1. 2.
1.
2.
3.
4. 5.
PEWARNAAN BAKTERI Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokus, dan spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberap macam. Pada bentuk basil, pembagiannya meliputi basil tunggal, diplobasil, dan triptobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus ( satu buah bakteri berbentuk kotak), diplococcus, sampai staphylococcus (berbentuk mirip buah anggur). Khusus pada spirilum hanya terbagi menjadi 2 yaitu setengah melengkung dan tidak melengkung. Bakteri Bakteri juga juga dapat dapat dibeda dibedakan kan melalu melaluii teknik teknik pewarn pewarnaan aan gram. gram. Teknik Teknik pewarna pewarnaan an gram gram tersebut dapat menghasilkan warna merah atau ungu. Bakteri gram negative ditandai dengan pewarnaan ungu, sedangkan yang positif berwarna merah. (Anonymous, 2008). Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospore endospore yang yang bias diwarnai. Endospore adalah organism yang dibentuk dalam kondisi yang stress karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut dilingkunga dilingkungan n sampai kondisi kondisi mnjadi mnjadi baik (Nobi, 2008) teknik teknik pewarnaan pewarnaan gram haruslah haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahn identifikasi data apakah gram positif atau gram negative, sehingga diperlukan agar mengetahui jalannya mekanisme pewarnaanya. Metode Metode pengeca pengecatan tan pertam pertamaa kali kali ditemu ditemukan kan oleh oleh Christ Christian ian Gram Gram pada tahun tahun 1884. 1884. Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bias dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp (Tryana, 2008) Struktur dasr bakteri terbagi menjadi dua, yaitu: Struktur dasar (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu), meliputi: dinding sel, membrane plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula penyimpanan. Struktur Struktur tambahan tambahan (dimiliki (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu) tertentu),, meliputi meliputi kapsul, kapsul, flagellum, flagellum, pilus, pilus, fimbria, klorosom, vakuola, gas, dan endospora. Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangatlah sulit, karena selain bakteri itu tidak tidak berwa berwarn rnaa juga juga tran transp spar aran an dan dan sang sangat at kecil kecil.. Untu Untuk k menga mengama mati ti hal ters terseb ebut ut maka maka dikembangkansuatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitisn mikrobiologi. (Rizki, 2008) Macam-macam pewwarnaa Pewarnaan negative Bakteri tidak diwarnai tapi mewarnai latar belakang Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarna seperti spirochaeta Pewarnaan sederhana Menggunakan satu macam zat warna (biru methilen atau air fukhsin) Bertujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Pewarnaan differensial Menggunakan lebih dari satu macam zat wrna Tujuan untuk membedakan antar baktericontoh pewrnaan gram, perwarnaan bakteri tahan asam. Pewarnaan khusus Untuk mewarnai struktur khusus / tertentu dari bakteri menjadi kapsul dan spora. Serta flagell. Cara Pewarnaan Negative
• •
• •
• • • • • •
a. b. c. d.
Sediaan dihapus kemudian teteskan emrsi, kemudian lihat dimikroskop Untu Untuk k memp mempel elaj ajar arii morf morfol olog ogi, i, stru strukt ktur ur,, sifa sifatt-si sifa fatt bakt bakter erii dala dalam m memb memban antu tu mengidentifikasi, kuman perlu diwarnai. Pewarnaan gram adalh suatu metode empiris untuk membebaskan spesies bakteri menjadi 2 kelompok besra, yakni gram positif, dan gram negative. Berdasrkan sifat kimia dan fisikanya dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark, Hant Cristian Gram (153-1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1984 untuk membedakan membedakan antara antara pneomokokus pneomokokus dan bakteriis bakteriislebsi lebsiella ella pneumonia (fizahazny, 2008) Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak dapat mempertahankan zat warna metal ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metal ungu gelap. Setelah dicuci dengan alkool, sementara bakteri gram negatifnya tidak. Pada uji pewarnaan gram, suatu pewarna menimbal di tambahkan setelah metal ungu yang membuat semua bakteri gram negative, menjadi berwrna merah, atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk untuk mengkl mengklasi asifik fikasi asikan kan kedua kedua tip bakteri bakteri ini berdas berdasark arkan an perbed perbedaan aan strukt struktur ur dindin dinding g sel mereka (Fizahazny, 2008) Pewarnaan sederhana Adalah Adalah pewarna pewarnaan an yang paling paling umum umum diguna digunakan. kan. Disebut Disebut demiki demikian an karena karena hanya hanya digunakan satu jenis pewarnaan untuk mewarnai organism. Kebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana, karena sitoplasma bersifat basofil (suka akan basa). Zat-za Zat-zatt warna warna yang akan akan diguna digunakan kan untuk untuk pewarna pewarnaan an sederh sederhana ana umumny umumnyaa bersif bersifat at alkali alkalin n (kom (kompon ponen en krom kromat atof ofor orny nyaa bersi bersifa fatt posit positif if). ). Pewa Pewarn rnaa aan n sede sederh rhan anaa ini ini memu memungk ngkin inkan kan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (coccus, villario, basillus, dll), dan bahan-baha lainnya yang ada pada olesan yang diwarnai (hadiutomo, 1990) Pewar Pewarna naan an negat negativ ive, e, meto metode de ini ini bukan bukan untu untuk k mewa mewarn rnai ai bakt bakter eri, i, tapi tapi mewa mewarn rnai ai latarbelakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Cirri-ciri gram negative: Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10-45mm, berlapis tiga atau multi layer Dinding slnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapt terdapt dalam lapisan kaku,, sebelh dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam laktat. Kurag rentan terhadap senyawa penisilin. Tidak resisten terhadap gangguan fisik Ciri-ciri bakteri gram positif: p ositif: Struktur dindingnya tebal Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal Bersifat lebih rentan terhadap senyawa penisilin Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu Kristal Komposisi yang dibutuhkan lebih rumit Lebih resisten terhadap gangguan fisik. Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap. Yaitu Pemberian cat warna utama (cairan Kristal violet) berwarna ungu Pengintensifan cat warna dengan penambahan larutan mordan Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alcohol asam Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin
• •
• •
• • • • • •
a. b. c. d.
Sediaan dihapus kemudian teteskan emrsi, kemudian lihat dimikroskop Untu Untuk k memp mempel elaj ajar arii morf morfol olog ogi, i, stru strukt ktur ur,, sifa sifatt-si sifa fatt bakt bakter erii dala dalam m memb memban antu tu mengidentifikasi, kuman perlu diwarnai. Pewarnaan gram adalh suatu metode empiris untuk membebaskan spesies bakteri menjadi 2 kelompok besra, yakni gram positif, dan gram negative. Berdasrkan sifat kimia dan fisikanya dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark, Hant Cristian Gram (153-1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1984 untuk membedakan membedakan antara antara pneomokokus pneomokokus dan bakteriis bakteriislebsi lebsiella ella pneumonia (fizahazny, 2008) Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak dapat mempertahankan zat warna metal ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metal ungu gelap. Setelah dicuci dengan alkool, sementara bakteri gram negatifnya tidak. Pada uji pewarnaan gram, suatu pewarna menimbal di tambahkan setelah metal ungu yang membuat semua bakteri gram negative, menjadi berwrna merah, atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk untuk mengkl mengklasi asifik fikasi asikan kan kedua kedua tip bakteri bakteri ini berdas berdasark arkan an perbed perbedaan aan strukt struktur ur dindin dinding g sel mereka (Fizahazny, 2008) Pewarnaan sederhana Adalah Adalah pewarna pewarnaan an yang paling paling umum umum diguna digunakan. kan. Disebut Disebut demiki demikian an karena karena hanya hanya digunakan satu jenis pewarnaan untuk mewarnai organism. Kebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana, karena sitoplasma bersifat basofil (suka akan basa). Zat-za Zat-zatt warna warna yang akan akan diguna digunakan kan untuk untuk pewarna pewarnaan an sederh sederhana ana umumny umumnyaa bersif bersifat at alkali alkalin n (kom (kompon ponen en krom kromat atof ofor orny nyaa bersi bersifa fatt posit positif if). ). Pewa Pewarn rnaa aan n sede sederh rhan anaa ini ini memu memungk ngkin inkan kan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (coccus, villario, basillus, dll), dan bahan-baha lainnya yang ada pada olesan yang diwarnai (hadiutomo, 1990) Pewar Pewarna naan an negat negativ ive, e, meto metode de ini ini bukan bukan untu untuk k mewa mewarn rnai ai bakt bakter eri, i, tapi tapi mewa mewarn rnai ai latarbelakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Cirri-ciri gram negative: Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10-45mm, berlapis tiga atau multi layer Dinding slnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapt terdapt dalam lapisan kaku,, sebelh dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam laktat. Kurag rentan terhadap senyawa penisilin. Tidak resisten terhadap gangguan fisik Ciri-ciri bakteri gram positif: p ositif: Struktur dindingnya tebal Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal Bersifat lebih rentan terhadap senyawa penisilin Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu Kristal Komposisi yang dibutuhkan lebih rumit Lebih resisten terhadap gangguan fisik. Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap. Yaitu Pemberian cat warna utama (cairan Kristal violet) berwarna ungu Pengintensifan cat warna dengan penambahan larutan mordan Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alcohol asam Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin
Banyak seenyawa organic berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopis dan telah dikembangkan prosedur pewarnaan gram untuk: Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar Mengidentifikasi bagian-bagian structural sel mikroorganisme Membantu mengidentifikasi atau membedakan organism yang serupa ( Suriawieia, 2002).
• • • • • • • •
3.1.1 alat 3.1.2 Bahan Mikroskop aquades sterl Kaca benda biakan murni bakteri Mangkuk pewarna Alkohol 70% Kawat penyangga Larutan iodin Pipet Kristal violet Pinset Larutan Safranin Lampu spirtus Alkohol 95% Botol penyemprot a. Menyediakan kaca benda yang bersih, lalu lewtkan diatas nyala api lampu spirtus b. Meneteskan setetes aquades steril diatas kaca benda tersebut c. Secara aseptic ambillah inokulum bakteri yang akan diperiksa, lalu letakkan diatas tekanan aquades itu. Kemudian ratakan perlahan-lahan. d. Mengambil kaca benda lain yang bersih, lalu meletakkan diatas kaca benda sediaan sehingga membentuk sudut 450 e. Menggeserkan kaca benda yang tegak ini, sehingga sediaan menjadi tipis dan merata. Biarkan sampai kering. f. melakukan fiksasi dengan cara melewatkan sediaan tersebut diatas nyala api lampu spirtus dengan cepat. g. Meletakkan sediaan diatas kawat penyangga yang berada diatas mangkuk pewarna. Lalu meneteskan Kristal violet diatas sediaan tersebut. Menunggu sampai 1 menit. h. Mmembuang kelebihan zat warna tersebut kedalam mangkuk dan bilaslah sediaan dengan air kran i. Meneteskan larutan iodine diats sediaan itu, lalu menunggu selama 2 menitdengan air kran. k. Membuang alcohol 95% diatas sediaan, lalu membiarkan selama 1 menit. l. Membuang sisa alcohol kedalam mangkuk dan membilas sedian dengan air kran. m. Meneteskan larutan safranin diatas sediaan , lalu membiarkannya selama 30 detik. n. Membuang kelebihan larutan safranin kedalam mangkuk, lalu bilas dengan air kran. o. Mengeringkan Mengeringkan sediaan itu secara hati-hati hati-hati dengan kertas penghisap penghisap lalu periksalah periksalah dibawah mikros mikroskop. kop. Bila Bila teknik teknik pewarna pewarnaanny annyaa berhas berhasil il dengan dengan baik, baik, maka maka sel-se sel-selny lnyaa bakteri bakteri yang yang bersifat gram positif akan berwarna ungu, sedangkan sel-sel bakteri yang yan g bersifat gram negative akan berwarna merah dan merah muda. Pewarnaan Pewarnaan bakteri bakteri untuk memperlihatkan memperlihatkan atau memperjela memperjelass kontras kontras antara antara sel dan latar belakang, sehingga dapat mempertajam bentuk sel-sel mikroba itu sendiri, dengan d engan car mewarnai sel-se sel-sell mikrob mikrobaa dengan dengan zat warna warna khususn khususnya, ya, yaitu yaitu warna warna Krista Kristall violet violet pada pengeca pengecatan tan digunakan digunakan bakteri bakteri Bacillus Bacillus aereus dan Salmonella Salmonella typii. Setelah pengecatan diperoleh bakteri tersebut berwarna ungu, yamg berarti bakteri tersebut menyerap zat warna cat tersebut sehingga
Nampak pada mikroskop. Zat wwarna yang umumnya digunakan adalah bersifat alkalin (Anonymous. 2008) Pengamatn gram termasuk pengecatan differensial yang digunakan untuk membedakan bakteri garam positif atau bakteri gggram negate. Pada pengecatan ini digunakan 3 jenis bakteri, yaitu: Bacillus aerus, salmonella typii, dan Eschercia colli. Pengecatan ini menggumakan 4 jenis larutan, yaitu: Kristal violet sebagai catwarna, larutan iodin sebagi pengintensifan cat utama, alcohol asam untuk pencucian dan safranin sebagai zat penetup. Berdasarkan percobaan dapat Baccilus aerus, dan Salmonella typii bersifat gram positif yang berartibakteri dapat mengikat dengan kuat cat warna ungu dari Kristal violet. Pada saat gram positif ditambahkan dengan kristel violet, maka gram positif akan mengabsorbsi larutan tersebut hanya pada dinding sel. Dengan pemberian larutan iodin mak Kristal violet akan masuk sampai ke inti sel. Pemberian alcohol menyebabkan pori-pori di dalam sel disebabkan oleh rendahnya kandungan lipid. Pada praktikum yang telah dilakukan dapat juga diidentifikasi bahwa bakteri berbentuk basil dan memiliki bidang pandang mikroskopis. Bakteri ini ditemukan pada perbesaran 40x10 (Anonymous, 2010) •
•
• •
Pewarnaan bakteri digunakan untuk memperlihatkan atau mempelajari kontras antar sel dan latar belakangnya sehingga dapat mempertsjsm bentuk sel-sel mikroba. Pengecatan gram termasuk pengecatan differensial yang digunakan untuk membedakan gram positif dan gram negative. Pada pengecatan, digunakan 4 larutan, yaitu: Kristal violet, iodine, alcohol. Dan safranin Bakteri yang bersifat gram positif dapat mengikat dengan kuat ungu dari krostal violet, sedangkan bakteri yang bersifat gram negative tidak dapat mengikat warna ungu dari Kristal violet biasa akan berwarna merah atau merah muda setelah diamati pad mikoskop. DAFTAR PUSTAKA Hadiutomo. 1990. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta: Erlangga Suriawiria. 200 Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta: PT. Garaemedia Tryana, S.T. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan Rizky.2008.http://ngecat bakteri makulrizki.blogspot.com/2008/02/materi kuliah html. Diakses tanggal 24 Nopember 2010 Fizahazny. 2008.http// wordpress.com/ Pengantar Temtamg Bakterihtml. Diakses tanggal 25 Nopember 2010 Anonymous. 2008.http//.id Wikipedia. Org/wiki.pewarnaan, gram. Anonymous: // makalh dan skripsi. Blogspot.com/2010/26 pewarnaan. Html pewarnann Pewarnaan secara gram adalah pewarnaan yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi dan klasifikasi bakteri, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel.
Karena kemampuannya membedakan suatu kelompok bakteri tertentu dari kelompok lainnya, maka pewarnaan ini juga disebut pewarnaan diferensial. Mikroorganisme terutama bakteri sulit dilihat dengan menggunakan mikroskop cahaya, karena tidak mengasorbsi ataupun membiaskan cahaya. Tehnik pewarnaan merupakan cara yang banyak dipergunakan untuk melihat struktur dan morfologi bakteri. Terdapat beberapa tehnik pewarnaan diantaranya, pewarnaan sederhana merupakan pewarnaan yang hanya menggunakan satu macam larutan warna contohnya pewarnaan sederhana dan pewarnaan negative, kemudian pewarnaan diferensial, merupakan pewarnaan yang menggunakan lebih dari satu macam larutan wa rna, contohnya pewarnaan gram, pewarnaan tahan asam, pewarnaan kapsul, dan pewarnaan spora. Sebelum melakukan prosedur pewarnaan terhadap bakteri, terdapat beberapa hal yang perlu diperhatikan, seperti gelas objek dibersihkan dengan menggunakan alcohol 70% untuk menghilangkan debu atau lemak, kemudian pewarnaan diferensial terlebih dahulu dibuat preparat, dan fiksasi dapat dilakukan dengan melewatkan preparat ulas diatas nyala api, adapun tujuan dilakukan fiksasi antara lain untuk melekatkan sel bakteri pada objek glass, mematikan sel bakteri dan lain sebagainya. 1. Pewarnaan sederhana. Pertama - tama membuat preparat ulas dengan cara : 1)
Bersihkan kaca objek dengan menyemprotkan alcohol 70 %, kemudian lap dengan menggunakan tisu atau kapas.
2) Pindahkan suspense bakteri dengan menggunakan jarum ose keatas kaca objek, dekatkan dengan api spritus agar kerja berjalan steril. 3) Campur dengan NaCl hingga merata. Oleskan campuran ini diatas kaca objek. 4) Biarkan preparat mengering di udara sebentar. 5) Fiksasi diatas api spritus. Kemudian, 6) Beri atau tetesi larutan metylen blue, diamkan sebentar sekitar 20-30 detik. 7) Zat warna dituang, kemudian bilas dengan aqua dest mengalir. 8) Preparat dikeringkan di udara, 9) Amati dengan menggunakan mikroskop. 2. Pewarnaan gram.
Pertama – tama membuat preparat ulas dengan cara : 1)
Bersihkan kaca objek dengan menyemprotkan alcohol 70 %, kemudian lap dengan menggunakan tisu atau kapas.
2) Pindahkan suspense bakteri dengan menggunakan jarum ose keatas kaca objek, dekatkan dengan api spritus agar kerja berjalan steril. 3) Campur dengan NaCl hingga merata. Oleskan campuran ini diatas kaca objek. 4) Biarkan preparat mengering di udara sebentar. 5) Fiksasi diatas api spritus. Kemudian, 6) Beri atau tetesi larutan Kristal violet, diamkan sebentar lalu bilas dengan aqua dest mengalir. 7)
Tetesi larutan lugol, diamkan sebentar lalu lunturkan dengan alcohol 96 % goyangkan sampai tidak ada lagi zat warna mengalir di preparat.
8) Zat warna dibuang bilas dengan aqua dest mengalir. 9) Tetesi dengan larutan safranin diamkan sebentar. 10) Zat warna dibuang dengan membilas dengan menggunakan aqua dest mengalir. 11) Preparat dikeringkan dengan menggunakan kertas saring. 12) Amati dengan menggunakan mikroskop. Pewarnaan yang dilakukan merupakan pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram. Dimana pewarnaan sederhana merupakan pewarnaan yang hanya menggunakan satu macam pewarna saja, sedangkan pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang menggunakan pewarna lebih dari satu macam. Pada pewarnaan sederhana menggunakan satu macam pewarna metylen blue, sehingga ketika diamati dengan menggunakan mikroskop maka pada bakteri E.coli akan terlihat bewarna
biru keungu-unguan, pada bakteri Streptococus kelihatan bewarna biru keungu-unguan, dan pada bakteri ketiga yaitu bakteri Pseudemonas, ketika diamati ternyata bewarna ungu kebiru-biruan pudar. Sedangkan pada pewarnaan gram menggunakan lebih dari satu macam pewarna seperti Kristal violet, larutan lugol, dan larutan safranin. Pada pewarnaan gram apabilah bakteri berakhir dengan warna merah maka bakteri tersebut merupakan bakteri gram negative, dan sebaliknya apabilah tidak bewarna merah berarti merupakan bakteri gram positive. Pada pewarnaan gram ini, ditemukan bahwa bakteri E. coli setelah diamati dengan menggunakan mikroskop, terlihat bewarna merah, kemudian bakteri streptococcus tidak bewarna, hanya ada sedikit warna merah yang merupakan pembiasan cahaya pada mikroskop, begitu juga dengan bakteri Pseudomonas terlihat bewarna sedikit kemerah-merahan dan kelihatan merah tambahan yang dihasilkan merupakan biasan cahaya dari mikroskop. Berdasarkan hasil pengamatan, maka dapat disimpulkan bahwa : a. Bakteri E.coli merupakan bakteri gram negative , karena berakhir dengan warna merah pada akhir pewarnaan gram. b. Bakteri Streptococus merupakan bakteri gram positif karena tidak berakhir dengan warna merah pada akhir pewarnaan gram dan berbentuk kokus yang merupakan cirri daripada bakteri gram positif. c. Bakteri Pseudomonas merupakan bakteri gram negative , karena berakhir dengan warna kemerahan pada akhir pewarnaan gram, serta berbentuk basil yang merupakan cirri daripada bakteri gram positif.
Cara Pewarnaan Bakteri
MACAM-MACAM TEKNIK PEWARNAAN BAKTERI
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jimmo, 2008). Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994). Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel microbe atau bagian-bagian sel microbe disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan pengecatan kapsul. (waluyo,2010) Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan strukur seperti spora, flagela, dan bahan inklusi yng mengandung zat pati dan granula fosfat (Entjang, 2003) Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Rizki, 2008). 2.1 Macam-macam pewarnaan 2.1.1 Pewarnaan Tujuan pewarnaan terhadap mikroorganisme ialah untuk : 1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, maupun fungi. 2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad 3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan struktur dalam jasad. 4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik dan kimia dapat diketahui.
Langkah-langkah utama teknik pewarnaan 1. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis 2. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia seperti sabun, formalin, fenol. 3. Aplikasi zat warna : tunggal, atau lebih dari 1 zat warna Teknik pewarnaan dikelompokkan menjadi beberapa tipe, berdasarkan respon sel bakteri terhadap zat pewarna dan sistem pewarnaan yang digunakan untuk pemisahan kelompok bakteri digunakan pewarnaan Gram, dan pewarnaan “acid-fast ” (tahan asam) untuk genus Mycobacterium. Untuk melihat struktur digunakan pewarnaan flagela, pewarnaan kapsul, pewarnaan spora, dan pewarnaan nukleus. Pewarnaan Neisser atau Albert digunakan untuk melihat granula metakromatik (volutin bodies) pada Corynebacterium diphtheriae. Untuk semua prosedur pewarnaan mikrobiologi dibutuhkan pembuatan apusan lebih dahulu sebelum melaksanakan beberapa teknik pewarnaan yang spesifik (Pelezar,2008). 2.1.2 Macam-Macam Pewarnaan Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut : 1. Pewarnaan sederhana Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak digunakan adalah biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan fukhsin-karbol (5 detik).
gambar pewarnaan sederhana 2. Pewarnaan differensial dibagi pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam Pewarnaan differensial Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam. Penjelasan sebagai berikut: Pewarnaan Gram Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram. Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu : Zat warna utama (violet kristal) • Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna • utama.
•
•
Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama. Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.
Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka. Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu 1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu. 2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ. 3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam. 4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm). Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif yaitu: Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu: Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer. • Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat • didalam •
lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat.
•
Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
•
Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
•
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
•
Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
•
Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
•
Peka terhadap streptomisin
•
Toksin yang dibentuk Endotoksin
Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu: Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer. • Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang • sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat. •
Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
•
Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
•
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
•
Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
•
Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut
•
Tidak peka terhadap streptomisin
•
Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin
Contoh bakteri gram posittif
contoh bakteri gram negatif
Sumber: “http://id.wikipedia.org/wiki/Pewarnaan_Gram Pewarnaan Tahan Asam Pewarnaan ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak dalam konsentrasi tinggi sehingga sukar menyerap zat warna, namun jika bakteri diberi zat warna khusus misalnya karbolfukhsin melalui proses pemanasan, maka akan menyerap zat warna dan akan tahan diikat tanpa mampu dilunturkan oleh peluntur yang kuat sekalipun seperti asam-alkohol. Karena itu bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA). Teknik pewarnaan ini dapat digunakan untuk mendiagnosa keberadaan bakteri penyebab tuberkulosis yaitu Mycobacterium tuberculosis . Ada beberapa cara pewarnaan tahan asam, namun yang paling banyak adalah cara menurut Ziehl-Neelsen.(anonymous,2009)
Bakteri Tahan Asam (pink) dan bakteri Tidak Tahan Asam (biru) Sumber: www.google.com 3. Pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel, pewarnaan spora, pewarnaan kapsul. Pewarnaan Spora Spora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan teknik pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling banyak digunak an. Endospora sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan endspores, perlu dilakukan pemanasan supaya cat malachite hijau bisa masuk ke dalam spora , seperti halnya pada pewarnaan Basil Tahan Asam dimana cat carbol fuschsin harus dipanaskan untuk bisa menembus lapisan lilin asam mycolic dari Mycobacterium . Skema prosedur pengecatan Spora Schaeffer Fulton
Sumber http://images.suite101.com/400620_com_endosporestainprocpscanite.jpg Protokol pewarnaan diferensial endospores dan sel vegetatif adalah sebagai berikut:
Spora kuman mempunyai dinding yang tebal sehingga diperlukan pemanasan agar pori-pori membesar zat warna fuchsin dapat masuk, dengan pencucian pori-pori kembali mengecil menyebabkan zat warna fuchsin tidak dapat dilepas walaupun dilunturkan dengan asam alkohol, sedangkan pada badan bakteri warna fuchsin dilepaskan dan mengambil warna biru dari methylen blue. Cara Kerja : • Dibuat suspensi kuman, ditambah dengan carbol fuchsin sama banyak. • Dipanaskan selama 6 menit pada api kecil atau pada penangas air 80oc selama 10 menit. • Dibuat sediaan dan dikeringkan. • Dimasukkan kedalam H2SO4 1% selama 2 detik • Dimasukkan kedalam alkohol sehingga tidak ada lagi warna merah mengalir. • Sediaan dicuci dengan air. • Diwarnai dengan methylen blue selama 1 menit kemudian dicuci dan dikeringkan. • Diperiksa dibawah mikroskop. Pewarnaan flagel Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel. Pewarnaan kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, k arena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang. Yang berwana biru gelap. 4. Pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri : pewarnaan Neisser (granula volutin), • •
pewarnaan yodium (granula glikogen).
5. Pewarnaan negatif Tujuan Mempelajari penggunaan prosedur pewarnaan negatif untuk mengamati morfologi organisme yang sukar diwarnai oleh pewarna sederhana. Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang. Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta Cara pewarnaan negatif - Sediaan hapus → teteskan emersi → lihat dimikroskop Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina. Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin.pewarna asam memiliki negatif charge kromogen,tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge pada permukaan bakteri. oleh karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar belakang berwarna.
METODE PEWARNAAN BAKTERI METODE PEWARNAAN BAKTERI Jenis-jenis pewarnaan kuman yang dikenal adalah: 1. Pewarnaan negatif 2. Pewarnaan sederhana 3. Pewarnaan difrensial 4. Pewarnaan khusus 1.PEWARNAAN NEGATIF Pewarnaan ini dipakai untuk yang sukar di warnai, misalkan Spirochaeta (Treponema, Leptospira dan Borrelia) 2. PEWARNAAN SEDERHANA Pewarnaan ini hanya menggunakan satu macam zat warna. Misalkan Biru metilen, Air Fukhsin atau Ungu Kristal selama 1-2 menit. Zat warna Anilin mudah di serap
oleh kuman. 3. PEWARNAAN DIFFRENSIAL Pewarnaan Diffrensial menggunakan lebih dari satu macam Zat warna: A. Pewarnaan Gram: Pewarnaan Diffrensial yang sangat penting. Ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. B. Pewarnaan Tahan Asam (acid fast staining). Misalkan pewarnaan Ziehl-Neelsen dan Kinyoun-Gabbett untuk membedakan kuman-kuman yang tahan Asam dari yang tidak Tahan Asam. A.PEWARNAAN GRAM Pewarnaan Differensial dimaksudkan untuk membedakan 2 jenis bakteri berdasarkan daya rekat dinding bakteri terhadap zat warna. Salah satu jenis pewarnaan differensial adalah Pewarnaan Gram, yang menggunakan 2 macam zat warna yaitu Zat warna Primer (Kristal Violet) dan Zat warna Sekunder (Fucshin atau Safranin). Bakteri dapat membentuk bulat/kokus/coccus dengan susunan berkelompok atau berantai, sebagian besar bakteri ini bersifat Gram Positif. Bakteri berbentuk berbentuk batang/basil/bacil dapat bersusun satu-satu, berantai ataupun bertumpuk seperti kayu bakar, sebagian besar bersifat Gram negatif. • Cara Pewarnaan: 1.Sediaan yang sudah direkat diwarnai dengan karbol Kristal Ungu selama 5 menit. 2. Zat warna dibuang dan diganti dengan larutan Lugol dibiarkan selama 45-60 detik. 3. Larutan Lugol dibuang dan sediaan dicuci dengan Alkohol 96% selama 30 detik atau digoyang-goyangkan sampai tidak ada zat warna yang mengalir lagi. 4. Sediaan dicuci dengan air dan diwarnai dengan air Fukhsin selama 1-2 menit. Sediaan dicuci, dikeringkan dan diperiksa dibawah mikroskop. Hasil dapat dibaca sebagai berikut: -Kuman Positif Gram berwarna Ungu - Kuman Negatiif Gram berwarna Merah Sifat kuman terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu kuman. B.PEWARNAAN BAKTERI TAHAN ASAM Pewarnaan ini adalah segolongan bakteri yang sulit diwarnai, tetapi sekali diwarnai sulit dihapus. Dinding sel bakteri tahan asam terdiri dari peptidogikan, arabinogalaktan, dan lipid, dimana 50% dari lipid ini terdiri dari asam nikolat. Bakteri ini dimasukkan kedalam golongan mikrobacterium yang sebagian besar bersifat satprofit, dikenal juga golongan atipik , sebagian kecil pathogen bagi manusia yaitu Mycrobaterrium tuberculosis dan Mycrobacterium leprae. Dari pewarnaan BTA dapat dibedakan 2, yaitu golongan bakteri tahan asam yang akan tetap mengikat zat pewarnaan primer (karbofuksin) dan tidak akan dilepas pada
pencucian alkoholm asam, serta tidak akan mengikat zat warna sekunder ( metilen blue), sedangkan bakteri tidak tahan asam akan melepaskan zat warna primer pada pencucian alcohol asam dan akan mengikat zat warna sekunder. Ada beberapa cara mewarnai bakteri tahan asam yaitu, menurut Ziehl-Neelseen, menurut Tan Thiam Hok (1957) yang disebut juga pewarnaan Kinyoun Gabelt, serta pewarnaan dengan AURAMEN-PHENOL FLUORCHROME. • Cara Pewarnaan: 1. Metode ZIEHL-NEESEN a. Buat sediaan dari sputum dengan cara, bersihkan kaca benda hingga bebas dari lemak, bakar ose hingga pijar dan tunggu dingin sejenak, ambil sputum dengan ose kemudian oleskan diatas kaca benda hingga didapat usapan yang rata dan tipis, tunggu dan keringkan dan difiksasi diatas api. Ose setelah digunakan dibakar lagi hingga pajar. b. Tuangi sediaan dengan karbol fuksin hingga tergenang, kemudian panaskan diatas api kecil sampai keluar asap lalu tunggu selama 5 menit c. Cuci dengan air mengalir d. Celupkan kedalam H2SO4 selama 2 detik untuk kuman M. leprae e. Celukan kedalam alcohol 60% sehingga tidak ada lagi zat warna merah yang larut f. Tuangi preparat dengan methylen blue selama 1-2 menit g. Cuci dengan air mengalir keringkan tetesi minyal imaersi dan amati dengan mikroskop pembesaran 10 X 100 2. Metode KINYOUN – GABBET a. Buat sediaan sputum dan rekatkan b. Sediaan dituangi larutan Kinyoun dan dibiarkan selama 3 menit c. Dicuci dengan air mengalir d. Preparat dituangi larutan Gabbet dan dibiarkan selama 1 menit e. Cuci dengan air mengalir lalu amati dengan mikroskop dengan pembesaran 10 X 100 Hasil dapat dibaca sebagai berikut: 1. Bakteri bersifat tahan asam akan berwarna Merah 2. Bakteri bersifat tidak tahan asam berwarna Biru 4.PEWARNAAN KHUSUS A. PEWARNAAN KAPSUL BAKTERI Kegunaan kapsul bakteri : 1. Mencegah kekeringan pada kondisi yang tidak menguntungkan 2. Meningkatkan kemampuan bakteri untuk menimbulkan penyakit, merupakan lapisan pelindung yang menghalangi proses fagositosis oleh sel daraah putih. Beberapa metode pewarnaan kapsul : 1. Pewarnaan Muir; kapsul bewarna biru dan badan bakteri berwarna merah. 2. Pewarnaan Hiss; kapsul berwarna biru muda dan badan bakteri ungu tua.
