PRÁCTICA # 1 DETERMINACIÓN DE INHIBIDORES MICROBIANOS EN LECHE M.C. MARIO R EAL NAVARRO NAVARRO Profesor de Toxicología Departamento de Salud Publica Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias Universidad de Guadalajara
OBJETIVO El alumno desarrollara en el laboratorio la técnica cualitativa para determinar la presencia de inhibidores microbianos en leche fluida. INTRODUCCION. Los antibi antibióti óticos cos son sustan sustancia ciass de acción acción antimi antimicrob crobian iana a produci producidas das por microorganismos o plantas superiores en el curso de su metabolismo normal, son sustancias que inhiben de otros microorganismos en concentraciones mínimas. De este modo, ciertas patologías que afectan exclusivamente a los animales y por tanto no son consideradas oonosis, pueden llegar a serlo de forma indirecta, puesto que su presencia presencia incrementa el riesgo potencial potencial para la salud p!blica debido a la presencia significativa de inhibidores microbianos en alimentos para consumo huma humano, no, como como cons consec ecuen uenci cia a del del uso uso masi masivo vo de antib antibió iótiticos cos para para prom promov over er el crecimi crecimient ento, o, curar curar y preveni prevenirr enferm enfermedad edades es y promoto promotorr del crecim crecimien iento to y el no resp respet eto o de los peri period odos os de supr supres esió ión. n. Exis Existe ten n inhi inhib bidor idores es natu natura rale less de microorganismos en la leche aunque el combate se haga principalmente en base al uso de antibióticos.
INHIBIDORES NATURALES DE LA LECHE NOMBRE Lactenina %nmunoglobulinas 'seudoglobulinas (ormonas )cidos grasos libres Leucocitos
PROPIEDADES Dos tipos, especialmente en calostro "poco activa en anaerobiosis#$ efecto menor en la leche &actor es específico co contra ci ciertos co coliformes %nhibición de propionibacterias en suero %nhibición lactobacilos &agocitosis
La cantidad de antibióticos que llega a la leche depende del tipo de preparado "componente activo y vehículo#, dosis y forma de aplicación, producción de leche del animal tratado, tipo y grado de afección mamaria y tiempo que media entre el tratamiento y el orde*o.
CAUSAS DE LA PRESENCIA DE RESIDUOS DE PENICILINA EN LOS SUMINISTROS DE LECHE. Errores de orien!"in $ %r&"i"!s in!de"'!d!s
+ -
incorrecta aplicación de recomendaciones ϕ recomendaciones equivocadas uso de ungentos y substancias que contengan penicilina. ϕ limpiea insuficiente de la m/quina de orde*o
011-
ϕ
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Co('ni"!"in $ di)'sin ins')i"iene en e* %redio
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La administración ya sea oral, intramuscular o intravenosa, tiene menos importancia, desde el punto de vista de higiene de leche, que la aplicación por vía intramamaria. Esta !ltima es la m/s usada para el tratamiento de la mastitis, dependiendo la cantidad de antibióticos eliminada por la leche del tipo de preparado, dosis, intervalos entre tratamiento y orde*o, n!mero de orde*os, producción de leche y factores individuales. Los preparados con base hidrofobia, presentan un tiempo de eliminación m/s prolongado que aquellos con base acuosa.
