Nutrient Agar (NA) merupakan merupakan suatu medium yang yang berbentuk padat, padat, yang merupakan merupakan perpaduan antara antara bahan alamiah dan senyawasenyawasenyawa kimia. NA dibuat dari campuran ekstrak daging dan peptone dengan menggunakan agar sebagai pemadat. Dalam hal ini agar digunakan sebagai pemadat, karena sifatnya yang mudah membeku dan mengandung karbohidrat yang berupa galaktam sehingga tidak mudah diuraikan oleh mikroorganisme. mikroorganisme. Dalam hal ini ekstrak beef dan pepton digunakan sebagai bahan dasar karena merupakan sumber protein, nitrogen, vitamin vitamin serta karbohidrat yang yang sangat dibutuhkan dibutuhkan oleh mikroorganisme mikroorganisme untuk untuk tumbuh dan berkembang. Medium Medium Nutrient Agar (NA) merupakan medium yang berwarna coklat muda yang memiliki konsistensi yang padat dimana medium medium ini berasal dari sint etik dan memiliki kegunaan sebagai medium untuk menumbuhkan bakteri Nutrient Broth (NB) adalah medium medium yang berbentuk cair dengan dengan bahan dasar adalah adalah ekstrak beef dan peptone. peptone. Perbedaan konsentris konsentris antara Nutrient Agar dengan Nutrient Nutrient Broth yaitu yaitu nutrient agar berbentuk padat padat dan Nutrient Broth berbentuk cair. Susunan Susunan kimia sama-sama sintetik. Fungsi kimia dari nutrient agar dan nutrient broth sebagai medium umum. Medium Nutrient Broth (NB) merupakan medium yang berwarna coklat yang memiliki memiliki konsistensi konsistensi yang cair dimana medium medium ini berasal dari dari sintetik dan memiliki memiliki kegunaan sebagai sebagai medium untuk untuk menumbuhkan menumbuhkan bakteri sama seperti medium NA. 2. NA (Nutrient Agar) a. Memiliki warna coklat tua b. Memiliki konsistensinya konsistensinya yang yang berbentuk padat padat c. Memiliki susunan kimianya adalah sintetik d. Merupakan medium untuk pertumbuhan bakteri 3. NB (Nutrient Borth) a. Memiliki warna coklat b. Memiliki konsistensinya konsistensinya yang berbentuk cair c. Memiliki susunan kimianya adalah sintetik d. Merupakan medium untuk pertumbuhan bakteri seperti pada medium NA Nutrient Broth Nutrient broth merupakan merupakan media untuk untuk mikroorganisme mikroorganisme yang berbentuk cair. Intinya sama dengan dengan nutrient agar. Nutrient Nutrient broth dibuat dengan cara sebagai berikut. 1.Larutkan 5 g pepton dalam 850 ml air distilasi/akuades. 2.Larutkan 3 g ekstrak daging dalam larutan yang dibuat pada langkah pertama. 3.Atur pH sampai 7,0. 4.Beri air distilasi sebanyak 1.000 ml. 5.Sterilisasi dengan autoklaf. Nutrient broth is made identically, except omitting the agar. Nutrient agar Peptone - 5 g/L Meat extract - 1 g/L Yeast extract - 2 g/L Sodium chloride - 5 g/L Agar - 15 g/L pH - 7.0 ± 0.2 Storage temperature - 2-8°C Nutrient broth is a liquid liquid formulation that that does not contain agar agar Nutrient Borth are used for for enrihment of specified bateria bateria like E,coli and salmnella salmnella Disiapkan semua alat dan bahan. Ditimbang Ekstrak beef sebanyak 0,3 gram, Pepton 0,5 gram. Ekstrak beef dan Pepton dilarutkan dengan 100 ml air. Dimasukkan dalam erlenmeyer dan dicukupkan volumenya dengan aquadest sampai 100 ml, kemudian erlenmeyer ditutup dengan kapas. Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121o C selama 15 menit. Medium didinginkan dan disimpan dalam kulkas. Diamati dan dicatat warna dan bentuk bentuk dua hari setelah penyimpanan. Pembuatan Medium Untuk mengembang-biakkan mikroorganisme seperti kapang, khamir, jamur ataupun yang lainya diperlukan medium. Medium merupakan suatu media untuk menumbuhkan mikroba, isolasi, memperbanyak jumlah, menguji sifat-sifat fisiologi dan perhitungan jumlah mikroba. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan mengembangbiakkan mikroorganisme tersebut harus sesuai susunanya dengan kebutuhan jenis-jenis mikroorganisme yang bersangkutan. untuk menumbuhkan mikroorganisme yang kita inginkan, yang pertama harus dilakukan adalah memahami kebutuhan dasarnya kemudian memformulasikan suatu medium atau bahan yang akan digunakan. Berdasarkan konsistensi ataupun kepadatannya, kepadatannya, medium terbagi tiga bagian, yaitu : 1. 2.