3. Pewarnaan Gins-Burri kombinasi pewarnaan negative dan sederhana, akan didapat hasil kapsul tidak berwarna dan badan bakteri berwarna merah, karena kapsul mudah ditembus zat warna tetapi sukar mengikat zat warna. • Cara Pewarnaan: 1.Buatlah sediaan Bakteri pada salah satu ujung kaca benda 2. Teteskan satu tetes Tinta Cina disebelah suspense kuman 3. Campurkan kedua suspensi tadi dengan menggunakan ujung kaca benda lain, kemudian dengan kaca benda tersebut ratakan suspensi kuman sepanjang kaca benda. 4. Keringkan sediaan dan direkatkan 5. Genangi dengan larutan karbol Fukhsin selama 2 menit 6. Cuci dengan air mengalir perlahan-perlahan dan keringkan diudara. 7. Amati dengan Mikroskop pembesaran 10 x 100, pada bagian yang tipis Keterangan: - Langkah 1-4 : Metoda Pewarnaan negative (Burri) - Langkah 5-7 : Metoda Pewarnaan Gins Hasil dapat dibaca sebagai berikut: - Kapsul bakteri : Tidak Berwarna - Badan bakteri Asam : akan berwarna Merah - Latar belakang : Hitam B. PEWARNAAN SPORA BAKTERI Beberapa genus bakteri dapat membuat endospora, yang diantaranya adalah dari genus bacillus dan clostridium. Bakteri ini mengalami siklus diverensiasi untuk merespon keaddaan lingkungan buruk seperti : kekeringan, kekurangan makanan, dll. Tiap sel membentuk satu endospora yang akan dilepaskan bila sel induk mengalami otolisis. Spora adalah bagian dalam bentuk istirahat. Spora bersifat resisten terhadap panas, kekeringan , dan zat kimiawi. Bila kondisi lingkungan telah baik kembali spora dapat kembali melakukan gemisasi dan memproduksi sel vegetative. • Cara Pewarnaan: 1. Buat suspensi bakteri didalam 1 ml NaCl 0,9% hingga keruh seperti susu 2. Masukkan karbol Fuchsin ke dalam suspensi bakteri tadi sama banyak (1:1) 3. Homogenkan, panaskan dengan api kecil (70%) selama 6 menit jaga jangan sampai mendidih 4. Siapkan kaca benda yang telah bersih 5. Buat preparat dari suspense tadi rekatkan dan dinginkan 6. Celupkan kedalam bejana yang berisi larutan H2SO4 1% selama 2-3 detik 7. Cuci dengan air mengalir perlahan-lahan 8. Genangi dengan Metilen Blue selama 2-4 menit 9. Cuci dengan air mengalir perlahan-lahan, dan keringkan 10. Amati dengan Mikroskop pembesaran 10 x 100
Hasil dapat dibaca sebagai berikut: - Spora bakteri : Merah - Badan bakteri asam : akan berwarna Biru C.PEWARNAAN FLAGEL o Flagel merupakan komponen tambahan dari sel yang menyerupai benang, terdiri dari protein Flagelin o Dikenal 4 jenis flagel : ¬ Monotrikh, flagel tunggal pada salah satu ujung, missal : Vibrio sp. ¬
Lofotrikh, terdapat 1/lebih flagel disalah satu ujung , Alcalingenes sp
¬
Amfitrikh, terdapat 1/lebih flagel di kedua ujung, cth: Alcalingenes sp
Peritrikh, flagel terbesar diseluruh badan kuman, cth: Pruteus vulganis Flagel merupakan organel sel yang tidak dapat dilihat dengan pewarnaan biasa. Ntuk itu pewarnaan khusus atau dengan mikroskop electron. Salah satu pewarnaan yang digunakan untuk melihat flagel adalah pewarnaan Gray serta beberapa pewarnaan lain diantaranya pewarnaan Novel, Zattnow, dan Fontana-Tribondeau dengan menggunakan impregnasi Ag. ¬
Pewarnaan Gray Digunakan untuk pemantek / mordant untuk mneingkatkan afinitas flagel terhadap zat warna dan memperbesar diameter flagel. Zat warna yang digunakan adalah Karbol Fuksin menjadi flagel dan badan kuman berwarna merah. Gerak Bakteri Gerak bakteri dapat diketahui dengan 2 cara yaitu secara langsung dan secara biakan. Biakan yang digunakan tidak mengandung gula karena adanya gula dapat meurunkan pH media sehingga gerak bakteri akan terhambat. Biakan yang digunakan harus mempunyai konsisten setengah padat agar bakteri dapat bergerak bebas. Biakan bakteri yang akan diperiksa harus lebih dari 20 jam dan perlu diperhatikan bahwa suhu optimum untuk gerak bakteri dibawah 300 C. • Cara Pewarnaan: 1. Metode Tetes Tegak a. Kaca benda dibersihkan agar terbebas dari lemak b. Disiapkan gelas penutup dengan memberikan vaksin pada keempat sisinya c. Letakkan suspense bakteri pada bagian tengah kaca benda jangan ditipiskan d. Tutup suspense tersebut dengan kaca penutup e. Amati dengan mikroskop pembesaran 10 X 100 2. a. b. c.
Metode Tetes Gantung Kaca benda cekung dibersihkan agar terbebas dari lemak Disiapkan kaca penutup dengan memberikan vaselin pada keempat sisinya Letakan suspensi kuman dibagian tengah kaca penutup, JANGAN DITIPISKAN
d. Peganglah kaca benda cekung dengan bagian cekung menghadap kebawah, kemudian dekatkan kaca benda ini perlahan-lahan pada kaca penutup sedemikian rupa sehingga bagian cekung melingkupi suspensi bakteri. Tekan perlahan-lahan agar vaselin menyebar e. Dengan hati-hati namun cepat baliklah kaca benda tersebut, kemudian amati dengan mikroskop pembesaran 10x kemudian 40x Hasil dapat dibaca sebagai berikut: - Gerak Positif: Bila bakteri berpindah tempat dengan cepat - Gerak Negatif: Bila bakteri bergerak ditempat saja akibat gerakan molekul air (Gerak Brown) 3. Biakan Semi Solid a. Disiapkan media semi solid SIM atau MIO b. Ambil biakan bakteri dengan menggunakan ose jarum yang sebelumnya telah dipijarkan c. Tusuk ose tersebut pada bagian tengah media hinnga dasar d. Eramkan media tersebut dalam inkubator selama 24 jam pada suhu 37 C Hasil dapat dibaca sebagai berikut: - Gerak Positif: Bila bakteri tumbuh menyebar akan terlihat kekeruhan atau turbiditas - Gerak Negatif: Bila bakteri hanya tumbuh pada bekas tusukan. (Sumber : Tim Dosen Mikrobiologi Lingkungan Politeknik Kementerian Kesehatan Jakarta II jurusan Kesehatan Lingkungan, Dra. Syarifah Miftahul El Jannah T . M. Biomed; Modul Praktikum Mikrobiologi Lingkungan, Jakarta.)
Bakteri merupakan organisme yang sangat kecil (berukuran mikroskopis). Itu berarti bahwa jasad renik ini tipis sekali sehingga tembus cahaya. Akibatnya, bakteri ini akan sangat sulit untuk dilihat dengan teliti di bawah mikroskop. Oleh karena itu, agar dapat dilihat dengan jelas maka bakteri tersebut haruslah diwarnai/dilakukan pengecatan terlebih dahulu. SEJARAH PEWARNAAN BAKTERI Pewarnaan bakteri sudah dilakukan sejak permulaan berkembangnya mikrobiologi di pertengahan abad ke- 19 oleh Loius Pasteur dan Robert Koch. Pewarnaan bakteri dapat dilakukan dengan satu macam zat warna ataupun lebih. Pewarnaan bakteri dengan menggunakan satu macam zat warna disebut pewarnaan sederhana. Pewarnaan dengan menggunakan lebih dari satu macam zat warna diberi nama sesuai dengan nama penemunya. Pada umumnya, ada dua macam zat warna (bahan cat) yang sering dipakai, yaitu sebagai berikut: Zat warna yang bersifat asam; komponen warnanya adalah anion, biasanya dalam bentuk • garam natrium •
Zat warna yang bersifat alkalis, dengan komponen warna kation, biasanya dalam bentuk klorida.
Pada pewarnaan sederhana yang sering dipakai adalah methylen blue. Hasil pewarnaannya akan lebih baik bila diberi sedikit KOH (Kalium Hidroksida). Larutan ini disebut Loffer methylen blue.
Cara-Cara Pewarnaan A. Pewarnaan Sederhana Tujuan pengecatan ini ialah untuk membedakan bakteri dari benda-benda mati lain yang bukan bakteri dan untuk melihat bentuk dan ukurannya. Larutan cat hanya terdiri dari satu bahan cat yang dilarutkan dalam suatu bahan pelarut. Bahan-bahan yang banyak dipakai untuk keperluan ini adalah karbol fuksin, kristal violet, dan methylen blue.
B. Pewarnaan Diferensial Untuk pewarnaan ini digunakan lebih dari satu macam bahan cat. Dengan cara ini bahan-bahan cat yang dipakai ada kalanya terpisah, atau ada kalanya dicampur dan digunakan dalam satu larutan. Dua macam pewarnaan/pengecatan yang terpenting dari golongan ini ialah pengecatan Gram dan pengecatan tahan asam seperti pengecatan Ziehl-Naelsen. Sediaan (preparat) untuk proses pengecatan dibuat sebagai berikut. 1. Kaca objek dibersihkan sehingga bebas lemak 2. Pada bagian ujung kaca objek diberi tanda, sebaiknya di sebelah permukaan yang tidak dicat 3. Dengan ose dibuat film yang tipis pada permukaan yang telah dibersihkan 4. Film dikeringkan di udara atau dengan hawa hangat dari api gas 5. Fiksasi dilakukan dengan cara menyentuhkan permukaan kaca objek tiga kali berturutturut pada ujung api 6. Setelah didinginkan preparat sudah siap untuk dicat Yang dimaksud dengan fiksasi ialah melekatkan bakteri pada kaca objek, mematikan bakteri dengan cepat agar sifat-sifatnya tidak banyak berubah. Fiksasi ini harus dilakukan setelah preparat kering.
a. Pewarnaan Gram (Christian Gram) Pewarnaan ini pertama kali dikemukakan oleh Christian gram (1884). Dengan pengecatan ini film bakteri mula-mula dilapisi dengan larutan zat warna karbol gentin violet (karbol kristal violet, karbol metilviolet ) dan didiamakan beberapa lama, kemudian disiram dengan larutan iodium dan dibiarkan terendam dalam waktu yang sama. Sampai tingkat pengecatan ini selesai, semua bakteri akan berwarna ungu. Untuk lebih jelasnya berikut adalah tahap-tahap pewarnaan; 1. Sediaan diwarnai dengan karbol gentian violet selama 3 menit
2. Kelebihan zat warna dibuang tanpa dicuci direndam dalam lugol (J dalam KJ) selama 45 menit detik 3. Sediaan dicuci dengan alkohol 95% sampai tidak ada lagi zat warna yang luntur 4. Cuci dengan air mengalir untuk menghilangkan alkohol diwarnai dengan fuchsin selama 3 menit 5. Cuci dengan air mengalir 6. Keringkan di antara 2 kertas saring dan dilihat dengan mikroskop Dengan pewarnaan Gram, ada beberapa bakteri yang dapat menahan zat warna ungu (karbol kristal violet, karbol metilviolet) dalam tubuhnya meskipun telah didekolorisasi dengan alkohol dan aseton. Bakteri yang memberi reaksi semacam ini dinamakan bakteri Gram Positif . Sebaliknya, bakteri yang tidak dapat menahan zat warna setelah didekolorisasi dengan alkhol dan seton akan kembali menjadi tidak berwarna dan bila diberikan pengecetan dengan zat warna kontras akan berwarna sesuai dengan zat warna kontras. Bakteri yang memperlihatkan reaksi semacam ini dinamakan bakteri Gram Negatif.
b. Pewarnaan Ziehl Neelsen Pewarnaan ini juga disebut dengan pengecetan tahan asam. Disebut demikian karena pada beberapa jenis bakteri sukar dilakukan pengecetan. tetapi sekali dapat tercat tidak mudah untuk dilunturkan meskipun dengan menggunakan zat peluntur (decolorizing agent) asam (atau asamalkohol). Yang termasuk bakteri yang sukar dicat adalah dari genus Mycrobacterium (Mycrobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium smegmatis). Bakteri tahan asam sangat banyak mengandung lipida, asam lemak, dan kandungan inilah yang mencerminkan sifat tahan asam pada golongan bakteri tersebut antara lain asam mikolat. Cara pengecetannya ialah : 1. Film bakteri pada kaca objek yang telah difiksasi, disiram dengan karbolfuksin, kemudian dipanaskan sampai keluar uap (tidak sampai mendidih). Pemanasan diulang beberapa kali agar bahan cat tetap hangat kemudian didiamkan selama lima menit. 2. Dekolorisasi dilakukan dengan asam-alkohol dalam waktu yang singkat, kemudian cepat dicuci dengan air. 3. Pengecetan dengan cat kontras dilakukan dengan metil biru dalam larutan KOH 1/10000 4. Setelah dicuci kembali dengan air preparat dikeringkan di udara. Dengan pewarnaan ini, bakteri dibagi dalam 2 golongan, yaitu: 1. Bakteri yang berwarna merah dengan pewarnaan Ziehl neelsen disebut bakteri tahan asam (acid fast) 2. Bakteri yang berwarna biru dengan pewarnaan Ziehl Neelsen disebut bakteri tidak tahan asam (non-acid fast)
c. Pewarnaan Neisser dan Albert
Di antara bakteri bentuk batang Gram positif, ada yang di dalam selnya ditemukan granula polifosfat yang disebut juga granula metakromatik atau volutin bodies. granula ini bersifat kromofil dan metakromatik yang berarti mempunyai aktivitas kuat terhadap zat-zat warna, dan seringkali tampak lain dari zat warna yang diberikan. Berikut adalah langkah-langkah pengecetannya: 1. Sebagai bahan cat disediakan tiga macam larutan, yaitu: Neisser A isinya methylen blue • Neisser B isinya gentian violet • •
Neisser C isinya chrysoidin (berwarna kuning)
2. Untuk pengecetan pertama digunakan larutan A dan B yang dicampur sesaat sebelum pengecatan dalam perbandingan dua bagian larutan A dengan satu bagian larutan B. Lama pengecatan adalah setengah menit 3. Setelah campuran tersebut dibuang preparat dibilas dengan larutan dan larutan ini didiamkan di atas film preparat selama ½ - 1 menit, kemudian dikeringkan dengan kertas saring. Selain itu, untuk menonjolkan granula metakromatik ini dapat pula dilakukan pengecetan Albert, yaitu: 1. Preparat dicat dengan larutan cat menurut Albert selama 3-5 menit 2. Setelah dicuci dengan air, preparat disiram dengan larutan iodium (menurut Gram) dan ditunggu satu menit. kemudian dicuci kembali dengan air dan dikeringkan dengan kertas saring. Hasil Pengecetan: 1. Pada pengecetan Neisser: Granula berwarna biru-hitam, sitoplasma berwarna kuning (krisoidin) atau tengguli/kecoklat-coklatan (Bismarck brown) 2. Pada pengecetan Albert: Granula berwarna biru-hitam, sitoplasma hijau ***Semua bakteri Gram negatif tidak tahan asam, sedangkan bakteri Gram positif ada yang tahan asam dan ada yang tidak tahan asam*** Pewarnaan Bakteri II. Tinjauan Pustaka Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu : 1. Pewarnaan sederhana Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk
pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan. a.
Pewarnaan Asam Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen biru dan air furksin.
b.
Pewarnaan Basa Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.
2. Pewarnaan Diferensial (Gram) Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853– 1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka. a. Bakteri Gram Negatif Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak. b. Bakteri Gram Positif Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010)
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009). Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009). Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif. Sifat
Bakteri garam (+)
Komposisi dinding sel
Kandungan lipid rendah (1- Kandungan lipid tinggi 4%)
Ketahanan penisilin
terhadap Lebih sensitif
Penghambatan oleh Lebih dihambat pewarna basa (VK)
Bakteri gram negatif(-)
Lebih tahan
Kurang dihambat
Kebutuhan nutrisi
Kebanyakan spesies relatif Relatif sederhana kompleks
Ketahanaa terhadap
Lebih tahan
Kurang tahan
perlakuan fisik (Manurung, 2010). Pewarnaan tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh – Neelson dengan pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan pewarna tandingan metilen blue Loeffler. Perlakuan panas tersebut diganti dengan penggunaan pembasah yaitu suatu deterjen untuk mengurangi tegangan permukaan lemak, untuk menjamin penetrasi. Pewarna yang mengandung pembasah ini disebut pewarna Kinyoun (Purwoko, 2010). Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri menahan zat warna tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh zat yang bersifat keras seperti asam alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%). Alkohol asam ini merupakan pemucat yang sangat intensif dan jangan dikelirukan dengan alkohol-aseton yang banyak digunakan dalam prosedur pewarnaan Gram. Kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat warna itu dikatakan tahan asam dan tampak merah. Bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah dipucatkan oleh alkohol-asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam. Tercucinya
karbol fuksin dapat diperagakan oleh terserapnya pewarna tandingan biru metilen oleh sel, sehingga bakteri tersebut tampak biru (Hadioetomo, 1993). Pewarnaan Ziehl Neelsen. Larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada seluruh permukaan sediaan, kemudian dipanaskan diatas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak sampai mendidih atau kering selama 5 menit. Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-7 menit lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan. Setelah itu larutan asam alkohol 3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan dibiarkan 2-4 menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1-3 menit, kelebihan larutan dibuang. Larutan methylene blue 0,1% dituang sampai menutup seluruh permukaan, dibiarkan 1 menit lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir (Karuniawati, 2005). 4. Pewarnaan Khusus Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai struktur khusus atau tertentu dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel dsb. Contoh pewarnaan khusus :Pewarnaan Endospora Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum , dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi, dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas. Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (Aditya, 2010) a. Pewarnaan kapsul Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang yang berwana biru gelap. b. Pewarnaan spora Dinding spora relatif tidak permeable, namun zat warna bias menembusnya dengan cara memanaskan preparat. c. Pewarnaan flagel Pewarnaan flagel dengan memberi suspensi koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel. d. Pewarnaan nucleoid
Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk DNA (Rudi, 2010).
IV. Cara Kerja Ø Disiapkan dua gelas benda dan penutupnya, Ø Bakteri sempel A dan B diteteskan satu tetes pada masing-masing gelas benda, Ø Sampel dipanaskan diatas api Bunsen hingga terfiksasi, jangan sampai pecah Ø 1 tetes kristal violet diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang, Ø 1 tetes iodine diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang, Ø 1 tetes etanol 96% diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang, Ø
1 tetes safranin diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang,
Ø
Setelah pembilasan terakhir, gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika terbentuk warna merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif.
V.
Hasil Pengamatan dan Pembahasan Tabel Hasil Pengamatan, Pengamatan Warna
N o
Nama
1 2
Hasil Ungu
Merah Muda
Bakteri Sampel A
-
ü
Bakteri gram negatif
Bakteri sampel B
ü
-
Bakteri gram positif
Praktikum ini memiliki tujuan agar praktikan terampil dalam melakukan pewarnaan gram untuk bakteri gram positif dan negatif, mempelajari teknik pewarnaan gram untuk pengamatan mikroba, mempelajari bentuk-bentuk dan struktur sel bakteri dari hasil pengamatan dengan pewarnaan gram, sera
membedakan kelompok bakteri berdasarkan reaksinya terhadap warna dan sekaligus menunjukkan sifat bakteri tersebut. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna (Manurung, 2010). Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Manurung, 2010). Langkah-langkah utama dalam teknik pewarnaan antara lain: a. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis. b. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia seperti sabun, formalin, fenol. c. Aplikasi zat warna tunggal, atau lebih dari 1 zat warna. Pewarnaan gram pada praktikum ini dilakukan dalam 4 tahap yaitu: a. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu. b. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ. c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam. d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin. Keempat tahap tersebut dijelaskan langsung dalam langkah percobaan di bawah ini. Langkah selanjutnya, 1 tetes kristal violet diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri
adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 30 detik bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri. Langkah percobaan yang dilakukan oleh praktikan dimulai dengan 1 tetes sampel yang berupa bakteri sampel A dan bakteri sampel B diteteskan di atas gelas benda yang berbeda. Kedua gelas benda berisi sampel tersebut dipanaskan (fiksasi) di atas bunsen burner. Hal ini bertujuan untuk menguapkan air sehingga hanya akan didapat bakteri saja. Proses fiksasi juga bertujuan supaya bakteri benar-benar melekat pada gelas benda sehingga olesan bakteri berupa tetesan sampel tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api. Langkah selanjutnya, 1 tetes iodine diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Iodine merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama. Pemberian iodine pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Iodine yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih kuat. Selanjutnya, 1 tetes alkohol 96% diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Etanol 95% merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 96% juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Reaksi yang terjadi ketika penambahan alkohol 96% gram + : lipid << + alkohol 96% pori dinding sel yang terbentuk kecil, protein dinding sel terdehidrasi, pori tertutup (kompleks kristal violet-iodine tidak tercuci )
gram - : lipid lipid >> + alkoho alkoholl 96% pori pori dindi dinding ng sel yang yang terben terbentuk tuk besar, besar, protein dinding sel terdehidrasi, pori tidak tertutup (kompleks kristal violet-iodine tercuci ) ) Alkohol 96% yang diteteskan di atas gelas benda didiamkan selama 30 detik kemudia dibilas dengan aquades dengan tujuan agar warna dapat luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa di dalam gelas benda. Setela Setelah h pembil pembilasa asan n reagen reagen alkoho alkoholl 96% 96% pada pada gelas gelas benda benda sebelu sebelumny mnya, a, selan selanjut jutnya nya ditete diteteska skan n 1 tetes tetes safran safranin in di atas atas gelas gelas benda benda terseb tersebut ut kemudi kemudian an didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, safranin memberikan warna warna pada pada mikroo mikroorga rganis nisme me non target target serta serta mengh menghabi abiska skan n sis sisa-s a-sisa isa cat atau atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu. Pemb Pember eria ian n reage reagen n atau atau pewa pewarn rna a yang yang berg bergan anti ti dari dari satu satu pewa pewarn rna a ke pewarna lain dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna terseb tersebut ut dapat dapat berika berikatan tan dengan dengan kompon komponen en dindin dinding g sel bakter bakterii dalam dalam waktu waktu singka singkat. t. Karena Karena itulah itulah rentan rentang g waktu waktu pember pemberian ian zat warna warna yang yang satu satu ke yang yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat (efisiensi waktu). Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap terhadap gelas gelas benda benda dengan dengan mengguna menggunakan kan aquades. aquades. pembilasan pembilasan ini bertujua bertujuan n untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masing-masing reagen, perlu dilakukan penyerapan air bilasan dari aquades dengan menggunakan menggunakan kertas tissu agar aquades aquades tidak tidak tercampur tercampur dengan dengan reagen reagen atau atau pewarn pewarna a baru baru yang yang akan akan diberi diberikan kan.. Setela Setelah h pembil pembilasa asan n terakhir, gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk warna warna ungu ungu maka maka termas termasuk uk golong golongan an bakter bakterii gram gram posit positif if , dan jika jika terbe terbentu ntuk k warna merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif. Gambar skematik langkah kerja yang dilakukan oleh praktikan
Tabel prosedur pewarnaan pewarnaan gram
(Pradhika, 2008) Zat warna warna adalah adalah senyaw senyawa a kimia kimia berup berupa a garamgaram-gar garam am yang yang salah salah satu satu ionnya ionnya berwar berwarna. na. Garam Garam terdir terdirii dari dari ion ion bermua bermuatan tan posit positif if dan ion bermua bermuatan tan negatif. negatif. Senyawa-s Senyawa-senyaw enyawa a kimia ini berguna berguna untuk untuk membedaka membedakan n bakteri-b bakteri-bakteri akteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka maka disebu disebutt zat warna warna asam. asam. Contoh Contoh zat warna warna basa basa adalah adalah methyl methylen en blue, blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl -, SO4 -, CH3COO-, COOHCO COOHCOO. O. Zat warna warna asam asam umumny umumnya a mempun mempunyai yai sifat sifat dapat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel (Rudi, 2010). Pewarnaan Pewarnaan bakteri bakteri dipengar dipengaruhi uhi oleh faktor-fakt faktor-faktor or seperti seperti fiksasi, fiksasi, peluntur peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan, dan penggunaan zat warna penutup. Pada bakter bakterii gram gram positi positiff menunj menunjukk ukkan an warna warna biru biru ungu ungu dan bakter bakterii gram gram negati negatif f berwar berwarna na merah. merah. Dalam Dalam prakti praktikum kum ini ini diguna digunakan kan salah salah satu satu pewarn pewarnany anya a yaitu yaitu safranin yang sesuai teori bersifat basa sehingga lebih mudah bersenyawa atau bereaksi dengan bagian-bagian inti sel bakteri.
Bakteri Gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka (Rudi, 2010). Hasil pengamatan di bawah mikroskop menunjukkan bahwa bakteri sampel A memiliki warna merah muda (gram negative), dan Bakteri sampel B memilki warna ungu (gram positif). 1. Escherichia coli
Gambar
E. coli dengan perbesaran 1000 x
Klasifikasi ilmiah Kingdom Filum Kelas Order Famili Genus Spesies
: : : : : : :
Bakteria Proteobacteria Gamma Proteobacteria Enterobacteriales Enterobacteriaceae Escherichia E. coli
Berdasarkan hasil pengamatan, terdapat bakteri Eschericia coli pada air WC. Berbentuk E . coli adalah basil (batang) yang pendek. Bakteri tersebut pada saat diwarnai menunjukkan warna merah muda yang berarti bahwa bakteri ini bersifat gram negatif.
Menurut literatur, E . coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk bakteri gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E. coli merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare, sindrom diare lanjutan, muntaber, hemolitik uremic (hus), infeksi usus, infeksi saluran urin, dan neonatal meningitis. Peranan yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi. Disamping itu, E. coli banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika dan biasa digunakan sebagai vektor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untuk dikembangkan karena bakteri ini memiliki pertumbuhan yang sangat cepat dan mudah dalam penanganannya (Fajriana, 2008). Infeksi E.coli O157:H7 yang patogen pada manusia yaitu yang bersifat verotoksigenik yang telah menyebabkan 16.000 kasus penyakit melalui makanan (Food Born Diseases) dan 900 orang meninggal per tahun di AS, dengan perkiraan annual cost $ 200,000 hingga $ 600,000. Kejadian wabah tunggal pada tahun 1993 di Western AS telah menyebabkan 700 orang menderita sakit dan 4 orang meninggal (Sartika, 2005). VI.
Kesimpulan
1. Pewarnaan yang digunakan dalam praktikum ini adalah pewarnaan Gram. Pewarnaan Gram adalah pewarnaan yang didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan pada dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Pewarnaan ini berguna untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni bakteri gram positif dan gram negatif. Langkah-langkah utama dalam teknik pewarnaan bakteri antara lain: a. Pembuatan olesan bakteri b. Fiksasi c. Aplikasi zat warna tunggal, atau lebih dari 1 zat warna. 2.
Teknik yaitu:
pewarnaan
gram
pada
praktikum
ini
dilakukan
dalam
4
a. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu. b. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ. c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
tahap
d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin. 3. Dari hasil pengamatan warna bakteri, pada sampel A dapat dikelompokkan dalam bakteri gram negatif karena menunjukkan warna merah muda ketika diamati di bawah mikroskop. 4. Dari hasil pengamatan warna bakteri, pada sampel B dapat dikelompokkan dalam bakteri gram positif karena menunjukkan warna ungu ketika diamati di bawah mikroskop. VII. Daftar Pustaka Aditya, Mushoffa. 2010. Teknik Pewarnaan Bakteri. http://mushoffaditya.blogspot.com/2010/01/teknik-pewarnaanbakteri.html. 11 November 2010. Dwijoseputro, d. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan. Fajriana, Rizki. 2008. Mikrobiologi Umum Pewarnaan Gram. http //pewarnaan bakteri\Mikroum…Pewarnaan Gram « RIZQI FAJRIANA BLOG’S.htm/. 11 November 2010. Fitria, Bayu. 2009. Pewarnaan Gram (Gram positif dan Gram Negatif). http://biobakteri.wordpress.com/2009/06/07/7-pewarnaan-gram-grampositif-dan-gram-negatif. 11 November 2010. Hadioetomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Gramedia. Hardiningsih, Riani, Rostiati Nonta Refina Napitupulu, dan Titin Yulinery. 2006. Isolasi dan Uji Resistensi Beberapa Isolat Lactobacillus pada pH Rendah. Biodiversitas Vol 7 No. 1. Karuniawati, Risdiyani, S. Nilawati, Prawoto, Y. Rosana, B. Alisyahbana, I. Parwati, Wia Melia, dan T.M. Sudiro. 2005. Perbandingan Tan Thiam Hok, Ziehl Neelsen dan Fluorokrom sebagai Metode Pewarna Basil Tahan Asam untuk Pemeriksaan Mikroskopik Sputum. Makara Kesehatan Vol. 9 No. 1. Manurung, Pebrin. 2010. Pengamatan Bentuk Bakteri. http://pebrinmanurung.blogspot.com/2010/10/pengamatan-bentukbakteri.html. 11 November 2010. Pradhika, E. Indra. 2008. Morfologi Mikroba. http://ekmonsaurus.blogspot.com/2008/11/bab-5-morfologi-mikroba.html. 11 November 2010. Purwoko, Tjahjadi. dkk. 2010. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Laboratorium Mikrobiologi UNS.
Reyza, Muhammad. 2008. Metode Pewarnaan Gram.http://qi206.wordpress.com/2008/10/17/mikroba/pewarnaan/ 11 November 2010. Rudi. 2010. Bakteri Gram dan Pewarnaannya. http://rudyregobiz.wordpress.com/bakteri-gram-dan-pewarnaannya-2/. 11 November 2010. Sartika, Ratu Ayu, Yvonne M. Indrawani, dan Trini Sudiarti. 2005. Analisis Mikrobiologi Escherichia coli O157:H7 pada Hasil Olahan Hewan Sapi dalam Proses Produksinya. Makara Kesehatan Vol 9 No. 1. Seri, Nesty Dwiyani. 2010. Bakteri Tahan Asam. http://my.opera.com/chanlightz/blog/2010/07/13/bakteri-tahan-asam. 11 November 2010.
PEWARNAAN SPORA BAKTERI
PENGANTAR Beberapa spesies bakteri tertentu dapat membentuk spora. Spora dihasilkan di dalam tubuh vegetatif bakteri tersebut, dapat berada di bagian tengah (central), ujung (terminal) ataupun tepian sel. Pelczar (1986), menyatakan bahwa spora merupakan tubuh bakteri yang secara metabolik mengalami dormansi, dihasilkan pada faselanjut dalam pertumbuhan sel bakteri yang sama seperti asalnya, yaitu sel vegetatif.
