Pada percobaan ini digunakan plasmid yang telah diisolasi sebelumnya. Plasmi Plasmidd merupa merupaka kann DNA ekstra ekstrakro kromos mosoma omall yan yangg dapat dapat berep bereplika likasi si secara secara autonom dan bisa ditemukan pada sel hidup. Plasmid biasanya digunakan sebagai vektor untuk cloning. Plasmid juga bisa dipindahkan antar sel bakteri dengan cara konjugas konjugasii atau transforma transformasi. si. Penamaan Penamaan plasmid plasmid biasanya biasanya diawali diawali deng dengan”p an”p”” diikuti oleh serangkaian kode, hal ini menunjukkan identitas dari plasmid terseb tersebut. ut. on ontoh toh plasmi plasmidd yan yangg umum umum diguna digunakan kan adalah adalah p! p!" ""#, "#, p! p!"""$, p%&'((. Plasmid)plasmid ini masing)masing membawa gen penanda resistensi terhadap antibiotic yang dapat digunakan sebagai dasar dalam seleksi koloni yang membawa plasmid dan yang tidak. Pada percobaan transformasi plasmid ini bertujuan untuk dapat melakukan transformasi sel E. coli. !ntuk pembuatan sel inang yang kompeten, digunakan Strain in yang digunakan yaitu kultu ulturr Escherichia coli yang yang beru berusi siaa satu satu hari hari.. Stra Escherichia coli
*op "+. Escherichia coli *op "+ memiliki ketetapan efisiensi
transf transform ormas asii sebes sebesar ar "" ""+$ +$ cfu-/ cfu-/gg DNA superkoi superkoill dan sanga sangatt ideal ideal untuk untuk klonin kloningg denga dengann efisien efisiensi si yang yang tinggi tinggi dan dan propa propagas gasii plasmi plasmid. d. Nilai Nilai efisie efisiensi nsi transformasi dapat dipengaruhi oleh sejumlah faktor teknis, antara lain kemurnian reagen yang digunakan, kondisi pertumbuhan sel, serta kebersihan peralatan gelas. Escherichia coli *op "+ bereplikasi dengan stabil untuk plasmid high-copy. *ransformasi merupakan suatu proses penyisipan materi genetik ke sel lain dengan prinsip yaitu dengan ekstraksi DNA dari sel donor, lalu dicampur dengan sel recipient yang telah dimodifikasi rentan terhadap pemasukan molekul DNA melalui pori dinding dan membran sel. 0etode 1 metode yang digunakan pada transformasi transformasi antara lain elektroporasi, elektroporasi, metode al(, dan kalsium 1 fosfat. Pada percobaan ini dilakukan metode al ( atau atau biasa biasa dengan dengan metode Heat Shock .
0eto 0etode de ini ini digu diguna naka kann kare karena na dira dirasa sa cuku cukupp efis efisie ienn dan dan tida tidak k
membutuhkan alat khusus. 2arutan ini berfungsi untuk membantu melekatkan DNA rekombinan dengan dinding sel yang sudah kompeten. Pada intinya molekul DNA rekombinan dengan sel E. coli yang sudah kompeten disimpan pada tabung yang sama, kemudian didinginkan selama '+ menit lalu dipanaskan pada suhu3( o selama 34 detik, lalu didinginkan kembali selama 4 menit. 5al ini bertujuan untuk mendapatkan mendapatkan pori 1 pori sel bakteri yang terbuka saat dipanaskan
dan molekul DNA rekombinan masuk ke dalam sel inang dan meutup kembali pada saat ditempatkan pada suhu dingin. 0etode yang digunakan untuk transformasi plasmid DNA tidak hanya dapat dilakukan dengan menggunakan metode Heat Shock . *etapi metode lain yang dapat digunakan adalah metode elektroporasi dan metode 6alsium fosfat. 0etode elektroporasi itu sendiri merupakan suatu metode yang menggunakan kejutan listrik untuk memperbedar pori)pori membrane sel sehingga dapat meningkatkan permeabilitas membrane. 0etode ini dapat dilakukan jika sel terlebih dahulu ditumbuhkan pada media hingga mencapai masa di sekitar pertengahan fase log. 7inyal elektrik yang digunakan akan menginduksi perbesaran pori)pori membrane sehingga molekul yang berukuran kecil seperti DNA dapat masuk. 8fisiensi dari metode ini berbading terbalik dengan peningkatan ukuran plasmid. 6euntungan metode transformasi ini adalah dapat mentransformasikan DNA ke dalam bakteri 9ram negative dan postif lainnya :tidak hanya E.Coli;. 7edangkan, metode 6alisum1
*op "+ ke media 2% cair. =nkubasi di dalam shaker-incubator
dengan kecepatan rotasi "(4 rpm pada suhu '> o selama "?)"# jam. 6ultur sel kompeten ditumbuhkan pada suhu '> o sampai sel bakteri memasuki awal fase logaritmik pertumbuhan. 6ultur berusia sehari ini diperkirakan telah mengalami fase log.
