambiente con 10% de CO 2. En agar sangre S.  pneumoniae presenta alfa hemólisis y las colonias son planas con forma de fichas de damas. Estreptococos fecales o enterococos ( por ejemplo  Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium). Existen

otras especies de Streptococcus que habitan el intestino del hombre y animales y se les conoce con el nombre de estreptococos fecales o enterococos. Se caracterizan porque generalmente son no hemolíticos y pueden crecer en condiciones de alta salinidad (NaCl 6,5%), pH básico (pH 9,6) y presencia sales biliares en que otros estreptococos no pueden hacerlo. Su presencia en alimentos o agua indica contaminación fecal. Aislamiento y Caracterización:

El aislamiento de Streptococcus pyogenes se efectúa sembrando la muestra sobre una placa de agar sangre. Streptococcus pyogenes presenta las siguientes características:

1. Hemólisis en placa de agar sangre. Se observa hemólisis limpia alrededor de las colonias, las cuales son muy pequeñas. Se debe confirmar mediante tinción de Gram la presencia de cocos Gram positivo en cadena, ya que otras especies pueden dar colonias semejantes, por ejemplo Staphylococcus. Una vez confirmada su presencia se realiza pruebas adicionales para confirmar el diagnóstico. a) Prueba de sensibilidad a Bacitracina. Los Streptococcus spp. beta hemolíticos del grupo A (Streptococcus  pyogenes) son sensibles a Bacitracina, esta prueba se realiza en forma similar a un antibiograma. Otros Streptococcus spp . también son sensibles, sin embargo no son beta hemolíticos.

b) Pruebas serológicas. El diagnóstico de Streptococcus pyogenes se debe confirmar mediante reacciones

serológicas con antisueros específicos para el antígeno superficial.

c) Bilis/Esculina, NaCl 6,5%:

Los  Enterococcus crecen en presencia de NaCl 6.5%, toleran las salas biliares y pueden hidrolizar la esculina. Estas propiedades se pueden usar para distinguir los  Enterococcus de otros cocos Gram (+) catalasa-negativo. En la prueba positiva, el tubo donde está el medio se torna de color chocolate oscuro, característico al desdoblar la bilis esculina.

d) Test de CAMP. La sigla CAMP proviene de Christie, Atkins, Munch y Petersen, los descubridores del

fenómeno La mayoría de los Streptococcus grupo B producen una proteína extracelular difusible (factor CAMP), la que actúa sinérgicamente con la beta-hemolisina producidas por algunas cepas de Staphylococcus aureus causando la hemólisis de los eritrocitos. Sobre una placa de agar sangre se inocula los Streptococcus en estudio trazando estrías perpendiculares a una estría central de Staphylococcus aureus. Tras la incubación se observa la  presencia de una zona hemolítica en forma de punta de flecha en el área de intersección, donde el factor CAMP y la beta-hemolisina han difundido (prueba de CAMP positiva). Aproximadamente el 95% de los Streptococcus del grupo B y de forma ocasional unas cepas de otros grupos son CAMP-positivos.

Test de susceptibilidad a agentes antimicrobianos: Método de Difusión en Agar o Kirby-Bauer

Se utiliza para determinar la sensibilidad in vitro de las bacterias a los distintos antimicrobianos. Este método cualitativo se basa en la inoculación del microorganismo sobre una placa de agar donde se coloca discos de  papel filtro estériles impregnados con una concentración conocida de antibiótico. Para que los resultados sean confiables y reproducibles es necesario estandarizar algunas condiciones de laboratorio: a) Concentración de bacterias que se siembra. Requiere uso de estándares de turbidez: Mac Farland 0.5 b) Medio de cultivo utilizado: Agar Müller-Hinton o agar Müller-Hinton Sangre para Streptococcus

c) Concentración del antimicrobiano en el disco: característica para cada antimicrobiano. d) Temperatura (37°C), tiempo de incubación (16-24 horas) y atmósfera de incubación (en O 2)

A partir de una colonia aislada (es absolutamente necesario un cultivo puro), se prepara una suspensión  bacteriana con una turbidez equivalente a un Mac Farland 0.5. La siembra de la suspensión debe ser homogénea sobre el agar (figura 4). El antibiótico en los discos difunde radialmente durante la incubación de tal manera que a medida que se aleja del disco, la concentración disminuye. En un punto determinado, la concentración del antibiótico no podrá

inhibir el crecimiento del microorganismo, produciéndose entonces una zona circular de inhibición ( halo

de

inhibición) alrededor del disco. El diámetro del área de inhibición puede ser convertido a las categorías de “susceptible”, “intermedio” o “resistente” de acuerdo a las tablas publicadas por el “National Committee for Clinical Laboratories Standars (NCCLS)”.

Figura Nº 11: Antibiograma mediante la técnica de difusión con discos

Bacitracina: Se siembra una placa de agar sangre homogéneamente. Se coloca un disco de bacitracina, se incuba 16-24 horas y después se mide el tamaño del halo. Se considera sensible cuando existe un halo de inhibición

!10

mm de diámetro y resistente cuando el halo de

inhibición es < 10 mm de diámetro.  Micrococcus es sensible a bacitracina. Staphylococcus es resistente a bacitracina.

Optoquina: compuesto químico que pone a prueba la fragilidad de la membrana celular bacteriana. A bajas concentraciones (5g/ml) permite diferenciar Streptococcus pneumoniae (sensible) de otros Streptococcus hemolíticos. El disco de Optoquina se deposita en una placa de agar sangre, sembrada homogéneamente con la colonia sospechosa. Se incuba a 37°C por 24 horas. Si el halo es 14 mm, corresponde a Streptococcus  pneumoniae.

Novobiocina: antibiótico activo por vía oral. Se utiliza para el tratamiento de infecciones por S. aureus e infecciones urinarias resistentes a otros fármacos. Es bacteriostática e interfiere con la síntesis de la pared  bacteriana. Este fármaco se utiliza muy poco debido a que su uso está asociado a una alta incidencia de reacciones adversas y a que frecuentemente emergen cepas resistentes. Se considera sensible cuando existe un halo de inhibición !16 mm de diámetro y resistente cuando el halo de inhibición es < 16 mm de diámetro.

Amoxicilina / Ácido Clavulánico : esta asociación se indica para el tratamiento a corto plazo de infecciones  bacterianas en las siguientes localizaciones, cuando se sospecha que están causadas por cepas resistentes a Amoxicilina y productoras de beta-lactamasas. En otras situaciones, debería considerarse la Amoxicilina sola.

Infecciones del tracto respiratorio superior;

en particular sinusitis, otitis media, amigdalitis recurrente. Estas

infecciones son a menudo producidas por Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis y Streptococcus pyogenes.

Infecciones del tracto respiratorio inferior,

en particular exacerbaciones agudas de bronquitis crónicas,

 bronconeumonia. Éstas son a menudo producidas por Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae y  Moraxella catarrhalis.

Infecciones del tracto genitourinario e infecciones abdominales,

en particular cistitis (especialmente cuando

sea recurrente o complicada, excluyendo prostatitis), aborto séptico, sepsis pélvica o puerperal y sepsis intraabdominal. Son a menudo producidas por Enterobacterias (principalmente  Escherichia coli, Staphylococcus saprophyticus spp. y Enterococcus spp .)

Infecciones de la piel y tejidos blandos,

en particular celulitis, mordeduras de animales y abscesos dentales

con celulitis diseminada que son a menudo producidas por Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes y  Bacteroides

spp. Algunas cepas de estos gérmenes producen beta-lactamasas, de modo que no responden a

Amoxicilina sola. NOTA: Lea el procedimiento por completo antes de comenzar a trabajar

  p   s

  p   s

   s    u      l      l     i    c    a     B

   O    V    I    T    I    S    O

   P

   M    A    R

  s   o    l    i   c   a    B

  o   v    i    t    i   s   o   p   a   s   a    l   a    t   a    C

  s   e    d   s   n   s   o   a   o   t   r    d   e    G   l   a   n   s   u   s   o   r   e    l    i   o   d   r   c   a   p   s   o    B   E   B

  m   a   r    G   n    ó    i   c   n    i    T   o    t   c   e   p   s    A

   G    S    A    I    R    E    T    C    A

  o   v    i    t   a   g   e    N

   B    E

   D

   N     Ó    I    C    A    C    I    F    I    T    N    E    D

   I

   E

   s    u    c    c    o    c    o     t    p    e    r     t     S

  s    i   s    i    l    ó   m   e    H   r   a   v   r   e   s    b    O

  s   o   n    i    f   s   o    l    i   c   a    B

  s    i   s   a    i    l   m    ó   m   m   a   e   G    H

   s   a    u   n    i    l    %    c    c   u    o   c  ,    c   s    5    6    o    E   l    r    e   s     t    i    C    l    n   a    i    B   N     E

  s    i   s    i   a    l    t    ó   e   m   e   B    H

  x   e    t   a    L   e    d    t   s   e    T

  s    i   s    i   a    l    ó   f    l   m   e   A    H

  s   a   a   e   s   a   c    l   a   a   c    t   o   a    C    C

   D    A    L    B    A

   T   o   v    i    t    i   s   o    P

   a     i    r    e     t    s     i     L

  s   u   c   c   o   c   o    S   r   c    i    M   a   n    i   c   a   r    t    i   c   a        )       B        (   e    d    t   s   e    T   a   s   a    l   u   g    R   a   o    C   e    d    t   s   e    T        )       +        (

 ,    s    C    u  ,    c    c   B   G    o  ,  ,    c   A   F    o     t  ,    p   o   p   D    e   u    r   r     t     S   G   a   e   n   l    i   u   b    i   q   s   o   n    t   p   e   s    O

   s    u    e    a    c     i    c    n    o    o    c    o    m     t    p    u    e    e    r    n     t     S    p

  a   e   n   t    i   n   u   t   q   e   o    i    t   s   p   s   e    O  r

   s    s    u    n    a    c     d    c     i    o    i    c    r    o    v     t    p   o   p    e    r   u     t   r     S   g

   R   o

  v    s    t    i    u   a    c   g    c   e    o   n    c    o   a      l    y   s   a      h   l    p   u    a     t   g     S   a   o

   C

  a   n    i   c   o    i    b   o   v   o    N   e    d    t   s   e    T    S

   s    u    e    r    u    a    s    u    c    c    o    c    o      l    y

  a    d   a   z    i    l   a   p   m   e   n   e   o    l    i   c   a    B

   m    u     i    r    e     t    c    a      b    e    n    y    r    o     C

   s    s    u    u    c    c    c     i    o    t    y    c     h    o    p      l    y      h    o    r    p    p    a    a     t     S    s

  o   v   s    i    t   a   u   c   g    t   e   i   y   n   h   a   p   s   a   o   r    l   u   p   a   g   a   s   o   o    C   N  .    S

  o   o   v   v   i    i    t    t    i    i   s   s   o   o   p   p   l   s    C    i    l    i   a    B   N

   s    u    c    c    o    c    o    r    e     t    n     E

ACTIVIDADES PRÁCTICAS Objetivos 1. Conocer la importancia de una buena toma de muestra 2. Conocer y practicar el procesamiento microbiológico de cocáceas Gram positivo aisladas a partir de muestras clínicas así como de flora normal 3. Realizar pruebas bioquímicas para la identificación de cocáceas Gram positivo 4. Identificar cepas bacterianas Gram positivo, provenientes de muestras clínicas. 5. Realizar estudios de susceptibilidad a agentes antimicrobianos.