Spora bersifat tahan terhadap tekanan fisik maupun kimiawi. Santoso (2010) menyebutkan bahwa ada dua genus bakteri yang dapat membentuk endospora, yaitu genus Bacillus dan genus Clostridium.Strukturspora yang terbentuk di dalamtubuh vegetative bakteri disebut sebagai ‘endospora’ (endo=dalam, spora=spora) yaitu spora yang terbentuk di dalam tubuh. Secara sederhana, dapat dikatakan bahwa endospora merupakan sel yang mengalami dehidrasi dengan dinding yang mengalami penebalan serta memiliki beberapa lapisan tambahan. Dengan adanya kemampuan untuk membentuk spora ini, bakteri tersebut dapat bertahan pada kondisi yang ekstrim.Menurut Pelczar (1986) bakteri yang dapat membentuk endospore ini dapat hidup dan mengalami tahapan-tahapan pertumbuhan sampai beberapa generasi, dan spora terbentuk melalui sintesis protoplasma baru di dalam sitoplasma sel vegetatifnya. Menurut Volk & Wheeler (1988), dalam pengamatan spora bakteri diperlukan pewarnaan tertentu yang dapat menembus dinding tebal spora. Contoh dari pewarnaan yang dimaksudkan oleh Volk & Wheeler tersebut adalah dengan penggunaan larutan hijau malakit 5%, dan untuk memperjelas pengamatan, sel vegetative juga diwarnai dengan larutan safranin 0,5% sehingga sel vegetative ini berwarna merah. Dengan demikian ada atau tidaknya spora dapat teramati, bahkan posisi spora di dalam tubuh sel vegetative juga dapat diidentifikasi.Namun ada juga zat warna khusus untuk mewarnai spora dan di dalam proses pewarnaannya melibatkan treatment pemanasan, yaitu; spora dipanaskan bersamaan dengan zat warna tersebu tsehingga memudahkan zat warna tersebut untuk meresap ke dalam dinding pelindung spora bakteri. Beberapa zat warna yang telah disebutkan di atas, dapat mewarnai spora bakteri, tidak lepas dari sifat kimiawi dinding spora itu sendiri.Semua spora bakteri mengandung asam dupikolinat.Yang mana subtansi ini tidak dapat ditemui pada sel vegetatif bakteri, atau dapat dikatakan, senyawa ini khas dimiliki oleh spora.Dalam proses pewarnaan, sifat senyawa inilah yang kemudian dimanfaatkan untuk di warnai menggunakan pewarna tertentu, dalam hal ini larutan hijau malakit. Sedangkan menurut pelczar (1986), selain subtansi di atas, dalam spora bakteri juga terdapat kompleks Ca2+dan asam dipikolinan peptidoglikan. Proses pembentukan spora disebut sprorulasi, pada umumnya proses ini mudah terjadi saat kondisi medium biakan bakteri telah memburuk, hal ini sesuai dengan kenyataan bahwa, sampel yang diambil dalam praktikum ini berasal dari biakan bakteri yang dibuat beberapa minggu yang lalu, sehingga di asumsikan, nutrisi di dalam medium telah hampir habis, sehingga diharapkan bakteri melakukan proses sporulasi ini. Haapan ini terbukti benanr dengan kenyataan bahwa dari kedua sampel yaitu koloni 1 dan koloni 2, keduanya sama-sama menghasilkan spora. Namun menurut Dwijoseputro (1979) beberapa bakteri mampu membentuk spora meskipun tidak dalam keadaan ekstrem ataupun medium yang kurang nutrisi. Hal ini dimungkinkan karena bakteri tersebut secara genetis, dalam tahapan pertumbuhan dan perkembangannya memang memiliki satu fase sporulasi. Masih menurut Dwijoseputro (1979) jka medium selalu diadakan pembaruan dan kondisi
lingkungan disekitar bakteri selalu dijaga kondusif, beberapa jenis bakteri dapat kehilangan kemampuannya dalam membentuk spora. Hal ini dimungkinkan karena struktur bakteri yang sangat sederhana dan sifatnya yang sangat mudah bermutasi, sehingga perlakuan pada lingkungan yang terus menerus dapat mengakibatkan bakteri mengalami mutasi dan kehilangan kemampuannya dalam membentuk spora. Proses pembentukan spora di dalam sel vegetatif bakteri, terjadi dalam beberapa tahapan, secara singkat bagan proses pembentukan spora bakteri di atas dapat dijelaskan sebagai berikut: 1. Terjadi kondensasi DNA pada bakteri yang akan membentuk spora 2. Terjadi pembalikan membran sitoplasma, sehingga, lapisan luar membran kini menjadi lapisan dalam membran (calon) spora. 3. Pembentukan korteks primordial (calon korteks) 4. Pembentukan korteks 5. Spora terlepas dan menjadi spora yang bebas, pada tahap 5 ini,jika spora mendapatkan lingkungan yang kondusif, maka ia bisa tumbuh menjadi satu sel bakteri yang baru. (sumber: FMIPA UPI) Spora bakteri ini dapat bertahan sangat lama, ia dapat hidup bertahun-tahun bahkan berabad-abad jika berada dalam kondisi lingkungan yang normal. Kebanyakan sel vegetatif akan mati pada suhu 60-70oC, namun spora tetap hidup, spora bakteri ini dapat bertahan dalam air mendidih bahkan selama 1 jam lebih. Selama kondisi lingkungan tidak menguntungkan, spora akan tetap menjadi spora, sampai kondisi lingkungan dianggap menguntungkan, spora akan tumbuh menjadi satu sel bakteri yang baru dan berkembangbiak secara normal (Volk & Wheeler, 1988). PENDAHULUAN Spora bakteri adalah bentuk bekteri yang sedang dalam usaha mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Spora bakteri mempunyai fungsi yang sama seperti kista amoeba, sebab bakteri dalam bentuk spora dan amoeba dalam bentuk kista merupakan suatu fase dimana kedua mikroorganisme itu berubah bentuk untuk melindungi diri terhadap faktor luar yang tidak menguntungkan. (Dwidjoseputro, 2001) Sepanjang pengetahuan yang kita miliki sekarang, hanya golongan basillah yang dapat membentuk spora, akan tetapi tidak semua basil mampu berbuat demikian. Beberapa spesies Bacillus yang aerob dan beberapa spesies Clostridium yang anaerob dapat membentuk spora. Spora ini lazim disebut endospora, dikarenakan spora itu dibentuk di dalam sel. (Dwidjoseputro, 2001) Endospora hanya terdapat pada bakteri. Merupakan tubuh berdinding tebal, sangat refraktif, dan sangat resisten, dihasilkan oleh semua spesies Bacillus, Clostridium dan Sporosarcina. Bakteri yang mampu membentuk endospora dapat tumbuh dan bereproduksi selama banyak generasi sebagai sel vegetatif. Namun pada beberapa tahapan di dalam pertumbuhannya, terjadi sintesis protoplasma baru dalam sitoplasma vegetatifnya yang dimaksudkan untuk menjadi spora. (Pelczar,1986)
Bentuk spora ada yang bulat, ada pula yang bulat panjang, hal ini bergantung pada spesies. Endospora ada yang lebih kecil dan ada pula yang lebih besar daripada diameter sel induk. (Dwidjoseputro, 2001) Letak endospora di dalam sel serta ukurannya selama pembentukannya tidaklah sama bagi semua spesies. Sebagai contoh, beberapa spora adalah sentral yaitu dibentuk di tengah-tengah sel, yang lain terminal yaitu dibentuk di ujung; dan yang lain lagi subterminal yaitu di dekat ujung. (Pelczar,1986) Pada umumnya sporulasi itu mudah terjadi, jika keadaan medium memburuk, zatzat yang timbul sebagai pertukaran zat bertimbun-timbun dan faktor-faktor luar lainnya merugikan. Tetapi pada beberapa spesies mampu membentuk spora meskipun tidak terganggu oleh faktor luar. Sporulasi dapat dicegah, jika selalu diadakan pemindahan piaraan ke medium yang baru. Beberapa spesies bakteri dapat kehilangan kemampuannya untuk membentuk spora. Spora dapat tumbuh lagi menjadi bakteri biasa apabila keaadaan di luar menguntungkan. Mula-mula air meresap ke dalam spora, kemudian spora mengembang dan kulit spora menjadi retak karenanya. Keretakan ini dapat terjadi pada salah satu ujung, tetapi juga dapat terjadi pada tengah-tengah atau dekat tengah-tengah spora. Hal ini merupakan ciri khas bagi beberapa spesies Bacillus. Jika kulit spora pecah di tengah-tengah, maka masing-masing pecahan akan merupakan suatu tutup pada kedua ujung bakteri. (Dwidjoseputro, 2001) PEWARNAAN SPORA BAKTERI Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Segera setelah keadaan luar baik lagi bagi mereka, maka pecahlah bungkus spora dan tumbuhlah bakteri. Spora lazim disebut endospora ialah karena spora itu dibentuk di dalam sel. Endospora jauh lebih tahan terhadap pengaruh luar yang buruk dari pada bakteri biasa yaitu bakteri dalam bentuk vegetatif. Sporulasi dapat dicegah, jika selalu diadakan pemindahan piaraan ke medium yang baru. Endospora dibuat irisan dapat terlihat terdiri atas pembungkus luar, korteks dan inti yang mengandung struktur nukleus. Apabila sel vegetatif membentuk endospora, sel ini membuat enzim baru, memproduksi dinding sel yang sama sekali baru dan berubah bentuk. Dengan kata lain sporulasi adalah bentuk sederhana diferensiasi sel, karena itu, proses ini diteliti secara mendalam untuk mempelajari peristiwa apa yang memicu perubahan enzim dan morfologi. Spora biasanya terlihat sebagai badan-badan refraktil intrasel dalam sediaan suspensi sel yang tidak diwarnai atau sebagai daerah tidak berwarna pada sel yang diwarnai secara biasa. Dinding spora relatif tidak dapat ditembus, ini pula yang mencegah hilangnya zat warna spora setelah melalui pencucian dengan alkohol yang cukup lama untuk menghilangkan zat warna sel vegetatif. Sel vegetatif akhirnya dapat diberi zat warna kontras. Spora biasanya diwarnai dengan hijau malachit atau carbol fuchsin. Spora kuman dapat berbentuk bulat, lonjong atau silindris. Berdasarkan letaknya spora di dalam sel kuman, dikenal letak sentral,subterminal dan terminal. Ada spora
yang garis tengahnya lebih besar dari garis tengah sel kuman, sehingga menyebabkan pembengkakan sel kuman. PROSEDUR KERJA Metode : Klein Tujuan : Untuk melihat spora bakteri Prinsip : Spora kuman mempunyai dinding yang tebal sehingga diperlukan pemanasan agar pori-pori membesar zat warna fuchsin dapat masuk, dengan pencucian pori-pori kembali mengecil menyebabkan zat warna fuchsin tidak dapat dilepas walaupun dilunturkan dengan asam alkohol, sedangkan pada badan bakteri warna fuchsin dilepaskan dan mengambil warna biru dari methylen blue. Cara Kerja : • Dibuat suspensi kuman, ditambah dengan carbol fuchsin sama banyak. • Dipanaskan selama 6 menit pada api kecil atau pada penangas air 80oc selama 10 menit. • Dibuat sediaan dan dikeringkan. • Dimasukkan kedalam H2SO4 1% selama 2 detik • Dimasukkan kedalam alkohol sehingga tidak ada lagi warna merah mengalir. • Sediaan dicuci dengan air. • Diwarnai dengan methylen blue selama 1 menit kemudian dicuci dan dikeringkan. • Diperiksa dibawah mikroskop. Interpretasi hasil : Spora : warna merah dan Badan bakteri : warna biru. Diposkan oleh HENDRO di Minggu, September 09, 2012
Pewarnaan SPORa Untuk mempermudah pengamatan, terutama pada spora bakteri dilakukan metode pewarnaan spora agar peneliti ataupun pengamat mampu melihat spora, membedakan dengan vel vegetatif ataupun mengamati bentuknya. Menurut Waluyo (2004) endospora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode pengecatan endospora dengan larutan Hijau Malakit. Metode Shaeffor, foton endospora diwarnai pertama dengan larutan Hijau Malakit. Pada pengecatan ini, sifatnya kuat karena dapat berpenetrasi ke dalam endospora dengan perlakukan larutan Hijau Malakit. Teknik ini akan menghasilkan warna hjau pada endospora dan merah pada sel vegetatif. Pada pengecatan endospora dengan larutan Hijau Malakit, bakteri penghasil endospora menunjukkan reaksi positif yaitu larutan Hijau Malakit akan b erikatan dengan spora sehingga saat pencucian akan tetap berwarna hijau dan cat penutup Safranin tidak bisa masuk/diikat oleh endospora. Sedangkan pada bakteri yang tidak menghasilkan endospora maka larutan Hijau Malakit tidak dapat diikat (Fardiaz, 1992).
Prosedur pewarnaan spora bakteri adalah sebagai berikut:
Sediakan kaca benda yang bersih, lalu lewatkan di atas nyala api spritus. 2. Teteskan setetes aquades steril di atas kaca benda tersebut 3. Secara aseptic ambillah inokulum bakteri yang akan diperiksa lalu letakkan di atas tetesan aquades itu kemudian ratakan perlahan-lahan 4. Ambillah kaca benda lain yang bersih lalu letakkan di ats kaca benda sediaan tersebut sehingga membentuk sudut 45 0 5. Geserkan kaca benda yang tegak ini, sehingga sediaan menjadi tipis dan merata, biarkan sampai mengering 6. Lakukan fiksasi dengan cara melewatkan sediaan tersebut di atas nyala api lampu spritus dengan cepat 7. Teteskan larutan hijau malakit di atas sediaan itu lalu panaskan sediaan tersebut diatas nyala api spritus selama 3 menit, jagalah jangan sampai sediaan mendidih atau mengering, jika mengering, tambahkan tetesan larutan hijau malakit. Selama pemanasan jepitlah sediaan dengan pinset. 8. Letakkan larutan hijau malakit di atas kawat penyangga yang diletakkan di atas mangkuk pewarna, lalu biarkan sampai dingin 9. Cucilah kelebihan larutan hijau malakit dengan air kran dalam botol penyemprot 10. Teteskan larutan safranin di atas sediaan tersebut, lalu biarkan selama satu menit 11. Cucilah kelebihan larutan safranin pada sediaan itu 12. Keringkan seiiaan dengan kertas penghisap dan amatilah di bawah mikroskop. jika pewarnaan ini berhasl dengan baik, maka sel vegetatif bakteri akan berwarna merah, jika sel membentuk spora maka spora akan Nampak berwarna hijau. 1.
Beberapa spesies bakteri tertentu dapat membentuk spora. Spora dihasilkan di dalam tubuh vegetatif bakteri tersebut, dapat berada di bag ian tengah (central), ujung (terminal) ataupun tepian sel. Pelczar (1986), menyatakan bahwa spora merupakan tubuh bakteri yang secara metabolik mengalami dormansi, dihasilkan pada faselanjut dalam pertumbuhan sel bakteri yang sama seperti asalnya, yaitu sel vegetatif. Spora bersifat tahan terhadap tekanan fisik maupun kimiawi. Santoso (2010) menyebutkan bahwa ada dua genus bakteri yang dapat membentuk endospora, yaitu genus Bacillus dan genus Clostridium.Strukturspora yang terbentuk di dalamtubuh vegetative bakteri disebut sebagai ‘endospora’ (endo=dalam, spora=spora) yaitu spora yang terbentuk di dalam tubuh. Secara sederhana, dapat dikatakan bahwa endospora merupakan sel yang mengalami dehidrasi dengan dinding yang mengalami penebalan serta memiliki beberapa lapisan tambahan. Dengan adanya kemampuan untuk membentuk spora ini, bakteri tersebut dapat bertahan pada kondisi yang ekstrim.Menurut Pelczar (1986) bakteri yang dapat membentuk endospore ini dapat hidup dan mengalami tahapan-tahapan pertumbuhan sampai beberapa generasi, dan spora terbentuk melalui sintesis protoplasma baru di dalam sitoplasma sel vegetatifnya.
Menurut Volk & Wheeler (1988), dalam pengamatan spora bakteri diperlukan pewarnaan tertentu yang dapat menembus dinding tebal spora. Contoh dari pewarnaan yang dimaksudkan oleh Volk & Wheeler tersebut adalah dengan penggunaan larutan hijau malakit 5%, dan untuk memperjelas pengamatan, sel vegetative juga diwarnai dengan larutan safranin 0,5% sehingga sel vegetative ini berwarna merah. Dengan demikian ada atau tidaknya spora dapat teramati, bahkan posisi spora di dalam tubuh sel vegetative juga dapat diidentifikasi.Namun ada juga zat warna khusus untuk mewarnai spora dan di dalam proses pewarnaannya melibatkan treatment pemanasan, yaitu; spora dipanaskan bersamaan dengan zat warna tersebu tsehingga memudahkan zat warna tersebut untuk meresap ke dalam dinding pelindung spora bakteri. Beberapa zat warna yang telah disebutkan di atas, dapat mewarnai spora bakteri, tidak lepas dari sifat kimiawi dinding spora itu sendiri.Semua spora bakteri mengandung asam dupikolinat.Yang mana subtansi ini tidak dapat ditemui pada sel vegetatif bakteri, atau dapat dikatakan, senyawa ini khas dimiliki oleh spora.Dalam proses pewarnaan, sifat senyawa inilah yan g kemudian dimanfaatkan untuk di warnai menggunakan pewarna tertentu, dalam hal ini larutan hijau malakit. Sedangkan menurut pelczar (1986), selain subtansi di atas, dalam spora bakteri juga terdapat kompleks Ca2+dan asam dipikolinan peptidoglikan. Proses pembentukan spora disebut sprorulasi, pada umumnya proses ini mudah terjadi saat kondisi medium biakan bakteri telah memburuk, hal ini sesuai dengan kenyataan bahwa, sampel yang diambil dalam praktikum ini berasal dari biakan bakteri yang dibuat beberapa minggu yang lalu, sehingga di asumsikan, nutrisi di dalam medium telah hampir habis, sehingga diharapkan bakteri melakukan proses sporulasi ini. Haapan ini terbukti benanr dengan kenyataan bahwa dari kedua sampel yaitu koloni 1 dan koloni 2, keduanya sama-sama menghasilkan spora. Namun menurut Dwijoseputro (1979) beberapa bakteri mampu membentuk spora meskipun tidak dalam keadaan ekstrem ataupun medium yang kurang nutrisi. Hal ini dimungkinkan karena bakteri tersebut secara genetis, dalam tahapan pertumbuhan dan perkembangannya memang memiliki satu fase sporulasi. Masih menurut Dwijoseputro (1979) jka medium selalu diadakan pembaruan dan kondisi lingkungan disekitar bakteri selalu dijaga kondusif, beberapa jenis bakteri dapat kehilangan kemampuannya dalam membentuk spora. Hal ini dimungkinkan karena struktur bakteri yang sangat sederhana dan sifatnya yang sangat mudah bermutasi, sehingga perlakuan pada lingkungan yang terus menerus dapat mengakibatkan bakteri mengalami mutasi dan kehilangan kemampuannya dalam membentuk spora. Proses pembentukan spora di dalam sel vegetatif bakteri, terjadi dalam beberapa tahapan, secara singkat bagan proses pembentukan spora bakteri di atas dapat dijelaskan sebagai berikut: 1. Terjadi kondensasi DNA pada bakteri yang akan membentuk spora 2. Terjadi pembalikan membran sitoplasma, sehingga, lapisan luar membran kini menjadi lapisan dalam membran (calon) spora. 3. Pembentukan korteks primordial (calon korteks) 4. Pembentukan korteks 5. Spora terlepas dan menjadi spora yang bebas, pada tahap 5 ini,jika spora mendapatkan lingkungan yang kondusif, maka ia bisa tumbuh menjadi satu sel bakteri yang baru. (sumber: FMIPA UPI)
Spora bakteri ini dapat bertahan sangat lama, ia dapat hidup bertahun-tahun bahkan berabadabad jika berada dalam kondisi lingkungan yang normal. Kebanyakan sel vegetatif akan mati pada suhu 60-70oC, namun spora tetap hidup, spora bakteri ini dapat bertahan dalam air mendidih bahkan selama 1 jam lebih. Selama kondisi lingkungan tidak menguntungkan, spora akan tetap menjadi spora, sampai kondisi lingkungan dianggap menguntungkan, spora akan tumbuh menjadi satu sel bakteri yang baru dan berkembangbiak secara normal (Volk & Wheeler, 1988).
Teknik pewarnaan bakteri Teknik Pewarnaan Bakter 1. Mengamati Morfologi Bakteri Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan. Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll. 2. Jenis Pewarnaan Pewarnaan pada bakteri di bagi menjadi tiga, yaitu : 2.1 Pewarnaan sederhana Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah memilen biru, krisdal violet dan karbol fuehsin. yang man pewarnaan sederhan ini di bagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan a. Pewarnaan Asam
Mewrupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan untuk hanya untuk melihat bentuk sel. adapun zat warna yang di pakai dalam pewarnaan positif adalah biru metilen, dan air furksin. Cara kerja untuk melakukan pewarnaan bakteri yaitu sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya. b. Pewarnaan Basa Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina. Cara kerja pewarnaan negatif, yaitu ambil dua object glass, teteskan nigrosin atau tinta cina di ujung kanan salah satu object glass. biakan diambil lalu diulaskan atau diteteskan dalam tetesan nigrosin tadi, lalu dicampurkan Tempelkan sisi object glass yang lain kemudian gesekkan ke samping kiri Biarkan preparat mengering di udara, jangan difiksasi atau dipanaskan di atas api. .2 Pewarnaan Diferensial (Gram) Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853– 1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka. Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri
gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bilakomponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar. Jadi bahan zat warna yang di pakai dalam pewarnaan gram, yaitu kristal violet, larutan iodin, alkohol 90 %, dan larutan safranin. Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu : 1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu. 2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ. 3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam. 4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin a. Bakteri Gram negatif Bakteri gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka. Banyak spesies bakteri gram-negatif yang bersifat patogen, yang berarti mereka berbahaya bagi organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel gram-negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau endotoksin).b.Bakteri Gram Positif Bakteri gram-positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram-negatif akan berwarna merah atau merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri.Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%),
peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Cara kerja pewarnaan diferensial, yaitu Sediakan kaca benda yang bersih, lalu lewatkan diatas nyala api bunsen teteskan setetes aquades steril diatas kaca benda tersebut secara aseptik ambilah inokulum bakteri yang akan diperksa, lalu letakkan diatas tetesan aquades itu, kemudian ratakan perlahan-lahan ambil kaca benda yang tegak sehingga apusan menjadi tipis dan merata. Biarkan sampai kering fiksasi dengan cara melewatkan apusan tersebut diatas nyala api dengan cepat letakkan apusan diatas kawat penyangga yang berada diatas mangkuk pewarna. Lalu teteskan larutan kristal violet pada apusan dan biarkan selama 30-60 detik cuci warna dasar dengan air mengalir, keringkan teteskan larutan iodin pada apusan, biarkan selama 30-60 detik cuci larutan iodin dengan air mengalir, keringkan rendam atau basuh dengan alkohol ... % selama ... detik teteskan larutan safranin, biarkan selama 30-60 detik cuci dengan air mengalir, lalu keringkan amati dengan mikroskop gambar bentuk morfologi
1.1 Latar Belakang Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada
bentuk
basil
pembagiannya
yaitu
basil
tunggal,
diplobasil,
dan
tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung (Dwidjoseputro.1998). Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro.1998). Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.
Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku (Lay.1994) Oleh karena itu yang melatar belakangi praktek ini yaitu untuk mengetahui teknik pewarnaan mikroorganisme sehingga mempermudah dalam melihat bagianbagian bakteri. Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorpsi ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme ataupun latar belakangnya. Zat warna mengadsorpsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora dan bahan infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat. Pewarnaan yang digunakan untuk melihat salah satu struktur sel disebut pewarnaan khusus. Sedangkan pewarnaan yang digunakan untuk memilahkan mikroorganisme disebut pewarnaan diferensial yang memilahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram negatif. Pewarnaan diferensial lainnya ialah pewarnaan ziehl neelsen yang memilihkan bakterinya menjadi kelompok-kelompok tahan asam dan tidak tahan asam (Dwidjoseputro.1998). Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan pewarnaan terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas (Hadiutomo. 1990). Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2004). Tujuan dari pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri, memperluas ukuran jazad, mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri, dan melihat reaksi jazad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat diketahui (Hadiutomo. 1990).
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bias dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp (Waluyo, 2004). Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam). Umumnya zat warna yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ionion yang bermuatan positif dan negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung warna adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion yang mengandung warna adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna negatif (Hadiutomo. 1990). Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat warna basa bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut kromofor dan memiliki muatan positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna mempunyai muatan negatif zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan didinding sel, membran sel dan sitoplasmasewaktu proses pewarnaan muatan positif pada zat warna
basa akan berkaitan
dengan muatan negatif
dalam
sel, sehingga
mikroorganisme lebih jelas terlihat (Dwidjoseputro.1998). Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme,
namun
biasanya
dimanfaatkan
untuk
mewarnai
mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai latar belakang sediaan pewarnaan. Zat warna asam yang bermuatan negatif ini tidak dapat berkaitan dengan muatan negatif yang terdapat pada struktur sel. Kadangkala zat warna negatif digunakan untuk mewarnai bagian sel yang bermuatan positif, perlu diperhatikan bahwa muatan dan daya ikat zat warna terhadap struktur sel dapat berubah
bergantung
(Dwidjoseputro.1998).
pada
pH
sekitarnya
sewaktu
proses
pewarnaan
Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroorganisme disebut pewarnaan positif dalam prosedur pewarnaan ini dapat digunakan zat warna basa yang yang bermuatan positif maupun zat warna asam yang bermuatan negatif. Sebaliknya pada pewarnaan negatif latar belakang disekeliling mikroorganisme diwarnai untuk meningkatkan kontras dengan mikroorganisme yang tak berwarna. Pewarnaan mencakup penyiapan mikroorganisme dengan melakukan preparat ulas (Dwidjoseputro.1998) Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek. Ulasan ini kemudian difiksasi. Jumlah bakteri yang terdapat pada ulasan haruslah cukup banyak sehingga dapat terlihat bentuk dan penataanya sewaktu diamati. Kesalahan yang sering kali dibuat adalah menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat terutama bila suspensi tersebut berasal adari bukan media padat. Sebaliknya pada suatu suspensi bakteri bila terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan sewaktu mencari bakteri pada preparatnya (Sutedjo.1991). Untuk pewarnaan yang mengamati morfologi sel mikroorganisme maka seringkali
setelah
pembuatan
preparat
ulas
dilakukan
fiksasi
diikuti
oleh
pewarnaan. Fiksasi dapat dilakukan dengan cara melewatkan preparat diatas api atau merendamnya dengan metanol. Fiksasi digunakan untuk : 1.
Mengamati bakteri oleh karena sel bakteri lebih jelas terlihat setelah diwarnai
2.
Melekatkan bakteri pada glass objek
3.
Mematikan bakteri Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Lazim, prosedur pewarnaan ini menggunakan zat warna basa seperti seperti crystal violet, biru metilen, karbol fuchsin basa, safranin atau hijau malakit. Kadang kala digunakan zat warna negatif untuk pewarnaan sederhana : zat warna asam yang sering digunakan adalah nigrosin dan merah kongo (Lay.1994). Prosedur Pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan penataan pada mikoorganisme bakteri pada bakteri dikenal bentu yang bulat (coccus), batang (basil), dan spiral.
Dengan pewarnaan sederhana dapat juga terlihat penataan bakteri. Pada coccus dapat terlihat pewarnaan seperti rantai (stertococcus), buah anggur ( stafilococcus), pasangan (diplococcus), bentuk kubus yang terdiri dari 4 atau 8 (saranae) (Lay.1994). Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat basa, tetapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif, pada metode ini mikroba dicampur dengan tinta cina atau nigrosin, kemudian digesekkan diatas kaca objek.Zat warna tidak akan mewarnai bakteri, akan tetapi mewarnai lingkungan sekitar bakteri. Dengan mikroskop mikroba akan terlihat tidak berwarna dengan latar belakang hitam (Lay.1994). Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh seorang ahli bioteknologi dari Denmark yang bernama Christian Gram pada tahun 1884. Menemukan metode pewarnaan secara tidak sengaja. Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. Pewarnaan gram merupakan pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi. Pewarnaan itu merupakan tahap penting dalam pencirian dan identifikasi bakteri (Lay,1994) Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan segar yang berumur 24-48 jam. Bila digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan penyimpanan hasil pewarnaan gram. Pada biakan tua, banyak sel mengalami kerusakan
pada
dinding-dinding
selnya.
Kerusakan
pada
dinding
sel
ini
menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan lartan pemucat. Ini berarti bahwa bakteri gram positif dengan dinding sel yang rusak tidak lagi dapat memertahankan crystal violet sehingga terlihat sebagai bakteri gram negatif (Lay,1994) Cirri-ciri gram negative: −
Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10-45mm, berlapis tiga atau multi layer
−
Dinding slnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat dalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam laktat.
−
−
Kurang rentan terhadap senyawa penisilin. Tidak resisten terhadap gangguan fisik Ciri-ciri bakteri gram positif:
−
Struktur dindingnya tebal
−
Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal
−
Bersifat lebih rentan terhadap senyawa penisilin
−
Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu Kristal
−
Komposisi yang dibutuhkan lebih rumit
−
Lebih resisten terhadap gangguan fisik. Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap. Yaitu a. Pemberian cat warna utama (cairan Kristal violet) berwarna ungu b. Pengintensifan cat warna dengan penambahan larutan mordan c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alcohol asam d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin Banyak seenyawa organic berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopis dan telah dikembangkan prosedur pewarnaan gram untuk :
−
Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar
−
Mengidentifikasi bagian-bagian structural sel mikroorganisme
−
Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa
3.3. Cara Kerja 3.3.1. Pewarnaan Sederhana 1.
Dibersihkan preparat glass dengan alkohol 70% kemudian difiksasi di atas bunsen
2.
Dipijarkan jarum ose kemudian dicelupkan ke aquades dan diberi juga sedikit aquades pada preparat glass menggunakan jarum ose
3.
Dipijarkan lagi jarum ose dan diambil bakteri dari media lalu diratakkan di atas preparat glass
4.
Dikeringkan dan dianginkan preparatnya
5.
Diteteskan larutan zat warna crystal violet sebanyak 1 atau 2 tetes
6.
Dikeringkan dan dianginkan selama 1 menit
7.
Dicuci dengan air mengalir
8.
Dikeringkan preparat dengan dianginkan, dan
9.
Diamati dibawah mikroskop karakteristik dan bentuk bakteri 3.3.2 Pewarnaan Negatif
1.
Dibersihkan preparat glass dengan alkohol 70% kemudian difiksasi di atas bunsen
2.
Dipijarkan jarum ose kemudian dicelupkan ke aquades dan diberi juga sedikit aquades pada preparat glass menggunakan jarum ose
3.
Dipijarkan lagi jarum ose dan diambil bakteri dari media lalu diratakkan di atas preparat glass
4.
Dikeringkan dan dianginkan preparatnya
5.
Diteteskan larutan zat warna tinta cina 1 tetes
6.
Dikeringkan dan dianginkan preparatnya
7.
Dicuci dengan air mengalir
8.
Dikeringkan preparat dengan dianginkan, dan
9.
Diamati dibawah mikroskop 3.3.3 Pewarnaan Gram
1.
Dibersihkan preparat glass dengan alkohol 70% kemudian difiksasi di atas bunsen
2.
Dipijarkan jarum ose kemudian dicelupkan ke aquades dan diberi juga sedikit aquades pada preparat glass menggunakan jarum ose
3.
Dipijarkan lagi jarum ose dan diambil bakteri dari media lalu diratakkan di atas preparat glass
4.
Dikeringkan dan dianginkan preparatnya
5.
Diteteskan larutan zat warna crystal violet 2-3 tetes dan didiamkan selama 1 menit
6.
Dikeringkan dan dianginkan preparatnya
7.
Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan
8.
Diteteskan dengan larutan Lugol dan dibiarkan selama 1 menit lalu dicuci dengan air mengalir dan diangin keringkan
9.
Kemudian dicuci dengan dengan alkohol 95% selama 30 detik, lalu dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan
10. Diberi larutan basic fuchsin atau safranin selama 2 menit 11. Dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan 12. Diamati dibawah mikroskop 3.3.4 Pewarnaan Spora 1.
Dibersihkan preparat glass dengan alkohol 70% kemudian difiksasi di atas bunsen
2.
Dipijarkan jarum ose kemudian dicelupkan ke aquades dan diberi juga sedikit aquades pada preparat glass menggunakan jarum ose
3.
Dipijarkan lagi jarum ose dan diambil bakteri dari media lalu diratakkan di atas preparat glass
4.
Ditutup dengan kertas saring
5.
Diteteskan malachite green kemudian difiksasi
6.
Didiamkan selama 5 menit dan dibuang kertas saring
7.
Dibilas dengan air mengalir dan kemudian dianginkan
8.
Diteteskan safranin dan dikeringkan tanpa fiksasi
9.
Diamati dibawah mikroskop
4.1 Hasil Pengamatan 4.1.1. Tabel hasil pengamatan pewarnaan No
Teknik Pewarnaan Pewarnaan
Pengamatan
. 1.
Pewarnaan Sederhana
Keterangan : Perbesaran 400 Berwarna Ungu Berbentuk basil
2.
Pewarnaan Negatif
Keterangan : Perbesaran 400 Berwarna Kuning Berbentuk coccus
3.
Pewarnaan Gram
Keterangan : Perbesaran 400 Berwarna Merah Berbentuk basil
Gram negatif 4.
Pewarnaan Spora
Keterangan : Perbesaran 400 Berwarna Merah Berbentuk coccus
4.2 Pembahasan Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satumacam zat zat warn warna a deng dengan an tuju tujuan an hany hanya a untu untuk k meli meliha hatt bent bentuk uk sel sel bakt bakter erii dan dan untu untuk k mengetahu mengetahuii morfologi morfologi dan susunan susunan selnya . pewarnaa pewarnaan n ini dapat menggunak menggunakan an pewarnaan basa pasda umumnya antara lain kristal violet , metylen blue , karbol , fuchsin , dan safranin(lay ,1994). Pewarnaan negatif yaitu pewarnaan yang ditujukan terhadap bakteri yang sulit sulit diwar diwarnai nai,, diman dimana a bakter bakteriny inya a tidak tidak diwarn diwarnai ai melain melainkan kan latar latar belaka belakangn ngnya, ya, metode pewarnaan negatif merupakan suatu metode perwarnaan umum, dimana digunakan larutan zat warna yang tidak meresap ke dalam sel-sel bakteri melainkan melatar belakangi sehingga sehingga kelihatan atau atau nampak sebagai bentuk-bentuk bentuk-bentuk kosong tak berwarna(negatif) (Lay.1994). Pewa Pewarn rnaa aan n
gram gram
meru merupa paka kan n
pewa pewarn rnaa aan n
yang yang
dig digunak unakan an
untu untuk k
mengelompokan bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna crystal violet dan akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat warna crystal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna air fucsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan zat warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya. Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan gram antara lain : crystal violet, alkohol, safranin, dan iodine (Lay.1994). Pewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan menggunakan malachite green dan safranin, yang dalam hasil pewarnaannya akan muncul warna hijau pada
sporanya, serta warna merah pada sel vegetatifnya yaitu pada Bacillus subtitulis (Lay.1994). Prinsip pewarnaan sederhana didasarkan pada zat warna yang digunakan hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut yang merupakan suatu
cara
yang
cepat
untuk
melihat
morfologi
bakteri
secara
umum(Dwidjoseputro.1998). Prinsip Prinsip pewarnaa pewarnaan n negatif negatif yaitu suatu metode metode pewarnaa pewarnaan n tidak tidak langsung langsung dimana dimana diguna digunakan kan laruta larutan n zat warna warna yang yang tidak tidak meresa meresap p kedala kedalam m sel bakter bakteru u melainkan ke dalam latar belakangnya (Lay.1994) Prinsip Prinsip pewarnaa pewarnaan n gram didasarka didasarkan n pada perbedaan perbedaan struktur struktur dinding dinding sel bakteri ; sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dengan permeabilitas zat warna dan penambahan larutan pencuci (Dwidjoseputro.1998). (Dwidjoseputro.1998). Prinsip pewarnaan spora yaitu suatu metode pewarnaan yang menggunakan malachite green dan safranin, yang dalam hasilnya pewarnaan akan muncul warna hijau pada sporanya dan warna merah pada sel vegetatifnya (Lay.1994) Fuch Fuchsi sin n carb carbon on,, meru merupa paka kan n camp campua uara ran n fuch fuchsi sin n feno fenoll dan dan dasa dasarr yang yang digunakan dalam prosedur pewarnaan bakteri. Hal ini umumnya digunakan dalam pewarnaan mikrobkateria karena memiliki ketertarikan untuk asam mycolic yang ditemukan di dinding sel mikroba, carbol fuchsin juga digunakan sebagai antiseptik tropikal (Lay,1994) Crystal violet atau ungu gentian adalah pewarna triarylmethane. Pewarna ini digunakan sebagai histologis noda dalam metode gram klasifikasi bakteri. Crystal violet violet memili memiliki ki sifat sifat sifat sifat anti anti bakter bakteri, i, jamur jamur dan obat obat cacing cacing,, dan dan sebelu sebelumny mnya a penting sebagai antiseptik topikal (Sutedjo,1991). (Sutedjo,1991). Nigrosin adalah campuran dari pewarna sintesis hitam yang dibuat dengan memanaskan memanaskan campuran campuran nirobenz nirobenzena, ena, anilin, anilin, dan hidroklori hidroklorida. da. Industri Industri utamanya utamanya adalah sebagai pewarna untuk lak, pernis, dan tinta penanda pena. Didalam biologi, nigrosin digunakan untuk pewarnaan negatif bakteri. Bentuk dan organisme yang terl terlih ihat at seba sebaga gaii warn warna a beba bebas s meng mengur urai aika kan n terh terhad adap ap lata latarr
bela belaka kang ng gela gelap. p.