rotasi "(4 rpm selama ( jam pada suhu '> o. 6ecepatan shaker "(4 rpm berguna untuk menyokong pertumbuhan Escherichia coli hingga mencapai densitas maksimum. 7etelah diinkubasi, dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 4>++ g selama 3 menit. 7entrifugasi ini dilakukan untuk memisahkan bakteri dengan medium pertumbuhannya, dan supernatan yang dihasilkan dari proses sentrifugasi dibuang. 7elanjutnya dilakukan penambahan al ( dingin, karena jika dalam keadaan dingin al( tidak larut sehingga kemampuan berikatan dengan membran besar. 7elain itu penambahan al ( juga berpengaruh pada proses transformasi yaitu larutan al ( dapat menggangu keseimbangan ion 6alsium :a(@; dalam membran sehingga membran berhasil terbuka dan DNA insert dapat masuk, dan membantu terbukanya protein integral sebagai kanal ion sehingga dapat meningkatkan keberhasilan proses transformasi. 7elanjutnya pada praktikum ini setelah dibuat sel kompeten, dilakukan transformasi plasmid. Plasmid dimasukkan pada sel kompeten yang mengandung al(. Plasmid yang digunakan dalam percobaan ini adalah plasmid p!"$ karena plasmid ini biasa digunakan sebagai vektor dan plasmid ini mengandung gen lac yang dapat menyandikan enBim C)galaktooksidase, serta plasmid ini memiliki gen resisten terhadap antibiotik kanamisin, sehingga ketika ditumbuhkan pada media kanamisin sel yang telah disisipi vector atau plasmid p!"$ akan tetap tumbuh. 7el kompeten yang telah ditambahkan p!"$, lalu dilakukan inkubasi di dalam es selama (+ menit, setelah itu diberikan perlakuan heat-shock :kejut panas; selama $+ detik pada suhu 3( +. Proses inkubasi di dalam es bertujuan untuk memberikan pengaruh suhu yang signifikan yaitu dari keadaan dingin ke keadaan panas saat keadaan diberikan heat-shock ,
rekombinan
sehingga dinding sel akan terbuka dan menyebabkan vektor masuk
sehingga
inkubasi
dalam
es
tersebut
dapat
menyempurnakan proses heat-shock atau proses pembukaan dinding sel, selanjutnya setelah diberikan heat-shock dilakukan inkubasi lagi kedalam es selama "+ menit, inkubasi kembali dalam es setelah kejut panas bertujuan untuk menutup kembali dinding sel yang tadinya telah terbuka akibat proses heat shock .