3.
Medium cair/broth/liquid yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB ( Nutrient ( Nutrient Broth), Broth), LB ( Lactose Broth Lactose Broth). ). Medium setengah padat (semi solid medium) yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semi solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB ( Nitrogen ( Nitrogen free Bromthymol free Bromthymol Blue) Blue) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada media Nitrate Broth Nitrate Broth,, kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media. Medium padat (solid medium) yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin media menjadi padat.. Contoh : endo agar, PDA, Nutrient agar
Berdasarkan komposisi medium dapat di bagi tiga bagian, yaitu : 1.
Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar . 2. Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti, misanya PDA ( Potato Dextrose Agar ) yang mengandung agar, dekstrosa dan ekstrak kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak dapat mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa penyusunnya. 3. Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic Agar, Pancreatic Extract Extract . Berdasarkan fungsinya, medium terbagi menjadi empat bagian, yaitu :
1. 2. 3. 4.
Medium umum, yaitu medium yang dapat ditumbuhi berbagai jenis mikroorganisme. Contoh : NA (nutrient agar) umum untuk bakteri, PDA (potato dextrose agar) dan toge umum untuk jamur. Medium selektif, yaitu medium yang hanya ditunbuhi jenis mikroba tertentu. Contoh : medium SSA untuk bakteri Salmonella dan Shigella. Medium diferensial, yaitu medium yang hanya ditumbuhi berbagai jenis mikroba, salah satu jenis memberikan cirri yang khas sehingga dapat segera diketahui berbeda dari yang lain. Contoh : Blood Agar, EMB agar, dll. Medium pengaya, yaitu medium yang kaya akan nutrient tertentu sehingga dapat menumbuhkan dan memperbanyak sel dengan cepat. Contoh: medium Tetrathionat Broth, dll.
Medium untuk menumbuhkan mikroorganisme ada berbagai macam. Mikroorganisme dapat tumbuh sesuai dengan medium yang digunakan. Berikut adalah berbagai medium yang sering digunakan : Nutrien Agar(NA) Nutrien agar adalah medium umum untuk uji air dan produk dairy. NA juga digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof. Media ini merupakan media sederhana yang dibuat dari ekstrak beef, pepton, dan agar. Na merupakan salah satu media yang umum digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti uji biasa dari air, sewage, produk pangan, untuk membawa stok kultur, untuk pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam kultur murni. Pada pembuatan medium NA ini ditambahkan pepton agar mikroba cepat tumbuh, karena mengandung banyak N 2 (Dwidjoseputro, 1994). Agar yang digunakan dalam proses ini untuk mengentalkan medium sama halnya dengan yang digunakan pada medium PDA yang juga berperan sebagai media tumbuh yang ideal bagi mikroba (Schlegel, 1993). Agar dilarutkan dengan komposisi lain dan disterilisasi dengan autoklaf pada 121°C selama 15 menit. Kemudian siapkan wadah sesuai yang dibutuhkan. Dalam percobaan warna NA sebelum dilarutkan dalam aquades adalah coklat, dan setelah dilarutkan dalam aquades berubah menjadi kekuning-kuningan dan terdapat endapan. Jadi untuk menghilangkan endapan tersebut maka dipanaskan dalam penangas air dengan tabung Erlenmeyer disumbat dengan alat penyumbat. Setelah sterilisasi warna medium menjadi agak coklat Potato Dextrose Agar (PDA) PDA digunakan untuk menumbuhkan atau mengidentifikasi yeast dan kapang. Dapat juga digunakan untuk enumerasi yeast dan kapang dalam suatu sampel atau produk makanan. PDA mengandung sumber karbohidrat dalam jumlah cukup yaitu terdiri dari 20% ek strak kentang dan 2% glukosa sehingga baik untuk pertumbuhan kapang dan khamir tetapi kurang baik untuk pertumbuhan bakteri. Cara membuat PDA adalah mensuspensikan 39 g media dalam 1 liter air yang telah didestilasi. Tetapi pada praktikum kali ini PDA dilarutkan pada 50mL air dengan perhitungan :