Keuntu Keuntunga ngan n dari dari mengg mengguna unakan kan metode metode ini daripa daripada da noda noda positi positiff biasa biasa sepert sepertii
fuchsin, metilen blue, atau carbol, ialah bahwa fiksasi sebelumnya oleh panas atau alkohol
tidak diperlukan sehingga organisme terlihat. Selain itu pewarnaan
negatif dengan nigrosin dapat mengungkapkan beberapa mikroorganisme yang tidak dapat diwarnai dengan metode biasa. Lugol’s yodium, juga dikenal sebagai solusi lugol, merupakan solusi dari iodium dan iodida dalam air. Larutan yodium lugol digunakan sebagai antiseptik dan desinfektan, dan untuk desinfikasi darurat air minum, dan sebagai reagen untuk
deteksi
pasti
di
dalam
laboratorium,
pewarnaan
dan
tes
medis
(Dwidjoseputro.1998). Safranin dalah noda biologis yang digunakan dalam histologi dan sitologi. Safranin digunakan sebagai conterstain dalam beberapa protokol pewarnaan. Mewarnai seluruhinti sel darah merah. Ini adalah counterstain klasik dalam gram stain. Hal ini juga dapat digunakan untuk deteksi tulang rawan, musin dan butiran sel mast. Safranin biasanya memilki struktur kimia. Ada juga trimetil safranin kedua senyawa berperilaku dasarnya identik dan
aplikasi pewarnaan
biologi dan
kebanyakan prosedur safranin tidak membedakan diantara keduanya. Persiapan safranin komersial sering mengandung campuran dari kedua jenis. Safranin juga digunakan sebagai indikator redok dalam kimia analitik (Sutedjo,1991) Fiksasi adalah suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak realistik dengan menggunakan grutaldehid dengan proses pemabakaran. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur selnya (Lay,1994). Menurut hasil pengamatan, pada pewarnaan sederhana dikemukakan bakteri dengan bentuk basil dan berwarna ungu dalam pembesaran 400. Pada pewarnaan negatif, tidak ditemukan terlalu banyak bakteri, ditemukan bakteri dengan bentuk coccus dan pewarnaan negatif mewarnai belakangnya berwarna biru gelap dan bakteri berwarna kuning. Pada pewarnaan gram ditemukan bakteri jenis gram negatif dengan warna merah dan memiliki bentuk basil pada perbesaran mikroskop hingga 400. Sedangkan, pada perwarnaan spora yang menggunakan malachite green dan safranin, spora seharusnya berwarna hijau, tetapi pada hasil pengamatan yang terlihat hanya warna merah dari safranin, yaitu sel vegetatifnya dengan bentuk coccus pada perbesaran 400 di mikroskop.
Beberapa faktor kesalahan pada praktikum antara lain pemberian zat warna yang berlebihan sehingga sel bakteri tidak nampak, kurang maksimalnya dalam proses fiksasi sehingga masih ada bakteri yang belum mati, dan faktor yang lain adalah pada proses pencucian terlalu deras dalam membilas zat warna dengan air sehingga dapat menyebabkan bakteri larut terbawa air
5.1 Kesimpulan Dari percobaan pewarnaan yang dilakukan dapat ditarik kesimpulan : −
Pewarnaan bakteri dipengaruhi faktor-faktor antara lain fiksasi, pelunturan warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup
−
Perbedaan pada garam negatif dan gram positif terletak pada warnanya pada gram positif berwarna ungu kareana dapat mempertahankan zat pewarna kristal violet serta perbadaan terjadi pada dinding selnya
−
Macam-macam pewarnaan anatara lain : pewarnaan sederhana,pewarnaan differensial,pewarnaan spora dan perwarnaan kapsul
−
Larutan zat warna yang digunakan pada percobaan perwarnaan antara lain : alkohol, carbol fuchsin, crystal violet, nigrosin, malachite green, lugol’s iodida, dan safranin.
5.2 Saran Sebaiknya
pada
praktikum
dilakukan
percobaab
yang
lain
seperti
pewarnaan kapsul, basil tahan asam, dan perwarnaan fulton, diharapkan dengan mempelajari berbagai macam metode pewarnaan lebih banyak mengenai tentang proses dan metode pewarnaan.
DAFTAR PUSTAKA Dwidjoseputro, D.1998.Dasar-Dasar Mikrobiologi, Malang : Djambatan Hadiutomo. 1990. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta: Erlangga Lay, Bibiana.W.1994.Analisis Mikroba di Laboratorium.Jakarta : Rajawali Sutedjo, Mul Mulyani.1991.Mikrobiologi Tanah.Jakarta : Rineka Cipta
Waluyo, lud. 2004. Mikrobiologi Umum.Malang : UMM Press
LAPORAN BAKTERIOLOGI : BAKTERI TAHAN ASAM I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang Mikroorganisme di dunia ini ada yang menguntungkan dan ada juga yang merugikan. Mikroorganisme yang menguntungkan dapat kita manfaatkan untuk kepentingan kesejahteraan hidup manusia. Akan tetapi, banyak juga mikroorganisme yang tidak menguntungkan kita yaitu dengan menyebabkan terjadinya penyakit pada tubuh manusia. Salah satu mikroorganisme yang dapat menyebabkan atau menginfeksi manusia adalam Mycobacterium tuberculosis. Bakteri ini dapat mengakibatkan penyakit tuberculosis pada manusia. Tuberculosis merupakan salah satu penyakit yang mematikan dan berbahaya di dunia. Percobaan tentang transmisi penyakit TBC pertama kali dilakukan oleh Klencke pada tahun 1843. Klencke memproduksi TBC di dalam tubuh kelinci dengan inokulasi jaringan TBC secara intravena. Infeksi oleh kuman TBC juga dibuktikan oleh Villemin pada tahun 1865 dengan cara memproduksi penyakit ini pada kelinci dengan inokulasi jaringan TBC tipe human dan bovine. Dia yang pertama kali mendemonstrasikan perbedaan resistensi kelinci terhadap organisme tipe human dan bovine. Villemin menyimpulkan bahwa TBC adalah penyakit spesifik, TBC disebabkan oleh agen inocilable, penyakit ini dapat menular dari manusia ke kelinci, TBC adalah penyakit yang mematikan. Robert Koch merupakan penemu Mycobacterium tuberculosis pada tanggal 24 Maret 1882, sehingga untuk mengenang jasanya bakteri tersebut diberi nama baksil Koch. Bahkan, penyakit TBC pada paru-paru kadang disebut sebagai Koch Pulmonum (KP). Bakteri ini berbentuk batang dan bersifat tahan asam sehingga dikenal juga sebagai Batang Tahan Asam (BTA) (Pelczar dan Chan, 1988). Tuberkulosis (TBC) yang disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis yang menyerang paru dan juga memberikan efek terhadap susunan saraf pusat, sistem limfatik, sistem sirkulasi, sistem urogenital, tulang, tulang sendi, dan kulit. Penyak it ini diketahui dapat menyerang semua bangsa burung, mamalia, primata, termasuk manusia. Selain Mycobacterium tuberculosis (tipe human), dikenal juga spesies Mycobacterium bovis, dan Mycobacterium avium. Mycobacterium bovis dan Mycobacterium avium jarang terjadi pada orangutan. Hanya terdapat sekitar 10% laporan kasus TBC pada primata yang disebabkan oleh Mycobacterium bovis. TBC tipe Human yang paling banyak ditemukan pada primata dan manusia (Sari 2004). Bakteri tahan asam merupakan bakteri yang kandungan lemaknya sangat tebal sehingga tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan biasa, tetapi harus dengan pewarnaan tahan asam. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA) karena dapat mempertahankan zat warna pertama sewaktu dicuci dengan larutan pemucat. Golongan bakteri ini biasanya bersifat patogen pada manusia contohnya adalah Mycobacterium tuberculosis. Bakteri Mycobacterium tuberculosis dapat diisolasi dari sputum penderita TBC. Reaksi hasil pewarnaannya jika positif terdapat bakteri TBC berwarna merah. Selain menyerang manusia juga menyerang hewan seperti marmut, dan kera. Penularannya dapat melalui udara yang masuk ke saluran pernafasan (Pelczar dan Chan, 1988).
Bakteri tahan asam dapat diamati dengan teknik pewarnaan Ziehl Neelson, Kinyoun Gabber, dan Fluorochrom. Pengambilan sputum (sekret paru-paru atau ludah) untuk analisis tuberculosis dapat dilakukan setiap saat dikenal ada 3 jenis sputum: a. Sputum pagi : sputum yang dikeluarkan oleh penderita pada saat bangun pagi. b. Spot sputum : sputum yang dikeluarkan pada saat itu. c. Collection sputum : sputum yang keluar dan ditampung selama 24 jam. Sputum yang telah diperoleh dapat disimpan dalam lemari es selama satu minggu. Tujuan dari praktikum ini adalah dapat melakukan pewarnaan BTA untuk menganalisis adanya infeksi Mycobacterium tuberculosis. Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum adalah sputum yang mengandung BTA, pewarna Ziehl- Neelson (larutan karbol fuchsin 0,3%, alkohol asam 3% , dan methylen blue 0,3%. 1. Pembuatan sediaan apus sputum a) Ose dipanaskan di atas api spirtus sampai merah dan didinginkan. b) Sputum disiapkan (hati-hati, hindari droplet/percikan sputum), diambil sedikit dari bagian yang kental dan berwarna kuning kehijauan (purulen) menggunakan ose. c) Sputum dioleskan secara merata pada object glass (ukuran 2x3 cm). d) Ose yang telah digunakan dimasukkan ke dalam alcohol sambil digoyang-goyang sampai sisasisa sputum bersih, kemudian dibakar. e) Sediaan yang telah dibuat dikeringkan di udara terbuka sekitar 15-30 menit, jangan sampai terkena sinar matahari langsung. f) Sediaan diambil dengan pinset dan difiksasi elama 3-5 detik. 2. Pewarnaan atau pengecatan a) Sediaan yang telah kering dilakukan fiksasi dan digenangi dengan carbol fichsin 0,3%, dipanaskan di atas pembakar spirtus sampai menguap tatapi jangan sampai mendidih/kering selama 5 menit. b) Sediaan dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. c) Warna merah dilarutkan pada sediaan sampai bersih dengan 3% alkohol-asam. d) Sediaan dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. e) Sediaan digenangi dengan larutan methylen blue selama 20-30 detik. f) Sediaan dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. 3. Pembacaan dan Penilaian a. Pembacaan 1. Sediaan yang telah kering ditetesi dengan minyak imersi, dilihat dengan mikroskop dengan perbesaran 100 kali. 2. Sediaan di bawah mikroskop dicari dengan adanya batang panjang atau pendek yang berwarna merah dengan latar belakang berwarna biru. b. Penilaian 1. BTA negatif : apabila dalam 100 LP atau selama 15 menit pengamatan tidak dijumpai adanya BTA. 2. BTA positif : apabila dalam pengamatan dijumpai adanya BTA. BTA positif apabila dibuat sediaan langsung dan diwarnai dengan Ziehl-Neelsen atau Kinyoun Gabbet, maka dapat dilakukan penilaian sebagai berikut : Penilaian menurut IUATLD (International Union Againts Tuberculose Lung Disease) o Negatif : tidak dijumpai adanya BTA
o o o o
Positif Positif 1 Positif 2 Positif 3
: ditemukan 1-9 BTA/100 LP : ditemukan 10-90 BTA/100 LP : ditemukan 1-10 BTA/1 LP : ditemukan lebih dari 10 BTA/1 LP. Bakteri tahan asam adalah jenis bakteri yang tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan anilin biasa kecuali dengan menggunakan fenol dan dengan pemanasan. Bakteri ini memilki dinding sel berlilin karena mengandung sejumlah besar materi lipoidal oleh karena itu bakteri ini hanya dapat diwarnai dengan pewarnaan BTA ( Acid-Fast Stain). Dinding sel hidrofobik dan impermeabel terhadap pewarnaan dan bahan kimia lain pada cairan atau larutan encer. Ketika proses pewarnaan, bakteri tahan asam ini melawan dekolorisasi dengan asam sehingga bakteri tersebut disebut bakteri tahan asam (Ball, 1997). Contoh dari bakteri tahan asam yaitu dari genus Mycobacterium. Bakteri ini memiliki sejumlah besar zat lipoidal (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relative tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel-sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau pewarnaan gram (Dwijoseputro, 1994). Mycobacterium tuberculosis berbentuk batang langsing, lurus atau berbentuk filament. Bakteri ini bersifat aerobik, tidak membentuk spora, non motil, tahan asam, dan merupakan bakteri gram positif. Namun, sekali mycobacteria diberi warna oleh pewarnaan gram, maka warna tersebut tidak dapat dihilangkan dengan asam. Oleh karena itu, maka mycobacteria disebut sebagai Basil Tahan Asam atau BTA. Beberapa mikroorganisme lain yang juga memiliki sifat tahan asam, yaitu spesies Nocardia, Rhodococcus, Legionella micdadei, dan protozoa Isospora dan Cryptosporidium. Pada dinding sel mycobacteria, lemak berhubungan dengan arabinogalaktan dan peptidoglikan di bawahnya. Struktur ini menurunkan permeabilitas dinding sel, sehingga mengurangi efektivitas dari antibiotik. Lipoarabinomannan adalah suatu molekul lain dalam dinding sel mycobacteria, berperan dalam interaksi antara inang dan patogen, menjadikan M. tuberculosis dapat bertahan hidup di dalam makrofaga (Thomas, 1999). Mikobakteria dapat tumbuh lebih cepat pada pH 6 dan 8 dengan pH optimum sekitar 6.5 6.8 untuk tipe pathogen. Bakteri ini mempunyai susunan dinding yang melindungi bakteri jika hidup di luar inangnya. Dinding sel mikobakteria menyebabkan penundaan hipersensitivitas dan beberapa diantaranya resisten terhadap infeksi. Sel mikrobakteria dapat menunda reaksi hipersensitifitas pada hewan yang sebelumnya sensitif. Sel mikobakteria terdiri dari tiga lapisan penting yaitu lipid, protein, dan polisakarida. (Mudihardi, 2005). TBC (tuberculosis) adalah penyakit yang ditandai dengan timbulnya bintik-bintik tuberkel pada alveolus akibat infeksi bakteri Mycobacterium tuberculosis yang menyebabkan terganggunya difusi oksigen. Penyebab penyakit ini adalah bakteri kompleks Mycobacterium tuberculosis. Mycobacteria termasuk dalam famili Mycobacteriaceae dan termasuk dalam ordo Actinomycetales. Kompleks Mycobacterium tuberculosis meliputi M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti, dan M. canettii. Dari beberapa kompleks tersebut, M. tuberculosis merupakan jenis yang terpenting dan paling sering dijumpai (Thomas, 1999). Tubercolosis merupakan salah satu penyakit yang mematikan didunia selain AIDS bahkan merupakan penyebab utama kematian di negara b erkembang. Oleh sebab itulah diperlukan suatu metode yang efektif untuk mencegah penularan yang lebih luas lagi dan penanganan yang tepat terhadap pasien yang positif terkena tuberculosis. Jumlah penderita TBC menurut WHO, Treatment of Tuberculosis, Guidelines for National Programes (1997), mencapai kira-kira 9 jt/tahun dengan kematian 3 juta orang. Penderita TBC sangat banyak di negara
-
-
berkembang mencapai 95 % dengan 75% adalah pend erita usia produktif (15-50 tahun) (Depkes RI, 2001). Sumber penularan adalah penderita TBC yang dahaknya mengandung Mycobacterium tuberculosis . Infeksi bakteri ini paling sering disebarkan melalui udara (air borne, droplets infection). Penyebaran melalui udara be rupa partikel-partikel percikan dahak yang mengandung bakteri berasal dari penderita saat batuk, bersin, tertawa, bernyanyi atau bicara. Partikel mengandung bakteri ini akan terhisap oleh orang sehat dan menimbulkan infeksi di saluran napas. Bakteri Mycobacterium tuberculosis mencemari udara yang ditinggali atau ditempati banyak manusia, karena sumber dari bakteri ini adalah manusia. Bakteri ini da pat hidup selama beberapa jam pada udara terbuka, dan selama itulah akan beterbangan di udara hingga akhirnya menemukan manusia sebagai tempat hidup (Clifton, 1958). Menurut Chivers dan Ford (1978), gejala klinis TBC pada manusia yang dapat diamati diantaranya: Batuk-batuk berdahak lebih dari dua minggu, batuk berdarah atau pernah mengeluarkan darah, dada terasa sakit atau nyeri, terasa sesak pada waktu bernafas. Berat badan turun selama 3 bulan berturut-turut tanpa sebab yang jelas dan tidak naik dalam 1 bulan meskipun sudah dengan penanganan gizi yang baik. Nafsu makan tidak ada (anorexia) dengan gagal tumbuh dan berat badan tidak naik (failure to thrive). Demam lama atau berulang tanpa sebab yang jelas, setelah disingkirkan kemungkinan penyebab lainnya (bukan tifus, malaria atau infeksi saluran nafas akut), dapa t juga disertai keringat malam. Gejala - gejala dari saluran nafas, misalnya batuk lama lebih dari 30 hari (setelah disingkirkan sebab lain dari batuk), nyeri dada ketika bernafas atau batuk. Apabila bakteri TB menyebar ke organ-organ tubuh yang lain, gejala yang ditimbulkan akan berbeda-beda. Misalnya, kaku kuduk, muntah-muntah, dan kehilangan kesadaran pad a TBC otak & saraf (meningitis TB). Pembengkakan tulang pinggul, lutut, kaki dan tangan, pada TBC tulang & sendi. Semua gejala yang ditimbulkan diatas sering berkaitan dengan patogenitas organisme, pejalanan penyakit, tingkat infeksi, dan beberapa faktor dari induk semang. Masa inkubasi tuberkulosis sangat lama, kejadiannya berlarut-larut, dan gejala k linis yang nyata jarang terlihat dengan jelas hingga penyakit ini berkembang lebih lanjut. Mycobacterium tuberculosis termasuk gram positif, berbentuk batang panjang atau pendek, tidak berspora, tidak berkapsul, pertumbuhan sangat lambat (2-8 minggu), suhu optimal 37-380C yang merupakan suhu normal manusia. Pertumbuhannya membutuhkan tambahan makanan seperti darah, egg yolk , serum, dan bahan kimia tertentu. Dalam jaringan, basil tuberkel adalah bakteri batang lurus dengan ukuran sekitar 0,4 – 3 μm. Pada media buatan, bentuk kokoid dan filamentous tampak bervariasi dari satu spesies ke spesies lain. Segera setelah diwarnai dengan pencelupan dasar mereka tidak dapat didekolorisasi oleh alkohol, tanpa memperhatikan pengobatan dengan iodine. Basil tuberkel secara umum dapat diwarnai dengan pewarnaan Ziehl Neelsen. Media untuk membiakan mikobakteria adalah media nonselektif dan media selektif. Media selektif berisi antibiotik untuk mencegah pertumbuhan kontaminan bakteri dan fungi yang berlebihan. Ada tiga formulasi umum yang dapat digunakan untuk kedua media nonselektif dan selektif, yaitu media agar semisintetik (middlebrook 7H10 dan 7H11), media telur inspisasi (Lowenstein-jensen), media kaldu (broth media) (Jawetz et al., 2001). Mikobakteria merupakan aerobik obligat yang memperoleh energi dari oksidasi beberapa senyawa sederhana. Penambahan CO2 meningkatkan pertumbuhan. Tidak ada aktivitas biokimia
yang menandai. Dan kecepatan pertumbuhan lebih rendah dari pada sebagian besar bakteri. Waktu untuk menggandakan basil tuberkel sekitar 18 jam, bentuk saprofit cenderung tumbuh lebih cepat, poliferasi terjadi pada temperatur 22-23˚C, untuk menghasilkan pigmen yang lebih banyak dan mengurangi bentuk ”cepat asam” daripada bentuk patogenik. Mikobakteria cenderung lebih resisten terhadap agen kimia daripada bakteri lain karena sifat hidrofobik permukaan sel dan pertumbuhannya. Basil tuberkel reisten terhadap kekeringan dan bertahan hidup selama periode waktu yang lama dalam sputum kering. Variasi dapat terjadi dalam ko loni, pigmentasi, virulensi, temperatur petumbuhan yang optimal dan beberapa tanda pertumbuhan atau seluler lainnya (Fardiaz, 1992). Mikobakteria kaya akan lipid, bahan dari lilin dan fosfatida. Lapisan lilin pada dinding sel ini menyebabkan bakteri ini tahan terhadap keadaan di luar tubuh induk semang. Bakteri dapat tahan berbulan-bulan di luar tubuh induk semang, jika terbungkus eksudat, tinja, dalam cairan atau dalam jaringan organ tubuh yang membusuk. Dalam sel, lipid secara meluas berikatan dengan protein dan polisakarida. Muramil dipeptida (dari peptidoglikan) yang diperkaya dengan asam mikolat dapat menyebabkan nekrosis kaseosa. Lipid pada beberapa perluasan bertanggung jawab terhadap kecepatan asam, yang terganggu pada integritas dinding sel dan kehadiran lipid tertentu. Kecepatan asam juga hilang setelah sonikasi sel mikobakteria (Mudihardi, 2005). Cara diagnosa penyakit TBC dengan menggunakan pendekatan mikrobiologis adalah dengan pewarnaan Bakteri Tahan Asam (BTA). Pewarnaan Bakteri Tahan Asam (BTA) menggunakan beberapa teknik atau metode pewarnaan. Teknik pewarnaan tersebut antara lain Tan Thiam Hok (Kinyoun Gabber), Ziehl-Neelsen, dan Fluorokrom. Metode Ziehl-Neelsen merupakan pewarnaan standar untuk mengamati M. tuberculosis (Karuniawati et al.,2005). Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen, yaitu dengan menggunakan zat warna carbol fuchsin 0,3 %, asam alkohol 3 %, dan methylen blue 0,3%. Pada pemberian warna pertama, yaitu carbol fuchsin, BTA bersifat mempertahankannya. Carbol fuchsin merupakan fuksin basa yang dilarutkan dalam larutan fenol 5 %. Larutan ini memberikan warna merah pada sediaan dahak. Fenol digunakan sebagai pelarut untuk membantu pemasukan zat warna ke dalam sel bakteri sewaktu proses pemanasan. Fungsi pemanasan untuk melebarkan pori-pori lemak BTA sehingga carbol fuchsin dapat masuk sewaktu BTA dicuci dengan larutan pemucat, yaitu asam alkohol, maka zat warna pertama tidak mudah dilunturkan. Bakteri kemudian dicuci dengan air mengalir untuk menutup pori-pori dan menghentikan pemucatan. BTA akan terlihat berwarna merah, sedangkan bakteri yang tidak tahan asam akan melarutkan carbol fuchsin dengan cepat sehingga sel bakteri tidak berwarna. Setelah penambahan zat warna kedua yaitu methylen blue, bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru (Lay, 1994). Menurut Entjang (2003), pada pewarnaan bakteri dengan metode Ziehl-Neelsen dapat menggolongkan bakteri menjadi dua, yaitu : 1. Bakteri yang berwarna merah dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut bakteri tahan asam (acid fast ). 2. Bakteri yang berwarna biru dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut bakteri tidak tahan asam (non acid fast ). Teknik pewarnaan Tan Thiam Hok (Kinyoun-Gabber) menggunakan larutan Kinyoun dan Gabber. Komposisi larutan Kinyoun yaitu fuchsin basis 4g, fenol 8ml, alkohol 95% 20ml, H2O destilata (100ml) dan larutan gabbett yaitu methylen blue 1gr, H 2SO4 96 % 20 ml, alkohol absolut 30 ml, dan H2O destilata 50 ml. Pewarnaan yang lain yaitu pewarnaan Fluorokrom (Auramine O). Sampel atau sediaan direndam dalam larutan Auramine (Merck) dan dibiarkan
-
selama 15 menit lalu dicuci dengan akuades dan dikeringkan. Setelah itu, sediaan tadi direndam dalam asam alkhohol, dibiarkan selama 2 menit dan dicuci dengan akuades dan dikeringkan. Setelah kering sediaan direndam dalam poasium permanganat 0,5 %, dibiarkan selama 2 menit lalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan di udara (Kurniawati et al., 2005). Metode pewarnaan yang digunakan dalam praktikum kali ini yaitu Ziehl-Neelsen. Metode ini digunakan karena cukup sederhana dan mempunyai sensitivitas serta spesifitas yang cukup tinggi. Spesifitas dan sensitivitas yang tinggi sebenarnya dimiliki oleh metode fluorokrom. Bakteri yang terwarnai menunjukkan warna yang kontras dengan lingkungannya dan tidak membutuhkan perbesaran sampai 1000x sehingga bisa mempercepat waktu. Akan tetapi, alat yang digunakan tidak ada yaitu mikroskop fluorescens (Kurniawati et al., 2005). Larutan kimia yang digunakan pada praktikum kali ini adalah alkohol asam 3% , carbol fuchsin 0,3%, serta methylen blue 0,3% yang masing-masing mempunyai fungsi antara lain asam alkohol digunakan sebagai peluntur, carbol fuchsin mempunyai fungsi membuka lapisan lilin agar menjadi lunak sehingga cat dapat menembus masuk ke dalam sel bakteri M. tuberculosis. Methylen blue berfungsi sebagai cat lawan dan pada pemberian methylen blue pada bakteri akan tetap berwarna merah dengan latar belakang biru atau hijau (Jutono dkk ., 1980). Hasil praktikum kemarin diperoleh bahwa sputum yang diambil oleh kelompok 1 bernilai positif 2. Hal itu dikarenakan ditemukan bakteri basil berwarna merah berjumlah 2 buah dalam 1 LP dalam sediaan apus yang diamati di bawah mikroskop. Hal ini sesuai dengan standar yang terdapat dalam IUATLD ( International Union Against Tuberculosis Lung Disease) seperti berikut : Negatif : Tidak dijumpai adanya BTA Positif : Ditemukan 1-9 BTA/100 LP Positif 1 : Ditemukan 10-99 BTA/100 LP Positif 2 : Ditemukan 1-10 BTA/1 LP Positif 3 : Ditemukan lebih dari 10 BTA/1 LP Berikut ini adalah gambar hasil praktikum yang menunjukkan adanya Mycobacterium tuberculosis. A. Kesimpulan Berdasarkan hasil dan pembahasan di atas, maka dapat diambil kesimpulan sebagai berikut :
1. Teknik pewarnaan bakteri tahan asam (BTA) ada tiga yaitu Tan Thiam hok (Kinyoun Gabber), Ziehl-Neelsen, dan Fluorokrom. 2. Mycobacterium tuberculosis dapat diisolasi dari sputum penderita TBC dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen. Metode ini menggunakan carbol fuchsin 0,3 %, alkohol asam 3 %, dan methylen blue 0,3%. Bakteri akan tetap berwarna merah dengan latar belakang biru.
3. Sediaan sputum pada kelompok satu menunjukkan hasil positif karena ditemukannya bakteri tersebut dalam sediaan yang diamati.
DAFTAR REFERENSI
Ball, A.S. 1997. Bacterial Cell Culture : Essential Data. John Wiley & Sons, New York. Chivers, D.J., Ford, E.H.R. 1978). Recent Advances in Primatology. Vol. 4 Medicine. Academic Press. London. Clifton, C. E. 1958. Introduction to the Bacteria Second Edition. McGraw-Hill Book Co. Inc., New York, Toronto, London, and Kogakusha Co. Ltd., Tokyo. Dwidjoseputro. 1989. Dasar-dasar Mikrobiologi. Djambatan, Malang. Entjang, I. 2003. Mikrobiologi dan Parasitologi untuk Akademi Keperawatan dan Sekolah Tenaga Kesehatan Yang Sederajat . Citra Aditya Bakti, Bandung. Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan. PT. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta. Jawetz, Melnick, Adelberg’s. 2001. Mikrobiologi Kedokteran. Salemba Medika, Jakarta. Jutono, Soedono, S., S. Hartanti, Suhandi, D. S., K. Soesanto. 1980. Analisis Praktikum Mikrobiologi Umum untuk Perguruan Tinggi. UGM Press, Yogyakarta. Kurniawati et al., 2005. Perbandingan Tan Thiam Hok, Ziehl Neelsen, dan fluorokrom sebagai Metode Pewarnaan Basil Tahan Asam untuk Pemeriksaan Mikroskopis Sputum. Makara Kesehatan. Vol 9, June 2005 : 29-33. Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada, Jakarta. Pelczar, M. J., E. C. S. Chan. 1988. Dasar-Dasar Mikrobiologi Jilid 2. UI Press, Jakarta. Sari, Y.S. 2004. Penyakit Infeksius yang menular Melalui Udara pada Orangutan (Pongo pygmaeus). Karya Tulis. FKH-IPB. Bogor. Thomas Dormandy (1999). The White Death: A History of Tuberculosis. ISBN 0-8147-1927-9 HB ISBN 1-85285-332-8 PB
PEWARNAAN BTA ( Zeihl neelsen)
PEWARNAAN BTA
( BASIL TAHAN ASAM ) Metode Zeihl-Neelsen IV. Dasar Teori Salah satu bahan yang digunakan untuk mendiagnosa adalah dahak atau sputum. Dahak yang diperiksa paling sedikit 3-5 cc. Jika jumlah kuman kurang dari 5000 dalam 1 cc dahak, maka itu tidak akan kelihatan di bawah mikroskop. Dahak yang diambil ialah dahak yang kental kuning kehijauan sebanyak 3-5 cc, dengan waktu pengambilan sebagai berikut : Dahak sewaktu, penderita datang berobat dengan keluhan apa saja ke poliklinik. Dahak pagi, yang diambil besok paginya begitu bangun tidur Dahak sewaktu, yang diambil sewaktu penderita mengantar dahak pagi tersebut. Ludah tidak dapat diperiksa karena ludah berasal dari kelenjar dalam rongga mulut. Biasanya dalam ludah tidak terdapat kuman TB. Bakteri tahan asam adalah bakteri yang mempertahankan zat warna karbol-fuchsin (fuchsin basayang dilarutkan dalam suatu campuran phenol-alkohol-air) meskipun dicuci dengan asam klorida dalam alkohol. Sediaan sel bakteri pada gelas alas disiram dengan cairan karbol fuchsin kemudian dipanaskan sampai keluar uap. Setelah itu, zat warna dicuci dengan asam alkohol dan akhirnya diberi warna kontras (biru atau hijau). Bakteri-bakteri tahan asam (spesies Mycobakterium dan beberapa Actinomycetes yang serumpun) berwarna merah dan yang lain-lain akan berwarna sesuai warna kontras. Mycrobakteria adalah bakteri aerob berbentuk batang, yang tidak membentuk spora. Walaupun tidak mudah diwarnai bakteri ini tahan terhadap penghilangan warna (deklorisasi) oleh asam atau alkohol dan karena itu dinamakan basil tahan asam. Ciri –ciri khas Mycobakterium tuberculosis dalam jaringan, basil tuberkel merupakan batang ramping lurus berukuran kira-kira 0,4 x 3 µm. Pada perbenihan buatan terlihat bentuk coccus dan filamen. Mycobakteria tidak dapat diklasifikasikan sebagai gram positif atau gram negatif. Sekali diwarnai dengan zat warna basa, warna tersebut tidak dapat dihilangkan dengan alkohol, meski dibubuhi dengan iodium. Basil tuberkel yang sebenarnya ditandai oleh sifat tahan asam misalnya 95 % etil alkohol yang mengandung 3 % asam hidroklorida (asam alkohol) dengan cepat akan menghilangkan warna semua bakteri kecuali Mycobakteria. Sifat tahan asam ini bergantung pada integritas struktur selubung berlilin. Pada dahak atau irisan jaringan, Mycobakteria dapat diperlihatkan karena memberi fluoresensi
kuning jingga setelah diwarnai dengan zat warna fluorokrom (misalnya auramin, rodamin). VI. Metode Kerja : 1. Pakailah masker 2. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. 3. Diambil kaca sediaan yang bersih, bebas lemak dan tidak ada goresan. 4. Disiapkan sebuah kaca sediaan yang diberi tanda ukuran 2X3 cm sebagai pola. 5. Diletakkan kaca pola dibawah kaca sediaan. 6. Lampu speritus dinyalakan dan ose dipanaskan sampai membara mulai ujung sampai kepangkal. 7. Dengan menggunakan ose steril lalu diambil bagian sputum yang kental berwarna putih kekuninggan atau putih kehijauan, lalu diletakkan pada kaca sediaan. 8. Sputum diratakan 9. Kemudian tangkai ose digoyangkan pelan-pelan untuk melepaskan sisa partikel sputum yang melekat pada ose. 10. Letakkan ose berdekatan pada api spiritus, setelah kering barulah dibakar sampai pijar. 11. Keringkan sediaan pada suhu kamar, jangan dikeringkan di atas nyala api. sediaan dilewatkan diatas nyala api lampu speritus sebanyak 3 X selama 3-5 detik. 12. Letakkan sediaan di atas rak pewarnaan dengan apusan menghadap ke atas. 13. Tuangkan Carbol Fuchsin sampai menutupi seluruh permukaan kaca sediaan. 14. Panaskan kaca sediaan secara hati-hati dengan caara melewatkan nyala api pada bagian bawah kaca sehingga keluar uap(jangan sampai mendidih) selama 3 menit. 15. Sediaan dibiarkan hingga dinginn selama 5 menit. 16. Sediaan dicuci dengan air mengalir. 17. Tuangkan asam alkohol 70% di atas kaca sediaan sampai warna merah dari fuchsin hilang. 18. Sediaan dicuci dengann air mengalir 19. Tuangkan larutan methylen blue 0,3% diatas sediaan dan biarkan selama 10-20 detik atau larutan methylen blue 0,1% selama 1 menit. 20. Sediaan dicuci dengan air mengalir dan keringkan pada suhu kamar. 21. Sediaan yang sudah kering diperiksa dibawah mikroskop. 22. Teteskan satu tetes minyak emersi diatas sediaan, periksa dengan okuler 10X dan objektif 100X.