Primera sesión práctica

I. MUESTRAS

CLÍNICAS

1. Observe la placa sembrada con su muestra clínica. Describa macroscópicamente las colonias bacterianas. Observe si se trata de cultivos

puros.

2. Realice una tinción de Gram y describa microscópicamente su muestra. Observe al microscopio con aumento 100X oil.

Recuerde que en el caso de cocáceas Gram + es de suma relevancia conocer la agrupación bacteriana y el tipo de hemólisis para el diagnóstico. 3. Realice las pruebas bioquímicas correspondientes según la tabla de identificación de bacterias Gram  positivo.

a. Catalasa: Busca la presencia de la enzima catalasa, que descompone el H 2O2 en H2O y O2. La enzima se encuentra en la mayoría de las bacterias que contienen citocromo. La excepción es  Streptococcus que no puede descomponer el H2O2. El test permite diferenciar Staphylococcus,  Micrococcus y  Listeria , todos ellos

catalasa

+, de Streptococcus, catalasa -. Procedimiento Prueba de la catalasa a) Ponga sobre el portaobjeto una gota de H 2O2  b) Con un palillo desechable tome la colonia en estudio y agréguela a la gota en el portaobjeto. La aparición rápida y sostenida de burbujas (antes de 20 segundos) indica test (+). Precauciones:

no tocar ni sacar agar sangre al tomar la colonia ni usar asa de platino, ya que estas sustancias

dan falsos positivos. c) Anote lo observado y compare con su resultado del Gram. d) Elimine el portaobjeto y el palillo en los recipientes respectivos

Figura Nº 12: reacción de la enzima Catalasa en presencia de Peroxido de hidrógeno.

 b. Coagulasa: Busca la presencia de la enzima coagulasa producida por Staphylococcus aureus. Procedimiento Prueba de la Coagulasa:

a) Tome una tira reactiva y agregue una gota de cada reactivo en las zonas marcadas.  b) Con un palillo plástico tome varias colonias desde el agar. c) Mezcle con la solución de anticuerpos del Test de aglutinación (plasma de conejo). d) Espere unos minutos agitando constantemente con el palillo. e) Si existe la presencia de coágulos (apariencia de “leche cortada”), la reacción es positiva. Si se ve siempre homogéneo, la reacción es negativa. f) Anote lo observado e identifique al patógeno presente en su muestra.

c. Test de CAMP para Streptococcus

Permite confirmar la presencia de Streptococcus tipo B por la producción de una zona de hemólisis característica cuando crece en la proximidad de Staphylococcus aureus, lo que se denomina “punta de lanza” (Ver figura adjunta)

Figura 13: Test de CAMP positivo

Procedimiento Test de CAMP:

a) Sobre una placa de agar Sangre realice con el asa una única estría en el centro a partir de un cultivo de Staphylococcus aureus. b) Perpendicular a la estría original, realice con el asa una o más estrías con su muestra clínica. Incubar a 37ºC

 por 24 horas.

d. Identificación de Streptococcus ! hemolítico por aglutinación con látex:

Consiste en la identificación de los distintos grupos de Streptococcus ! hemolítico grupo A, B, C, D, F y G. Procedimiento prueba de aglutinación con látex:

a) Agregue 1 gota de cada reactivo de látex en cada uno de los 6 pocillos de la tarjeta de aglutinación.  b) Tome dos a tres colonias !  hemolíticas que quiera identificar. Recuerde que deben pertenecer a un cultivo puro y al Gram ser cocáceas Gram (+) en cadenas.

c) Mezcle y agite circularmente las colonias en cada pocillo de la tarjeta durante UN MINUTO

4. Realice el Test de difusión por disco. Sensidiscos. a) Con el asa tome una colonia aislada desde la placa de Agar sangre y siémbrela en el tubo de suero fisiológico estéril hasta que quede turbio. Compare con el standard 0,5 Mac Farland.  b) Tome la tórula estéril y (sin flamearla!!!!) sumérjala en el caldo recién inoculado. Flamee la boca del tubo y cierre. c) Deslice la tórula sobre toda la superficie del agar Müller-Hinton ( Staphylococcus) o agar Müller-Hinton Sangre (Streptococcus). Al terminar elimine la tórula en el recipiente apropiado. d) Tome la pinza estéril y flaméela brevemente. Tome con cuidado cada uno de los sensidiscos (5 en total) y distribúyalos homogéneamente en la placa, cuidando de que no queden demasiado cerca del borde de ella ni demasiado cerca entre sí. e) Incubar a 37ºC por 24 horas. RECUERDE que la elección de los sensidiscos dependerá del patógeno que haya identificado en su muestre

clínica.

Nota: Asegúrese de flamear las pinzas cada vez que tome un sensidisco y enfríe en la tapa de la placa antes de

sacar uno. NO FLAMEE los frascos con los sensidiscos. Trate de no tocar el agar al poner los discos, sólo déjelos caer desde cerca y presiónelos suavemente contra el agar con la pinza (sin hundirlos!!!).

II. FLORA NORMAL

1. Para el estudio de flora normal tómese una muestra bucoranfingea, nasal o de piel con una tórula estéril  previamente humedecida con suero fisiológico y siémbrela en agar sangre. Sólo el prim er cuadrante se siembra con la tórula y el resto con asa previamente flameada para poder obtener colonias aisladas. Incube esta placa a 37ºC por 24 horas.

Segunda sesión práctica Resultados siembra flora norma

1. Escoja la colonia aislada y más representativa de su cultivo. Descríbala macroscópicamente y microscópicamente. 2. Sugiera un posible agente presente en su muestra, dependiendo, por ejemplo de la zona de la muestra, características de crecimiento y sus observaciones.

Lectura e interpretación del Test de Sensidiscos

a) Observe los halos de inhibición y mida el diámetro de estos para determinar si la bacteria es “susceptible”, “intermedio” o “resistente” con respecto a los antibióticos dispuestos en el agar. Compare con la Tabla adjunta, según corresponda.  b) Anote sus observaciones. Interpretación de los halos de Inhibición para Staphylococcus spp (Agar Mueller –Hinton) DROGA CONTENIDO SENSIBLE INTERMEDIA RESISTENTE DEL DISCO (Halo en mm) (Halo en mm) (Halo en mm) Oxacilina 11-12 ! 13 "10 1 µg Eritromicina 14-22 ! 23 "13 15 µg Clindamicina 15-20 !  21 "14 2 µg Vancomicina ! 15 30µg ! 10 Bacitracina 0,05 unidades < 10 ! 16 " 16  Novobiocina 5 µg Amoxicilina / ! 20 " 19 20 / 10 µg A. Clavulánico

Observaciones Para S. aureus

Interpretación de los halos de Inhibición para  Streptococcus -hemolíticos y Enterococcus (MuellerHinton con sangre de cordero) DROGA CONTENIDO SENSIBLE INTERMEDIA RESISTENTE DEL DISCO (Halo en mm) (Halo en mm) (Halo en mm) Penicilina 10 unidades 20-27 ! 28 " 19 Eritromicina 16-20 ! 21 " 15 15 µg Clindamicina 16-18 ! 19 " 15 2µg Vancomicina ! 17 30µg Optoquina ! 14 5 µg

Interpretación de los halos de Inhibición para Streptococcus pneumoniae (Mueller-Hinton con sangre de cordero) DROGA CONTENIDO SENSIBLE INTERMEDIA RESISTENTE DEL DISCO (Halo en mm) (Halo en mm) (Halo en mm) Penicilina ! 20 1 µg de oxacilina Eritromicina 16-20 ! 21 " 15 15 µg Trimet/sulfame 16-18 ! 19 " 15 1.25/25.75µg Vancomicina ! 17 30µg Optoquina ! 14 5 µg

TRABAJO PRÁCTICO N°4 FISIOTAXONOMÍA DE BACTERIAS GRAM NEGATIVO

El grupo de las Enterobacterias, nombre común utilizado para referirse a la Familia  Enterobacteriaceae,

incluye a bacilos Gram (-), aerobios y anaerobios facultativos, la mayoría de ellos móviles

mediante flagelos perítricos, que como característica microbiológica fenotípica común tienen la capacidad de fermentar la glucosa y reducir los nitratos a nitritos. Tienen como hábitat el intestino de animales inferiores y del hombre. Tienen además una amplia distribución en el ambiente, se encuentran en el suelo, agua, plantas y algunas especies de esta familia, como Proteus  spp., cumplen una función ecológica importante: inician en el ambiente la degradación de la materia orgánica y por este comportamiento se relaciona con un ciclo de vida netamente ambiental, son saprófitos. Entre las numerosas especies que constituyen esta familia, encontramos algunos grupos que en su relación con el hospedero humano son comensales, como es el caso de  Escherichia coli , un constituyente importante de la microbiota intestinal normal aerobia, especialmente a nivel de la porción distal del intestino delgado y fundamentalmente a nivel del intestino grueso. En esta localización la presencia de  E. coli  resulta en un  beneficio para el hospedero, pues como parte de su metabolismo se sintetizan vitaminas y también participa en la degradación de ácidos y sales biliares. Debido a la presencia masiva de E. coli  a nivel intestinal, su detección se utiliza como marcador de contaminación fecal, por ejemplo se ha establecido un “Índice coli” para evaluar la calidad microbiológica del agua potable o de alimentos. Si el índice coli sobrepasa la norma considerada aceptable significa que existe contaminación fecal e indirectamente se deduce que el agua o el alimento, según sea el caso, puede contener patógenos intestinales. Otros integrantes de este grupo en cambio son patógenos intestinales como son géneros Salmonella, Shigella, Yersinia y

un subgrupo de  E. coli  con factores de virulencia específicos que afectan el intestino y por ello se

denominan  E. coli diarreogénicos. Estos grupos o géneros bacterianos causan infecciones gastrointestinales que pueden expresarse clínicamente como diarrea acuosa, diarrea con sangre (también denominada diarrea enterocólica o síndrome disentérico) y en algunos casos a partir de la infección intestinal estas bacterias pasan al torrente sanguíneo y se puede producir una infección sistémica o bacteremia, como por ejemplo la fiebre tifoidea (Salmonella enterica serovar Typhi). En el laboratorio de Microbiología el análisis de una muestra clínica o ambiental sigue, por lo general, la siguiente secuencia: a) Toma de muestra  b) Siembra y obtención del microorganismo aislado (cultivo puro) c) Observación de morfología macroscópica d) Tinciones y observación de morfología y agrupación microscópica.

e) Identificación fisiotaxonómica (reacciones metabólicas específicas) con batería bioquímica convencional y Sistema estandarizado API 10S f) Estudios de sensibilidad a agentes antimicrobianos. La fisiotaxonomía bacteriana estudia el comportamiento de las bacterias vivas frente a distintos medios de cultivo a través de las alteraciones que producen en estos medios. Estas alteraciones, son producidas por

enzimas específicas de las diferentes bacterias, ya que no todos los microorganismos poseen los mismos requerimientos nutricionales y las mismas rutas metabólicas. De este modo esta técnica taxonómica se basa  principalmente en la detección de: a) Utilización de distintas fuentes de carbono.  b) Formación de productos finales. c) Presencia de enzimas. d) Sensibilidad a productos químicos o antibióticos.