39x50 = 1000x x=
x = 1,95gr jadi PDA yang digunakan untuk 50 ml aquades adalah 1,95gr. Serbuk PDA berwarna kuning karena merupakan ekstrak kentang yang pada dasarnya berarna kuning. serbuk dicampur dan dipanaskan serta aduk. Didihkan selama 1 menit untuk melarutkan media secara sempurna. Sterilisasi pada suhu 121°C selama 15 menit. setelah disterilisasi dalam autoklaf medium berwarna kecoklatan dan didapat endapan berwarna putih. Dinginkan hingga suhu 40-45°C dan tuang dalam cawan petri dengan pH akhir 5,6+0,2.).Setelah didinginkan, medium dapat ditanami bakteri (Schegel, 1993) Plate Count Agar (PCA) PCA digunakan sebagai medium untuk mikroba aerobik dengan inokulasi di atas permukaan. PCA dibuat dengan melarutkan semua bahan (casein enzymic hydrolisate, yeast extract, dextrose, agar) hingga membentuk suspensi 22,5 g/L kemudian disterilisasi pada autoklaf (15 menit pada suhu 121°C). Media PCA ini baik untuk pertumbuhan total mikroba (semua jenis mikroba) karena di dalamnya mengandung komposisi casein enzymic hydrolisate yang menyediakan asam amino dan substansi nitrogen komplek lainnya serta ekstrak yeast mensuplai vitamin B kompleks. Selain medium di atas masih terdapat medium lain yang juga memiliki fungsi untuk menumbuhkan kultur mikroorganisme, yaitu : Lactose Broth Lactose broth digunakan sebagai media untuk mendeteksi kehadiran koliform dalam air, makanan, dan produk susu, sebagai kaldu pemerkaya (pre-enrichment broth) untuk Salmonellae dan dalam mempelajari fermentasi laktosa oleh bakteri pada umumnya. Pepton dan ekstrak beef menyediakan nutrien esensial untuk memetabolisme bakteri. Laktosa menyediakan sumber karbohidrat yang dapat difermentasi untuk organisme koliform. Pertumbuhan dengan pembentukan gas adalah presumptive test untuk koliform. Lactose broth dibuat dengan komposisi 0,3% ekstrak beef; 0,5% pepton; dan 0,5% laktosa. Nutrient Broth (NB) Nutrient broth merupakan media untuk mikroorganisme yang berbentuk cair. Intinya sama dengan nutrient agar. Nutrient broth dibuat dengan cara sebagai berikut. 1. Larutkan 5 g pepton dalam 850 ml air distilasi/akuades. 2. Larutkan 3 g ekstrak daging dalam larutan yang dibuat pada langkah pertama. 3. Atur pH sampai 7,0. 4. Beri air distilasi sebanyak 1.000 ml. 5. Sterilisasi dengan autoklaf. EMBA (Eosin Methylene Blue Agar) Media Eosin Methylene Blue mempunyai keistimewaan mengandung laktosa dan berfungsi untuk memilah mikroba yang memfermentasikan laktosa seperti S. aureus, P. aerugenosa, dan Salmonella. Mikroba yang memfermentasi laktosa menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap dengan kilap logam. Sedangkan mikroba lain yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna. Adanya eosin dan metilen blue membantu mempertajam perbedaan tersebut. Namun demikian, jika media ini digunakan pada tahap awal karena kuman lain juga tumbuh terutama P. Aerugenosa dan Salmonella sp dapat menimbulkan keraguan. Bagaiamanapun media ini sangat baik untuk mengkonfirmasi bahwa kontaminan tersebut adalah E.coli. Agar EMB (levine) merupakan media padat yang dapat digunakan untuk menentukan jenis bakteri coli dengan memberikan hasil positif dalam tabung. EMB yang menggunakan eosin dan metilin bklue sebagai