23. Carilah basil tahan asam (BTA) yang berwarna merah dengan latar belakang biru. 24. Periksa paling sedikit 100 lapangan pandang dengan cara menggeserkan sediaan dari kiri ke kanan atau dari kanan ke kiripada garis lurus. 25. Foto hasil pengamatan dan buatkan laporan VII. Pembahasan Pewarnaan Basil Tahan Asam (BTA) merupakan uji makroskopik yang memiliki nilai diagnosa yang tinggi karena pemeriksaan tersebut dapat memangkas isolasi bakteri yang akan memakan waktu sampai 8 minggu. Cara pengambilan spesimen harus di perhatikan, contohnya dalam pengambilan sampel darah atau dahak / sputum bukan hanya harus dilakukan secara aseptik untuk menghindari kontaminasi, namun juga harus diperhatikan waktu pengambilannya, karena infeksi bakteri memiliki siklus tertentu. Hati-hati dengan hasil false positive dan false negative. False positif maksudnya dalam sampel seharusnya tidak ditemukan bakteri namun dalam pelaporan / pengerjaan ditemukan bakteri. Hal ini bisa terjadi bila dalam pengerjaan terjadi kontaminasi. False negatif maksudnya dalam sampel seharusnya terdapat bakteri namun dalam pengerjaan / pelaporan tidak ditemukan bakteri. Hal ini bisa terjadi karena kurangnya ketelitian dalam penggunaan ose. Dinding bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin dan lemak yang sukar ditembus cat. Oleh karena pengaruh fenol dan pemanasan maka lapisan lilin dan lemak itu dapat ditembus cat basic fuchsin. Pada waktu pencucian lapisan lilin dan lemak yang terbuka akan merapat kembali. Pada pencucian dengan asam alkohol warna fuchsin tidak dilepas. Sedangkan pada bakteri tidak tahan asam akan luntur dan mengambil warna biru dari methylen blue. Pembacaan hasil dilakukan dengan menggunakan skala IUATLD sebagai berikut : • Tidak ditemukan BTA dalam 100 lapangan pandang : Negatif • Ditemukan 1-9 BTA/ 100 lapangan pandang : Ditulis jumlah kuman yang ditemukan. • Ditemukan 10-99 BTA/ 100 lapangan pandang : + (1+) • Ditemukan 1-10 BTA/ 1 lapangan pandang : ++ (2+) Ditemukan > 10 BTA/ 1 lapangan pandang : +++ (3+) VIII. Hasil Pengamatan IX. Kesimpulan Setelah dilakukan pewarnaan di laboratorium secara mikroskopik, dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen dapat dilakukan identifikasi bakteri
tahan asam, dimana bakteri akan terbagi menjadi dua golongan: Bakteri tahan asam, adalah bakteri yang pada pengecatan Ziehl-Neelsen tetap mengikat warna pertama, tidak luntur oleh asam dan alkohol, sehingga tidak mampu mengikat warna kedua. Dibawah mikroskop tampak bakteri berwarna merah dengan warna dasar biru muda. Bakteri tidak tahan asam, adalah bakteri yang pada pewarnaan ZiehlNeelsen, warna pertama, yang diberikan dilunturkan oleh asam dan alkohol, sehingga bakteri akan mengikat warna kedua. Dibawah miskroskop tampak bakteri berwarna biru tua dengan warna dasar biru yang lebih muda. Interpretasi hasil : BTA : warna merah dan Non BTA : warna biru
PEWARNAAN TAHAN ASAM A. Tujuan
1. Mempelajari dan mengenal cara pewarnaan tahan asam. 2. Melihat bentuk bakteri tahan asam dan tidak tahan asam. B. Landasan teori
Bakteri tahan asam adalah bakteri yang mempertahankan zat warna karbol-fuchsin (fuchsin basayang dilarutkan dalam suatu campuran phenol-alkohol-air) meskipun dicuci dengan asam klorida dalam alkohol. Sediaan sel bakteri pada gelas alas disiram dengan cairan karbol fuchsin kemudian dipanaskan sampai keluar uap. Setelah itu, zat warna dicuci dengan asam alkohol dan akhirnya diberi warna kontras (biru atau hijau). Bakteri-bakteri tahan asam (spesies Mycobakterium dan beberapa Actinomycetes yang serumpun) berwarna merah dan yang lainlain akan berwarna sesuai warna kontras. Mycrobakteria adalah bakteri aerob berbentuk batang, yang tidak membentuk spora. Walaupun tidak mudah diwarnai bakteri ini tahan terhadap penghilangan warna (deklorisasi) oleh asam atau alkohol dan karena itu dinamakan basil tahan asam. Ciri –ciri khas Mycobakterium tuberculosis dalam jaringan, basil tuberkel merupakan batang ramping lurus berukuran kira-kira 0,4 x 3 µm. Pada perbenihan buatan terlihat bentuk coccus dan filamen. Mycobakteria tidak dapat diklasifikasikan sebagai gram positif atau gram negatif. D. Cara Kerja
1. Menyiapkan 2 buah kaca objek yang bersih.
2. Membuat film. 3. Fiksasi. 4. Memberikan zat warna utama safranin. 5. Fikasasi. 6. Mendinginkan, kemudian cuci dengan air mengalir. 7.
Mencuci dengan H2S04 sampai larutan pencucinya tidak berwarna lagi dan biarkan sampai kering.
8. Setelah agak kering meneteskan metilen blue 1-2 menit. 9. Membuang kelebihan zat warna. 10. Membilas dengan air mengalir dan keringkan. 11. Mengamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10 X 100. Bakteri “acid fast” berwarna merah dan “ non acid fast” berwarna biru. E. Hasil Pengamatan
1. Hasil pengamatan bakteri E.Coli
Pembesaran 10x
Pembesaran 40x
2. Hasil pengamatan bakteri B. Substilis
Pembesaran 10x
Pembesaran 40x
F. Pembahasan
Adakalanya, setelah suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer, maka semua zat warna terhapus. Akan tetapi ada juga preparat yang tahan asam encer, misalnya bakteri-bakteri TBC dan basil-basil berspora. Maka dapat dikatakan bahwa itu adalah bakteri tahan asam. Ini merupakan cirri khas bagi suatu spesies.
Untuk menetukan sifat bakteri yang termasuk bakteri tahan asam dan bakteri tidak tahan asam harus diwarnai dengan pewarnaan khusus. Pada umumnya, bakteri tahan asam merupakan bakteri yang lapisan paling luar selnya terdiri dari lapisan lilin, sehingga menyebabkan zat warna sukar masuk ke dalam sel bakteri. Untuk mewarnainya maka lapisan lilin pada sel itu harus dihilangkan, yaitu dengan cara pemanasan yang dimaksudkan supaya lilinnya meleleh, sehingga sel tersebut bias dengan mudah menerima zat warna. Selain sukar menerima zat warna, bakteri than asam juga sukar menyerap bahan penghilang zat warna (pencuci), sehingga walaupun dicuci dengan larutan asam encer, sel bakteri ini akan tetap mengikat zat warna yang telah masuk. Sedangkan hasil bakteri yang telah didapat menyerap biru saja, ini berarti bakteri merupakan bakteri tidak tahan asam. Bakteri tahan asam adalah bakteri yang mempertahankan zat warna karbol-fuchsin (fuchsin basayang dilarutkan dalam suatu campuran phenol-alkohol-air) meskipun dicuci dengan asam klorida dalam alkohol. Bakteri tahan asam (BTA) merupakan bakteri yang memiliki ciri-ciri yaitu berantai karbon (C) yang panjangnya 8 - 95 dan memiliki dinding sel yang tebal yang terdiri dari lapisan lilin dan asam lemak mikolat, lipid yang ada bisa mencapai 60% dari berat dinding sel. Bakteri yang termasuk BTA antara lain Mycobacterium tuberculose, Mycobacterium bovis,
Mycobacterium
leprae,
Nocandia
meningitidis,
dan
Nocandia
gonorrhoeae.
Mycobacterium tuberculose adalah bakteri patogen yang dapat menyebabkan penyakit tuberculose, dan bersifat tahan asam sehingga digolongkan sebagai bakteri tahan asam (BTA). Penularan Mycobacterium tuberculose terjadi melalui jalan pernafasan (Syahrurachman, 1994). Pewarnaan Ziehl Neelson atau pewarnaan tahan asam memilahkan kelompok Mycobacterium dan Nocandia dengan bakteri lainnya. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam karena dapat mempertahankan zat warna pertama (carbol fuchsin) sewaktu dicuci dengan larutan pemucat (alkohol asam). Larutan asam terlihat berwarna merah, sebaliknya pada bakteri yang tidak tahan asam karena larutan pemucat (alkohol asam) akan melakukan reaksi dengan carbol fuchsin dengan cepat, sehingga sel bakteri tidak berwarna (Lay, 1994). Uji bakteri tahan asam (BTA) pada praktikum kali ini menggunakan prosedur pewarnaan Ziehl Neelson yaitu dengan memberi larutan pewarna carbol fuchsin, alkohol asam, dan methylen blue. Bakteri genus mycobacterium dan beberapa spesies nocardia pada dinding selnya mengandung banyak zat lipoid (lemak) sehingga bersifat permiable dengan pewarnaan biasa.
Bakteri tersebut bersifat tahan asam (+) terhadapa pewarnaan tahan asam. Pewarnaan tahan asam dapat digunakan untuk membantu menegakkan diagnosa tuberkulosis. Pewarnaan tahan asam menggunakan larutan ziehl-Neelsen A (cat karbol fuchsin), Ziehl-Neelsen B (alkohol asam :HCL 3% dalam metanol 95%) dan ziehl –neelsen C (cat biru metilen). Hasil pewarnaan maka bakteri tahan asam akan berwarna merah dan bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru. G. Kesimpulan
Adakalanya, setelah suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer, maka semua zat warna terhapus. Akan tetapi ada juga preparat yang tahan asam encer, misalnya bakteri-bakteri TBC dan basil-basil berspora. Maka dapat dikatakan bahwa itu adalah bakteri tahan asam. Ini merupakan cirri khas bagi suatu spesies. Pewarnaan Ziehl Neelson atau pewarnaan tahan asam memilahkan kelompok Mycobacterium dan Nocandia dengan bakteri lainnya. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam karena dapat mempertahankan zat warna pertama (carbol fuchsin) sewaktu dicuci dengan larutan alkohol asam. Larutan asam terlihat berwarna merah, sebaliknya pada bakteri yang tidak tahan asam karena larutan pemucat akan melakukan fuksin karbol dengan cepat, sehingga sel bakteri tidak berwarna
DAFTAR PUSTAKA
Jutono, dkk. (1980). Pedoman Praktikum Mikrobiologi Umum Untuk Perguruan Tinggi. Yogyakarta: Departemen Mikrobiologi Fakultas Pertanian UGM. [25 Oktober 2012] Lay, B. W. (1994). Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT. Raga Grafindo Persada. [25 Oktober 2012] anonim.
(2012).
pewarnaan
bakteri
tahan
asam.
[online].
tersedia
:
http://analisbantul.blogspot.com/2012/09/pewarnaan-bta-bakteri-tahan-asam.html. [ 15 januari 2013].
PENDAHULUAN Salah satu bahan yang digunakan untuk mendiagnosa adalah dahak atau sputum. Dahak yang diperiksa paling sedikit 3-5 cc. Jika jumlah kuman kurang dari 5000 dalam 1 cc dahak, maka itu tidak akan kelihatan di bawah mikroskop. Dahak yang diambil ialah dahak yang kental kuning kehijauan sebanyak 3-5 cc, dengan waktu
pengambilan sebagai berikut : • Dahak sewaktu, penderita datang berobat dengan keluhan apa saja ke poliklinik. • Dahak pagi, yang diambil besok paginya begitu bangun tidur. • Dahak sewaktu, yang diambil sewaktu penderita mengantar dahak pagi tersebut. Ludah tidak dapat diperiksa karena ludah berasal dari kelenjar dalam rongga mulut. Biasanya dalam ludah tidak terdapat kuman TB. Bakteri tahan asam adalah bakteri yang mempertahankan zat warna karbol-fuchsin (fuchsin basayang dilarutkan dalam suatu campuran phenol-alkohol-air) meskipun dicuci dengan asam klorida dalam alkohol. Sediaan sel bakteri pada gelas alas disiram dengan cairan karbol fuchsin kemudian dipanaskan sampai keluar uap. Setelah itu, zat warna dicuci dengan asam alkohol dan akhirnya diberi warna kontras (biru atau hijau). Bakteri-bakteri tahan asam (spesies Mycobakterium dan beberapa Actinomycetes yang serumpun) berwarna merah dan yang lainlain akan berwarna sesuai warna kontras. Mycrobakteria adalah bakteri aerob berbentuk batang, yang tidak membentuk spora. Walaupun tidak mudah diwarnai bakteri ini tahan terhadap penghilangan warna (deklorisasi) oleh asam atau alkohol dan karena itu dinamakan basil tahan asam. Ciri –ciri khas Mycobakterium tuberculosis dalam jaringan, basil tuberkel merupakan batang ramping lurus berukuran kira-kira 0,4 x 3 µm. Pada perbenihan buatan terlihat bentuk coccus dan filamen. Mycobakteria tidak dapat diklasifikasikan sebagai gram positif atau gram negatif. Sekali diwarnai dengan zat warna basa, warna tersebut tidak dapat dihilangkan dengan alkohol, meski dibubuhi dengan iodium. Basil tuberkel yang sebenarnya ditandai oleh sifat tahan asam misalnya 95 % etil alkohol yang mengandung 3 % asam hidroklorida (asam alkohol) dengan cepat akan menghilangkan warna semua bakteri kecuali Mycobakteria. Sifat tahan asam ini bergantung pada integritas struktur selubung berlilin. Pada dahak atau irisan jaringan, Mycobakteria dapat diperlihatkan karena memberi fluoresensi kuning jingga setelah diwarnai dengan zat warna fluorokrom (misalnya auramin, rodamin). PROSEDUR KERJA Metode : Zeihl neelsen Tujuan : Untuk mencari BTA Prinsip : Dinding bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin dan lemak yang sukar ditembus cat. Oleh karena pengaruh fenol dan pemanasan maka lapisan lilin dan lemak itu dapat ditembus cat basic fuchsin. Pada waktu pencucian lapisan lilin dan lemak yang terbuka akan merapat kembali. Pada pencucian dengan asam alkohol warna fuchsin tidak dilepas. Sedangkan pada bakteri tidak tahan asam akan luntur dan mengambil warna biru dari methylen blue.
Prosedur Pembuatan Sediaan • Diambil kaca sediaan yang bersih, bebas lemak dan tidak ada goresan. • Disiapkan sebuah kaca sediaan yang diberi tanda ukuran 2X3 cm sebagai pola. • Diletakkan kaca pola dibawah kaca sediaan. • Lampu speritus dinyalakan dan ose dipanaskan sampai membara mulai ujung sampai kepangkal. • Dengan menggunakan ose steril lalu diambil bagian sputum yang kental berwarna putih kekuninggan atau putih kehijauan, lalu diletakkan pada kaca sediaan.
• Sputum diratakan seperti terlihat pada gambar : • Dimasukkan ose kedalam botol yang berisi pasir dan olkohol 70 %(tinggi alkohol ± 3 cm diatas pasir). Kemudian tangkai ose digoyangkan pelan-pelan untuk melepaskan sisa partikel sputum yang melekat pada ose. • Letakkan ose berdekatan pada api spiritus, setelah kering barulah dibakar sampai pijar. • Keringkan sediaan pada suhu kamar, jangan dikeringkan di atas nyala api.sediaan dilewatkan diatas nyala api lampu speritus sebanyak 3 X selama 3-5 detik. Prosedur Pewarnaan • Letakkan sediaan di atas rak pewarnaan dengan apusan menghadap ke atas. • Tuangkan Carbol Fuchsin sampai menutupi seluruh permukaan kaca sediaan. • Panaskan kaca sediaan secara hati-hati dengan caara melewatkan nyala api pada bagian bawah kaca sehingga keluar uap(jangan sampai mendidih) selama 3 menit. • Sediaan dibiarkan hingga dinginn selama 5 menit. • Sediaan dicuci dengan air mengalir. • Tuangkan asam alkohol 3% di atas kaca sediaan sampai warna merah dari fuchsin hilang. • Sediaan dicuci dengann air mengalir • Tuangkan larutan methylen blue 0,3% diatas sediaan dan biarkan selama 10-20 detik atau larutan methylen blue 0,1% selama 1 menit. • Sediaan dicuci dengan air mengalir dan keringka pada suhu kamar. Prosedur Pembacaan dan Interpretasi Hasil • Sediaan yang sudah kering diperiksa dibawah mikroskop. • Teteskan satu tetes minyak emersi diatas sediaan, periksa dengan okuler 10X dan objektif 100X. • Carilah basil tahan asaam (BTA) yang berwarna merah dengan latar belakang biru. • Periksa paling sedikit 100 lapangan pandang dengan cara menggeserkan sediaan dari kiri ke kanan atau dari kanan ke kiripada garis lurus. • Pembacaan hasil dilakukan dengan menggunakan skala IUATLD sebagai berikut : 1. Tidak ditemukan BTA dalam 100 lapangan pandang : Negatif 2. Ditemukan 1-9 BTA/ 100 lapangan pandang : Ditulis jumlah kuman yang ditemukan. 3. Ditemukan 10-99 BTA/ 100 lapangan pandang : + (1+) 4. Ditemukan 1-10 BTA/ 1 lapangan pandang : ++ (2+) 5. Ditemukan > 10 BTA/ 1 lapangan pandang : +++ (3+) Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorbsiatnupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme karena zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme dengan lingkungannya ditingkatkan. Pewarnaan Gram merupakan pewarnaan diferensial yang bayak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi guna pencirian don identifiknsi bakteri. Pewarnaan gram memilahkan bakteri menjadi kelompok Gram positif dam Gram negatif. Bakteri Gram positif berwarna ungu karena bnkteri tersebut mengiknt kompleks zat warna kristal ungu-iodium, sednngkan bakteri Gram negntif berwnrna merah karena mengikat zat warna sekunder yang berwarna merah.
Perbedaan hasil dalam pewarnaan ini disebabkan perbedaan struktur dinding sel bakteri don perbedaan kandungan asam ribonukleat antnara bakteri Gram positif don Gram negatif. Pewarnaan dengan zat warna yang mengandung yodium menyebabkan amilopektin berwarna biru atau keunguan, sedangkan glikogen berwarna merah kecoklatan atau merah keunguan. Dengan melakukan pewarnaan sangat memungkinkan kita untuk melihat bakteri dengan jelas, tetapi tidak dapat membedakan jenis-jenis bakteri yang berbeda dengan morfologi yang soma. Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokos, dan spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplokokus, sampai sthapylococcus (bentukknya mirip buah anggur). Khusus pada spiral hanya di bagi dua yaitu setengah melengkung dan tidak melengkung. Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negative ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah (textbook, 2008). Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat di identifikasi dengan mudah, selain itu, ada endospora adalah organism yang dibentuk dalam kondisi yang stress karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut dilingkungan sampai kondisi menjadi baik (ncbi, 2008). Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahan identifikasi data apakah gram positif atau gram negative sehingga diperlukan adanya praktikum ini dilakukan agar mengetahui jalanya mekanisme pewarnaan gram. Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa zat warna safranin atau air fuchsin. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumonia. Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif (berwarna ungu/biru) dan bakteri Gram negatif (berwarna merah). Perbedaan dua kelompok bakteri ini didasarkan pada kemampuan sel menahan (mengikat) warna ungu dari kristal violet selama proses dekolorisasi oleh alkohol. Bakteri gram positif tidak mengalami dekolorisasi karena tetap mengikat warna ungu kristal violet dan pada tahap akhir
pengecatan tidak terwarnai safranin. Bakteri gram negatif mengalami dekolorisasi oleh alkohol dan pada tahap akhir pengecatan terwarnai menjadi merah oleh safranin. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram. Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru. Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek. Menurut Pelzar et al (2005), macam-macam pewarnaan antara lain pewarnaan sederhana yaitu dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis yang sudah di fiksasi. Pewarnaan differentsial yaitu prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan diantara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba dari pewarnaan gram adalah teknik pewarnaan differensial digunakan untuk bakteri. Menurut Pratiwi (2009), stain merupakan gram-gram yang tersusun atas ion positif dan negative, yang salah satunya berwarna dan disebut kromofor (chromofor). Pewarnaan pada dasarnya adalah prosdur mewarnai mikroorganisme dengan menggunakan zat warna yang dapat menonjolkan strktur tertentu dari mikroorganisme yang ingin kita amati. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna krisktal violet dan karenanya akan tampak bewarna ungu tua dibawah mikroskop. Adapun bakteri gram negates akan kehilangan zat Kristal violet setelah dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat warna air tochsin atau safranin akan tampak merah. Perbedaan warna ini disebabkan olh perbedaan struktur kimiawi dinding selnya.(wapedia,2010)
Adakala suatu perlu diwarnai dua kali setelah zat warna yang pertama (ungu) terserap, maka sediaan dicuci dengan alkohol, kemudian ditumpangi dngan zat warna yang berlainan, yaitu dngan zat warna merah. Jika sediaan itu kemudian kita cuci dengan air lau dengan alkohol
maka dua kemungkinan dapat terjadi. Pertama, zat tambahan terhapus, sehingga yang tampak ialah zat warna asli (ungu). Dalam hal ini sediaan (bakteri) kita sebut gram positif. Kedua zat warna tambahan (merah) bertahan hingga zat warna asli tidak tampak. Dalam hal ini sediaan (bakteri) jika kita katakana gram negatif (Dwioseputro, 1984) Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4 -, CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagianbagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Pada bakteri gram positif menunjukkan warna biru ungu dan bakteri gram negatif berwarna merah. Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu : 1. Zat warna utama (violet kristal) Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama. 2. Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama. 3. Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol. Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini dibagi menjadi 2 kelompok, salah satu di antaranya, bakteri gram positif yang mempertahankan zat warna ungu Kristal dan karenanya tampak ungu tua. Kelompok yang lain, bakteri gram negatif, kehilangan ungu Kristal ketika dicucci dengan alkohol dan waktu diberi pewarna tandingan dengan warna merah safranin, tampak bewarna merah (Zubaidah,2006). Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna
untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka. Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negative mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu. Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm). Stuktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu : 1. Struktur dasar (dimiliki hamper semua jenis bakteri ) Meliputi : dinding sel, membrane plasma, sitoplasma, ribasom, DNA, dan granula penyimpanan. 2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu) Meliputi kapsul, flagellum, pilus, fimbria, klorosom, vakuola gas dan endospora Sthaplyococcus adalah bakteri gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni dan berbentuk seperti buah anggur. Pada tahun 1884, Rosenbach menjelaskan ada dua jenis warna staphlycoccus yaitu : sthapylococcus aureus yang berwarna kuning dan sthapylococcus albus yang berwarna putih. Beberapa karateristik yang dimiliki sthapylococcus aureus diantaranya hemolytic pada darah segar, catalase-oxidase-positif dan negatif, dapat tumbuh paa suhu erkisar antara 15 sampai 45 derajat dan lingkungan NaCl padakonsentrasi tinggi hingga 15 persen dan menghasilkan enzim coagulase. Selin itu, biasanya s. aeureus merupakan pathogen seperti bisul, styes dan furunculosis beberapa infeksi (radang paru-paru, radang kelenjar dada, radang urat darah, meningitis, saluran kencing osteomyelitis dan endocarditis) serta menyebabkan keracunan makanan yaitu dengan melepaskan enterotoxins
menjadi makanan sehingga menjadi toksik dengan melepaskan super antigens ke dalam aliran darah (kenneath, 2008) Menurut kenneath (2008), Escherichia coli termasuk dalam family Enterobacteraceae yang termasuk gram negative dan berbentuk batangyang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar
di
dalam
usus
manusia,
yaitu
membatu
sistem
pencernaan
manusia
dan
melindunginya darbakteri pantogen, akn tetap pada strain baru dari e. coli merupakan pathogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic ( hus). Peranan yanag menguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indicator pada percemaraan air serta mendeteksi patoge pada feses manusia yang disebabkan oleh salmonella typi.( mikrolibrary, 2008). Endospora adalah organism yang dibentuk dalam kondisi yang stress dan kurang nutrisi, yang memiliki kemunginan untuk tetap berlanjut dilingkungan sampai kondisi menjadi baik (ncbi, 2008). Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif yaitu: Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu: - Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer. - Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam - lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat. - Kurang rentan terhadap senyawa penisilin. - Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet. - Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana. - Tidak resisten terhadap gangguan fisik. - Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat - Peka terhadap streptomisin - Toksin yang dibentuk Endotoksin
-
Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu: Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
- Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat. -
Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
-
Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
-
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
-
Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
-
Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut Tidak peka terhadap streptomisin
-
Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, termasuk bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk melihat dan mengamati bentuk sel bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, sehingga untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Struktur di dalam sel pada tempat-tempat yang dibentuk oleh spesies ini, disebut endospora. Endospora dapat bertahan hidup dalam keadaan kekurangan nutrien, tahan terhadap panas, kekeringan, radiasi UV serta bahanbahan kimia. Ketahanan tersebut disebabkan oleh adanya selubung spora yang tebal dan keras. Sifat-sifat ini menyebabkan dibutuhkannya perlakuan yang keras untuk mewarnainya. Hanya bila diperlukan panas yang cukup, pewarna yang sesuai dapat menembus endospora. Tetapi sekali pewarna memasuki endospora, sukar untuk dihilangkan. Ukuran dan letak endospora di dalam sel merupakan ciri-ciri yang digunakan untuk membedakan spesies-spesies bakteri yang membentuknya. Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies. Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel microbe atau bagian-bagian sel microbe disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan pengecatan kapsul. Macam-macam pewarnaan: 1. Pewarnaan negatif - Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang - Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta Cara pewarnaan negatif - Sediaan hapus → teteskan emersi → lihat dimikroskop
Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina. 2. Pewarnaan sedehana - Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) - Tujuan hanya untuk melihat bentuk sel Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnapewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). 3. Pewarnaan Tahan Asam Pewarnaan ini dilakukan pada bakteri tahan asam dalam proses warna akibat Alkohol-asam, dan penggunaan pembalik warna pada tahap akhir dari proses sehingga menghasilkan warna merah. 4. Pewarnaan structural/khusus - Untuk mewarnai struktur khusus/tertentu dari bakteri→ kapsul, spora, flagel dll i)
Pewarnaan kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang. Yang berwana biru gelap. ii)
Pewarnaan spora
Dinding spora relative tidak permeable, namun zat warna bias menembusnya dengan cara memanaskan preparat. iii)
Pewarnaan flagel
Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel. iv)
Pewarnaan nucleoid
Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk DNA. 5. Pewarnaan diferensial - menggunakan lebih dari satu macam zat warna - Tujuan untuk membedakan antar bakteri
- Contoh: Pewarnaan Gram, Pewarnaan Bakteri Tahan Asam Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya. Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram.
TEKNIK PEWARNAAN MIKROORGANISME
A. PENDAHULUAN Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa Pewarna asam dapat tejadi karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna. Pewarna asam ini disebut pewrna negatif. Contoh pewarna asam misalnya : tinta cina, larutan Nigrosin, asam pikrat, eosin dan lainlain. Pewarnaan basa bisa terjadi biasenyawa pewarna bersifat positif, sehingga akan diikat oleh dinding sel bakteri dan sel bakteri jadi terwarna dan terlihat. Contoh dari pewarna basa misalnya metilin biru, kristal violet, safranin dan lain-lain. Teknik pewarnaan asam basa ini hanya menggunakan satu jenis senyawa pewarna, teknik ini disebut pewarna sederhana. Pewarnaan sederhana ini diperlukan untuk mengamati morfologi, baik bentukmaupun susunan sel. Teknik pewarnaan yang lain
adalah pewarnaan diferensial, yang menggunakan senyawa pewarna yang lebih dari satu jenis. Diperlukan untuk mengelompokkan bakteri misalnya, bakteri gram positif dan bakteri gram negatif atau bakteri tahan asam dan tidak tahan asam. Juga diperlukan untuk mengamati struktur bakteri seperti flagela, kapsula, spora dan nukleus. Teknik pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang belkau yakni sebagai berikut: mempersiapkan kaca obyek. Kaca obyek ini harus bersih dan bebas lemak, untuk membuat apusan dari bakteri yang diwarnai. mempersiapkan apusan. Apusan yang baik adalah yang tipis dan kering, terlihat seperti lapisan yang tipis. Apusan ini dapat berasal dari biakan cair atau padat. Biakan Cair. Suspensi sel sebanyak satu atau dua mata jarum inokulasi diletakkan pada kaca obyek. Lalu diapuskan pada kaca obyek selebar ... cm. Biarkan mengering diudaraata diatas api kecil dengan jarak 25 cm. Biakan Padat. Bakteri yang dikultur pada medium padat tidak dapat langsung dibuat apusan seperti dari biakan cair, tapi harus diencerkan dulu. Letakkan setetes air pada kaca obyek, lalu denganjarum inokulasi ambil bakteri dari biakan padat, letakkan pada tetesan air dan apusan. Biarkan mengering diudara.• Fiksasi dengan pemanasan. Apusan bakteri pada akaca obyek bila tidak diletakkan secara kuat, dapat terhapus pada waktu proses pewarnaan lebih lanjut. Proses peletakan apusan pada kaca obyek dapat dilakukan diantaranyadengan cara memanaskan diatas api. B. DASAR TEORI -pewarnaan gram Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bilakomponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar. Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop cahaya terang biasa karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri, walaupun biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna. Bakteri sering diamati dalam keadaan olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup. Yang dimaksud dengan bakteri terwarnai adalah oganisme yang telah diwarnai dengan zat pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari (Volk dan Whleer, 1998). Sel-sel mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus pandang (transparan) bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa hingga sukar dilihat karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bias yang hampir sama dengan
indeks bias lingkungannya yang bersifat cair. Kontras antara sel dan latar belakangnya dapat dipertajam dengan cara mewarnai sel-sel tersebut dengan zatzat warna (Hadioetomo, 1990). Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna khusus diperlukan untuk melihat bentuk kapsul ataupun flagella, dan hal-hal terperinci tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, yang salah satu diantaranya berwarna (Volk dan Whleer, 1998). Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatka. Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll (Irawan, 2008). Banyak senyawa organik berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopik dan telah dikembangkan prosedur pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985) : - Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar. - Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme. - Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa. Langkah-langkah utama dalam persiapan spesimen mikroba untuk pemeriksaan mikroskopik adalah (Pelczar, 1986) : - Penempatan olesan atau lapisan spesimen pada kaca objek. - Fiksasi olesan pada kaca objek. - Aplikasi pewarna tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan pewarna atau reagen (pewarnaan diferensial. Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba, banyak dilakukan baik secara langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni). Tujuan dari pewarnaan tersebut adalah pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985) : - Mempermudah melihat bentuk jasad baik bakteri, r agi ataupun fungi. - Memperjelas ukuran dan bentuk jasad - Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad. - Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik dan kimia yang ada akan dapat diketahui. Pewarna yang digunakan pada umumnya berbentuk senyawa kimia khusus yang
akan memberikan reaksi kalu mengenai bagian tubuh jasad. Karena pewarnaan tersebut berbentuk ion yang bermuatan positif ataupun negative. Sel bakteri bermuatan mendekati negatif kalau dalam keadaan pH mendekati netral. Sehingga kalau kita memberikan pewarnaan yang bermuatan positif ataupun negatif (Suriawiria, 1985). Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif). Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya (Campbell dan Reece, 2005)). Pewarnaan Negatif. Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. Tapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif. Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan mewarnai lingkungan sekitarnya, sehingga sel tampak transparan dengan latar belakang hitam (Campbell dan Reece, 2005). Setelah dilihat di mikroskop, maka akan tampak bentuk sel bakteri. Berikut merupakan berbagai bentuk sel bakteri (Anonim, 2008):
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Irawan, 2008). Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sebagai berikut (Irawan, 2008): a. Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV-iodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif. b. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa species yang memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter. Pewarnaan Endospora. Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya.
Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas (Irawan, 2008). Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (keduaduanya transparan, sel vegetatif berwarna), sehingga diperlukan teknik pewarnaan endospora. Berikut merupakan beberapa tipe endospora dan contohnya (Irawan, 2008): E. CARA KERJA 1. Sediakan kaca benda yang bersih, lalu lewatkan diatas nyala api bunsen 2. teteskan setetes aquades steril diatas kaca benda tersebut 3. secara aseptik ambilah inokulum bakteri yang akan diperksa, lalu letakkan diatas tetesan aquades itu, kemudian ratakan perlahan-lahan 4. ambil kaca benda yang tegak sehingga apusan menjadi tipis dan merata. Biarkan sampai kering 5. fiksasi dengan cara melewatkan apusan tersebut diatas nyala api dengan cepat 6. letakkan apusan diatas kawat penyangga yang berada diatas mangkuk pewarna. Lalu teteskan larutan kristal violet pada apusan dan biarkan selama 30-60 detik 7. cuci warna dasar dengan air mengalir, keringkan 8. teteskan larutan iodin pada apusan, biarkan selama 30-60 detik 9. cuci larutan iodin dengan air mengalir, keringkan 10. rendam atau basuh dengan alkohol ... % selama ... detik 11. teteskan larutan safranin, biarkan selama 30-60 detik 12. cuci dengan air mengalir, lalu keringkan 13. amati dengan mikroskop 14. gambar bentuk morfologi DAFTAR PUSTAKA
Campbell, N. A. Dan Reece, J. B., 2005. Biologi Jilid 2. Erlangga. Jakarta. Hadioetomo, R, S., 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia. Jakarta. Irawan, 2008. Teknik Pewarnaan Mikroba. http://wordbiology.wordpress.com. Diakses pada hari Senin, 13 April 2008 pada pukul 19.00 WITA. Pelczar, M. W., 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi 1. UI Press. Jakarta. Suriawiria, U., 1985. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Gramedia. Jakarta. Volk, W. A. dan Margareth F. W., 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta : Erlangga.