La identificación de una cepa bacteriana aislada puede realizarse utilizando diferentes ensayos bioquímicos que generalmente determinan la actividad de una vía metabólica (conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no. Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una característica bioquímica como la presencia o ausencia de una determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o vía metabólica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano. Para llevarlas a cabo, se puede utilizar diversos sistemas de trabajo (medio de cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente aún para el mismo ensayo si se trata de distintos microorganismos. Por ejemplo, se debe suplir con factores de crecimiento el medio de cultivo para estudiar la fermentación de distintos azúcares cuando se sabe que el microorganismo en estudio es exigente. A la determinación de la especie se puede llegar según diversos sistemas (manuales de identificación, comerciales, etc.). Los sistemas comerciales utilizan modificaciones de las pruebas bioquímicas convencionales, ya sea sustratos deshidratados, tiras de papel de filtro impregnadas en reactivos o pequeños compartimentos con medios listos para sembrar. En todos los casos se emplean códigos numéricos para la interpretación de resultados.

I. Batería bioquímica convencional para diagnóstico microbiológico

1. Agar tendido corriente: medio sólido nutritivo, que permite observar posible pigmentación en las colonias.

2. Agar Urea de Christensen: medio sólido en el que se puede observar la presencia de la enzima Ureasa, ya que contiene además de nutrientes básicos: •

Triptona.

•

Urea.

•

Indicador de pH fenolftaleina.

Esta prueba se basa en la capacidad de algunas bacterias, que poseen la enzima ureasa, de degradar urea a amoníaco y CO2. Esta reacción es fácilmente evidenciable, porque el pH varía hacia alcalino debido al efecto del amoníaco. Este cambio se observa por viraje del indicador de pH como Fenolftaleína (Figura 1)

Figura 14: Resultados medio Urea

3.- Agar Citrato: Este medio de cultivo contiene, además de sales minerales:

•

•

•

Fosfato de amonio. Citrato de sodio, como única fuente de carbono. Indicador de pH azul de bromo timol (verde a pH neutro, azul a pH alcalino).

En este medio sólo pueden desarrollarse aquellas bacterias que poseen la enzima Citrato Permeasa, la que les  permite transportar el citrato a tr avés de la membrana citoplasmática. Una vez en el interior de la célula, el ión citrato es metabolizado a través del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (Figura Nº 15)

Figura Nº 15: Resultados medio Citrato

4. Agar TSI: Las bacterias pueden utilizar azúcares (hidratos de carbono) a través de varias rutas metabólicas.

Los productos finales de estas reacciones dependerán de cada bacteria, del azúcar utilizado y de la ruta metabólica. En general estos productos serán ácidos (fórmico, pirúvico, láctico, etc.) y gases (CO 2, H2). Existen muchos medios de cultivo que se han diseñado con el objeto de detectar la producción de ácido y gas a  partir de distintos azúcares.

El Agar TSI (Triple Sugar Iron) es un medio rico que contiene los nutrientes necesarios para el crecimiento de las bacterias y que permite visualizar la utilización de azúcares. Contiene además de nutrientes como extracto de carne, extracto de levadura, peptona, etc: •

Glucosa al 0,1%

•

Lactosa al 1,0%

•

Sacarosa al 1,0%

•

Citrato de amonio.

•

Hierro.

•

Indicador de pH rojo de fenol (Amarillo pH ácido; Rojo pH alcalino).

a. Si la bacteria inoculada es fermentadora sólo de glucosa usará ésta y se obtiene sólo una pequeña cantidad

de ácido, la que en las primeras 8 a 12 horas de incubación es suficiente para convertir ambas porciones (tendido y profundo) a un color amarillo. Dentro de las próximas horas, sin embargo, la glucosa sobrante es completamente agotada y la bacteria comienza la degradación oxidativa de los aminoácidos en el tendido del tubo, donde hay oxígeno, lo que lleva a la liberación de aminas que neutralizan las pequeñas cantidades de ácido presente en el tendido, y en 18 a 24 horas este tendido cambia a pH alcalino y vuelve a color rojo. En la  porción profunda (anaeróbica) del tubo, la degradación de aminoácidos es insuficiente para neutralizar el ácido formado, y el medio permanece amarillo. Si el TSI es inoculado con un organismo fermentador de glucosa y

lactosa o sacarosa, aún cuando la glucosa se agota en las primeras 8 a 12 horas, la fermentación continúa ya

que el organismo es capaz de usar lactosa o sacarosa. Así, a las 18 a 24 horas, ambas porciones están amarillas. b. Si se produce gas se observará como quiebres en el agar o separación de la columna de agar del fondo del

tubo. c. Para la detección de H 2S, el cual es incoloro, el medio incluye un indicador. El tiosulfato de sodio es la

fuente de átomos azufre en la mayoría de los medios usados para la producción de H 2S. Sales de fierro (Sulfato ferroso y citrato férrico amoniacal) incorporadas en el medio de cultivo reaccionan con sulfuro de hidrógeno  para producir un precipitado negro insoluble (sulfuro ferroso) este reacciona con la sal de hierro dando sulfato ferroso, un compuesto insoluble de color negro. (Figura 16)

Figura Nº 16: Resultados medio TSI

C: Control negativo 1: Desaminación (+), fermentación glucosa, lactosa y sacarosa (-), producción de H 2S (-). 2: Desaminación (+), fermentación glucosa (+), lactosa y sacarosa (-), producción de H 2S (-). 3: Desaminación (+), fermentación glucosa (+), lactosa y sacarosa (-), producción de H 2S (+). 4: Desaminación (+), fermentación glucosa, lactosa y sacarosa (+), producción de H 2S (-). 5: Desaminación (+), fermentación glucosa, lactosa y sacarosa (+), producción de H 2S (+). 5. Agar LIA: Las distintas bacterias poseen enzimas inducibles que pueden actuar sobre algunos aminoácidos,

desaminándolos o decarboxilándolos. Ejemplo de estas reacciones enzimáticas son: decarboxilación de Lisina y desaminación de Lisina. Otro efecto de las bacterias sobre aminoácidos azufrados es la remoción del grupo -hSH 2, produciendo H 2S (reacción que se observa también en el medio TSI). Este medio contiene además de nutrientes como peptona y extracto de levadura: •

Aminoácido lisina

•

Aminoácidos azufrados

•

Glucosa

•

Citrato de hierro y amonio

•

Indicador de pH púrpura de bromocresol (Amarillo a pH ácido, morado a pH alcalino).

a. La bacteria primero utiliza la glucosa produciendo ácido por lo que el pH baja y el indicador vira a amarillo.

Si la bacteria NO PRODUCE lisina decarboxilasa se mantendrá esta coloración amarilla (reacción K/A, negativa). Si la bacteria PRODUCE la enzima lisina decarboxilasa, la cual remueve el grupo COOH de la lisina dando como producto CO 2 y una diamina (alcalina), entonces el indicador vira nuevamente hacia el lado alcalino y se revierte el viraje de amarillo a morado (reacción K/K, positivo). Si la bacteria es capaz de desaminar a la lisina, la superficie se verá roja y el fondo amarillo (reacción R/A). b. Si la bacteria produce H 2S éste reacciona con la sal de hierro formando sulfuro ferroso (negro). (Figura 17)

Figura Nº 17: Resultados medio LIA

6. Medio MIO: Permite observar motilidad, presencia de la enzima ornitina descarboxilasa y producción de

indol. a. Si el crecimiento bacteriano se observa como el enturbamiento completo del medio, la reacción es positiva.

Si sólo se limita al pinchazo, es negativa. b. La enzima ornitina descarboxilasa, que participa en el metabolismo de varios aminoácidos en algunas

 bacterias. La reacción positiva se observa por el color mor ado del tubo; en cambio, si la reacción es negativa el medio se torna amarillo (puede ponerse morado el fondo). c. La presencia de indol, se evalúa agregando una gota de reactivo de Kovacs. En este caso, la reacción positiva

será la aparición de un aro rojo sobre la superficie del medio (Figura Nº 18).

Figura Nº 18:  Resultados medio MIO (Los pares están organizados sin y con reactivos de Kovacs)

1: Motilidad (-), ornitina descarboxilasa (-), indol (+) (anillo fucsia) 2: Motilidad (+), ornitina descarboxilasa (+), indol (-) (anillo amarillo) 3: Motilidad (+), ornitina descarboxilasa (+), indol (+).

2. Sistemas comerciales usados en la identificación de Enterobacterias

2.1- API 10S: Sistema de identificación estandarizado para Enterobacterias y otros bacilos Gram negativo,

como algunos no fermentadores ( Pseudomonas, Acinetobacter ) que utiliza 11 pruebas bioquímicas que usan sustratos deshidratados.

2.2- SensIdent: Es un sistema semiautomatizados que permite identificar bacilos Gram negativo

fermentadores y no fermentadores de glucosa. La identificación se hace mediante pruebas bioquímicas las que vienen liofilizadas en placas de microtitulación y se rehidratan con la suspensión bacteriana.

2.3 VITEK: Es un sistema automatizado (Bio-Merieux). La identificación de los bacilos Gram negativo

fermentadores y no fermentadores de glucosa se hace a través de pruebas bioquímicas que vienen incluidas en tarjetas de identificación. Los tiempos de incubación varían entre 2 y 15 horas. El sistema vitek determina si cada pocillo es positivo o negativo midiendo la turbidez mediante un lector óptico. Cuando finaliza el periodo de incubación, las reacciones son analizadas automáticamente y la identificación es impresa.

3. Oxidasa

Busca la presencia de la enzima citocromo oxidasa y consiste en colocar directamente la colonia sospechosa en el extremo de una varilla que contiene un reactivo oxidable. La reacción es positiva cuando aparece un color  púrpura después de 1 min. Esta prueba es positiva para  Neisseria spp. y para bacilos Gram negativo no fermentadores, y es negativa para Enterobacterias.

4. Susceptibilidad a Antibióticos

Los antibióticos son agentes terapéuticos producidos por organismos vivos, que inhiben o destruyen a los agentes infecciosos. Los ensayos de susceptibilidad están indicados para apoyar la terapia antimicrobiana de tratamiento en procesos infecciosos por bacterias en las que la identidad del microorganismo no es suficiente  para predecir en forma confiable su susceptibilidad. Estos ensayos son a menudo indicados cuando se piensa que el organismo causante pertenece a una especie capaz de mostrar resistencia a los agentes antimicrobianos más comúnmente usados. Los métodos de susceptibilidad antimicrobiana o antibiogramas son métodos que determinan

in vitro

la

sensibilidad de los microorganismos a una variedad de agentes antimicrobianos bajo condiciones específicas y estandarizadas.