PUNTOS CRTICOS 7uando se introduce un antibiótico en la ubre, éste se distribuye en el te8ido mamario por los conductos galactóforos y es transferido al torrente sanguíneo por un mecanismo fisicoquímico que depende del valor de p9a "valor de disociación# del preparado, valor de p( del plasma sanguíneo, proteína ligada al antibiótico y valor de p( de la leche. Debido a esto, la reabsorción del producto es muy variable de acuerdo al preparado y al animal. De la dosis administrada a la gl/ndula mamaria, una parte es absorbida pasando al torrente sanguíneo, otra es inactivada por la leche y los productos generados por la infección y el resto, que es la mayor parte, es excreta da a la leche durante los orde*as posteriores. Existe una correlación negativa entre el tiempo de eliminación del antibiótico y el volumen de leche producido por el animal. Los animales de ba8a producción
demoran en excretar el preparado, principalmente por la mala absorción y secreción de los cuartos afectados. El orde*o frecuente aumenta el efecto de dilución y por lo tanto acorta el tiempo de eliminación del antibiótico. 'or otra parte, no sólo la leche de los cuartos tratados es la que se contamina. :e ha podido comprobar, en algunos casos, actividad antibiótica en los cuartos vecinos no tratados, actividad que permanece, por lo general, durante un período de tiempo igual a la mitad del observado para los tratados. Es posible que esta situación se produca por difusión pasiva entre la sangre y la leche y también por difusión directa entre los te8idos mamarios. Debido a que los antibióticos de aplicación intramamaria son de f/cil aplicación y generalmente baratos, dado que usualmente no se consulta al médico veterinario para su aplicación, se han hecho muy populares en las explotaciones lecheras y la consecuencia inmediata de esto es su reconocimiento como la principal causa de aparición de residuos de antibióticos en la leche.
IMPORTANCIA EN SALUD P/BLICA En la actualidad no se conocen informes sobre intoxicaciones provocadas por antibióticos de uso com!n ingeridos a través de la leche y se explica porque sus concentraciones resultan ser muy ba8as como para provocar un efecto tóxico, con la excepción, posiblemente, del cloranfenicol, que es capa de producir, de acuerdo a algunos investigadores, anemia pl/stica por depresión de la médula ósea, al suministrarse dosis ba8as por períodos cortos de tiempo. ;o obstante lo anterior, subsiste la duda de si el consumo de antibióticos por el hombre, a través de alimentos contaminados, puede alcanar niveles que determinen una toxicidad de tipo crónico, motivo m/s que suficiente para prohibir la presencia de éstos en los alimentos. ϕ ϕ ϕ
alteración de la flora intestinal, estimulación de bacterias antibiótico?resistentes, desarrollo de microorganismos patógenos, y . reducción de la síntesis de vitaminas.
Desde el punto de vista de la salud p!blica, el establecer límites m/ximos permisibles en cuanto a contenido de antibióticos en la leche resulta muy difícil y el uso de un límite inferior sólo debe considerarse como solución transitoria, siendo imperioso llevar a cabo mayores investigaciones en el tema. 'or lo anterior, la tendencia debe inclinarse hacia la limitación en el uso de estos preparados, por la vía de una adecuada selección genética, buen mane8o del ganado, control sobre su utiliación y principalmente, toda medida que contribuya a disminuir la incidencia de mastitis.
PROBLEMAS TECNOLO0ICOS. La producción de productos fermentados es la m/s afectada en la industria cuando en la leche recibida est/n presentes residuos de antibióticos, provocando grandes pérdidas en calidad y, por ende, económicas. 'or e8emplo, las bacterias empleadas en la fabricación de yoghurt, Lactobacillus vulgaricus y Streptococcus termophillus resultan ser unas de las m/s sensibles a los antibióticos. Las bacterias, por efecto de los antibióticos, presentan cambios morfológicos y pueden darse situaciones en que los cultivos iniciadores sean reemplaados por microorganismos indeseables, provocando la inutiliación del producto o que se convierta en peligroso para su consumo. =dem/s de los efectos en los productos l/cteos fermentados, la industria se ve per8udicada en pruebas de control de calidad a la que es sometida la leche a nivel de recepción. @al es el caso del test de tiempo de reducción del aul de metileno, @A=B, que aumenta cuando la leche est/ contaminada con antibióticos, lo que trae como consecuencia un error en la clasificación de la leche. 'or otra parte, a!n persiste la creencia errónea de que los tratamientos térmicos a que se somete la leche destruyen las sustancias inhibidoras y, en forma particular, los antibióticos. :in embargo, un informe de 5C01 de la &ederación %nternacional de la Lechería se*ala que la penicilina pierde solamente un 2- de su actividad luego de la pasteuriación. n tratamiento térmico m/s exigente "C67 por 36 minutos#, destruye el 6- de la actividad de la penicilina y la esteriliación un 46-. En el cuadro siguiente, se muestra un resumen con respecto a la termo estabilidad de los antibióticos frente a diferentes tratamientos.