Teknik Pengecatan atau Pewarnaan Bakteri
Semua jenis mikroorganisme mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan (Sutedjo, 1991). Pengecatan dan pewarnaan merupakan salah satu cara untuk mengamati sel-sel bakteri. Untuk membedakan berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat digunakan pewarna sederhana. Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa). Sedang kan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bak teri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. Sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994). Sejumlah besar koloni bakteri dan fungi menarik perhatian oleh warnanya yang mencolok, disebabkan karena terjadi eksresi zat warna ke dalam medium atau fermentasi sel. Kemampuan membentuk zat warna terfiksasi secara genetik, dan demikian merupakan penanda khusus. Bentuk-bentuk pewarna mudah dikenal dan ditentukan identitasnya, zat warna dapat merupakan derivat dari berbagai kelas; karotenoid zat warna fenazin, zat warna pirol, azakuinon dan antosian (Hans, 1994). Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bak teri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4-, CH3COO-, COOHCOO-. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Sutedjo, 1991). Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4-, CH3COO-, COOHCOO-. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Sutedjo, 1991). Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan tidak kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan, oleh sebab itu pengamatan tanpa pewarnaan menjadi lebih sukar dan tidak dapat digunakan untuk melihat bagian-bagian sel dengan teliti. Pewarnaan akan
menyebabkan bakteri-bakteri tersebut kontras berwarna dengan sekelilingnya, sehingga akan terlihat jelas. Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas bentuk dan ukuran bakteri, melihat struktur luar dan dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, serta mengha silkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas dari bakteri. Bakteri memiliki beberapa bentuk tubuh. Bentuk-bentuk tubuh dari bakteri yaitu: 1. Bentuk bola atau Cocci (tunggal = coccus) 2. Bentuk batang atau bacilli (tunggal = bacillus) 3. Bentuk spiral atau sprilli (tunggal = sprilum) 4. Bentuk koma atau vibrios (tunggal = vibrio) (Volk & Wheeler, 1993). Sel–sel bakteri mempunyai muatan yang agak negatif bila pH lingkungannya mendekati netral. Muatan negatif dari sel bakteri akan bergabung dengan muatan positif dari ion zat warna misalnya methylen blue, sehingga selnya akan berwarna. Perbedaan muatan inilah yang menyebabkan adanya ikatan atau gabungan antara zat warna dan sel bakteri (Frobisher et all, 1974). Satu sifat penting dari bakteri dalam hubungannya dengan mikrobiologi adalah kemampuan beberapa jenis bakeri untuk memproduksi struktur internal yaitu endospora. Endospora ini umumnya terbentuk secara tunggal dalam sel guna menanggulangi keadaan lingkungan yang kurang baik. Spora yang sudah masak dilepas oleh alam ke lingkungan sekitarnya. Spora-spora ini dapat dilihat di bawah mikroskop fase kontras dan nampak sebagai bagian yang bercahaya terang baik di dalam atau di luar sel. Spora-spora ini tahan terhadap ke adaan fisik atau kimiawi yang ekstrim seperti suhu, kekeringan dan bahan-bahan kimia pembasmi kuman dan dapat bertahan dalam keadaan tidur untuk beberapa tahun. Pada saat kondisi pertumbuhan memungkinkan, spora-spora tersebut tumbuh menjadi sel-sel vegetatif normal (Buckle, 198 7). Sumber: http://bocahpharmacy.multiply.com/journal/item/92/Bakteri_dan_Pengecatannya
Pewarnaan Gram ini pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli histologik Christian Gram (1884). Dengan pewarnaan Gram, bakteri-bakteri dapat dibagi atas 2 golongan yaitu Gram positif dan Gram negatif. Gram
1. 2. 3. 4.
positif warnanya violet (ungu) karena mengikat zat warna utama “kristal violet”. Sedangkan Gram negatif berwarna merah jambu karena melepaskan zat warna utama dan menangkap zat warna penutup ”fuchsin”. Prinsip atau pokok-pokok pewarnaan Gram meliputi 4 tingkatan yaitu : Pewarnaan dengan zat warna utama (kristal gentian violet yang warnanya violet). Merekatkan (mengintensifkan) dengan suatu larutan mordant, yaitu larutan lugol (J-KJ). Menambahkan zat decolorisasi (bahan peluntur) misalnya alkohol atau alkohol-asam. Pemberian zat penutup (counter stain), misalnya : larutan fuchsin, safranin, dll.
Pulasan menurut Gram mempunyai banyak modifikasi, sebaiknya pakailah salah satu cara saja diantara yang banyak. Kesalahan biasanya terdapat pada ”overstaining” dan ”overdecolozing”, yaitu terlalu lama memberikan zat-zat warna atau pancucian dengan alkohol. Akibatnya Grampositif dapat menjadi Gram negatif. Teknik mewarnai hendaknya dikontrol juga dengan melakukan pemulasan terhadap bakteri yang telah diketahui Gramnya. Larutan-larutan zat warna yang digunakan senantiasa diperiksa, apakah sudah terdapat kristal-kristal atau kotoran-kotoran lainnya. Gunakanlah selalu larutan-larutan zat warna yang disaring dengan kertas saring. Perlu kita ketahui bahwa perbedaan sifat antara kedua golongan bakteri tadi, tidaklah absolut tegas dan spesifik, melainkan tergantung juga pada beberapa faktor, antara lain: a) Bakteri-bakteri Gram positif sering kali tidak dapat menyerap dan mengikat zat warna kristal violet, terutama apabila dibuat preparat dari bakteri-bakteri biakan murni yang telah tua (rough). b) Ada bakteri-bakteri tertentu yang sangat peka terhadap cara-cara yang mengalami sedikit perubahan. c) Selain daripada itu ada juga bakteri-bakteri yang bersifat ”gram variable”, dll. Gentian violet dapat diganti dengan crystalviolet atau methylviolet, jika gentian violet tidak ada. ·
·
·
Larutan Standard Gentian Violet. Bubuk (kristal) gentian violet : 5 gram. Alkohol 95-96% : 95 ml. Larutan Pakai. Larutan standard gentian violet : 10 ml. Karbol (phenol) 5% : 90 ml. Larutan Standard Fuchsin. Bubuk (kristal) fuchsin : 5 gram.
·
·
Alkohol 95-96% : 95 ml. Larutan Pakai. Larutan standard fuchsin : 10 ml. Aquadest : 90 ml. Bubuk digerus dalam mortir dengan alkohol sedikit demi sedikit, setelah larut masukkan ke dalam botol (untuk gentian violet harus botol yang cokelat atau sawo matang). Genapkan volume alkohol sampai volume yang diperlukan. Biarkan 24 jam baru dapat dipakai. Jika hendak dipakai larutan stam ini harus diencerkan dahulu 10x dan disaring. Filtrat ini dipakai untuk pewarnaan. Larutan Lugol (J-KJ). Jodium kristal : 1 gram Kalium jodida (KJ) : 2 gram Aquadest : 300 ml. Mula-mula Jodium + KJ dalam kira-kira 10 ml aquadest. Sesudah jodium larut, genapkan volumenya menjadi 300 ml. Larutan lugol ini disimpan dalam botol yang sawo matang. Dapat juga kita sediakan larutan lugol dalam 5x atau 10x kuat. Pada waktu pemakaian encerkan dengan aquadest. Bila perlu disaring. Larutan lugol yang dibuat seperti di atas, langsung dipakai tanpa ditipiskan lagi.
A. Cara pewarnaan Gram : 1. Buat sediaan pada objek gelas, keringkan, kemudian rekatkan (fiksasi) 3x di atas api Bunsen. 2. Tuangi dengan larutan karbol-gentian-violet (sesudah sediaan dingin), biarkan selama 5 menit. 3. Zat warna dibuang dan bubuhi dengan larutan mordant (lugol), diamkan selama kira-kira 1-3 menit. 4. Lugol dibuang dan preparat dicelupkan ke dalam alkohol 96%, sampai warna gentian violet lepas (sampai gentian violet tidak ada luntur lagi). 5. Cuci dengan air kran sampai bersih, kemudian bubuhi dengan catpenutup (counter stain) larutan water-fuchsin, biarkan kira-kira 1-2 menit. 6. Cuci dengan air kran, keringkan dalam temperatur kamar, lihat dengan mikroskop memakai lensa rendam minyak. Gram positif = ungu. Gram negatif = merah.
B. VARIASI PEWARNAAN GRAM yang digunakan di Bagian Pathologi Klinik Fakultas Kedokteran dan Rumah Sakit Dr. Cipto Mangunkusumo di Jakarta. Larutan-larutan zat warna : 1. Carbol Gentian Violet. Gentian violet 1 gram; Phenol kristal 2 gram; Alkohol 95 % 10 ml dan aquadest ad. 100 ml. Gentian violet digerus dengan alkohol dalam mortir tambahkan phenol dan campur. Kemudian tambah air sedikit demi sedikit dengan mengaduk terus, biarkan 24 jam kemudian disaring. 2. Larutan Lugol (J-KJ) Jodium 1 gram, KJ 2 gram dan aquadest 300 ml. Geruslah Jodium bersama KJ hingga homogen, tambah air sedikit demi sedikit, biarkan 24 jam. Saring dan disimpan dalam botol yang cokelat. Larutan ini gunanya sebagai mordant. 3. Larutan safranin (counter stain). Safranin 1 gram, alkohol 95% sebanyak 4 ml dan aquadest 360 ml. Geruslah safranin dengan alkohol, tuangkan ke dalam botol, mortir berkalikali dicuci dengan air, biarkan 24 jam. Saring dan siap untuk digunakan.
~ ~ ~ ~
~ ~
Cara pewarnaan : Buat sediaan pada objek gelas, rekatkan di atas api Bunsen 3x, tunggu sampai dingin. Pulas dengan karbol gentian violet selama 60 detik. Cuci dengan aquadest, bubuhi lugol selama 30 detik. Cuci dengan aquadest, buang zat warna dengan alkohol (decolorisasi) sampai tidak ada lagi warna yang dilepaskan dari sediaan. Boleh juga dicuci lagi dengan aquadest. Pulas dengan larutan safranin (counter stain) kira-kira 30 detik. Cuci dengan aquadest, biarkan kering dalam temperatur kamar dan periksa dengan mikroskop memakai lensa rendam minyak. Hasil pewarnaan Gram : Bakteri Gram positif : Biru-ungu (ungu kebiru-biruan). Bakteri Gram negatif : Merah kekuning-kuningan.
C. Pewarnaan Gram modifikasi BURKE. (Burke’s modifikation : J. Bact. 7: 159, 1922). 1. Sediaan sesudah difiksasi 3x di atas api, dituangi dengan larutan 1% gentian violet (crystal violet) dalam alkohol, kemudian segera ditambah dengan larutan Natrium-Bikarbonat 5%, biarkan selama kira-kira 1 menit. 2. Cuci degan air, bubuhi dengan larutan mordant yaitu larutan lugol ( 1 gram J + 2 gram KJ + 200 ml aquadest), biarkan selama 1 menit.
3. Segera dicuci dengan air. Bubuhi larutan decolorisasi tetes demi tetes (bahan peluntur) yang terdiri dari : 1 bagian ether + 3 bagian aceton, sampai zat warna utama terlepas atau bahan peluntur tidak berwarna lagi. 4. Bersihkan dengan air, kemudian bubuhi dengan larutan counter stain (cat penutup) safranin 0,5 % beberapa detik lamanya. 5. Bersihkan dengan air, keringkan pada temperatur kamar, lihat dengan mikroskop memakai lensa rendam minyak. Gram positif : biru-ungu. Gram negatif : merah kekuning-kuningan. Catatan : Sebagai counter-stain dapat juga digunakan karbol fuchsin encer, yaitu Karbol Fuchsin Z. Neelsen 1 ml + 9 ml aquadest (pengenceran 10x). Jika karbol fuchsin ini dipakai waktunya dipersingkat, paling lama 1 menit. Karbol fuchsin encer ini sering digunakan untuk memulas vibrio, waktunya kira-kira 5-10 detik. Vibrio berwarna merah jambu dan bentuk koma. Susunan pulasan karbol fuchsin lihat pada pewarnaan tahan asam. BTA Beberapa mikroba tertentu tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan sederhana ataupun Gram, misalnya golongan Mycobacterium, Retinomycites, dll. Hal ini disebabkan sel-sel mikroba diliputi oleh semacam lilin (lipid) dan asam mycolat, sehingga tubuhnya sukar ditembus oleh zat-zat warna. Tetapi dia dapat diwarnai dengan karbolfuchsin panas (sambil dipanasi), ternyata zat warna ini dapat meresap dan diikat oleh tubuh bakteri tersebut. Keistimewaan dari kuman tahan asam ini, zat warna yang telah diikat itu sukar dilepaskan walaupun dilakukan dengan pencucian dengan alkoholasam, misalnya asam sulfat dan asam chlorida. Oleh karena kuman-kuman seperti itu tahan terhadap pencucian asam-asam mineral, maka disebut kuman tahan asam. Kuman-kuman yang tahan asam ialah: 1. Mycobacterium tuberculose ( bakteri tbc). 2. Mycrobacterium leprae (basil Hansen). 3. Golongan saprophyt (apathogen). 4. Bakteri S*#@?!. S*#@?! Walaupun tahan asam tetapi zat warna yang diikat luntur oleh pencucian decolorisasi (alkohol-asam).
I. Cara ZIEHL NEELSEN. Larutan-larutan yang diperlukan : A. Carbol-fuchsin : Basic fuchsin : 1 gram. Alkohol 95% : 10 ml. Phenol 5% dlm air :100 ml.
B. C.
1. 2. 3. 4. 5. 6.
Mula-mula fuchsin dilarutkan dalam alkohol (gerus dalam mortir), kemudian tambah phenol, biarkan 24 jam, saring. Alkohol-asam, yaitu 3-5 ml asam chlorida pekat dalam alkohol 95% sampai 100 ml. Methylen biru biasa, sebagai counter stain. Methylen biru : 1 gram. Aquadest : 100 ml. Dapat juga digunakan methylen biru menurut Loffler. Caranya : Buat sediaan, keringkan di atas api, kemudian disiram dengan carbolfuchsin. Panasilah sediaan itu dengan hati-hati sampai kelihatan uap tetapi jangan sampai mendidih, biarkan menguap kira-kira 3-5 menit. Cuci dengan aquadest kemudian warna carbol-fuchsin dibuang dengan decolorisasi HCl-alkohol. Pencucian selesai bila air cucian tidak berwarna merah lagi, cuci lagi dengan aquadest. Warnai dengan counter stain methylen biru, biarkan kira-kira 2-3 menit. (Loffler m. blue 20-30 det). Cuci dengan air, keringkan di udara dan dilihat dengan mikroskop. Hasil pewarnaan: Bakteri tahan asam : merah. Tidak tahan asam : biru.
II. Cara KINYOUN. (Am. J. Pub. Health th 5: 867, 1915). A. Larutan Carbol-fuchsin menurut Kinyoun : Basic fuchsin 4 gram, alkohol 95% 20 ml, phenol 8 gram, dan aquadest 100 ml. Fuchsin digerus dalam mortir dengan alkohol sampai larut. Cucilah berkali-kali mortir itu dengan air dan pindahkan ke dalam botol. Panasilah phenol di atas penangas air 56°C sampai mencair dan tambahkanlah phenol itu ke larutan tadi. Biarkan 24 jam, kemudian disaring dan siap untuk dipakai. B. Decolorisasi : HCl 3-5% atau Asam-sulfat 5%. C. Counter stain : Methylen biru 1% dalam air. Caranya : 1. Buat sediaan, keringkan di atas api, kemudian fiksasi di atas api. 2. Tuangi dengan larutan Kinyoun, biarkan 3-5 menit. 3. Cuci dengan air kran mengalir pelan-pelan : ½ menit. 4. Tetesi dengan asam-sulfat 5%, biarkan : ½ menit. 5. Bubuhi dengan alkohol 70%, biarkan : ½ menit. 6. Cuci dengan air kran mengalir pelan-pelan : ½ menit. 7. Warnai dengan methylen biru, biarkan : 1 menit. 8. Cuci dengan air kran, keringkan dan lihat dengan mikroskop. Cara Kinyoun tidak perlu dipanasi. 9. Hasil pewarnaan:
Bakteri tahan asam : merah. Tidak tahan asam : biru. III. Cara GOBBET. 1. Buat preparat, keringkan dan fiksasi di atas api, kemudian tuangi dengan basic-fuchsin yang terdiri dari : basic fuchsin 0,9 gram, alkohol 95% 10 ml, phenol 5% 90ml, panasi sampai keluar uap dan biarkan selama 3-5 menit. 2. Bersihkan dengan air kran mengalir pelan-pelan ½ menit. 3. Celupkan ke dalam larutan Gobbet selama 1 menit. Larutan Gobbet terdiri dari : Methylen biru 1 gram, asam-sulfat 96% 20 ml, alkohol absolut 30 ml dan aquadest 50 ml. 4. Bilasi dengan air kran, keringkan di udara dan dilihat dengan mikroskop. 5. Hasil pewarnaan: Bakteri tahan asam : merah. Tidak tahan asam : biru. IV. Cara TAN THIAM HOK. Cara ini merupakan kombinasi dari Kinyoun dan Gabbet. 1. Sediaan sesudah difiksasi di atas api, celupkan ke dalam larutan Kinyoun selama 3 menit. 2. Cuci dengan air kran selama ½ menit. 3. Celupkan lagi dalam larutan Gabbet selama 1 menit. 4. Bilasi dengan air kran, keringkan dalam temperatur kamar dan dilihat dengan mikroskop. 5. Hasil pewarnaan: Basil tahan asam : merah. Tidak tahan asam : biru muda. Kirimkan Ini lewat Email BlogThis! Berbagi ke Twitter Berbagi ke Facebook
pewarnaan gram 1.1
Pengertian dan Tujuan Pewarnaan
Salah satu teknik pewarnaan diferensial yang paling penting dan paling luas digunakan untuk bakteri ialah pewarnaan gram. Telah dikembangkan prosedur-prosedur pewarnaan untuk :
1. Mengamati dengan lebih baik tampang morfologi mikroorganisme secara kasar. 2. Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme. 3. Membantu mengidentifikasi dan membedakan organisme yang serupa. (Pelczar dan Chan, 1986).
Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba banyak dilakukan baik secara langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni). Tujuan dari pewarnaan tersebut ialah untuk : 1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, ataupun fungi. 2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad. 3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad. 4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik dan kimia yang ada akan dapat diketahui. (Suriawiria, 1995) Pewarna (stain) merupakan garam-garam yang tersusun atas ion positif dan negatif, yang salah satunya berwarna dan disebut kromosfor (chromosphore). Bila kromosfor berada pada ion positif disebut pewarna basa (basic dye) dan bila kromosfor berada pada ion negatif disebut sebagai pewarna asam (acidic dye) (Pratiwi, 2008). 1.2
Macam dan Fungsi Pewarnaan
Ada tiga macam prosedur pewarnaan, yaitu pewarnaan sederhana (simple stain), pewarnaan diferensial (differential strain), dan pewarnaan khusus (special strain). Pada pewarnaan sedarhana hanya digunakan satu macam pewarna dan bertujuan mewarnai seluruh sel mikroorganisme sehingga bentuk seluler dan struktur dasarnya dapat terlihat (Pratiwi, 2008).
Menurut Zubaidah (2006), yaitu banyak senyawa organik berwarna (zat pewarna) digunakan
untuk
mewarnai
mikroorganisme
untuk
pemeriksaan
mikroskopis.
Telah
dikembangkan prosedur-prosedur pewarnaan untuk : 1. Mengamati dengan lebih baik tampang morfologi mikroorganisme secara kasar 2. Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme 3. Membantu mengidentifikasi dan membedakan organisme yang serupa. Macam-macam pewarnaan adalah : 1.
Pewarnaan sederhana : pemberian warna pada bakteri atau jasad-jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis atau olesan yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana.
2.
Pewarnaan diferensial : prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba disebut pewarnaan diferensial.
3. Pewarnaan gram : salah satu teknik pewarnaan diferensial yang paling penting dan paling luas digunakan untuk bakteri ialah pewarnaan gram. Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini dibagi menjadi dua kelompok, salah satu diantaranya bakteri gram positif dan bakteri gram negatif (Pelczar dan Chan, 1986).
1.3
Perbedaan Gram Positif dan Negatif, beserta contohnya Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat metil ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu dibawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah atau merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel (Annisa, 2010).
Perbedaan warna antara bakteri gram positif dan bakteri gram negatif disebabkan oleh adanya perbedaan struktur dan dinding selnya. Dinding bakteri gran positif banyak mengandung peptidoglikan, sedangkan dinding bakteri gram negatif banyak mengandung lipopolisakarida (Pratiwi, 2008).
Menurut Pelczar dan Chan (1986), perbedaan bakteri gram positif dan gram nehatif adalah : Gram Positif Ungu kristal
1.4
Gram Negatif
Sel berwarna ungu
Sel berwarna ungu
Larutan Iodium
Kompleks UK-Y terbentuk di dalam sel, sel tetap berwarna ungu
Kompleks UK-Y terbentuk di dalam sel, sel tetap berwarna ungu
Alkohol
Dinding sel mengalami dehidrasi, pori-pori menciut, daya rembes dinding sel dan membran menurun, UK-Y tak dapat keluar dari sel, sel tetap ungu
Lipid terekstrasi dari dinding sel, pori-pori mengembang, kompleks UK-Y keluar dari sel, sel menjadi tak berwarna
Safranin
Sel tak terpengaruhi, tetap ungu
Sel menyerap zat pewarna ini, menjadi merah
Mekanisme Penyerapan Zat Warna oleh Gram Positif dan Gram Negatif
Reaksi gram dapat dikonfirmasi dengan uji kelarutan kalium hidroksida (kori). Ambillah satu OSE penuh kultur bakteri yang sedang tumbuh aktif dan campur dengan setetes larutan KOH 3% di atas kaca objek yang bersih dan aduk hingga diperoleh suspensi yang rata. Angkat
OSE beberapa centimeter dari kaca objek. Jika benang lendir bakteri itu terangkat oleh OSE(kira-kira 5-20 mm panjangnya), maka bakteri itu adalah gram negatif. Jika dihasilkan suspensi berair dan tidak tampak adanya benang lendir setelah OSE digerakkan berulangulang maka kultur bakteri itu adalah gram positif. Perusakan dinding sel organisme gram negatif yang diikuti dengan pembebasan DNA, yang sangat kental di dalam air, menghasilkan benang lendir. Dinding sel bakteri gram positif lebih tahan terhadap KOH dan tetap melekat sehingga tidak ada DNA yang dibebaskan (Soekirno, 2008).
Pada pewarnaan gram ini, bakteri yang telah di fiksasi dengan panas sehingga membentuk pada kaca objek diwarnai dengan pewarna basa yaitu crystal violet. Karena warna ungu mewarnai seluruh sel, maka pewarna ini disebut pewarna primer (primary stain). Selanjutnya mordant (penajam). Setelah iodin dicuci dengan baik, bakteri gram positif maupun gram negatif tampak berwarna ungu. Selanjutnya noda spesimen dicuci dengan alkohol yang merupakan decolorizing agent (senyawa peluntur warna) yang pada spesies bakteri twertentu dapat menghilangkan warna ungu dari sel. Setelah alkohol dicuci, noda spesimen diwarnai kembali dengan safranin yang merupakan pewarna basa berwarna merah. Bakteri yang tetap berwarna ungu digolongkan ke dalam gram positif, sedangkan bakteri yang berwarna merah digolongkan ke dalam gram negatif (Pratiwi, 2008).
Mikroorganisme gram positif adalah mikroorganisme yang berwarna violet dimanan warna tersebut tidak hilang jika mikroorganisme disiram dengan aseton atau alkohol. Sedangkan mikroorganisme gram negatif adalah mikroorganisme yang akan kehilangan warna violetnya jika mikroorganisme tersebut disiram dengan aseton atau alkohol dan kemudian akan berwarna merah muda dengan carbol fuchsin atau merah netral (Gibson, 1996).
Posted 4th August 2012 by Gamma Sugara
PEWARNAAN GARM 1.
Aug 4
pewarnaan gram
1.1
Pengertian dan Tujuan Pewarnaan
Salah satu teknik pewarnaan diferensial yang paling penting dan paling luas digunakan untuk bakteri ialah pewarnaan gram. Telah dikembangkan prosedur-prosedur pewarnaan untuk : 1. Mengamati dengan lebih baik tampang morfologi mikroorganisme secara kasar. 2. Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme. 3. Membantu mengidentifikasi dan membedakan organisme yang serupa. (Pelczar dan Chan, 1986).
Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba banyak dilakukan baik secara langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni). Tujuan dari pewarnaan tersebut ialah untuk : 1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, ataupun fungi. 2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad. 3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.
4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik dan kimia yang ada akan dapat diketahui. (Suriawiria, 1995) Pewarna (stain) merupakan garam-garam yang tersusun atas ion positif dan negatif, yang salah satunya berwarna dan disebut kromosfor (chromosphore). Bila kromosfor berada pada ion positif disebut pewarna basa (basic dye) dan bila kromosfor berada pada ion negatif disebut sebagai pewarna asam (acidic dye) (Pratiwi, 2008).
Dengan pewarnaan biasa atau Gram spora bakteri tidak dapat dilihat. Prinsip pewarnaan spora ialah warna sporanya harus berbeda dengan warna bakteri. I. Cara KLEIN. Larutan warna yang diperlukan ialah: · Carbolfuchsin Ziehl Neelsen. . Methylen biru 1%. · Asam sulfat 1%. 1. Satu ml suspensi bakteri yang umurnya 24 jam dalam bouillon atau suspensi kuman yang dibikin dari tanaman pada agar-miring yang telah berumur 48 jam, dicampur dengan carbolfuchsin yang sama banyaknya di dalam tabung reaksi. 2. Campuran ini dimasak (direndam) pada penangas air 80°C kira-kira 10 menit, gunanya untuk membunuh bakteri-bakteri yang tidak membentuk spora. 3. Satu ose dari campuran dibuat sediaan pada satu objek gelas yang bersih dan bebas dari lemak, keringkan dan fiksasi 3x di atas api Bunsen. 4. Celupkan dalam asam-sulfat 1% selama 1-2 detik. 5. Cuci dengan air kran dan akhirnya diwarnai dengan methylen biru, kirakira selama 2-3 menit. 6. Cuci dengan air kran, keringkan dan lihat dengan mikroskop. Hasil pewarnaan: Spora : berwarna merah. Bakteri : berwarna biru. II. Cara MULLER Asam chromat 5%. · Carbol fuchsin Z. Neelsen. · Asam asetat 5%. · Methylen biru 1% dan · Chloroform.
1. Buat sediaan dari biakan kuman yang umurnya 2 hari dalam bouillon (dari agar miring), sesudah dilidah apikan (rekatkan) 3x, tetesi dengan chloroform selama 2 detik. 2. Cuci dengan air, tetesi dengan asam chromat selama 2 detik. 3. Cuci dengan air kran, bubuhi dengan carbol-fuchsin, uapkan (jangan mendidih) biarkan menguap selama 5 menit. 4. Cuci dengan asam asetat 5%, kemudian dengan air. 5. Bubuhi dengan methylen biru 1% kira-kira 2 detik. 6. Methylen biru dibuang dan keringkan dengan kertas saring, periksa dengan mikroskop. Hasil pewarnaan: Spora : berwarna merah. Bakteri : berwarna biru. III. Cara FLEMING. 1. Buat sediaan keringkan, kemudian fiksasi 3x di atas api Bunsen. 2. Warnai dengan carbol-fuchsin Z. Neelsen, panaskan sampai menguap dan biarkan menguap selama 5 menit. 3. Cuci dengan air kran sampai warna fuchsin tidak luntur lagi, bubuhi Natrium-sulfit 5% selama 20-30 detik. 4. Cuci dengan air, tetesi dengan larutan methylen biru 1% (dengan larutan Nigrosin 10%), kemudian apuskan di atas objek gelas. 5. Keringkan pada temperatur kamar dan lihat dengan mikroskop. Hasil pewarnaan: Spora : berwarna merah. Bakteri : berwarna biru. IV. Cara SCHAEFFER DAN FULTON. (Science 77, 194, 1933). Larutan-larutan yang diperlukan: · Larutan Malachiet hijau 5% dalam aquadest. (sesudah dibuat biarkan dahulu ½ jam, kemudian disaring, baru dapat dipakai). · Larutan Safranin 0,5% dalam aquadest. Caranya : 1. Buat sediaan dari suspensi kuman yang akan diperiksa, keringkan, kemudian fiksasi di atas api 3x. 2. Tetesi dengan larutan Malachiet hijau 5%, uapkan perlahan-lahan, biarkan menguap 1½ menit. 3. Cuci dengan air kran, kemudian bubuhi dengan larutan Safranin 0,5% selama 1½ menit. 4. Cuci lagi dengan air, kemudian keringkan dengan kertas saring, periksa dengan mikroskop. Hasil pewarnaan: Spora : berwarna hijau.
Bakteri : merah.
LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI UMUM PEWARNAAN SEL (BAKTERI DAN JAMUR) DAN PEWARNAAN ENDOSPORA
1.1 Latar Belakang
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Selain itu bakteri yang hidup akan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Sedangkan, untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu, bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan merah sedangkan yang positif berwarna ungu (Levine, 2000). Praktikum persiapan pembuatan apusan dan teknik pewarnaan gram sangat penting dilakukan karena untuk pengamatan biakan dari koloni mikroba dan biakan jamur dapat dilakukan dengan mudah dan baik. Pewarnaan ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospora yang bisa diwarnai. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Pelczar dan Chan, 2007)
Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat kecil, bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop dengan pembesaran 1.000 X atau lebih (Waluyo, 2004). Sel bakteri memiliki panjang yang beragam, sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih panjang daripada sel spesies yang lain. Bakteri merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara 0,1 sampai 0,3 µm. Bentuk bakteri bermacam – macam
yaitu elips, bulat, batang dan spiral. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai dengan suatu zat pewarna kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal ukuran, bentuk, susunan dan keadaan struktur internal dan butiran. Sel sel individu bakteri dapat berbentuk seperti bola/elips, batang (silindris), atau spiral (heliks) (Pelczar & Chan, 2007). Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya. Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial (Pelczar & Chan, 2007). Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan n egatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4-, CH3COO-, COOHCOO?. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Sutedjo, 1991). Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Terdapat tiga mcam metode pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial dan pewarnaan gram. Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan diferensial memakai serangkaian larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan gram merupakan metode pewarnaan yang paling umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri (Umsl, 2008). Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, salah satu di antaranya berwarna. Pada zat warna yang bersifat basa, warna terdapat pada ion positif (zat
pewarna+ Cl-) dan pada pewarna asam, warna akan terdapat pada ion negatif (zat pewarna- Na+). Hubungan antara bakteri dengan zat pewarna basa yang menonjol disebabkan terutama oleh adanya asam nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. Jadi, jika bakteri itu diwarnai, muatan negatif dalam asam nukleat bakteri akan bereaksi dengan ion positif zat pewarna basa, Kristal violet, safranin dan metilin blue adalah beberapa zat pewarna basa yang biasa digunakan. Sebaliknya zat pewarna asam ditolak oleh muatan negatif bakteri menyeluruh. Jadi, mewarnai bakteri dengan zat pewarna asam akan menghasilkan hanya pewarnaan pada daerah latar belakang saja. Karena sel bakteri tak berwarna di atas latar belakang yang berwarna (Volk & Wheeler, 1993). Pewarnaan gram ditemukan pada tahun 1884 oleh seorang dokter kebangsaan Denmark Christian Gram (membuat zat pewarna khusus) pewarna tersebut merupakan pewarna differensial karena dapat membagi bakteri menjadi dua kelompok fisiologi, yang akan memudahkan untuk identifikasi. Prosedur pertama dari pewarnaan gram ini adalah memberi pewarna kristal violet, setelah 1 menit dibilas dan kemudian akan diberikan pewarna yodium, setelah satu menit dibilas dan kemudian akan diberi laputan alkohol 95% selama 30 detik, kemudian dibilas dan diberi pewarna safranin atau bismarck (untuk buta warna merah) selama 1 menit. Zat pewarna kristal violet dan yodium akan membentuk senyawa yang kompleks. Beberapa bakteri akan melepaskan zat pewarna dengan mudah apabila dicuci dan beberapa bakteri yang lain zat pewarna akan bertahan walaupun dicuci dengan alkohol 95%. Bakteri gram positif akan terwarna ungu (kristal violet) dan bakteri gram negatif akan terwarna merah (safranin) (Umsl, 2008). Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah pewarnaan Gram dan Ziehl‐ Nelsen. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui morfologi, struktur, dan karakteristik bakteri. Pewarnaan Gram dapat mengidentifikasi penyakit infeksi. Prosedur pewarnaan Gram dimulai dengan pemberian kristal violet, setelah itu ditambahkan larutan iodium maka semua bakteri akan berwarna biru. Setelah itu ditambah alkohol. Bakteri Gram positif membentuk kompleks Kristal iodine yang berwarna biru. Setelah di tambahkan safranin, bakteri Gram positif akan berwarna ungu. Contoh bakteri Gram positif adalah Streptococcus, Bacillus, Stapilococcus, Clostridia, Corynebacterium dhypteriae, Peptococcus, Peptostreptococcus, dll. Sedangkan bakteri Gram negatif akan terdekolorisasi oleh alcohol dan pemberian safranin akan memberikan
warna merah pada bakteri Gram negatif. Contoh bakteri Gram negative adalah Neisseria, Klebesiella, Vellonella, Shigella, Salmonella, Hemophillus, dll (Cappuccino & Sh erman, 1983). Proses pewarnaan gram ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent ). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat mengikat warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar. Larutan yang biasa dipakai adalah ungu kristal, lartan iodium, alkohol dan safranin (Tracy, 2005). Teori Salton menjelaskan bahwa ada konsentrasi lipid yang tinggi pada dinding sel bakteri Gram negatif. Sehingga jika lipid dilarutkan dalam pemberian alcohol, maka pori‐ pori akan membesar dan tidak mengikat pewarna. Hal ini menyebabkan bakteri menjadi tidak berwarna. Sedangkan bakteri Gram positif akan mengalami denaturasi selama pemberian alcohol. Hal ini akan mengecilkan pori‐ pori sehingga menghasilkan kompleks kristal iodium. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang kuat dan lapisan peptidoglikan sebanyak 30 lapisan sehingga permeabilitas dinding selnya menjadi berkurang. Sedangkan bakteri Gram negatif hanya memiliki 1‐2 lapisan peptidoglikan sehingga memiliki permeabilitas dinding sel yang lebih besar. Pewarnaan Gram terdiri atas Gram A (violet) (Kristal violet, Aalkohol, Ammonium oksalat, Aquades), Gram B (cokelat)
(Iodium, Kalium iodide,
Aquades), Gram C
(Aseton, Alcohol), Gram D (merah) (Safranin, Alcohol, Aquades). Pewarnaan ZN digunakan untuk mengidentifikasi infeksi yang disebabkan oleh bakteri tahan asam, conttohnya adalah Micobacteriom
tuberculosis,
Micobacterium
leprae,
Mycobacterium
atypical
seperti
Mycobacterium avium intraseluler / Mycobacterium avium complex yang tumbuh pada 41C yang menyerang sistem imun, Mycobacterium marinum dan Mycobacterium ulcerans yang tumbuh pada 31C dan menginfeksi kulit, Nocardia, Legionella mycdatci, Rhodococcus, Tsukamurella, Gordonia / Gordona, Cryptosporidium, Isospora, Cyclospora, Sarcocytis, dll. Contoh bakteri than asam yang tidak cocok pada pewarnaan ZN tetapi cocok pada Kinyoun adalah Nycordia, Rhodococcus, Tsukamurella, dan Gordonia. Hasil pewarnaan ZN akan
mengidentifikasikan : 1. Bakteri tahan asam Bakteri tahan asam baru akan terkarakterisasi setelah pewarnaan setelah pemberian asam‐ alkohol. Hasilnya berwarna merah. 2. Bakteri tidak tahan asam Hasilnya adalah berwarna biru karena dekolorisasi pada pewarnaan pertama oleh asam‐alkohol, jadi perlu diberi pewarnaan kedua berupa counter stain. Sifat tahan asam pada bakteri tahan asam disebabkan karena dinding selnya terdiri atas peptidoglikan, arabinogalaktan, dan lipid (50%‐nya tersusun atas asam mikolat). Asam mikolat merupakan asam lemak ranai panjang yang terdiri atas 34‐90 karbon. Pewarnaan ZN terdiri dari ZN ‐A (merah) (Basic fusion, Alcohol, Fenol, Aquades), ZN‐B (tidak berwarna) (HCl, Etil alcohol), dan ZN‐C (biru) (Methylen blue, Aquades) (Madigan, 2003). Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut: pewarnaan sederhana, pewarnaan differensial (pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam), pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel, pewarnaan spora, pewarnaan kapsul, pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri (pewarnaan Neisser (granula volutin), pewarnaan yodium (granula glikogen) dan
pewarnaan negatif
(Gozali, 2009 Gambar 2.1 Pewarnaan Sederhana (Gozali, 2009) Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina (Hadiotomo, 1990) Gambar 2.2 Pewarnaan Negatif (Hadiotomo, 1990) Gambar 2.3 Pewarnaan Gram (Jason, 2009). Endospora merupakan struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa jenis bakteri. Struktur endospora sangat bervariasi pada setiap spesies. Endospora merupakan struktur yang tahan terhadap keadaan lingkungan yang ekstrim misalnya kering, pemanasan dan keadaan asam. Karena kandungan air endospora sangat rendah bila dibandingkan dengan sel vegetatifnya, maka endospra berbentuk sangat padat dan sangat refraktil bila dilihat di bawah mikroskop. Endospora sangat sukar diwarnai dengan pewarnaan biasa, sehingga harus menggunakan pewarnaan
spesifik. Bakteri yang menghasilkan spora pada umumnya tahan terhadap pewarnaan, sedangkan bakteri yang tidak memiliki spora dan hanya memiliki sel vegetatif tidak tahan terhadap pewarnaan (Partic, 2008). Endosopora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya, tetapi sekali diwarnai, zat warna tersebut akan sulit hilang. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode pengecatan spora secara umum. Pada metode Schaeffer-Fulton yang banyak dipakai dalam pengecatan endospora, endospora diwarnai pertama dengan malachite green dengan proses pemanasan. Larutan ini merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora. Setelah perlakuan malachite green, biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin. Teknik ini akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah muda pada sel vegetatifnya (Fardiaz, 1992). Kondisi yang terus memburuk membuat endospora dibebaskan dari degenerasi sel vegetatif dan menjadi sel independen yang disebut spora yang diakibatkan komposisi lapisan kimia spora bersifat tahan terhadap efek-efek merusak, misalnya pemanasan berkelebihan, pembekuan, radiasi, pengeringan, dan agent kimia lainnya sehingga diperlukan pewarnaan khusus secara mikrobiologi dan ketika kondisi lingkungan kembali normal, spora bebas kembali untuk aktif secara metabolik dan sel vegetatif berkurang resisten melalui germinasi. Sporogenesis dan germinasi tidak dimaksudkan untuk reproduksi tetapi hanya mekanisme yang menjamin ketahanan sel dibawah kondisi lingkungan (Suriawiria, 2005). Endospora adalah struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa jenis bakteri. Karena kandungan air endospora sangat rendah bila dibandingkan dengan sel vegetatifnya, maka endospora berbentuk sangat padat dan sangat refraktil bila dilihat di bawah mikroskop. Endospora sangat sukar diwarnai dengan pewarna biasa, sehingga harus digunakan pewarna spesifik
dan
yang
biasa
digunakan
adalah
malachite
green.
Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Disebut demikian karena hanya digunakan satu jenis cat pewarna untuk mewarnai organisme. Kebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofil (suka akan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen
kromofornya
bersifat
positif).
Pewarnaan
sederhana
ini
memungkinkan
dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (coccus, vibrio, basillus, dsb) dari bahan-bahan lainnya yang ada pasa olesan yang diwarnai (Hadiotomo, 1990).
Bakteri penghasil spora tahan terhadap pewarnaan. Oleh karena itu, setelah diwarnai oleh suatu warna, misalnya malachite green, akan mengikat kuat senyawa pewarna. Untuk pewarnaan selanjutnya, cat tersebut (misalnya safranin) sel spora tidak dapat menerimanya karena sudah terikat dengan cat pertama. Akhirnya warna bakteri spora adalah hijau. Bakteri yang tidak berspora cenderung tidak tahan pengecatan karena hanya memiliki sel vegetatif. Saat diwarnai oleh malachite, sel vegetatif dapat mengikat warna tetapi dapat luntur setelah dilunturkan karena ikatannya tidak kuat. Setelah pewarnaan selanjutnya dengan safranin, sel vegetatif mudah mengikat warna kembali. Oleh karena itu, hasil pewarnaan akhir adalah merah muda dari safranin (Assani, 1994). 3.2.1
Pembuatan Apusan
Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70%, kemudian bakteri hasil isolasi diambil menggunakan jarum ose sebanyak satu kali pengambilan yang telah di tehnik aseptis dan diletakkan di atas kaca obyek yang telah terdapat aquades steril sebanyak satu kali yang pengambilannya dengan jarum ose. Kemudian di fiksasi secukupnya hingga kering. Preparat apusan siap diwarnai dan diamati.
3.2.2
Teknik Pewarnaan Gram
Apusan dicat dan digenangi dengan cat gram A selama 1 menit, cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. Setelah kering, apusan digenangi dengan cat gram B selama 1 menit, cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. Setelah kering, apusan ditetesi dengan cat gram C selama 30 detik, cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. Setelah kering, apusan digenangi dengan cat gram D selama 1 menit, sisa cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. Kemudian preparat siap diamati dibawah mikroskop 3.2.3
Konfirmasi Hasil Cat Gram Dengan KOH
Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70%, kemudian bakteri yang akan dikonfirmasi diambil sebanyak satu ose dan diletakkan pada gelas obyek yang telah terdapat larutan KOH sebanyak satu jarum ose. Kemudian campurkan dengan mengaduknya, kemudian jarum ose diangkat beberapa sentimeter untuk mengetahui apakah cairan berlendir atau tidak.
3.2.4
Pewarnaan Endospora
Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70%, kemudian B. subtilis diambil menggunakan jarum ose sebanyak satu kali pengambilan yang telah di tehnik aseptis dan diletakkan di atas kaca obyek yang telah terdapat aquades steril sebanyak satu kali pengambilan dengan jarum ose. Kemudian di fiksasi secukupnya hingga kering. Selanjutnya gelas obyek dipanaskan di atas air mendidih dengan menutup preparat dengan kertas saring dan ditetesi dengan malakit hijau selama 10 menit. Setelah itu dinginkan preparat sebentar, selanjutnya preparat di cuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan. Kemudian genangi preparat dengan pewarna safranin selama 1 menit, di cuci dengan air mengalir. Preparat ditiriskan dengan kertas saring dan diamati di bawah mikroskop, endospora akan tampak berwarna hijau dan sel vegetatif akan tampak berwarna merah.
4.1 Analisa Prosedur 4.1.1 Pembuatan Apusan
Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70% agar tidak terdapat mikroorganisme yang tidak diinginkan saat pembuatatn apusan, kemudian bakteri hasil isolasi diambil menggunakan jarum ose sebanyak satu kali pengambilan yang telah di tehnik aseptis, agar tidak terdapat mikroorganisme yang tidak diinginkan saat pembuatatn apusan dan diletakkan di atas kaca obyek yang telah terdapat aquades steril sebanyak satu kali pengambilan dengan jarum ose. Kemudian di fiksasi secukupnya hingga kering, agar bakteri yang akan digunakan mati namun organ dan struktur tidak rusak (Madigan, 2003).
4.1.2 Teknik Pewarnaan Gram
Apusan dicat dan digenangi dengan cat gram A selama 1 menit, cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan, agar pewarna sebelumnya tidak bercampur dengan pewarna yang lain yang akan digunakan (Umsl, 2008). Setelah kering, apusan digenangi dengan cat gram B selama 1 menit, cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. Cat gram B akan menguatkan ikatan antara pewarna dengan dinding sel bakteri. Setelah kering, apusan ditetesi dengan cat gram C selama 30 detik, cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. Cat gram C akan melarutkan warna sebelumnya, apabila preparat bakteri merupakan gram negative, maka
preparat akan berwarna bening. Setelah kering, apusan digenangi dengan cat gram D selama 1 menit, sisa cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. Kemudian preparat siap diamati dibawah mikroskop. Bakteri gram negative akan berwarna kemerahan, sedangkan bakteri gram positif akan berwarna ungu.
4.1.3 Konfirmasi Hasil Cat Gram Dengan KOH 3%
Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70% agar tidak terdapat mikroorganisme yang tidak diinginkan saat perlakuan, kemudian bakteri yang akan dikonfirmasi diambil sebanyak satu ose dan diletakkan pada gelas obyek yang telah terdapat larutan KOH sebanyak satu jarum ose, konfirmasi dilakukan untuk memastikan bakteri tersebut gram negatif atau positif. Kemudian campurkan dengan mengaduknya, kemudian jarum ose diangkat beberapa sentimeter untuk mengetahui apakah cairan berlendir atau tidak. Jika cairan tersebut berlendir maka bakteri tersebut merupakan bakteri gram negatif dan jika cairan tersebut tidak berlendir maka bakteri tersebut bakteri gram positif (Umsl, 2008).
4.1.4 Pewarnaan Endospora
Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70% agar tidak terdapat mikroorganisme yang tidak diinginkan saat perlakuan, kemudian B. subtilis diambil menggunakan jarum ose sebanyak satu kali pengambilan yang telah di teknik aseptis dan diletakkan di atas kaca obyek yang telah terdapat aquades steril sebanyak satu kali pengambilan dengan jarum ose. Kemudian di fiksasi secukupnya hingga kering, agar bakteri yang akan digunakan mati namun organ dan struktur tidak rusak. Selanjutnya apusan bakteri dengan pewarna malakit hijau, masuknya pewarna dalam endospora di bantu dengan, gelas obyek dipanaskan dengan diletakkan pada ram kawat di atas air mendidih hingga timbul uap air dengan menutup preparat dengan kertas saring dan ditetesi dengan malakit hijau agar endospora yang berkembang dapat terwarna hijau dan agar endospora tidak mati (menjaga agar tetap lembab (tidak kekeringan)) selama 10 menit, agar endospora dapat berkembang (memudahkan pengamatan). Setelah itu dinginkan preparat sebentar, selanjutnya preparat di cuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan. Kemudian genangi preparat dengan pewarna safranin selama 1 menit, di cuci dengan air mengalir agar endospora dapat terwarna dengan baik. Preparat
ditiriskan dengan kertas saring dan diamati di bawah mikroskop, endospora akan tampak berwarna hijau dan sel vegetatif akan tampak berwarna merah (Scienceprofonline, 2008).
4.3 Data Hasil Pengamatan
Tabel 1. Data hasil pewarnaan bakteri dan endospora No
1
Isolat
BP 1.3
2
BNP 1.1
3
BNP 3.2.
4
BP 8.1
kel
Bentuk
Gram
Perbesaran
Uji KOH 3%
Endospora
1
Basil
-
1000x
Ada
B.subtilis Ada
2 3 4 5 6 7 8
Basil Basil Basil Basil Basil Basil Basil
+ + -
1000x 1000x 1000x 1000x 1000x 1000x 1000x
Ada Tidak ada Tidak ada Ada Ada Ada Ada
Ada Ada Ada Ada Ada Ada Ada
Tabel 2. Data hasil pewarnaan kapang No Isolat Kelompok 1 KNP 6.1 1
Spora Bentuk : Bulat
Sporangium Ada
Hifa Sporangiofor Tidak bersekat, Ada
cabang, tidak rapat Ujung :
2
Tumpul Jenis : Satu Bentuk : Bulat
Ada
Tidak bersekat,
Ada
cabang, tidak rapat Ujung :
2
KP 5.3
3
Tumpul Jenis : Satu Bentuk : Bulat
Tidak ada
Tidak bersekat,
Tidak ada
cabang, tidak rapat Ujung :
4
Tumpul Jenis : Satu Bentuk : Bulat
Tidak ada
Tidak bersekat,
Tidak ada
cabang, tidak rapat Ujung :
3
KP 4.1
5
Tumpul Jenis : Satu Bentuk :
Tidak ada
Lonjong Ujung : Lancip Jenis : Dua :
Bersekat,
Tidak ada
cabang, rapat
Besar dan 6
Kecil Bentuk :
Tidak ada
Lonjong Ujung : Lancip Jenis : Dua :
Bersekat,
Tidak ada
cabang, rapat
Besar dan 4
KP 5.1.
7
Kecil Bentuk : Bulat
Ada
Tidak bersekat,
Ada
cabang, tidak rapat Ujung :
8
Tumpul Jenis : Satu Bentuk : Bulat
Ada
Tidak bersekat,
Ada
cabang, tidak rapat Ujung : Tumpul Jenis : Satu 4.3 Analisa Hasil
Data hasil pengamatan menunjukkan bahwa isolate BP 1.3, BNP 3.2 dan BP 8.1 merupakan bakteri gram negatif dan berbentuk basil jika diamati pada mikroskop dengan perbesaran 1000x. Preparat BNP 1.1 merupakan bakteri gram positif, namun terdapat bentuk yang berbeda yang dikarenakan kurang telitinya praktikan dalam mengamati bentuk bakteri. Pewarnaan endospora
menggunakan bakteri Bacillus subtilis, dimana bakteri ini mempunyai endospora yang ditandai dengan warna hijau. Data hasil pengamatan pada pewarnaan kapang menunjukkan bahwa terdapat variasi bentuk pada kapang tersebut antara lain bentuk spora yang bulat dan lonjong, ujung tumpul dan lancip, terdiri atas satu macam atau dua macam spora. Ada yang memiliki sporangium dan ada pula yang tidak mempunyai sporangium. Hifa ada yang bersekat dengan cabang yang tidak rapat, ada pula hifa yang bersekat dengan cabang rapat. Ada yang memiliki sporangiofor dan ada pula yang tidak memiliki sporangiofor. Bakteri dan kapang, baik yang tercemar maupun yang tidak tercemar pestisida akan mempunyai karakteristik yang sama berdasarkan hasil pewarnaan yang telah dilakukan. Hal ini menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan morfologi yang berarti antara bakteri dan kapang yang tercemar maupun yang tidak tercemar. Pada pewarnaan Gram yang dilakukan digunakan gram A, gram B, gram C, dan gram D. Gram A merupakan cat yang terdiri dari campuran kristal violet 2 gram, etil alkohol 95% 20 ml, ammonium oksalat 0,8 gram, aquades 80ml. Kristal violet merupakan bahan kimia dengan rumus kimia C18H15 N3O3, bukan merupakan bahan kimia berbahaya, dan biasa digunakan dalam teknik pewarnaan microscopy Certistain (Merck, 2007). Gram B merupakan merupakan cat yang terdiri dari campuran yodium 1 gram, kalium yodida 2 gram, akuades 300ml. Gram B merupakan larutan mordan yang berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri lebih kuat, memperjelas warna dari zat warna tersebut, mempersulit pelarutan zat warna. Pada pewarnaan gram , penambahan larutan mordan menyebabkan terbentuknya persenyawaan kompleks kristal violet-yodium. Tanpa penambahan larutan mordan, zat warna kristal violet akan larut saat penambahan larutan pemucat. Gram C merupakan cat yang terdiri dari campuran aseton 50ml dan etil alkohol 95%50ml. Gram C merupakan larutan pemucat . larutan pemucat berfungsi untuk melarutkan lipida pada membrane bakteri gram negative yang akan menyebabkan pori-pori sel membesar sehingga meningkatkan daya larut persenyawaan kristal violet-yodium. Gram D merupakan cat yang terdiri dari campuran safranin 0, 25 gram , etil alkohol 95% 10ml, dan akuades 90ml. Safranin pada gram D tidak akan menyebabkan perubahan warna pada bakteri positif karena persenyawaan kompleks kristal violet-yodium tetap terikat pada dinding sel. Pada bakteri gram negatif penambahan safranin akan menyebabkan warna bakteri berubah menjadi merah karena
warna ungu yang dihasilkan oleh kristal violet-yodium telah luntur dengan lisisnya membran sel sehingga safranin dapat terikat. Oleh sebab itu, gram D atau zat pewarna kedua berfungsi sebagai pembeda terhadap zat warna kristal violet (Lay, 1994). Tabel 3. Perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif (Filzahazny, 2008) No. 1
Perbedaan Dinding sel
Bakteri Gram Positif (+) Bakteri Gram Negarif (-) Lapian peptidoglikan tebal Lapian peptidoglikan lebih
1-4% (Lebih rendah) Lebih pekat
tipis 11-22% (Lebih tinggi) Larut
Kepekaan terhadap Yodium
Lebih peka
Kurang peka
Toksin yang dibentuk
Eksotoksin
Endotoksin
5 6
Resistensi terhadap tellurit
Lebih tahan
Lebih peka
7
Sifat tahan asam
Ada yang tahan asam
Tidak ada yang tahan asam
8
Kepekaan terhadap penisilin
Lebih peka
Kurang peka
9
Kepekaan terhadap
Tidak peka
Peka
10 11 12
streptomisin Penghambatan warna Ketahanan terhadap fisik Kebutuhan nutrien
Lebih dihambat Lebih tahan Kompleks
Kurang dihambat Kurang tahan Relatif
2 3
Kadar lipid Resistensi terhadap alkali (1% KOH)
4
Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik. Komponen endospora mempunyai resistan terhadap agen kimia yang kuat pada spore coat, yang terdiri dari cross-linked keratin. Identifikasi dapat dilakukan dengan melihat morfologi, lokasi, dan ukuran endospora. Beberapa endospora mempunyai diameter lebih besar daripada sel,
dimana sel tersebut akan nampak menggembang pada letak endosporanya. Letak endospora yang berbeda diantara spesies bakteri dapat digunakan untuk identifikasi. Tipe utama diantara terminal, subterminal dan sentral. Tipe sentral atau tengah merupakan lokasi dari sel vegetatif yang letaknya tepat di tengah. Tipe terminal memiliki pengertian letak sel vegetatif diantara ujung dan pinggir dari sel vegetatif. Tipe subterminal berarti lokasi endosporanya diantara tengah dan pinggir dari sel vegetatif. Endospora dapat berukuran lebih besar ataupunkecil dari sel vegetatif yang terdiri dari lapisan protein yang terbuat dari keratin. Spora ini memiliki resistensi yang tinggi terhadap pewarnaan, prosedur pewarnaan dengan malakit hijau adalah dengan pemanasan. Endospora merupakan metode pertahanan hidup yang bukan bertujuan untuk reproduksi. Contohnya Bacillus subtilis memiliki endospora yang terletak di subterminal (Scienceprofonline, 2008). Komposisi dari Lactophenol Cotton Blue yaitu kristal, cotton blue 0,075 g berfungsi untuk memberi warna pada sel kapang, asam laktat 20 ml yang berfungsi untuk menjernihkan latar belakang dan mempertajam struktur kapang, gliserol 40 ml berfungsi menjaga fisiologi sel dan menjaga sel terhadap kekeringan, kristal fenol + air panas 70oC untuk membunuh jamur, dan air suling 40 ml (Waluyo, 2007). Kelebihan dan kekurangan pengecatan gram (Nirwati, 2001): Kelebihannya adalah: pengecatan gram penting sebagai pedoman awal untuk memutuskan terapi antibiotik, sebelum tersedia bukti definitif bakteri penyebab infeksi (kultur dan kepekaan bakteri terhadap antibiotik). Hal ini dikarenakan bakteri gram positif dan negatif mempunyai kepekaan yang berbeda terhadap berbagai jenis antibiotika. Kadang-kadang morfologi bakteri yang telah dicat gram mempunyai makna dignostik. Misalnya pada pemeriksaan gram ditemukan gram negatif diplococci intraseluler dari spesimen pus (nana), uretral, maka memberikan presumptive diagnosis untuk penyakit infeksi g onoro. Kekurangannya adalah pengecatan gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak yakni lebih dari 104 ml per ml. Sampel yang cair dengan jumlah kecil mikroorganisme misalnya cairan serebrospinal, memerlukan prosedur sentrifuge dulu untuk mengkonsentrasikan mikroorganisme tersebut. Pellet (endapan hasil sentrifuge) kemudian dilakukan pengecatan untuk diperiksa secara mikroskopis.
5.1 Kesimpulan
Teknik pembuatan sediaan apusan (preparat) dapat dilakukan dengan mensuspesikan biakan bakteri dengan aquades, kemudian difiksasi. Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah pewarnaan Gram dan Ziehl‐ Nelsen. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui
morfologi,
struktur,
dan
karakteristik
bakteri.
Pewarnaan
Gram
dapat
mengidentifikasi penyakit infeksi. Prosedur pewarnaan Gram dimulai dengan pemberian kristal violet, setelah itu ditambahkan larutan iodium maka semua bakteri akan berwarna biru. Setelah itu ditambah alkohol. Bakteri Gram positif membentuk kompleks Kristal iodine yang berwarna biru. Setelah di tambahkan safranin, bakteri Gram positif akan berwarna ung u. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik. Letak endospora yang berbeda diantara spesies bakteri dapat digunakan untuk identifikasi, tipe utama diantaranya ialah terminal, subterminal dan sentral.
DAFTAR PUSTAKA
Assani, S. 1994. Mikrobiologi Kedokteran. Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia,
Jakarta.
Cappuccino, J. G. & Natalie. S. 1983. Microbiology A Laboratory Manual. Addison-Wesley Publishing Company, New York. Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan I. Gramedia. Jakarta Filzahazny., 2008, , http:/wordpress.com/Penganta-tentang-bakteri.htm. Diakses pada tanggal 26 April 2010 Gozali.
Amir.
2009.
Pewarnaan
gram.
http://www.gozali.blogspot.com/gram/pewarnaan-gram-
prinsip.html . Diakses pada tanggal 26 April 2010 Hadiotomo, Ratna Siri., 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Pt Gramedia. Jason. 2009. The Gram Stainning. http://astro.temple.edu/~jasoncg/ID/ microreporting.htm. Diakses pada tanggal 26 April 2010 Lay, B.W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada. Jakarta. Levine, M. 2000. An Introduction to Laboratory Technique in Bacteriology. McMillan Company, New York. Madigan, M.T. 2003. Brock Biology of Microorganism. Pearson Education, inc. United State of America.
Merck
.
2007.
Cresyl
Violet
Acetate.
http://www.merck-chemicals.co.id/cresyl-violet-
acetate/MDA_CHEM105235/p_zyOb.s1LZb0AAAEWZuEfVhTl;sid=2XfBHZapUlXHHd9B9vTSj5pCnREAl69HlgSHhO2CnREAkWqXGgJCVGG. diakses pada tanggal 26 April 2010 Nirwati, Hera. 2001. Pembuatan preparat dan pengecatan dalam petunjuk praktikum mikrobiologi Fakultas kedokteran Universitas Gadjah Mada. Universitas Gadjah Mada press. Yo gyakarta. Partic, Li. 2008. Pewarnaan endospora. http://www.dunia-mikro.blogspot.com/2008/08/pewarnaan endospora. Diakses pada tanggal 26 April 2010 Pelczar, M. J., Chan, E.C.S. 2007. Elements of Microbiology. Mc Graw Hill Book Company. New York. Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti. Jakarta. Sutedjo, M. 1991. Mikrobiologi Tanah. Rineka Cipta. Jakarta. Tracy. 2005. Gram Staining. www.tracy.k12.ca.us/thsadvbio/pdfs/gram%20stain.pdf . Diakses pada tanggal 26 April 2010 Umsl. 2008. Staining Bacteria. www.umsl.edu/~microbes/pdf/stainingbacteria.pdf . Diakses pada tanggal 26 April 2010 Volk & Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar. Pen erbit Erlangga. Jakarta Waluyo, L . 2007 . Mikrobiologi Umum . Universitas Muhammadiyah Malang Press. Malang.
Pewarnaan Malachite Green
Pewarnaan malachite green adalah pewarnaan yang biasanya digunakan untuk melihat bakteri batang pembentuk spora. Untuk membuat larutan malachite green dapat digunakan bahan kimia dari Malachite Green Oxalate dari Sigma Aldrich atau dari Fisher Scientific.
Untuk membuatnya , larutkan 5 gram Malachite Green Oxalate dalam 100 ml Aquadest. Untuk konfirmasi spora, panaskan sample 80 derajat C selama 10 menit. yakinkan bahwa media sudah mencapai suhu tersebut sebelum inokulasi. Pindahkan dan dinginkan dalan kotak es. Kemudian inkubasi pada temperatur optimum microbe selama 5 - 7 hari. Spora akan tumbuh sedangkan bakteria vegetative akan mati. Selain itu, terdapat beberapa tekhnik yang dapat digunakan untuk manganalisa bakteri batang pembentuk spora. ( masih bahasa asli, takut salah translatenya ) 1. POPPING TEST. Immerse suspect culture in an acidic oxidizer (e.g. 0.1% KMnO4 in 0.3 N HNO3). The spore cortex ruptures and the cellular milieu spills out for staining with basic dyes. Mount a dried film of the suspected spores on as a dried film on a slide; expose to the reagent for 10 - 20 minutes; observe under oil immersion without staining or with staining.
2. Negative Staining. Use 7% (w/v) nigrosin and observe for highly refractile elliptical or spherical bodies. 3. Dorner Spore Stain. Heat fix the suspension on a slide and cover with thin filter paper cut to fit; saturate with carbolfuchsin and steam for 10 min.; remove paper and decolorize with acid-alcohol for 1 min. and rinse with tap water; blot dry; place a drop of nigrosin on the smear and cover with another slide; slowly draw the two apart to form a thin film; cover with a cover slip or dry; observe. The endospore is red. (This is also called "Flemming's Stain"). 4. Alternate Dorner Spore Stain. In a test tube mix an aqueous suspension of the culture with an equal volume of carbolfucshin; heat in a boiling water bath for 10 min.; Mix 1 loopful of 7% nigrosin with 1 loopful of the stained suspension on a glass slide; mix and spread until a thin film forms and dries; examine
eberapa spesies bakteri tertentu dapat membentuk spora. Spora dihasilkan di dalam tubuh vegetatif bakteri tersebut, dapat berada di bagian tengah (central), ujung (terminal) ataupun tepian sel. Pelczar (1986), menyatakan bahwa spora merupakan tubuh bakteri yang secara metabolik mengalami dormansi, dihasilkan pada faselanjut dalam pertumbuhan sel bakteri yang sama seperti asalnya, yaitu sel vegetatif. Spora bersifat tahan terhadap tekanan fisik maupun kimiawi.
Santoso (2010) menyebutkan bahwa ada dua genus bakteri yang dapat membentuk endospora, yaitu genus Bacillus dan genus Clostridium.Strukturspora yang terbentuk di dalamtubuh vegetative bakteri disebut sebagai ‘endospora’ (endo=dalam, spora=spora) yaitu spora yang terbentuk di dalam tubuh. Secara sederhana, dapat dikatakan bahwa endospora merupakan sel yang mengalami dehidrasi dengan dinding yang mengalami penebalan serta memiliki beberapa lapisan tambahan. Dengan adanya kemampuan untuk membentuk spora ini, bakteri tersebut dapat bertahan pada kondisi yang ekstrim.Menurut Pelczar (1986) bakteri yang dapat membentuk endospore ini dapat hidup dan mengalami tahapan-tahapan pertumbuhan sampai beberapa generasi, dan spora terbentuk melalui sintesis protoplasma baru di dalam sitoplasma sel vegetatifnya. Menurut Volk & Wheeler (1988), dalam pengamatan spora bakteri diperlukan pewarnaan tertentu yang dapat menembus dinding tebal spora. Contoh dari pewarnaan yang dimaksudkan oleh Volk & Wheeler tersebut adalah dengan penggunaan larutan hijau malakit 5%, dan untuk memperjelas pengamatan, sel vegetative juga diwarnai dengan larutan safranin 0,5% sehingga sel vegetative ini berwarna merah. Dengan demikian ada atau tidaknya spora dapat teramati, bahkan posisi spora di dalam tubuh sel vegetative juga dapat diidentifikasi.Namun ada juga zat warna khusus untuk mewarnai spora dan di dalam proses pewarnaannya melibatkan treatment pemanasan, yaitu; spora dipanaskan bersamaan dengan zat warna tersebu tsehingga memudahkan zat warna tersebut untuk meresap ke dalam dinding pelindung spora bakteri. Beberapa zat warna yang telah disebutkan di atas, dapat mewarnai spora bakteri, tidak lepas dari sifat kimiawi dinding spora itu sendiri.Semua spora bakteri mengandung asam dupikolinat.Yang mana subtansi ini tidak dapat ditemui pada sel vegetatif bakteri, atau dapat dikatakan, senyawa ini khas dimiliki oleh spora.Dalam proses pewarnaan, sifat senyawa inilah yang kemudian dimanfaatkan untuk di warnai menggunakan pewarna tertentu, dalam hal ini larutan hijau malakit. Sedangkan menurut pelczar (1986), selain subtansi di atas, dalam spora bakteri juga terdapat kompleks Ca2+dan asam dipikolinan peptidoglikan. Proses pembentukan spora disebut sprorulasi, pada umumnya proses ini mudah terjadi saat kondisi medium biakan bakteri telah memburuk, hal ini sesuai dengan kenyataan bahwa, sampel yang diambil dalam praktikum ini berasal dari biakan bakteri yang dibuat beberapa minggu yang lalu, sehingga di asumsikan, nutrisi di dalam medium telah hampir habis, sehingga diharapkan bakteri melakukan proses sporulasi ini. Haapan ini terbukti benanr dengan kenyataan bahwa dari kedua sampel yaitu koloni 1 dan koloni 2, keduanya sama-sama menghasilkan spora. Namun menurut Dwijoseputro (1979) beberapa bakteri mampu membentuk spora meskipun tidak dalam keadaan ekstrem ataupun medium yang kurang nutrisi. Hal ini dimungkinkan karena bakteri tersebut secara genetis, dalam tahapan pertumbuhan dan perkembangannya memang memiliki satu fase sporulasi. Masih menurut Dwijoseputro (1979) jka medium selalu diadakan pembaruan dan kondisi lingkungan disekitar bakteri selalu dijaga kondusif, beberapa jenis bakteri dapat kehilangan kemampuannya dalam membentuk spora. Hal ini dimungkinkan karena struktur bakteri yang sangat
sederhana dan sifatnya yang sangat mudah bermutasi, sehingga perlakuan pada lingkungan yang terus menerus dapat mengakibatkan bakteri mengalami mutasi dan kehilangan kemampuannya dalam membentuk spora. Proses pembentukan spora di dalam sel vegetatif bakteri, terjadi dalam beberapa tahapan, secara singkat bagan proses pembentukan spora bakteri di atas dapat dijelaskan sebagai berikut: 1. Terjadi kondensasi DNA pada bakteri yang akan membentuk spora 2. Terjadi pembalikan membran sitoplasma, sehingga, lapisan luar membran kini menjadi lapisan dalam membran (calon) spora. 3. Pembentukan korteks primordial (calon korteks) 4. Pembentukan korteks 5. Spora terlepas dan menjadi spora yang bebas, pada tahap 5 ini,jika spora mendapatkan lingkungan yang kondusif, maka ia bisa tumbuh menjadi satu sel bakteri yang baru. (sumber: FMIPA UPI) Spora bakteri ini dapat bertahan sangat lama, ia dapat hidup bertahun-tahun bahkan berabad-abad jika berada dalam kondisi lingkungan yang normal. Kebanyakan sel vegetatif akan mati pada suhu 60-70oC, namun spora tetap hidup, spora bakteri ini dapat bertahan dalam air mendidih bahkan selama 1 jam lebih. Selama kondisi lingkungan tidak menguntungkan, spora akan tetap menjadi spora, sampai kondisi lingkungan dianggap menguntungkan, spora akan tumbuh menjadi satu sel bakteri yang baru dan berkembangbiak secara normal (Volk & Wheeler, 1988).
PEWARNAANENDOSPORAPADABAKTERI
Endospora adalah struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa jenis bakteri. Karena kandungan air endospora sangat rendah bila dibandingkan dengan sel vegetatifnya, maka endospora berbentuk sangat padat dan sangat refraktil bila dilihat di bawah mikroskop. Endospora sangat sukar diwarnai dengan pewarna biasa, sehingga harus digunakan pewarna spesifik dan yang biasa digunakan adalah malachite green [1]. Dua jenis bakteri yang dapat membentuk spora misalnya Clostridium dan Bacillus. Clostridium adalah bakteri yang bersifat anaerobic, sedangkan Bacillus pada umumnya bersifat aerobic. Struktur endospora mungkin bervariasi untuk setiap jenis spesies, tapi umumnya hamper sama. Endospora bakteri merupakan struktur yang tahan terhadap keadaan lingkungan yang ekstrim misalnya kering, pemanasan, dan keadaan asam [3]. Bakteri pembentuk spora lebih tahan terhadap desinfektan, sinar, kekeringan, panas, dan kedinginan. Kebanyakan bakteri pembentuk spora tinggal di tanah, namun spora bakteri dapat tersebar di mana saja [3].