ACTIVIDADES PRÁCTICAS Objetivos 1. Realizar pruebas bioquímicas convencionales para la identificación de bacterias Gram negativo. 2. Reconocer alteraciones producidas en los medios de cultivo, por la presencia de productos intermediarios o finales, debido a la acción bacteriana. 3. Realizar test comercial API 10S, para la identificación de bacterias Gram negativo. 4. Realizar prueba de susceptibilidad antimicrobiana por difusión en agar. 5. Identificar el agente etiológico (Género y especie) presente en una muestra clínica.

Primera sesión práctica Actividades 1. Observe las placas de Agar Mc Conkey sembradas y describa las colonias bacterianas. Verifique si se trata de cultivos puros.

2. Realice una tinción de Gram a su muestra. Observe al microscopio y describa.

3. Siembra de Batería Bioquímica Convencional y sistema de identificación comercial API 10S.

No olvide

anotar el número de muestra. 4. Realice prueba de susceptibilidad (Antibiograma).

3a. Pruebas bioquímicas convencionales Cada grupo contará con una batería convencional compuesta por 6 tubos. Para sembrar la batería se debe seguir las siguientes indicaciones: a. Flamear el asa para su esterilización.  b. Tomar una colonia aislada de la placa de agar Mc Conkey con la muestra a estudiar. c. Flamear la boca del tubo con caldo estéril o suero fisiológico, sumergir el asa con cuidado y agitar. Repetir hasta una densidad igual a 0.5 Mc Farland. d. Flamear el asa para su esterilización. El caldo recién sembrado será utilizado como inóculo para sembrar toda la batería.

e. Antes de empezar, anotar los colores de los distintos medios. Esto le servirá para hacer una comparación con el resultado final. f. Para cada tubo de la batería el asa debe ser esterilizada previamente y enfriada en las paredes del tubo antes de sumergirla en el caldo inoculado.

Posteriormente siembre en los medios teniendo en cuenta que: 1. Los medios semitendidos (Agar TSI y LIA) se deben sembrar en profundidad y en superficie, es decir, atravesándolos hasta el fondo con el asa en punta, y luego en zig-zag por la superficie. 2. Los medios tendidos (Agar Citrato, Agar Urea y Corriente) se siembran sólo en la superficie, es decir, se realiza un zig-zag con un asa convencional (en argolla). 3. Los caldos se siembran agitando el asa con el inóculo dentro del tubo con el medio. 4. Los medios semisólidos (agar MIO) se siembran sólo en profundidad con un asa en punta, pinchando el agar hasta la mitad del tubo aproximadamente. 3b. Siembra y Lectura de API 10 S 1. Prepare una suspensión bacteriana en 5 ml de suero fisiológico, hasta una medida de densidad igual a 0.5

Mac Farland (estándar) 2. Con una pipeta Pasteur estéril, inocule cada una de las celdas de la galería hasta el menisco, tal y como se

muestra en la figura adjunta (línea azul). Evite la formación de burbujas en los micropocillos, pues interfiere con sus resultados. 3. Llene la prueba CIT hasta la cúpula 4. En las pruebas LDC, ODC, URE y H2S , después de inocular, llene las cúpulas con aceite mineral, para crea

un ambiente microaerofílico. 5. Coloque la galería en la cámara de incubación, a la que debe colocarle previamente agua para crear un

ambiente húmedo. Que NO quede un exceso 6. Cierre la cámara e incube 18 a 28 horas a 37°C.

4. Test de susceptibilidad a los agentes antimicrobianos, método de difusión en agar o Kirby-Bauer Se utiliza para determinar la sensibilidad

in vitro

de las bacterias a los distintos antimicrobianos. Para que los

resultados sean confiables y reproducibles es necesario estandarizar algunas condiciones de laboratorio: a) Concentración de las bacterias que se siembran: Requiere uso de estándares de turbidez: Mac Farland 0.5  b) Medio de cultivo utilizado: Agar Muell er-Hinton c) Concentración del antimicrobiano en el disco: varía para cada antimicrobiano. d) Temperatura (37°C), tiempo de incubación (16-24 horas) y atmósfera de incubación (en O 2) Una vez que se obtiene una colonia aislada (es absolutamente necesario que no exista mezcla de bacterias), se 8

 prepara una suspensión bacteriana a una concentración conocida (1 a 2 x 10  UFC/mL) llevando a una turbidez equivalente a un Mac Farland 0.5. a. Tome una tórula estéril y (sin flamearla!!) sumérjala en el caldo con el inoculo. Flamee la boca del tubo y cierre.  b. Deslice la tórula mojada sobre toda la superficie del agar Müller-Hinton. Una vez que termine, elimine la tórula. c. Deje secar la placa con la tapa ligeramente entreabierta. d. Tome la pinza y flaméela brevemente. Tome con cuidado cada uno de los sensidiscos y distribúyalos homogéneamente en la placa, cuidando de que no queden demasiado cerca del borde de la placa ni demasiado cerca entre si. e. Incube a 37ºC durante 16 hrs.

Segunda sesión práctica LECTURA E INTERPRETACIÓN DE LA BATERÍA. Una vez que la batería es sembrada, se incuba a 37ºC para que los microorganismos crezcan y produzcan los cambios en los distintos medios. Posteriormente los resultados se “leen” y se comparan con las Tablas de Resultados adjuntas.

Lectura Batería Bioquímica  Agar Urea

Reacción positiva : El agar se torna fucsia. Reacción negativa : El agar no cambia de color.  Agar Citrato

Reacción positiva : Viraje del indicador de pH a color azul (alcalino). Reacción negativa : El agar permanece de color verde (neutro).  Agar TSI

Utilización de glucosa : Superficie roja (pH alcalino). Se anota K Fondo amarillo (pH ácido). Se anota A Utilización de lactosa : Fondo y superficie amarilla (pH ácido). Se anota A/A

Reacción negativa : El tubo no varía de color. Se anota K/K. Producción de gas : Ruptura de la columna de agar. Indica reacción positiva Producción de H2S : Ennegrecimiento del agar. Indica reacción positiva  Agar LIA

Decarboxilación de lisina positivo : todo el tubo morado (alcalino). Se anota K/K Decarboxilación de lisina negativo : superficie morada (alcalina). Se anota como K fondo amarillo (ácido). Se anota como A Desaminación de lisina positivo : superficie roja. Se anota R fondo amarillo. Se anota A Desaminación de lisina negativo : no hay cambio. Se anota A/A Producción de H2S : ennegrecimiento del agar. Indica reacción positiva  Medio MIO

Motilidad positiva : crecimiento bacteriano produce opalescencia del medio. Motilidad negativa : crecimiento bacteriano limitado al pinchazo con el asa. Presencia de indol : reacción positiva, aparición de un aro rojo en la superficie del medio, al agregar el reactivo de Kovacs. Presencia enzima ODC: el medio se observa de color morado, indicando reacción positiva : el medio se torna amarillo (puede ponerse morado el fondo), indicando reacción negativa.  Agar Corriente : reacción positiva si existe coloración de las colonias .

  a     e   r    U   o    t   n   e     m   g    i    P

  -

  -

  -   -

  -

  -

  -    +   -   -    V    V    +    +

  -

  -

  -

  -

  -   -

  -

  -

  -

  -

   +

  -

   +    +   -    +    /   -    /   -    /   -    +    +

  -

  -

  -

   M   -    +    +    +    +    +    +    +    +      R     e     a     e     c     a      i     r     e      t     c     a      b     o     r     e      t     n      E

  a    i    l    i   m   a    f   a    l   a   r   a   p   s   a   c    i   m    í   u   q   o    i    b   s   a    b   e   u   r   p   s   a   n   u   g    l   a   e    d   s   e    t   n   e   u   c   e   r    f   s    á   m   s   o    d   a    t    l   u   s   e    R

  -   -    +    +   -

  -   -

  -

  -

     +   -    +    +    /    +    +    +   -    /   -

  -

  -

   l   o    d    +   -    +   -     n    I

  -

  -

  -

  -    +   -

  -

  -

   d   a    d      i    l    /    i    t    +     o    M

    -    +    +    +   -    +   -    +    +    +    /    +    +    +

   +

   +

   S    2      H

  -

  -    /     -    +   -    +    /    +    +   -

  -    +    +

  -

  -

  -

   )   -    V   -    +    +    +    +    +    V    +    +    V    +    (

   +

   V

  -

  -

  -    +    /   -   -    +    +    +    +

   +

  -

  -

  -    +    +    +    +    +    +    +   -    +   -

  -

   P   -      V

  o    t   a   r      t    i    C   a   n    i    t     a    l   e    G    l   o    t    i    b   r    +   o    S    l   o    t    i   n    +   a    M   a   s   o   r   a    V   c   a    S   a   s   o    t   c    +   a    L   a   s   o    G   c   u    A    l    G

   i    l   o   c   a    i    h   c    i   r   e    h   c   s    E

  -

  -

  -   -

  -

  -

  -

  -

  -   -

  -   -

  -

  -

  -

  -

  -

   V   -    +    +    +    +    +    +    +    +    +    +   -

  -

  -

  -   -

  -

    -    /    +    +    +    V    +    +    +    V

  -

  -    V   -   -

  -

  -    +    +    +    V   -    +   -

  -

   V   -

  -

   G    G    G    G    G    V    V    G    A   -    A    G    A    A    A    A    A    A    A    V    A    A    A

   i   r   e   n   x   e    l    f   a    l    l   e   g    i    h    S

  r   a   p   s    i    d   a    l    l   e   g    i    h    S

   A    B   m    i    i   u    h    h   r    i   p   p   a    i   y    t   y   n    d    i    t    i   n   a    h   a   r    l    l   u   e   p   r   a   a   a    f   y    t   p   p   g   r   a   a    l   a   a   r   e    l    l    l    l    l    l    l    t   e   e   e   e   c   a   n   n   n   n    b   o   o   o   o   o   m    l   m    l   m    l   m   r    l    i   a   a   a   a    t    S    S    S    S    C

  s   e   e   a    i   n   n   e   o   g   o   m   r   e   u   e   a   n   r   e   p    t   c   a    l   a    l    b   e   o    i   s   r    b   e   e    t    l   n    K    E

  e   a    i   n    f   a    h   r   e    t   c   a    b   o   r   e    t   n    E

  s   n   e   c   e   s   a   e    d   c   r    i   a    b   m   u   r   a    i   a    i    t    t   a   a   r   r   r   e   r   e    S    S

  s    i   r   a   g    l   u   v   s   u   e    t   o   r    P

  -

  s    i    l    i    b   s   a   r   a   n   *    i   a   s   m   o   o   s   m   n   o   u    d   i   e   u   g    t   u   o   r   e   s   r   e    P    P   a