7etelah itu ditambahkan 2% sebanyak " ml, penambahan 2% ini
bertujuan untuk memenuhi kebutuhan nutrisi dari bakteri setelah diberikan perlakuan yang ekstrim, setelah penambahan 2% " m2 lalu dilakukan shake incubation kembali. ampuran ditumbuhkan pada media 2%-6an-)9al-=P*9
untuk dilakukan seleksi koloni 8.coli yang telah disisipi DNA plasmid rekombinan. 0edia 2% merupakan media yang digunakan untuk pertumbuhan bakteri 8.coli, sedangkan 6an merupakan media yang digunakan untuk mengetahui apakah sel rekombinan telah disisipi oleh vektor rekombinan atau belum, sehingga dari media ini dapat diketahui bahwa koloni yang akan tumbuh hanyalah sel transforman yang telah disisipi oleh vektor atau plasmid yang resisten terhadap antibiotic kanamisin. 0edia )9al merupakan molekul yang mirip dengan galaktosa sedangkan =P*9 merupakan inducer enBim C) galaktooksidase, )9al dan =P*9 merupakan media yang digunakan untuk mengetahui keberhasilan atau keberadaan DNA insert, dimana jika sel telah tersisipi DNA plasmid rekombinan maka tidak akan dihasilkan C) galaktooksidase dan akan ditandai dengan warna putih, sedangkan apabila sel tidak tersisipi DNA plasmid rekombinan maka akan dihasilkan C) galaktooksidase sehingga ditandai dengan warna biru. 5asil inkubasi tabung nomor ' ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan 2%-kan-)9al-=P*9 sebanyak "++ /l. *abung nomor 3 disentrifugasi dengan kecepatan 4.>++ g selama 4 menit. 7upernatan dibuang hingga tersisa "++ /l, dan kemudian ditumbuhkan dengan cara plating ke media 2%-kan-) 9al-=P*9. 5asil inkubasi pada tabung no.4 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan 2%-Amp sebanyak "++ /l dan ke media cawan 2% sebanyak 4+ /l, dilanjutkan dengan inkubasi selama "? jam pada suhu '>o. !ntuk cawan yang berisi 8. coli dengan pA0%=A dilakukan penjumlahan koloni untuk diketahui efisiensi transformasinya. Namun pada praktikum ini tahap tersebut, yakni perhitungan efisiensi transformasi tidak dilakukan. 5asil yang didapatkan setelah melakukan transformasi DNA dengan menggunakan metode kejut panas adalah terjadi pertumbuhan sel bakteri pada media yang mengandung antibiotik kanamisin yang selanjutnya dilakukan metode seleksi biru putih untuk memisahkan sel bakteri yang telah mengandung plasmid rekombinan yang telah disisipi dan sel yang tidak
mengandung plasmid rekombinan.*ransforman yang didapatkan pada metode seleksi biru putih adalah berwarna biru dan putih.%agian koloni berwarna biru dikarenakan adanya senyawa )gal yang terdapat dalam medium. 9en lac-Z jika tidak tersisipi oleh DNA insert makan gen lac-Z akan menjadi β galaktosidase galaktosidase
dikarenakan lac-Z
merupakan gen pengkode dari β-
yang selanjutnya jika β-galaktosidase terbentuk dan berikatan
dengan )gal pada media maka akan menunjukkan koloni bakteri yang berwarna biru. 5asil koloni yang berwarna putih menyatakan bahwa sel bakteri telah mengandung DNA plasmid rekombinan yang menunjukkan bahwa proses ligasi berhasil. 7elain itu, jika hasil koloni yang berwarna biru menyatakan bahwa proses dari transformasi DNA ke dalam sel bakteri tidak berhasil. 6etidakberhasilan proses dari transformasi DNA dapat disebabkan oleh ukuran dari insert yang terlalu kecil sehingga tidak dapat membuat gen lac-Z terinaktifasi yang berarti posisi sisipan yang kurang tepat dan insert yang diklon bersifat meracuni bagi bakteri. Eadi hanya koloni putih yang tumbuh di media yang mengandung antibiotic yang kemungkinan mengandung DNA insert yang telah di transformasikan. Adapun faktor yand dapat menyebabkan gagalnya transformasi DNA adalah adanya pengotor pada DNA sehingga DNA yang masuk pada sel menjadi tidak optimal dalam melakukan transformasi dan gen tidak terekspresi, pemberian donor yang berlebihan, sel kurang kompeten karena waktu penambahan al( dan waktu hehatshock kurang atau berlebihan :Das dan Dash, (+"4;.