TERMOESTABILIDAD DE ANTIBIOTICOS =ntibiótico 'enicilina Estreptomicina
- de destrucción seg!n el tratamiento térmico 'asteuriación C67 F 36 min 5667 F 36min 2646? ? 00
;eomicina 7lorotetraciclina
? ? ? ?
? ? ? ?
00 C6 C6 ?
PRINCIPALES EECTOS PROVOCADOS POR ANTIBIÓTICOS EN LOS PROCESOS INDUSTRIALES
LA
PRESENCIA
DE
Queso y productos fermentados ϕ ϕ ϕ ϕ ϕ ϕ
ϕ
Demora en la acidificación Demora en la coagulación 7oagulación deficiente Disminución de la retención de agua Desarrollo de microorganismos indeseables =lteración de las características normales del producto> cuerpo débil o textura blanda o o sabor amargo "excesiva acción del cua8o# consistencia arenosa "yogurt# o %nterferencia en la formación de aroma en mantequilla fermentada.
En el siguiente cuadro se identifican algunos microorganismos l/cticos y su sensibilidad a la penicilina, estreptomicina y clortetraciclina>
CULTIVO
In2i3i"in %or Ani3ii"os Peni"i*in! Esre%o(i"in! C*orer!"i"*in! U.I. 4 (* 0!(!s 4 (* 0!(!s 4 (* parcial
total
Strptococcus cremoris Strtococcus. lactis Streptococcus. thermophilus Lactobacillus acidophilus Lactobacillus casei Lactobacillus helveticus Lactobacillus lactis
6.64 G 6.51 ? 6.6651 G 6.51 6.3 G 6.0 6.3 G 6.0
6.5 G 6.4 ? 6.64 G 6.64 6.5 G 6.3 6.64 G 4.6
6.3
?
7ultivo
6.651 G
?
6.64 G 6.3 ?
parcial
total
parcial
Total
?
?
?
?
? 6.4 G 4.6
?
? 6.665 G 6.65
6.4
?
6.3
?
?
?
6.3 G 6.4
?
?
?
6.64
6.5 G 6.4
?
?
?
?
?
?
6.3 G 3.6
6.5 G
?
6.65 G
?
Bantequilla 7ultivo inicial para quesos
6.51 6.6 G 6.64
6. 6. G 6.46
6.6+
?
6.5 6.6 G 6.64
?
MATERIAL E,'i%o5 Hortex. Ha*o mario a 26I7 Estufa bacteriologica a 3+I7 Bechero 'inas de punta fina Cris!*eri!5 'ipetas de 5 ml @ubos de ensayo de 0 mL 7a8as petri Cons'(i3*es5 Barcador indeleble Discos de papel Jhatman de 0mm :ensidiscos con penicilina a 6.65 % pFdisco :olución buffer K 5 Bedio de cultivo para antibiótico K 5 Bio*6i"o5 Hacilo :ubtilis PROCEDIMIENTO POR MUESTRA DE LECHE 5. Barcar dos tubos de ensayo & "&rió# y 7 "7aliente#. . 7olocar en cada uno de los tubos 5 mL de leche y mL de solución Huffer. 3. =gitan en el bortex por 4 segundos. +. E% tubo marcado con la 7 se lleva a ba*o Baría "26I7# por 3 minutos posteriormente se de8a enfriar a temperatura ambiente y se agitan nuevamente en el bortex. 4. E% tubo & se mantiene a temperatura ambiente. 0. En la ca8a petri con el medio de cultivo para antibiótico K 5 con Hacilo subtilis se colocan discos de papel Jhatman K + de 0mm humedecidos en el contenido de los tubos marcados con & y 7 respectivamente y en el centro de la ca8a se coloca el sensidisco con penicilina como referencia. 1. %ntroducir la ca8a de petri a la estufa bacteriana "3+I7# por + horas para su cultivo.
RESULTADOS DISCUSION CONCLUCIÓN
;ombre del
alumno>
&echa> &irma>