   )   s   a   g   e    d     n    ó    i   c   c   u    d   o   r     p   y   e   a   o   e    t   c   a   r   a    t    i   s   r    b   -    t   e   s   u   a   c   s    í   a    l    d    b   e    4   o   r    d   n    ó   o   o   e    t   v    ó    3   i   v   i   -   n    i    t   e   t    i    E   c   a    d   s   a   g   z   a    i   s   o   e    i    l    é   p   n    i    i    l    t   u   e   e   u   m    t    t   p    (   s   a    f   e   n   n   s   e    *   s    l   a    d   e   a    i   m   m   e    l    l    l   o   l   a   a    G   a   v   a    b   i   r   c   n     o   a   t   e   r   e   e   e    d    i    i   r   s   n   n   a   c    i    f   c   a   e   e   o    A   V   P   G   G   s   e   n   e    t   e   =   =   =   =   =   n   e   r   e   g    i    l   p   a   o   c    N    G    )    /   -    +    l    A    * A   V   +    (    +   /   -

  o   v    i    t   a   g   e    N

   b

  o   v    i    t   a   g   e    N

   I    A    L    B    A    T

  o   o   v   i   v    i    t   o    t    i   v   s   i   s   i   o   o   t    P   P   a   a   a   g   s   s   e    N   o   t   c   o   a   u   c    l   a   s   a    G   L   i   n   e   e    d   d   m   a   n   n   s    ó    i   e    i    ó    D   c   c   a   a   a    t    t   n   n   n   e   e   i   s    i   m   m    L   r   r   e   e    F   F

  o   v    i    t    i   s   o    P   a   s   a    l    i   x   o    b   r   a   c   s   e    D   a   n    i   s    i    L

   l   o    d   n    I

  o   v    i    t    i   s   o    P

   i    l   o   c   a    i    h   c    i   r   e    h   c   s    E

  o   v    i    t   a   g   e    N

   i    i    d   n   u   e   r    f   r   e    t   c   a    b   o   r    t    i    C

   S    2    H   e    d   n    ó    i   c   c   u    d   o   r    P

  o   v    i    t    i   s   o    P

  o   v    i    t   a   g   e    N    l   o    d   n    I

  a   s   a    l    i   x   o    b   r   a   c   s   e    D   a   n    i   s    i    L

 .   p   p  .   s   p   r   e   p   s    t   c   a   a   l    b   l   e   o    i   r   s   e   b    t   e   n   l    E   K

  a

  o   v    i    t    i   s   o    P

  a   n   o   z    i   r    A

  a    l    l   e   n   o   m    l   a    S

  a    í    d   r   e    3   o   o    d    2    l   a   o   v    i    t    i   s   o   p   r   a    d   e    d   e   u   p   e   u   q  ,   a    l    l   e    i    i    l   s   o   b   e   c   l  .    K    E   o   o   t    t   p   p   e   c  .   e   c   a   x   x   s    E   o   E  .   c  .   o   u   o   v    l   v   i   g   i    t    t   a   e   i   g    d   s   o   e   s   p   n   a   o   a   g   t   s   a   n   a   r   e   e   t   c   i   r   u   C   U    d   n   n   o   o   r   o   p   s   s   s   s   s   o   o   o   d    d   o   d   o   o    T    T    T   :   a    t   o    N

  e  .    t   n   o   v   e   i    t   m  a   a   g    t   n   e   e   n    l   a   a   s   s   a   o   l    i    t   c   x   a   o    L   b   r   a   a    l   c   n   s   a   e    t   n   D   e   a   n   m   r    i   s   e   i    F   L   a   n   n   o   o   s   z   i    i   r    l   o    A  c  .  .    S   E   e   e    d   d   s   s   e   e   i    i   c   c   e   e   p   p   s   s   e   e   s   s   a   a   t    t   r   r   e   e   i    i   c   c   :   :   a   b

 .

  o   v    i    t   a   g   e    N

   I    I    A    L    B    A    T

  o   o   v   v   i    i    t    t   o    i   s   a   v   g    i   o   e   t    P   N   i   s   a   o   s   a    P   o   s   o   a   c   t   s   u    l   c   a   a   n    G   L   i   e   e   m    d   d   a   n   n   s   e    ó    i    ó    i    D   c   c   a   a   a    t   n    i   n   t   s   e   n   e   i   m    L   r   m   e   r   e    F   F

  o   v    i    t   a   g   e    N   a   s   a    l    i   x   o    b   r   a   c   s   e    D   a   n    i   s    i    L

  o   v    i    t    i   s   o    P    l   o    d   n    I

  o   v    i    t    i   s   o    P

   i   r   p   e   p   g   s    t   a    t    i   e   r   c   s   n   e   u   d    i   e   v    t   o   r   o   r    P   P

  o   v    i    t   a   g   e    N

   i   n   a   g   r   o   m   s   u   e    t   o   r    P

  o    t   a   r    t    i    C

   S    2    H   e    d   n    ó    i   c   c   u    d   o   r    P

  a   v    i    t    i   s   o    P

  o   v    i    t   a   g   e    N   a   s   a    l    i   x   o    b   r   a   c   s   e    D   a   n    i   s    i    L

  o   v    i    t   a   g   e    N    l   o    d   n    I   o   v    i    t    i   s   o    P

  s    i    l    i    b   a   r    i   m   s   u   e    t   o   r    P   s    i   r   a   g    l   u   v   s   u   e    t   o   r    P

  o    t   a   r    t    i   a    C    i   c   r   n   a   e   z   a   d    i    i   s    l    i   v    t   o   o   u   c   r   u   o   l    P   n   G  o   o   e   t   p   n   d   e   e   s   c    d   a   x   e   g   E   u   e  .   p   d   o   s   o   i   v    i    l    i   c   t    i    b   o   s   p   o   a   r   n   p    i   m  u   a  .   n   s   a    P   e   r   c   e   y   u   U   s   d    i   r   o   r   n   a   p   o   s   g   s   s    l   u   o   o   v   d   d  .   o   o    P   T   T   :   a    t   o    N

  o   v    i    t    i   s   o    P   o   v    i    t   a   g   e    N

  a   v    i    t   a   g   e    N

  o   o   v   v   i    i    t    t    i   a   o   v   s   g   i   o   e   t    P   N  a   g   a   e   s   a   s    N   o    I   o    I   c   t    I   u   c   a    l   a   s   a    A    G   L   n    i    L   e   e    B    d   d   m   a    A   n   n   s   e    T    ó    i    ó    i   c   c   D   a   t   a   a    t   n   n   n   i   e   e   i   s   m   m   r   r    L   e   e    F   F

  a   s   a    l    i   x   o    b   r   a   c   s   e    D   a   n    i   s    i    L

  o   v    i    t   a   g   e    N

  a   v    i    t    i   s   o    P

   l   o    d   n    I

  o   v    i    t   a   g   e    N

  o   v    i    t    i   s   o    P

   S    2    H   e    d   n    ó    i   c   c   u    d   o   r    P

  o   v    i    t   a   g   e    N   o    t   a   r    t    i    C

  o   o   v   v   i    i    t    t    i   a   s   g   o   e   P    N   t   o    l   a   o   r    d   t   n   i    I    C   o   v    i    t    i   s   o    P   o    t   a   r    t    i    C

  a   s   a    l    i   x   o    b   r   a   c   s   e    D   a   n    i   s    i    L

  e    d   s   a   g   e   c   u    d   o   r   p   o    t   s   e   r    l    E  .

   A    i    h   p  .   y   p    t   a   p   r   s   a   a    P   l    l

  a   e    l   g    l    i   e   h   n   S   o   m    l   a    S

  a    i    t   a   r   r   e    S

  a

  r   e    t   c   a    b   o   r    t    i    C

  o   v    i    t   a   g   e    N

  o   v    i    t    i   s   o    P

  a   c    i    t    i  .    l   p   o   c   p   s   o   r   e   a   t    l    l   n   e   e   g    i   a    h   i   n    S   i   s   r   e    Y

  o   v    i    t    i   s   o    P

  o    t   a   r    t    i    C   o   v    i    t   a   g   e    N

   l   o    d   n    I   o   v    i    t    i   s   o    P

  o   o   i   v    t    t   a   r   a    t    i   g    C  e    N

  a    l    l   e    i   s   r   a   w    d    E

   B    i    h   p   y    t   a   r   a    P

  a    l    l   e   n   o   m    l   a    S    i   a    h   n   p   o   z   y   i    T  r   a   A

   l   a    l    l   e   l   n   e   o   n   m  o    l   m   a   l    S   a    S

  a   c    i    t    i    l   o   c   o   r   e    t  .   n   a   e   c   a    i    t    i    i    l    i   n   o   s   c   r   o   r   e   e   Y    t   y   n   i   e   h   a   p    i   y   n   T    i   s   r   l   a   e   l    Y  e   n   e   o    d   m   s   l   a   a   p   S   e  ,   c   i   a   s   t   a   a   r   n   r   u   e   g   S    l  ,   a   a    l    l   o    t   p   e   g   e   i   c   h   x   S    E  a  .   o   s   o   v    i    t   c   u   a   l   g   G   e   e    N    d   a   s   s   a   a   g   e   r   n    U  e   n   c   u   o   d   s   o   s   r   o   p    d   o   o    T   N   :   a    t   o    N

  o   v    i    t   a   g   e    N   o   o   v    i    t    i   s   o    P    l   o    d   n    I   r   e   s   n   e    d   e   u   p   y   o   v    i    t   a   g   e    N   a   s   o    t   c   a    L   n   o   s

  r   e    t   c   a    b   o   r    t    i    C

  e    d   s   e    i   c   e   p   s   e   s   a    t   r   e    i    C   :   a

Interpretación API 10

Antes de realizar la interpretación del tes comercial API 10, debe agregar los siguientes reactivos en sus correspondientes posillos: •

TDA (Triptofano-desaminasa): agregue una gota del reactivo TDA. Coloración marrón oscura indica

 positivo. •

IND (Producción de indol): Agregue una gota del reactivo de James. Coloración rosa indica positivo.

•

NO2 (Producción de nitritos): Agregue una gota del reactivo NIT1 y NIT 2 en el tubo GLU. Espere 2

a 3 minutos. Una coloración roja indica positivo. •

Realice aparte el test de oxidasa.

•

Registre todas las reacciones en la hoja de resultados que le entregará su profesor.

•

Codifique el conjunto de reacciones obtenidas en un perfil numérico. Sume los números de cada grupo si las reacciones son positivas Se obtienen 4 dígitos que corresponden al perfil numérico. Busque el perfil numérico en el catálogo que tendrá su profesor o en un software.

•

Registre sus resultados en la cartilla y guárdelo para pegarlo en su informe .

TEST

REACCIONES

POSITIVO

NEGATIVO

ONPG

Beta galactosidasa

Amarillo

Incoloro

GLU

Fermentación /oxidación

Amarillo,amarillo/ gris

Azul, azul/verdoso

Amarillo

Azul, azul/verdoso

 Naranja

Amarillo

Rojo/naranja

Amarillo

glucosa ARA

Fermentación/oxidación arabinosa

LDC

Enzima lisina descarboxilasa

ODC

Enzima ornitina descarboxilasa

CIT

Utilización del citrato

Azul/verde, azul

verde pálido/amarillo

H2S

Producción de H2S

Depósito/línea negra

Incoloro/gris

URE

Enzima ureasa

Rojo/naranja

Amarillo

Lectura e interpretación Antibiograma

Luego de la incubación del antibiograma, se produce la difusión del antimicrobiano en el agar y si la bacteria es sensible, se produce la inhibición del desarrollo en forma de halo. Si la bacteria es resistente habrá desarrollo hasta el disco mismo (6mm) o con halos de inhibición disminuidos. Están definidos para cada grupo de bacterias los halos de inhibición que permitirán clasificar a las bacterias en Sensibles, Intermedias o Resistentes.

f. Observe y mida el diámetro del halo formado alrededor de los sensidiscos.