indikator memberikan perbedaan yang nyata antara koloni yang meragikan laktosa dan yang tidak. Medium tersebut mengandung sukrosa karena kemempuan bakteri koli yang lebih cepat meragikan sukrosa daripada laktosa. Untuk mengetahui jumlah bakteri coli umumnya digunakan tabel Hopkins yang lebih dikenal dengan nama MPN (most probable number) atau tabel JPT (jumlah perkiraan terdekat), tabel tersebut dapat digunakan untuk memperkirakan jumlah bakteri coli dalam 100 ml dan 0,1 ml contoh air. MRSA (deMann Rogosa Sharpe Agar) MRSA merupakan media yang diperkenalkan oleh De Mann, Rogosa, d an Shape (1960) untuk memperkaya, menumbuhkan, dan mengisolasi jenis Lactobacillus dari seluruh jenis bahan. MRS agar mengandung polysorbat, asetat, magnesium, dan mangan yang diketahui untuk beraksi/bertindak sebagai faktor pertumbuhan bagi Lactobacillus, sebaik nutrien diperkaya MRS agar tidak sangat selektif, sehingga ada kemungkinan Pediococcus dan jenis Leuconostoc serta jenis bakteri lain dapat tumbuh. MRS agar mengandung: 1. Protein dari kasein 10 g/L 2. Ekstrak daging 8,0 g/L 3. Ekstrak ragi 4,0 g/L 4. D (+) glukosa 20 g/L 5. Magnesium sulfat 0,2 g/L 6. Agar-agar 14 g/L 7. dipotassium hidrogen phosphate 2 g/L 8. Tween 80 1,0 g/L 9. Diamonium hidrogen sitrat 2 g/L 10. Natrium asetat 5 g/L 11. Mangan sulfat 0,04 g/L MRSB merupakan media yang serupa dengan MRSA yang berbentuk cair/broth.
Trypticase Soy Broth (TSB) TSB adalah media broth diperkaya untuk tujuan umum, untuk isolasi, dan penumbuhan bermacam mikroorganisme. Media ini banyak digunakan untuk isolasi bakteri dari spesimen laboratorium dan akan mendukung pertumbuhan mayoritas bakteri patogen. Media TSB mengandung kasein dan pepton kedelai yang menyediakan asam amino dan substansi nitrogen lainnya yang membuatnya menjadi media bernutrisi untuk bermacam mikroorganisme. Dekstrosa adalah sumber energi dan natrium klorida mempertahankan kesetimbangan osmotik. Dikalium fosfat ditambahkan sebagai buffer untuk mempertahankan pH. APDA Media APDA berfungsi untuk menumbuhkan dan menghitung jumlah khamir dan yeast yang terdapat dalam suatu sampel. Khamir dan yeast akan tumbuh dengan optimal pada media yang sesuai. Adanya asam tartarat dan pH rendah maka pertumbuhan bakteri terhambat. APDA dibuat dengan merebus kentang selama 1 jam/45 menit, agar dilelehkan dalam 500 ml air. Campurkan ekstrak kentang dalam agar lalu ditambahkan glukosa dan diaduk rata. Pada APDA jadi ini juga ditambah asam tartarat. VRBA (Violet Red Bile Agar) VRBA dapat digunakan untuk perhitungan kelompok bakteri Enterobactericeae. Agar VRBA mengandung violet kristal yang bersifat basa, sedangkan sel mikroba bersifat asam. Bila kondisi terlalu basa maka sel akan mati. Dengan VRBA dapat dihitung jumlah bakteri E.coli. Bahan-bahan yang dibutuhkan untuk membuat VRBA adalah yeast ekstrak, pepton, NaCl, empedu, glukosa, neutral red, kristal violet, agar). Bahan-bahan tersebut kemudian dicampur dengan 1 liter air yang telah didestilasi. Panaskan hingga mendidih sampai larut sempurna. Dinginkan hingga 50-60°C. Pindahkan dalam tabung sesuai kebutuhan, pH akhir adalah 7,4. Campuran garam bile dan kristal violet menghambat bakteri gram positif. Yeast ekstrak menyediakan vitamin B-kompleks yang mendukung pertumbuhan bakteri. Laktosa merupakan sumber karbohidrat. Neutral red sebagai indikator pH. Agar merupakan agen pemadat. PGYA Media ini berfungsi untuk isolasi, enumerasi, dan menumbuhkan sel khamir. Dengan adanya dekstrosa yang terkandung dalam media ini, PGYA dapat digunakan untuk mengidentifikasi mikroba terutama sel khamir. Untuk membuatnya, semua bahan dicampur dengan ditambah CaCO3 terlebih dahulu sebanyak 0,5 g lalu dilarutkan dengan akuades. Kemudian dimasukkan dalam erlenmeyer dan disumbat dengan kapas lalu disterilisasi pada suhu 121°C selama 15 menit.