NOTA: Los diversos tamaños de los halos de inhibición producidos por antibióticos diferentes para una misma especie bacteriana NO PUEDEN SER COMPARADOS ENTRE SI. Por ejemplo: un halo de inhibición de 30mm para Penicilina no indica mayor sensibilidad que un halo de 20 mm para Tetraciclina.

Interpretación de los halos de Inhibición para Enterobacteriaceae (Mueller-Hinton): DROGA

CONTENIDO DEL DISCO

10 !g 10 !g 20 !g 5 !g 30 !g 30 !g 30 !g

Ampicilina Gentamicina Cloranfenicol Ciprofloxacino Cefotaxima Tetraciclina Ceftazidima Amoxicilina / Ác. Clavulanico Carbenicillin para Especies de Proteus

20 / 10 !g

SENSIBLE (Halo en mm)

INTERMEDIA (Halo en mm)

!

 17  15  18  21  26  15  21

14 – 16 13 – 14 13 – 17 16 – 20 23 – 25 12 – 14 18 – 20

!

 18

14 – 17

! ! ! ! ! !

RESISTENTE (Halo en mm)

"

 13  12  12  15  22  11  17

"

 13

" " " " " "

100 !g

 23

18 – 22

 17

100 !g

 17

14 – 16

 13

 E. coli

Carbenicillin para  P. aeruginosa

Ceftazidima para  P. aeruginosa

Clindamicina Ciprofloxacino

30 !g



18

15 – 17



14

2 !g 5 !g



21 21

15 – 20 16 – 20



14 15





Interpretación de los halos de Inhibición para Bacilos Gram (-) no fermentadores (Mueller-Hinton): DROGA

CONTENIDO DEL

SENSIBLE (Halo en

INTERMEDIA (Halo en RESISTENTE

DISCO

mm)

mm)

(Halo en mm)

Ceftazidima

30!g

"18

15-17

#14

Gentamicina

10!g

"15

13-14

#12

Ciprofloxacino

5!g

"21

16-20

#15

TRABAJO PRÁCTICO N°5 LEVADURAS Y HONGOS FILAMENTOSOS OBJETIVOS 1.- Conocer y caracterizar la morfología macroscópica de las colonias de hongos unicelulares (levaduras) y  pluricelulares (filamentosos). 2.- Conocer la morfología microscópica de hongos unicelulares (levaduras) y pluricelulares (filamentosos).

MARCO TEÓRICO El ser humano está constantemente expuesto a la propagación de organismos eucariontes como son los hongos.

La mayoría tolera esta exposición sin secuelas, pero algunos desarrollan una hipersensibilidad

alérgica. Esto porque un individuo sano tiene una resistencia innata a la colonización de hongos y porque la virulencia inherente en estos microorganismo es muy baja. Sin embargo, en individuos inmunosuprimidos, la infección puede desencadenar enfermedades que, si no son debidamente controladas, pueden llevar a un resultado fatal para el hospedero. A los hongos que se aprovechan de la debilidad del hospedero se les denomina

hongos oportunistas . Hongos como Candida

(Candida albicans),  Aspergillus ( Aspergillus fumigatus) y varios  Zigomicetos ( Rhizopus arrhizus) son ejemplos de ellos.

TALO (cuerpo macroscópico)

Unicelular

Pluricelular Micelio

Levaduras Sifonado Colonias semejantes a las  bacterianas

Septado

Colonias algodonosas, lanosas, aterciopeladas

Tanto las levaduras como los hongos filamentosos se siembran en Agar Sabouraud, cuyo contenido en glucosa es mayor que el de otros medios de cultivo y el pH es ácido (pH 5,6) para impedir la contaminación  bacteriana. Generalmente se incuban a 25-30°C por un tiempo que depende de la especie fúngica (levaduras y hongos ambientales, 48 horas aproximadamente, hongos dermatofitos, 15-30 días).

Hongos Unicelulares (Levaduras) Las levaduras son organismos fúngicos unicelulares que generalmente se reproducen asexualmente  por yemación. Los criterios usados para el diagnóstico son fundamentalmente morfológicos (macroscópicos y microscópicos). Las levaduras normalmente prosperan en hábitat con abundante azúcar, tales como frutas, flores e incluso la corteza de los árboles. Algunas de ellas viven en simbiosis con animales, especialmente insectos. Las levaduras más importantes desde el punto de vista comercial son las cepas cerveceras y panaderas de la especie Saccharomyces cerevisiae.

Candida spp.:

En ciertas condiciones C. albicans, C. tropicalis, C. kefyr,  y otras, son parte de la

flora normal de los humanos. Pueden aislarse de las superficies mucosas sanas de la cavidad oral, vagina, tracto gastrointestinal y área rectal. Sin embargo, cuando se rompe la barrera mucosa, los microorganismos  pueden llegar a la sangre e invadir pulmones, bazo, riñones, hígado, corazón y cerebro.

Este género se

caracteriza por un aspecto macroscópico de su colonia opaco, de color cremoso y consistencia pastosa (Figura  Nº 19).

Figura Nº 19: Observación microscópica de una muestra de esputo en que se ponen de manifiesto las

levaduras en yemación y las pseudohifas de las especies de Candida.

Hongos Filamentosos: Estos pueden ser sifonados (aseptados) o septados.

Los hongos sifonados son generalmente

multinucleares (ej.  Mucoral ) y los hongos septados presentan hifas con tabiques que son prolongaciones de la membrana citoplasmática (ej. Aspergillus, Dermatophytos).

1)

Hongos septados

Estos hongos pueden presentarse como contaminantes ambientales (ej.  Penicillium), como patógenos oportunistas (ej. Aspergillus) y como patógenos (ej.  Dermatophytos).  Aspergillus spp.: Los microorganismos que pertenecen a éste género son extremedamente frecuentes

en el medio ambiente y de crecimiento rápido (48 hr).

En contraste con la mayoría de las infecciones

 producidas por Candida, la aspergilosis se adquiere de fuentes exógenas.

Estos microorganismos se

identifican por sus características morfológicas presentando colonias aterciopeladas, algodonosas o pulverulentas, coloreadas (crema, verde, café y negras). Microscópicamente presentan hifas septadas de las que nace una prolongación no septada (conidóforo), el cual se dilata en su extremo distal (vesículas) rodeándose allí de células conidiogénicas (fiálides). Las fiálides producen conidios los que se disponen en forma de cadenas. El conjunto vesícula, fiálide y conidios se conoce como “cabeza aspergilar”  (Ver

Figura Nº 20). De las aproximadamente 900 especies de  Aspergillus  descritas,  A. fumigatus y  A. flavus   son las que con mayor frecuencia se asocian a enfermedad invasiva. Son ubicuitarios en el ambiente y no forman parte de la flora normal del ser humano, aunque pueden producirse colonizaciones transitorias. La aspergilosis está asociada con problemas respiratorios como la dilatación crónica de la vía aérea hasta un colapso de un segmento pulmonar.

Figura Nº 20: Estructura microscópica de especies de  Aspergillus

 Penicillium:

Estos microorganismos son ubicuitarios en el medio ambiente y suelen aislarse en muestras

de aire y como contaminantes en los cultivos de laboratorio, desarrollándose en 3-4 días.

En 1929, Sir

Alexander Fleming observó que una especie de  Penicillium  había contaminado su cultivo de Staphylococcus aureus, destruyendo las bacterias que se encontraban inmediatamente en contacto con el hongo.

observación casual llevó al descubrimiento de la penicilina.

Esta

Los hongos que petenecen a este género se caracterizan por la producción de conodióforos en el extremo de hifas septadas ramificantes.

Cuando se alojan en superficies, como una placa de agar,

germinan y crecen rápidamente produciendo colonias con aspecto polvoriento, de color verde azulado.  P. marnefeii  es la única especie patógena de  Penicillium  y es causa de infecciones espontáneas del

sistema retículoendotelial, afectando vasos linfáticos, pulmón, hígado, bazo y hueso. Ver figura Nº 21.

Figura Nº 21: Aspecto microscópico de  Penicillium.

2)

Hongos sifonados.

 Zigomicetos:

Especies de  Rhyzopus,  Mucor  y  Absidia   han sido implicados en cuadros de

zigomicosis. Macroscópicamente presentan un micelio algodonoso. Microscópicamente, forman hifas aseptadas y se reproducen asexualmente produciendo esporangios en los que se desarrollan esporas (Ver

Figura Nº 22). Las enfermedades asociadas a estos microorganismos son usualmente la mucormicosis rinocerebral.

Esta infección se origina en los senos paranasales y puede afectar órbita y el paladar,

extendiéndose hacia el cerebro.

En pacientes inmunodeprimidos puede afectar el pulmón, el tracto

gastrointestinal y los tejidos subcutáneos.

Figura Nº 22:

Aspecto microscópico de hongos sifonados.

I.- Estudio Clínico

El reconocimiento del hongo como agente de infección se inicia por la sospecha clínica del Médico al orientar su diagnóstico hacia una micosis. Este se sustenta gracias al examen físico, la historia clínica y en infecciones  profundas, se agrega el apoyo de imágenes, fundamentalmente el Scanner. Frecuentemente, en micosis oportunistas los signos y síntomas clínicos no son específicos, siendo indistinguibles de una infección  bacteriana. Muchas veces, la presencia de factores predisponentes o de riego y la pobre r espuesta al tratamiento antibacteriano, es señal que índica la posible presencia causal de agentes fúngicos, sospecha que debe ser indicada en la solicitud de examen para que el profesional de laboratorio oriente la búsqueda y aislamiento del hongo siguiendo la metodología apropiada. II.- Toma y Transporte de Muestras

La recolección y transporte del material clínico depende en gran parte de la sospecha clínica, tejido afectado, tipo de lesión y estado general del paciente. Esta etapa es fundamental para el éxito del diagnóstico. Debe asegurarse una cantidad suficiente de muestra que permita realizar todos los exámenes de laboratorio. La calidad de la muestra está directamente relacionada con la sensibilidad y rendimiento del examen en el laboratorio.

Si el paciente se encuentra bajo tratamiento antifúngico, se recomienda suspender el tratamiento, por lo menos 2 semanas antes de la toma de muestra. Esto se orienta principalmente a pacientes portadores de micosis superficiales o cutáneas y las consideradas no graves. III.- Procedimiento General del Diagnóstico de Laboratorio

En general, el examen microscópico directo (EMD) y el cultivo pueden ser realizados para todas las muestras clínicas que se reciben. Estos exámenes forman parte del método directo de identificación de hongos y se recomienda en todas las micosis. La microscopía proporciona información vital y frecuentemente una inmediata corroboración del diagnóstico presuntivo al observar el agente fúngico en el material clínico. Los hongos filamentosos se presentan en parasitismo como hifas que pueden ser cenociticas (poco septadas) o septadas, hialinas o dematiancias (oscuras) según el tipo de hongo. Algunas levaduras presentan características microscópicas particulares en parasitismo, lo cual orienta su identificación.

a)

El EMD puede ser realizado en frotis, fijándose la muestra al portaobjetos y usando la tinción de Gram o Giemsa, para poder observar con el objetivo de inmersión (100X). Lo más frecuente, es la  preparación al fresco con soluciones clarificadoras con o sin colorantes como KOH 10 o 20%. Además, se emplea la tinta de China para observar la presencia de cápsula en levaduras del género Cryptococcus, observándose con objetivos de 10X y 40X de aumento. En muestras de tejido, además

 puede solicitarse examen histopatológico donde se verá además la reacción tisular.  b)

El cultivo primario del hongo es realizado en varios tubos o placas de Petri conteniendo los medios de cultivo según la sospecha clínica. Las micosis causadas por hongos filamentosos se incuban generalmente a 25ºC y el tiempo de incubación dependerá de la sospecha clínica. Así, en las dermatofitosis o tiñas los medios se incuban hasta por 30 días, debido a que estos hongos demoran aproximadamente 20 días en crecer y presentar sus estructuras micromorfológicas características que  permitirán su diagnóstico a nivel de especie. Sin embargo, los hongos filamentosos oportunistas como  Aspergillus spp., Penicillium spp., Fusarium spp.,  mucorales y dematiaceos, entre otros, crecen más

rápido, obteniéndose colonias entre los 5 a 10 días de incubación. Las levaduras crecen mejor a 37ºC y sus colonias se obtienen entre las 24 y 72hrs dependiendo de la especie.

1.- HONGOS FILAMENTOSOS Examen Microscópico de la Colonia A partir del hongo filamentoso aislado in vitro, se realiza una preparación microscópica para observar las características morfológicas del organismo, buscando principalmente las estructuras reproductivas, ya que son éstas las que permitirán identificar el agente. Muchas veces, como consecuencia de la fragilidad de estas estructuras, se logra aproximar el diagnóstico a nivel de género o grupo de hongos, por tal motivo se requiere de un cultivo especial cuyo propósito es estimular la producción de células reproductivas en medios pobres y conservar su agrupación con respecto a las hifas a partir de un microcultivo. (no se realizará)

2.- IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS a) Prueba Fisiológica de Producción del Tubo Germinativo Este examen es realizado para identificar la presencia de C. albicans. En condiciones determinadas de cultivo “in vitro”, esta levadura desarrolla un tubo fino que no se libera ni presenta punto de constricción en el punto de unión con la célula madre. Se inocula la levadura en un tubo conteniendo plasma o suero humano y se incuba a 37ºC por 2 a 3 hrs. Debido a lo rápida, fácil y barata, esta técnica se encuentra implementada en la gran mayoría de los laboratorios. Sin embargo, es recomendable acompañarla siempre con estudios en microcultivo, para comprobar la identificación de C. albicans, ya que se han descrito casos de falsos positivos y negativos.

b) Prueba Fisiológica de Filamentación Este examen es realizado para identificar la presencia de Candida sp.. En condiciones determinadas de cultivo “in vitro”, estas levaduras desarrollan filamentos (pseudohifas) a partir de la célula madre. Se inocula la levadura en un tubo conteniendo plasma humano y se incuba a 37ºC por 24 hrs.

c) Pruebas Bioquímicas El estudio bioquímico de levaduras comprende principalmente el análisis de asimilación de hidratos de carbono conocido como Auxanograma, sometiéndose a la cepa en estudio a diferentes azúcares dependiendo del género de levadura que se sospeche. Este examen se complementa con asimilación de fuentes de nitrógeno, fermentación de azúcares denominado Zimograma e hidrólisis de urea. El auxanograma y la asimilación de nitratos son incubados a 25ºC hasta por 3 días. Entretanto, el zimograma e hidrólisis de urea se incuba a 37ºC. El perfil bioquímico obtenido será comparado con los datos en las tablas de identificación respectivas, según el género de levadura sospechado, permitiendo reconocer la o las especies que presentan el patrón bioquímico determinado.

d) Sistemas Comerciales de Identificación de Levaduras En virtud de trabajo y experiencia que se requiere para leer e interpretar los resultados bioquímicos realizados  por el método estándar, la industri a ha desarrollado progresivamente nuevos sistemas para facilitar y disminuir el tiempo de identificación de las especies de levaduras de interés clínico. La mayoría de los sistemas disponibles en el mercado son galerías que contienen distintos nutrientes y reactivos deshidratados en los  pocillos que, al ser inoculados e incubados correctamente proporcionan lectura de fácil interpretación, las cuales, en su mayoría generan un código numérico de varios dígitos que son interpretados por registros propios de cada empresa. El primer inconveniente observado por los laboratorios es la necesidad de contar con disponibilidad de otra estufa de cultivo, ya que algunos de estos sistemas se incuban a 30ºC por 24 y 48hr.

Sistema comercial

Productor

- Api Candida

BioMérieux

- ID 20C e ID 32C

BioMérieux

- Fungichrom I

International Microbio

En resumen, a partir del diagnóstico clínico los pasos importantes que favorecen el aislamiento e identificación del hongo son:

- Apropiada recolección del material clínico y rápido transporte al laboratorio - Inmediato y oportuno procesamiento de la muestra - Adecuada elección de la o las soluciones en el examen microscópico directo - Correcta selección del o los medios de cultivos - Óptimo procedimiento de inoculación e incubación - Adecuada realización, lectura, análisis e interpretación de las técnicas de identificación

ACTIVIDADES PRÁCTICAS 1.- Observación y descripción de cultivos de levadura. 1.1.- Procedimientos. a) Examen macroscópico : Describa, tal como lo hacía para colonias bacterianas, forma, color, aspecto de la superficie, borde, elevación y brillo de las colonias. Anote lo que observe.

b) Examen microscópico : Realice una tinción Gram tradicional. Es decir, realice un frotis con la colonia de levaduras en una gota de agua y continúe con el protocolo por usted. conocido. Observe con inmersión y dibuje lo que observa.

Nota: La tinción Gram es sólo una técnica de tinción . Las levaduras no son Gram + ni Gram -.   Recuerde que la característica de ser Gram+ o Gram- está relacionada con propiedades que pertenecen a las

membranas

bacterianas. c) Observación de tubo germinativo y filamentación en

Candidas:

1. Coloque en un portaobjeto limpio una gota del cultivo de Candida que se le entregará (*) 2. Cubra con un cubreojeto. 3. Observe al fresco en aumento de 40X y dibuje lo observado

(*) Para esta prueba la levadura a estudiar se siembra en un tubo con plasma humano y se cultiva a 37°C por 4 horas para observar tubo germinativo y por 24 horas para observar filamentación. Recuerde que sólo C. albicans presenta tubo germinativo a las 4 horas, mientras que varias especies de Candida presentan filamentación a las 24 horas. d) Tinción de cápsula : 1. Coloque en un portaobjeto limpio una gota de agua y una gota de tinta china. 2. Emulsione una colonia de Cryptococcus y extienda la preparación con otro portaobjeto. 3. Seque suavemente en la llama del mechero 4. Cubra con fucsina y deje reposar 2-3 minutos. 5. Lave con agua, seque y observe al microscopio con aceite de inmersión en 100X

Figura Nº 23: C ápsula de Cryptococcus spp.

2.- Observación, y descripción de hongos filamentosos. 2.1.- Procedimientos. a)

Examen macroscópico: Color y aspecto (aterciopelada, algodonosa, polvorienta, lanosa) en anverso

y reverso. Anote lo que observe. b)

Examen microscópico: Para esto se realizará un examen al fresco.

Examen al Fresco:

1.- Coloque una gota de azul de lactofenol sobre un portaobjeto. 2.- Flamee un asa en punta, enfríe cerca del mechero y obtenga un pequeño trozo del hongo (sin sacar agar). DEBE USAR MASCARILLA. 3.- Mezcle el fragmento del hongo con el azul de lactofenol y cubra con un cubreobjeto. 4.- Observe con aumento de 40X (sin inmersión, ni aplastando la muestra). 5.- Reconozca las estructuras microscópicas reproductivas de cada especie y dibuje.

•

Recuerde : el principal criterio para la identificación de estos microorganismos es el morfológico, por

lo tanto, es importante que trabaje con cuidado.

   )      (    N     Ó    I    C    A    T    N    E    M    A    L    I    F

   )    +    (    A    L    U    S    P     Á    C

   )      (

   A    L    U    S    P     Á    C

 .    p    s    s    u    c    c    o    c    o    t    p    y    r    C

   e    l    o    b    s    a   i    a   l    b   u   s    o    p    r    r    o    o    p   t    l  ,    o   u    r    d    2    3   o   o    I    h   T    P   R    A

   )      (    O    V    I    T    A    N    I    M    R    E    G    O    B    U    T

   O   O    V   V    I    I    T   T    I    L   S    U   O    C   P

   S    A    R    U    D    A    V    E    L

   O    V    I    T    A    N    I    M    R    E    G    O    B    U    T

   )    +    (    O    V    I    T    A    N    I    M    R    E    G    O    B    U    T

   S    A    I    D    I    N    O    C    O    R    T    R    A    N    O    C    S    A    F    I    H

   )    +    (    N     Ó    I    C    A    T    N    E    M    A    L    I    F

   S   S    A   A    I    F    I    D    H   I    N    O   O    S   C    A   O    F   T    I    H   S    A    O   L    D   B    U    E   N    S   O    P   C

   s    n    a    c    i    b    l    a    a    d    i    d    n    a    C

   S    A   Y    S    F    I    S   A    H   A   I    I    D    O   D   I    I    N    S   N   O    A   O   C    F    I    C   O    H   O   D    O   T   I    D   S   M    U   A   A    L    E   L   C    S   B    P

   E    L    B   o    A   n   m    o   u    B   r    O    o   h    c    i    R   p    r    t    P   s    o  ,    h   o    2   c   e    i    G    3   r    I    T    P    A

 .    p    s

   a    d    i    d    n    a    C

   s    n    a    c    i    b    l    a    a    d    i    d    n    a    C

   N     Ó    I    C    A    )    )    T    E   S   O    E    M   R   R    R   A   T    E   C   O    F    /    Ú   U    N   Z   2    A   3     Ó    I    E   I    C   D   P    A    A    (    L    I    M    I    S    A

TRABAJO PRÁCTICO N°6 PARÁSITOS

1.- Reconocer formas infectantes y parásitos adultos de interés clínico.

2.- Observar las características más importantes de estos parásitos.

MARCO TEÓRICO Se define como

parásito a todo ser vivo, vegetal o animal, que pasa toda, o parte de su existencia, a

expensas de otro ser vivo

(hospedero) , del cual vive causándole o no daño, que puede ser aparente o

inaparente, y con quien tiene una dependencia obligada y unilateral. Existen diversos tipos de parasitismo:

1.  Parasitismo obligatorio: los parásitos necesitan para vivir hacer vida parasitaria. Este estado puede ser  permanente, permanente estacionario, periódico o temporario.

2. Parasitismo facultativo: son seres de vida libre que en circunstancias favorables hacen vida parasitaria. 3. Parasitismo accidental: no son parásitos verdaderos, pero ocasionalmente pueden serlo. 4. Parasitismo extraviado: parásitos de los animales que anormalmente pueden encontrarse en el hombre. 5.  Parasitismo errático: cuando la localización del parásito, en el huésped, no es en el órgano o tejido habituales.

Ciclos de vida del parásito: 1. Ciclos directos (monoxénicos): son aquéllos en los que no hay la presencia de un hospedero intermediario. Pueden ser

cortos -donde la forma emitida es la infectante- o largos, donde la forma emitida necesita un

determinado tiempo en el medio (generalmente el suelo) para transformarse en infectante. En general, los  parásitos con ciclos directos cortos son cosmopolitas y los directos largos están condicionados por las situaciones climáticas.

2. Ciclos indirectos (heteroxénicos): son los que necesitan un hospedero intermediario para completar su ciclo. La presencia de estas parasitosis en un área determinada depende de la existencia de dicho hospedero intermediario.

Características más importantes de los parásitos: Resistencia al medio exterior:  para enfrentar los factores climáticos y algunos agentes químicos, los huevos, quistes o larvas se protegen con cubiertas proteicas que los hacen resistentes.

Patogenicidad: está relacionada con la morbilidad y la mortalidad. Algunos parásitos son patógenos por sí mismos, y otros lo son dependiendo de las características del hospedero; ésto hace que un mismo parásito  pueda o no producir enfermedad. Por esta razón existen el portador sano y los parásitos oportunistas, que se manifiestan en pacientes inmunocomprometidos.

Autoinfección: es la forma para que el parásito permanezca por más tiempo en el hospedero. Puede ser

autoexoinfección, en la que está en el exterior un tiempo muy corto (por ejemplo oxiuriasis); o autoendoinfección, en la que se multiplica dentro del huésped, y la recontaminación se hace en el interior del mismo (por ejemplo teniasis). Prepatencia: es el tiempo que transcurre entre la entrada del parásito al hospedero y la demostración de la

 presencia de éste, o de sus formas de desarrollo, ya sea por la observación directa, estudios bioquímicos, cultivos, etc. Viabilidad: es importante que las formas emitidas al exterior por el parásito sean viables a través de

estructuras resistentes, tanto al medio como a los huéspedes intermediarios. Se asegura de esta forma la continuidad del ciclo y su permanencia. Diapausa: es el estado en que muchas veces las larvas de los parásitos permanecen en el organismo del

huésped en forma latente -encapsuladas o formando quistes- para evadir la respuesta inmunológica. Longevidad: la longevidad de un parásito admite dos formas: longevidad verdadera, cuando permanecen

muchos años en un organismo (por ejemplo Trypanosoma cruzi, agente etiológico de la enfermedad de Chagas); o perpetuándose -por medio de la autoinfección- aunque el parásito tenga vida muy corta. Fecundidad: la capacidad para emitir determinada cantidad de formas parasitarias que le sirve al parásito para

 perpetuarse. Es útil conocerla, ya que a t ravés de ello (por ejemplo, en los helmintos, postura diaria de huevos), es posible hacer el cálculo aproximado del número de parásitos que infectan al huésped. Prevención de las parasitosis

La Organización Mundial de la Salud estableció que, dado que las parasitosis son patologías con alto componente social, podrían ser controladas pero difícilmente eliminadas. Las medidas de prevención están vinculadas a la modificación de los hábitos, la educación y el bienestar de la población. Incluyen: 1.

Disminuir el fecalismo a través de medidas de saneamiento básico, como facilitar el acceso al agua  potable, la correcta eliminación de heces, etc.

2.  No utilizar excrementos como abono para el cultivo de hortalizas, ni aguas servidas para riego. 3.  No consumir carnes o verduras crudas. 4.

Controlar los vectores mecánicos (moscas, cucarachas) y los vectores biológicos (vinchuca, mosquitos etc.).

5.

Desparasitar periódicamente a los animales domésticos, sobre todo perros y gatos.

6.

Prevenir las parasitosis congénitas a través del control de la mujer embarazada.

7.

Evaluar marcadores de parasitosis en dadores de sangre y donantes de órganos.

8.

Modificar hábitos de convivencia del hombre con los animales para evitar el contacto con las heces de los mismos.

9.

Promocionar la lactancia materna, ya que se ha comprobado que ésta protege contra determinadas  parasitosis, principalmente las que originan diarreas.

10. Evitar el hacinamiento, que facilita el contagio persona a persona.

11. Hervir el agua de consumo por un minuto, utilizando esta modalidad como norma, especialmente cuando la ingieran lactantes y niños. 12.  No caminar descalzo o con calzado abierto en suelos de tierra o arena, sobre todo húmedos. 13. Utilización de guantes y calzado cerrado siempre que se trabaje con la tierra. 14. Antes de utilizar abono o turba de río comercial rociar el material con agua recién hervida. 15. Tratar de evitar que los niños jueguen en areneros o patios de tierra. Si ello no fuera factible, establecer un lugar delimitado para ellos, al que se rociará periódicamente, si es posible en forma diaria, o en los períodos de clima cálido y después de las lluvias, con agua recién hervida. 16. Colocar los juguetes de los niños al sol las veces que se pueda, ya que la mayoría de las formas  parasitarias no resisten a la desecación y temperaturas superiores a 50ºC.

LABORATORIO DE PARASITOLOGIA

OBTENCIÓN DE LA MUESTRA

CONDICIONES GENERALES •

Los parásitos intestinales del hombre son protozoarios y/o helmintos, también llamados gusanos intestinales. Estos helmintos pueden ser cilíndricos (nemátodos), anillados o segmentados (céstodos).

•

Para observar los trofozoítos, quistes u ooquistes de los protozoarios así como las larvas y huevos de helmintos se debe usar un microscopio. La mayor parte de los helmintos adultos son macroscópicos y su morfología puede estudiarse directamente, con ayuda de un estereoscopio o una lupa.

•

Las formas evolutivas de los protozoos intestinales se eliminan por las heces (trofozoíto, quiste, ooquiste y espora), según la especie involucrada.

•

Los helmintos intestinales adultos (proglótidas de Taenia sp.,  Enterobius vermicularis y  Ascaris lumbricoides) pueden salir al exterior espontáneamente o después del tratamiento.

•

Los helmintos intestinales se eliminan con las heces.

•

Los métodos de diagnóstico de los parásitos intestinales pueden ser: directo o por concentración de los elementos parasitarios que se eliminan en las heces.

•

En las heces podemos encontrar formas adultas y microscópicas (huevos, larvas, trofozoitos, quistes, ooquistes y esporas) de los parásitos intestinales; por ello, es importante obtener una buena muestra fecal, así como la conservación óptima del espécimen.

•

La muestra debe ser obtenida (entre 3 y 6 gramos) lo más fresca posible (máximo 90 minutos, si se  busca  Entamoeba histolytica), y depositada en un frasco de boca ancha con tapa rosca y rotulada correctamente con los datos de identificación.

•

La muestra debe obtenerse antes del uso de medicamentos antiparasitarios, o hasta 2 a 5 días después de su administración.

•

Las heces depositadas en el suelo no son las recomendadas para el diagnóstico, debido a que pueden contaminarse con formas biológicas, como por ejemplo: larvas similares a los enteroparásitos del hombre, larvas de nemátodos, huevos de ácaros o insectos, etc.

•

Si el paciente no es regular en la evacuación de sus deposiciones y ha evacuado en la noche anterior al examen, se recomienda guardar la muestra en una refrigeradora o en un lugar fresco no expuesto a la luz solar, para que no se alteren las formas parasitarias. Cuando la muestra va a demorar en llegar al laboratorio varias horas o días, se recomienda adicionarle líquido fijador y/o conservador (PAF, PVA, formalina 10%, SAF, acetato de sodio, etc.).

MUESTRA PARA EXAMEN PARASITOLÓGICO Comprende las siguientes muestras: heces, bilis o jugo duodenal, esputo, secreción, biopsia o preparaciones histológicas, siendo heces la más frecuente .

EXAMEN DIRECTO MACROSCÓPICO Fundamento. Permite observar directamente las características morfológicas de los parásitos adultos, enteros o fraccionados, así como los cambios en las características organolépticas de las heces eliminadas, (color, presencia de sangre y/o moco, consistencia, etc.).

Figura Nº 24. Ascaris lumbricoides macho adulto (der.) y proglótido grávido de Taenia solium (4X)

(izq.),

coloración: Tionina EXAMEN DIRECTO MICROSCÓPICO Fundamento. Buscar, principalmente en muestras frescas, la presencia de formas evolutivas móviles de parásitos de tamaño microscópico (trofozoítos, quistes de protozoos:  Entamoeba histolytica, Giardia lamblia,  Balantidium coli, etc.; así como larvas o huevos de helmintos: Strongyloides stercoralis, Ancylostoma duodenale, Necator americanus, Trichostrongylus sp., Paragonimus, Fasciola, etc.).

Ejemplos

Figura N º 25: Trofozoito de Giardia lamblia con solución lugol.

Figura Nº 26: Huevos operculados de  Paragonimus peruvianus (izq.) y Fasciola hepatica (der.) en muestra fresca

DIAGNOSTICO EN EL LABORATORIO PARASITOLOGÍA La recolección correcta de las muestras es esencial para un examen de heces confiable. Se recomienda realizar un seriado coproparasitológico, una muestra fresca en solución formolsal. Debe entregarse a cada  paciente tres frascos o recipientes plásticos de boca ancha con cierre adecuado, Se puede solicitar al paciente que tres días antes de iniciar la recolección no ingiera manteca, frutas de hollejo, verduras de hoja y legumbres.Puede ingerir carnes magras, pastas, dulces, papa. Esta dieta previa no es un requisito estricto. Se debe suspender la ingesta de purgantes oleosos y sustancias radio opacas.

Recolección de materia fecal en conservantes: • Seriada coproparasitológica: Se indica la recolección de un mínimo de una muestra (tamaño de una cucharada de postre) de cada deposición en tres días alternos. Se le indica al paciente que defeque en una bacinica, o en un recipiente de boca ancha, limpio y seco, o sobre superficie plástica o papel no absorbente de donde tomará la porción para colocarla en un frasco grande con formolsal al 5%.

Examen macroscópico de las heces remitidas: Cuando las heces frescas son recibidas en el laboratorio deben ser examinadas bajo luz lo que permite observar directamente las características morfológicas de los parásitos adultos, enteros o fraccionados, así como los cambios en las características organolépticas de las heces eliminadas, (color, presencia de sangre y/o moco, consistencia, etc.).

Examen microscópico de heces: La aplicación de los métodos de concentración permite detectar elementos parasitarios que estén presentes y se examina una cantidad mayor de heces en menor volumen.

ACTIVIDADES PRÁCTICAS Las actividades del laboratorio de parasitología consistirán en la observación de elementos parasitarios conservados en soluciones fijadoras y disecados y/o observación de diapotecas según disponibilidad de cada laboratorio.

EJEMPLOS DE ELEMENTOS PARASITARIOS QUE PUEDEN ENCONTRARSE EN UN SERIADO DE DEPOSICIONES