METODE PENGECATAN ENDOSPORA Endoso End osopor pora a tid tidak ak mud mudah ah diw diwarn arnai ai den dengan gan zat pew pewarn arna a pad pada a umu umumny mnya, a, tetapi sekali diwarnai, zat warna tersebut akan sulit hilang. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode pengecatan spora secara umum. Pada metode Schae Sc haeff ffer er-F -Ful ulto ton n yan yang g ban banya yak k di dipak pakai ai da dala lam m pe peng ngec ecat atan an en endo dosp spor ora, a, endo en dosp spor ora a di diwa warn rnai ai pe pert rtam ama a de deng ngan an ma mala lach chit ite e gr gree een n de deng ngan an pr pros oses es pema pe mana nasa san. n. La Laru ruta tan n in inii me meru rupa paka kan n pe pewa warn rna a ya yang ng ku kuat at ya yang ng da dapa patt berpen ber penetr etrasi asi ke dal dalam am end endosp ospora ora.. Set Setela elah h per perlak lakuan uan mal malach achite ite gre green, en, biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin. Teknik ini akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah muda pada sel vegetatifnya [2]. Langkah-langkahnya sebagai berikut. 1.Gunakan teknik aseptis, siapkan biakan bakteri dalam kondisi udara yang kering dan dengan pemanasan yang baik. 2.Siapkan waterbath yang dipanaskan. 3.Tutup gelas preparat dengan selembar tisu dan letakkan pada rak di atas waterbath. 4.Tetesi dengan malachite green 5.Panaskan gelas preparat selama 5 menit. 6.pi 6. pind ndahk ahkan an ge gela las s pr prep epara aratt da dari ri wa wate terb rbat ath h da dan n am ambi bill ke kert rtas as ti tisu su dar darii preparat. 7.Biarkan gelas preparat dingin lalu cuci dengan air deionisasi. 8.Keringkan dan tambahkan safranin, diamkan selama 2 menit. 9.Cuci sisa safranin dengan air deionisasi dan keringkan noda. 10.L 10 .Laku akuka kan n pe peng ngam amat atan an pr prep epara aratt de deng ngan an mi mikr kros oskop kop de deng ngan an ba bant ntua uan n minyak emersi. Diantara ciri-ciri utama sel bakteri yang dipelajari adalah ukuran, bentuk, susunan dalam kelompok, struktur sel, dan bagian-bagian lain yang memberi ciri khas bagi pengenalan bakteri tersebut seperti flagel, kapsul, spora dan sebagainya. Motilitas suatu bakteri juga merupakan ciri khas bagi pengenalan bakteri. Yang dimaksud dengan gerak ini adalah sifat atau kemampuan bakteri untuk dapat berpindah tempat dengan menggunakan salah satu bagian tubuhnya. Jadi bukan gerak yang disebabkan oleh pengaruh luar, seperti bergetar b ergetar atau gerak g erak maju mundur yang dise diseba babka bkan n oleh oleh benda benda-b -ben enda da halu haluss yang yang bera berada da dalam dalam cair cairan an susp suspen ensi si,, seba sebaga gaii akiba akibatt pertumbukan molekul-molekul cairan dengan bakteri tersebut (gerak semacam ini disebut gerak Brown). Salah satu bagian tubuh atau organ yang dimaksud adalah flagel. Bakteri dapat bergerak dengan menggunakan menggunakan flagel, flagel, akan tetapi tetapi flagel flagel tidak ditemukan ditemukan pada semua jenis bakteri. Oleh karena itu dapat atau tidaknya bakteri bergerak merupakan salah satu ciri yang dapat digunakan dalam identifikasi bakteri.
Diantara banyak anggota Protista sekurang-kurangnya ada empat gerakan berpindah yang dapa dapatt dibed dibedak akan, an, yait yaitu u gera gerak k amoe amoeboi boid, d, gerak gerak melu melunc ncur ur,, gerak gerak yang yang dise diseba babka bkan n oleh oleh berputarnya sel berbentuk sawa (Spirochaetales), dan gerak yang disebabkan adanya gerak seperti mendayung oleh flagel atau bulu cambuk. Flagel sebagai alat gerak bakteri adalah suatu organ berupa benang yang berpangkal dalam sitoplasma (Indrawati, dkk., 2002) atau flagel adalah semacam untai rambut yang menembus keluar dinding sel dan menimbulkan gerak berenang (Usman, 1987). Sedangkan menurut Pelczar (1986) flagelum adalah embel-embel seperti rambut yang teramat tipis mencuat menembus dinding sel dan bermula dari tubuh dasar, suatu struktur granular tepat di bawah membran sel di dalam dalam sitopl sitoplasm asmaa (jamak (jamak,, flagel flagela). a). Flagel Flagelum um inilah inilah yang menyeba menyebabka bkan n motil motilita itass pada sel bakteri. Flagel tersusun dari tiga atau lebih serat paralel atau melilit memanjang, terbuat dari protein tipe flagelin yaitu semacam miosin, lebih halus dari flagel ialah bulu getar (silia) eukarion. Tiap serta adalah rantai polipeptida berbentuk sawa. Flagel terdiri dari tiga bagian : 1. Tubuh dasar Bagian dasar flagel berhubungan dengan membran sitoplasma dan dinding sel. 2. Struktur seperti kait Struktur Struktur ini terdiri terdiri dari dua (pada bakteri Gram positif) atai empat (pada bakteri Gram negatif) bagian berupa cincin yang melekatkan flagel itu pada membra sitoplasma dan dinding sel. Tersusun dari subunit protein (monomer) yang diatur dalam pola sawa. Hilangnya dinding sel tidak mengganggu flagel, hanya bila dinding sel tidak ada, gerak bakteri itu berkurang. 3. Sehelai filamen panjang di luar dinding sel Bahan filamen berbentuk sawa, biasanya beberapa kali lebih panjang dari selnya sendiri. Lama benar orang tidak tahu dengan pasti, apakah flagel itu tumbuh pada dinding sel ataukah mempunyai akar di dalam sitoplasma, atau mungkinkah flagel itu hanya merupakan kepanjangan protoplasma melalui celah-celah di dalam dinding sel. Elektron mikroskop menunjukan bahwa flagel itu benang-benang protoplasma yang berpangkal pada titik-titik tepat di bawah membran sel; pangkal itu disebut rizoblast (Dwidjeseputro, 1980). Tetapi menurut Usman (1987), terdapat flagel yang memiliki flagel ekstern. Tetapi didalam selnya terdapat strukur yang mirip flagel tepat di bawah pembungkus luar sel, dan dinamakan flagel periplasma, pernah disebut fibril
taks taksis is atau atau endof endofla lage gel. l. Inil Inilah ah yang yang menye menyeba babk bkan an gera gerak k spir spirok okhe heta ta,, teta tetapi pi bagai bagaima mana na terlaksananya masih belum jelas diketahui.
Flagel menurut letak dan jumlahnya jumlahnya merupakan salah satu ciri yang dapat digunakan digunakan dalam identifikasi bakteri. Macam-macam letak flagel: -
monotrik; (monotrich; monos, tunggal; thrix, rambut) satu flagel pada salah satu ujung sel bakteri. Contoh bakteri Pseudomonas bakteri Pseudomonas aeruginosa -
amphitrik; (amphitrich; amphi, dua-dua) satu flagel pada kedua ujung sel bakteri. Contoh
bakteri Spirillum serpens -
lofotrik; (lophotrich; lophos, tumbuh berupa segumpal rambut) lebih dari satu flagel pada
salah satu atau kedua ujung sel bakteri. Contoh Pseudomonas Contoh Pseudomonas flourescens -
peritrik; (peritrich; peri, sekitar) sekitar) flagel keluar dari tiap bagian permukaan sel bakteri. Contoh
bakteri Salmonella typhii -
atrik; tidak ada flagel, umumnya bakteri berbentuk kokus.
Karena ada bukti-bukti bahwa bakteri yang amfitrik itu sebenarnya bakteri yang sedang atau akan membelah diri, maka timbullah pendapat baru untuk mengadakan dua klasifikasi saja mengenai kedudukan flagel, yaitu flagel terminal yang terdapat pada ujung saja seperti Vibrio, Vibrio, dan Pseudomonas,, dan flagel lateral seperti halnya Escherichia halnya Escherichia coli, Spirillum, Spirillum, dan Pseudomonas coli, Proteus vulgaris serta pada beberapa Bacillus beberapa Bacillus dan Clostridium yang dapat bergerak. Sehubungan dengan masalah gerak bakteri ini, dapat diamati suatu fenomena yang disebut serotaksis. Pengamatan terhadap fenomena ini dapat dilakukan di atas kaca objek dan dilihat dengan menggunakan mikroskop. Dalam hal ini yang diperhatikan ialah kemana bakteri itu bergerak: 1. Bila terdapat gerak menuju periferi, bakteri tersebut bersifat aerob obligat 2. Bila terdapat gerak menuju sentrum, bakteri tersebut bersifat anaerob obligat 3. Bila gerak menuju daerah antara periferi dan sentrum, bakteri bersifat mikroaerofil Panjang flagellum biasanya beberapa kali lebih panjang dari selnya, namun diameternya jauh lebih kecil daripada diameter asalnya, misalnya 10 sampai 20 nm. Di dalam keadaan alamiahnya, flagel flagellum lum terlam terlampau pau kecil kecil untuk untuk dapat dapat diliha dilihatt dengan dengan mikros mikroskop kop cahaya. cahaya. Namun, Namun, dengan dengan
prosedur pewarnaan khusus yang menggunakan mordan (suatu substansi yang mengikatkan zat warna pada suatu permukaan), diameter dapat diperbesar dengan cukup untuk membuatnya tampak di bawah mikroskop cahaya. Bukti-bukti tak langsung mengenai adanya flagella dapat diperoleh dengan cara memeriksa bakteri pada preparat basah untuk melihat adanya pergerakan. Untuk memeriksa gerak bakteri dapat dilakukan secara mikroskopik dan makroskopik. Cara mikroskopik ada dua macam, yaitu: 1. Pengecatan flagel 2. Dengan pembuatan preparat Bagi pergerakan silia dan flagella pada mikroorganisme motil dibutuhkan energi. Menurut perkiraan, sebanyak 10 persen dari energi yang dipakai oleh beberapa dari mikrobe ini digunakan untuk pergerakan flagella (Pelczar, 1986). Bukti yang menunjang bahwa ATP dibutuhkan untuk menggerakan flagella berasal dari penelitian sitokimiawi pada bakteri-bakteri motil. Hasil penelitian ini menampakan adanya aktivitas ATPase yang bergantung pada Mg pada situs-situs pada membran tempat munculnya flagella. Hal ini menunjukan baha ATPase terlokalisasi pada area-area ini dan karena itu ATP merupakan sumber energi bagi pergerakan flagella bakteri (Pelczar, 1986).
Bacillus subtilis Jenis Bacilllus terdiri dari 22 spesies, dimana banyak diantaranya ditemukan pada makanan. Bakteri ini bersifat aerobik sampai anaerobik fakultatif, katalase positif, dan kebanyakan bersifat gram positif, hanya beberapa gram variabel. Bentuk spora yang diproduksi oleh Bacillus bermacam-macam, tergantung dari spesiesnya. B.subtilis dan B.cereus memproduksi spora berbentuk silinder yang tidak membengkak (langsing), tidak melebihi diameter 0.9 µm. B.subtilis bersifat mesofilik (bakteri yang hidup baik antara 5 ºC dan 60ºC, sedang temperatur optimumnya ialah di antara 25ºC sampai 40ºC). Bakteri atau kuman ini berbentuk batang lurus, Gram positif, berukuran 1.5 x 4.5 µm, sendiri-sendiri atau tersusun dalam bentuk rantai, bergerak dan tidak bersimpai. B. subtilis temasuk ke dalam golongan bakteri bentuk L atau bakteri yang tidak berdinding sel. Tetapi spesies ini dapat kembali memperoleh kembali dinding aslinya. Pengembalian khususnya dapat dirangsang oleh konsentrasi tinggi gelatin, tetapi dapat pula oleh agar keras, membran filter atau fragmen dinding sel.
Tumbuh pada agar darah membentuk zona haemolisis beta yang lebar. Dapat juga tumbuh pada agar gizi dan lain-lain. Beberapa jenis membuat haemolisis yang dapat larut. Kuman ini bersifat patogen oportunis, menyebabkan infeksi pada telur dan septikimia. Dapat mencemari botol transfusi darah sehingga melisiskan sel darah. B. subtilis menghasilkan antibiotik basitrasin dan subtilin. Bakteri ini juga dapat dipergunakan untuk pengempukan daging, dan penghilang noda pakaian III.2 Tata Kerja : A. Tetes tegak; bersihkan sebuah kaca objek sampai bersih dan bebas lemak. Teteskan satu ose suspensi bakteri di bagian tengah, lihat dengan mikroskop dengan kondensor yang diturunkan dan lensa objektif pembesaran 40x (cahaya lemah). B. Tetes tegak dengan penutup; sama dengan cara A, tetapi menggunakan penutup gelas (cover glass) yang sekelilingnya diberi vaselin. C.
Tetes gantung; bersihkan sebuah kaca objek cekung dengan sebuah kaca penutup.
Disekeliling kaca penutup diberi vaselin. Ditengah kaca penutup, diteteskan 1 ose suspensi bakteri, suspensi tadi jangan dilebarkan, dibiarkan berkumpul ditengah kaca penutup. Tempelkan kaca objek cekung dengan kaca penutup sehingga tetesan tepat di daerah cekung. Lihat dengan mikroskop seperti cara A di atas. Cara makroskopik; dengan menanam bakteri dalam medium setengah padat (medium semi solid). Medium yang digunakan adalah buylon agar dengan konsentrasi agar 0.1 – 0.2% dan dibekukan dalam tabung reaksi secara tegak. Penanaman dilakukan dengan jarum penusuk, yang ditusukan secara tegak ke dalam medium pembiakan tersebut. Selanjutnya diinkubasi pada suhu yang sesuai selama 12-24 jam. Jika gerak positif, seluruh medium menjadi keruh. Jika gerak negatif, maka bakteri yang hidup hanya pada daerah tusukan saja. IV.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Percobaan ini dilakukan pada hari kamis, tanggal 2 Desember 2004. Pada percobaan mengamati motilitas bakteri, praktikan mempergunakan metode tetes gantung. Metode tetes gantung ini dipergunakan untuk mengamati proses kehidupan tertentu, misalnya motilitas dan reproduksi. Metode ini berguna sekali apabila morfologi mikroorganisme yang tengah diperiksa dapat rusak karena perlakuan dengan panas atau bahan kimia ataupun bila organisme tersebut sukar untuk diwarnai.
Hasil yang diperoleh adalah bakteri sampel bergerak naik turun (motil), dan berbentuk basil (silinder). Praktikan tidak dapat menunjukan apakah bakteri sampel bergerak menggunakan organ atau tidak. Karena flagellum terlampau kecil untuk dilihat melalui mikroskop cahaya. Pewarnaan dengan menggunakan mordan juga tidak dilakukan. Tetapi menurut sumber yang diperoleh, B. subtilis bergerak dengan menggunakan organ atau flagel. Bacillus subtilis termasuk gram positif, oleh karena itu diperkiran bakteri tersebut memiliki dua bagian yang membentuk cincin yang melekatkan flagel dengan membran sitoplasma atau dinding sel. Bakteri ini berukuran 1.5 x 4.5 µm, sendiri-sendiri atau tersusun dalam bentuk rantai. Sumber juga mengatakan bahwa Bacillus subtilis ini termasuk dalam klasifikasi flagel berkedudukan lateral. Pada percobaan, objek glass diberikan vaselin, karena vaselin berguna agar suspensi bakteri tidak kering. Vaselin atau jeli petroleum ini juga berfungsi untuk mengurangi laju penguapan dan meniadakan aliran udara.
Dwidjoseputro D., Dr., Prof. 1980. Dasar-dasar Mikrobiologi. Malang: Penerbit Djambatan Fardiaz, Srikandi. 1989. Mikrobiologi Pangan. Bogor: Departemen Pendidikan dan Kebudayaan, Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi, Institut Pertanian Bogor Indarwati, Ida., Ratu Safitri, Mia Miranti. 2002. Praktikum Mikrobiologi Dasar . Sumedang: Jurusan Biologi FMIPA UNPAD MD., Satish Gupte. 1982. Mikrobiologi Dasar Edisi ketiga. Terjemahan Dr. Julius E.S. Jakarta: Binarupa Aksara Pelczar, M.J., dan E.C.S. Chan. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi I . Jakarta: UI Press Suriawiria, Unus Drs.1985. Pengantar Mikrobiologi Umum. Bandung: Penerbit Angkasa Usman, Razali. 1987. Mikrobiologi Dasar . Bandung: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Padjadjaran
Motalitas merupakan salah satu ciri penting pengkarakterisasian bakteri. Sifat ini diakibatkan oleh adanya alat moler cambut yang disebut flagella sehingga sel bakteri dapat berenang didalam lingkungan air. Motilitas sebagaian besar jenis bakteri motil pada suhu relative rendah 15-25◦c dan mungkin tidak motil pada suhu 37◦c. Namun, suatu resiko tersendiri bagi organisme berukuran kecil untuk menerima kenyataan bahwa dengan ukuran tersebut sel bakteri dapat dipengaruhi oleh
aktifitas
molekul
air/
pelarut
disekitarnya
yang dinamakan
Brownian
movement. Gerakan brown adalah gerak partikel koloid yang bergerak dengan arah tak beraturan, gerak acak molekul ini dapat membuat sel bakteri bergoyang-goyang cepat atau lebih tepatnya bergetar tak beraturan sehingga bagi mata yang awas akan terlihat motil. Sel yang berpengaruh gerak brown diamati pada perbesaran 1000x dengan mikroskop cahaya, tentunya dengan preparat sederhana dan media kaldu atau koloni yang dicampur air (anonymous,2010). Sel yang bergerak dengan dorongan flagella akan bergerak lebuh aktif. Jika suatu sel tersebut motil, akan menciptakan jalur gerak yang tak beraturan. Namun untuk gerak brown sel tampk pasif dan seperti bergerak sendiri, mirip pada saat menggetarkan
batang
pensil
dengan
memutarkan
pergelangan
tangan
(Anonymous,2010). Flagella merupakan struktur komplek yang tersusun atas bermacam-macam protein termasuk flagelin yang membuat flagella berbentuk seperti tabung cambut dan protein kompleks yang memanjang dinding sel dan membran sel untuk membentuk seperti cambuk, flagella digunakan bakteri sebagai alat gerak. Bentuk yang umum dijumpai meliputi:
Monopolar monotrikha :bakteri memliki satu flagel yang berada disalah satu ujung sel.
Monopolar lofotrikha: memiliki banyak flagel yang ditemukan pada salah satu kutub sel.
Bipolar amfritrikha: memiliki flagel pada kedua kutubnya dengan jumlah lebih dari satu.
Peritikha: bakteri mempunyai flagel yang tersebar pada seluruh bagian selnya (Kaiser,qary, 2004) Tidak semua bakteri mempunyai daya motilitas, ada bakteri yang tidak mempunyai alat gerak
yaitu flagella sehingga berdasarkan letak dan jumlah
flagel pada sel bakteri, jenis ini digolongkan dalam bakteri ( Anonymous, 2010). Menurut nastutik (2002) kebanyakan sel bakteri dapat bergerak dengan menggunakan flagel, akan tetapi ada bakteri yang tidak dapat bergerak karena lidah memiliki flagel. Hal ini senada dengan penyataan taringan (1988) yang menyatakan bahwa gerak bakteri terjadi pada bakteri yang mempunyai flagel, karena flagel ini merupakan alat gerak bagi sel bakteri. Flagel merupakan bulu cambuk yang dimiliki oleh beberapa jenis bakteri dan letaknya berbeda-beda tergantung kepada spesiesnya. Flagel tersusun atas tiga bagian yaitu:
Pangkal (basal) merupakan bagian yang berhubungan dengan membrane plasma.
Kook yang panjang.
Filamen yang bentuknya seperti benang. Menurut gross (1995) struktur bakteri yang berflagel itu kaku dan dilengkapi dengan gelendong yang berbentuk spiral. Gelendong spiral tersusun atas protein yang disebut dengan flagelin yang merupakan unit dasar penyusun flagella (Anonymous, 2010). Praktikum ini digunakan untuk mengamati gerak atau motilitas bakteri. Metode ini bertujuan untuk mengamati gerak bakteri yang bergera. Pada alat inokulasi bakteri diambil dan ditusukan menggunakan jarum ose pada tabung reaksi yang sudah terisi media dan tabung reaksi dapat dilihat mikroba yang bergerak, pengelompokan bakteri secara natural dan reaksi bakteri terhadap bahan kimia (Anonymous, 2010). Gerak bakteri yang bersifat motil diakibatkan oleh adanya struktur atau organ sel bakteri yang berbentuk benang yang flagelia. Flagella panjang dan
ramping. Pada umumnya memiliki panjang sekitar 12-30 mm. Untuk bisa melihat jelas pergerakan flagella bakteri digunakan zat warna tertentu (Anonymous, 2010). Fariaty (1995) juga mengatakan bahwa gerak brown adalah gerak partikel koloid yang bergerak dengan zig-zag, gerakan ini disebabkan adanya tumbukan antara, molekul-molekul pelarut dengan molekul. Menurut volk (1988) kemampuan suatu organisme bergerak sendiri disebut motilitas (daya gerak). Hamper semua sel bakteri spiral dan sebagian dari sel bakteri basil bersifat motil (bergerak), sedangkan bakteri yang berbentuk kokus bersifat tidak bergerak (non motil). a. Motilitas merupakan salah satu cirri penting pengkarakterisasi bakteri b. Motolitas mikroba yaitu kemampuan bergerak mikroba. c. Flagel merupakan struktur kompleks yang tersusun atas bermacam-macam protein termasuk flagelin yang membuat flagel berbentuk seperti tabung cambuk. d. Gerak brown adalah gerak praktikel koloid yang bergerak dengan zig-zag. e. Kemampuan suatu organisme bergerak sendiri disebut motilitas. f.
Bakteri yang berbentuk kokus bersifat tidak bergerak (non motil).
Anonymous, 2010. Motalitas Bakteri.http//lordbroken wordpress.com/2010/03/06 motalitas bakteri. Gross,1995.introgductary microbiology . London:chaswaan hall university and profesional Hastutik, Sri utami, 2002. Petunjuk praktikum mikro, Malang :UMM press Karser, gery. 2004. Microbiology laboratory manual. Cotons ville campus of the comunity collage of balsimere country Volk, 1988, mikrobiologi dasar . Jakarta: Erlangga.
Motilitas bakteri adalah suatu gerakan bakteri yang disebabkan adanya gerak aktif dan pasif
Gerak aktif adalah gerakan bakteri yang disebabkan karena bakteri memiliki flagel Gerak pasif disebabkan karena factor dari luar (gerak brown)
Gerak brown adalah suatu gerakan yang dapat menggetarkan partikel-partikel secara acak atau terarah karena terus-menerus terkena pukulan molekul-molekul kecil yang tak terlihat yang terdapat dalam cairan.
Motilitas dapat diamati dengan baik pada biakan yang masih baru. Pada biakan yang sudah lama,bakteri sudah mati, sehingga sangat sukar untuk mendapatkan sel yang motil, selain itu produksi asam dan produk yang bersifat racun dapat menyebabkan hilangnya motalitas sel bakteri pada biakan (Volk, 1988). Menurut Taringan (1988) beberapa bakteri dapat melakukan gerakan meluncur yang sangat mulus yang hanya terjadi kalau persentuhan dengan benda padat. Kebanyakan bakteri yang motil dapat mendekati atau menjauhi berbagai senyawa kimia yang disebut kemotaksis. Menurut Volk (1988) kemampuan suatu organisme untuk bergerak sendiri disebut motilitas. Hampir semua sel bakteri spiral dan sebagian dari sel bakteri basil bersifat motil, sedangkan bakteri yang berbentuk kokus bersifat immotil
. keuntungan yang diperoleh dengan penggunaan metode preparat tetes gantung dalam uji motilitas bakteri adalah: a. sel bakteri akan lebih leluasa atau mudah bergerak karena fluida yang menggantung memberikan ruangan yang lebih besar untuk bakteri bergerak, sedangkan fluida yang menempel pada permukaan obyek glass (tidak menggantung), akan membuat bakteri terhimpit sehingga tidak dapat bebas bergerak. b. melalui preparat tetes gantung sel bakteri tidak akan mati terhimpit kaca penutup dan kaca benda, karena pada metode ini kaca benda yang digunakan adalah kaca benda yang cekung pada bagian tenganya. c. karena posisi bakteri yang menggantung diatas cekungan, maka bakteri tidak membahayakan praktikan seandainya saja bakteri tersebut bersifat patogen
d. lebih mudah mengamati gerak sel bakteri karena sel-sel bakteri hanya bergerak sebatas tetesan fluida sebagai media tinggal bakteri. Endospora adalah struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa jenis bakteri. Dua jenis bakteri yang dapat membentuk spora misalnya Clostridium dan Bacillus. Clostridium adalah bakteri yang bersifat anaerobic, sedangkan Bacillus pada umumnya bersifat aerobic. Struktur endospora mungkin bervariasi untuk setiap jenis spesies, tapi umumnya hamper sama. Endospora bakteri merupakan struktur yang tahan terhadap keadaan lingkungan yang ekstrim misalnya kering, pemanasan, dan keadaan asam.
Variasi letak spora : a. Ditengah sel (sentral). Contoh Bacillus Cereus. b. Di ujung sel (terminal). Contohnya Clostridium thuringensis. c. Didekat ujung (sub terminal). Contohnya Clostridium subterminale. Bakteri pembentuk spora lebih tahan terhadap desinfektan, sinar, kekeringan, panas, dan kedinginan. Kebanyakan bakteri pembentuk spora tinggal di tanah, namun spora bakteri dapat tersebar di mana saja. Metode pengecatan spora : •
Metode Scaffer fulton Metode Bartolomev mittwer
•
Metode Klein
•
MetodeWirtz
•
Prosedur Pengecatan a. Metode Scaffer fulton
1. Bersihkan objek glass dengan alkohol agar bebas dari lemak 2. Buat preparat dari biakan yang ada secara aseptik 3. Kering anginkan 4. Lakukan fiksasi di atas nyala api 5. Genangi preparat dengan 2-3 tetes malachite green 5% panasi hingga keluar uap 3 kali, diamkan selama 10 menit 6. Cuci dengan air mengalir 7. Tetesi dengan cat safranin selama 1 menit 8. Cuci dengan air mengalir 9. Preparat dikering anginkan
10. Amati preparat dengan mikroskop ( memakai minyak imersi) 11.
Spora berwarna merah sedangkan bentuk vegetatif berwarna hijau b.Metode Bartolomev mittwer 1. Bersihkan objek glass dengan alkohol agar bebas dari lemak 2. Buat preparat dari biakan yang ada secara aseptik 3. Kering anginkan 4. Lakukan fiksasi di atas nyala api 5. Genangi preparat dengan 2-3 tetes malachite green 5% dan biarkan selama 10 menit, 6. Cuci dengan air mengalir 7. Tetesi dengan cat safranin selama 1 menit 8. Cuci dengan air mengalir 9. Preparat dikering anginkan 10. Amati preparat dengan mikroskop ( memakai minyak imersi) 11. 11. Spora berwarna merah sedangkan bentuk vegetatif berwarna hijau
c.Metode Klein I 1. Campur suspensi bakteri dengan carbol fuschin dalam tabung reaksi dengan perbandingan 1:1. 2. Panaskan dalam penangas air selama10 menit pada temperatur 80 0 C . 3. Buat preparat dari campuran suspensi diatas. 4. Celupkan ke dalam asam sulfat selama 1-2 detik. 5. Cuci dengan air mengalir, lalu genangi methylene blue selama 3 menit. 6. Cuci dengan air, kering anginkan 7. Amati dibawah mikroskop perbesaran 1000x dengan emersi oil 8. Spora berwarna merah sedangkan bentuk vegetatif berwarna biru d. Metode Wirtz
1. Buat preparat dari suspensi bakteri. 2. Genangi dengan malachite green, panaskan sampai menguap kurang lebih selama 2 menit. 3. cuci dengan air mengalir, tambahkan safranin selama 30 detik. 4. Cuci dengan air, keringkan dengan kertas saring. 5. Amati dengan perbesaran1000x dengan emersi oil.
LATAR BELAKANG
Bakteri berasal dari kata “bakterion” (bahasa Yunani) yang artinya tongkat atau benang. Saat ini nama itu dipakai untuk menyebut sekelompok mikroorganisme yang bersel satu, tidak berklorofil (meskipun ada kecualinya), berkembang biak dengan pembelahan diri, serta demikian kecilnya sehingga hanya tampak dengan menggunakan mikroskop. Apabila kita ingin mengetahui sifat-sifat morfologi bakteri, maka bekteri dapat diperiksa dalam keadaan hidup maupun dalam keadaan mati. Pemerikasaan morfologi ini perlu untuk mengenal nama bakteri dan sifat-sifat fisiologi yang merupakan faktor penentu dalam mengenal nama spesiesnya. Pada rangkaian pengamatan bakteri, terdapat cara untuk mengetahui sifat-sifat morfologi tersebut yaitu dengan pewarnaan bakteri. Larutan pewana tidak dapat langsung masuk ke dalam sel hidup. Oleh karena itu, sel biasanya di bunuh dahulu sebelum dilakukan pewarnaan. Sel yang mati akan menyerap dan mempertahankan pewarna. Cara umum untuk membunuh sel adalah dengan fiksasi panas. Sel diapuskan pada gelas objek sehingga diperoleh lapisan tipis. Preparat kemudian dipanaskan pelahan-lahan untuk membunuh sel. Metode mewarnai atau mengecat preparat itu ada banyak sekali antara lain dengan pewarnaan sederhana. Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan mikroorganisme dengan menggunakan satu jenis zat saja. Kemudian ada pewarnaan negatif. Pewarnaan negatif merupakan pewarnaan dengan mencampurkan sampel dengan zat warna dan disebarkan menjadi lapisan tipis. Selanjutnya ada pewarnaan acid-fast. Pewarnaan acid-fast digunakan untuk membedakan bakteri yang tahan asam dengan yang tidak tahan asam. Kemudian
pewarnaan
gram. Pada
tahun
1884,
seorang
ahli
histology
dan
bakteriologiawan dari Denmark, Christian Gram secara kebetulan menemukan prosedur
pewarnaan Gram. Pewarnaan ini mungkin merupakan salah satu prosedur yang amat penting dan paling banyak digunakan dalam klasifikasi bakteri. Dengan metode ini, bakteri dapat dipisahkan secara umum menjadi dua kelompok besar, yaitu pertama, organisme yang dapat menahan kompleks pewarna primer ungu iodium sampai pada akhir prosedur (sel-sel tampak biru gelap/ungu), disebut “Gram positif”. Kedua, organisme yang kehilangan kompleks warna ungu kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol namun kemudian terwarnai oleh pewarna bandingan, safranin (sel-sel tampak merah muda), disebut “Gram negatif”. Pada perkembangan ilmu pangan, pengetahuan akan bakteri sangat dibutuhkan terutama dalam identifikasi jenis bakteri yang berkaitan dengan pangan. Misalnya pemanfaatan bakteri yanag menguntungkan sehingga banyak digunakan dalam industri makanan atau proses pengubahan suatu zat dalam makanan. B. TUJUAN
Tujuan dari praktikum acara Morfologi dan Pewarnaan Bakteri adalah untuk mempelajari morfologi bakteri dan membedakan jenis bakteri dengan cara pewarnaan bakteri menggunakan metode pewarnaan negatif, Gram, dan acid-fast. C. TINJAUAN PUSTAKA
Ziehl-Neelsen adalah metode yang paling umum digunakan. Dinding sel organisme mikrobakteri
mengandung
phitiocerols dan
kompleks lipid
polimetil
asam.
dikenal
sebagai hidroksi
Kompleks
karboksilat
lainnya
lipid
asam, dan
glycolipids telah diisolasi. Karboksilat hidroksi asam yang memiliki sifat tahan luntur asam dan lainnya menyajikan sebuah penghalang untuk pewarna masuk serta elusi. Metode Ziehl-Neelsen ini adalah dengan menambahkan fenol, agen lipofilik untuk larutan dari fuchsin dasar oleh pemanasan dan memperpanjang waktu pewarnaan (Raoul, 2009). Pencarian untuk kecepatan dan keberhasilan telah menghasilkan beberapa modifikasi untuk menyederhanakan metode pewarnaan penerimaan
yang
luas kecuali
ini, pewarnaan ZN menggunakan
ZN. Namun, untuk
0,3%
tidak
metode fuchsin dasar
satupun yang telah
pewarnaan
memperoleh
dingin. Dalam
yang ditemukan
sensitif
studi dan
spesifik untuk yang menggunakan 1% fuchsin dasar. Menggunakan reagen ini dapat menghindari pemborosan fuchsin dasar dan mengurangi biaya pewarnaan. Mengurangi konsentrasi dari fuchsin
dasar
di
bawah
0,3%,
bagaimanapun, ditemukan
mempengaruhi
sensitivitas
ZN (Selvakumar, 2005). Secara garis besar berdasar pengecatan Gram, bakteri dikelompokkan menjadi 2, yaitu Gram positif dan Gram negatif. Bakteri Gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna gram A yang mengandung kistal violet, sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri Gram negatif akan berwarna merah
atau merah muda, karena warna ungu dapat dilunturkan kemudian mengikat cat Gram D sebagai warna kontras. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri. Pada bakteri Gram positif susunan lebih sederhana terdiri atas 2 lapis namun memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal sementara pada dinding sel bakteri lebih kompleks terdiri atas 3 lapis namun lapisan peptidoglikan tipis (Juliantina, 2009). Bakteri Lactobacillus sp. ini termasuk Gram positif, tidak berspora, tidak motil oleh flagel peritrichous, fakultatif anaerob, kadang-kadang mikroaerofilik, sedikit tumbuh di udara tapi bagus pada keadaan di bawah tekanan oksigen rendah, dan beberapa anaerob pada isolasi. Bakteri yang mendekati genus ini mempunyai ciri-ciri morfologi sebagai berikut: warna koloni putih susu atau agak krem, bentuk koloni bulat dengan tepian seperti wol. Sel berbentuk batang dan biasanya tetap, berukuran 0,5-1,2 x 1,0-10,0 μm (Feliatra, 2004). Salah satu teknik pewarnaan diferensial yang paling penting dan paling luas digunakan untuk bakteri adalah pewarnaan Gram. Dalam proses ini olesan bakteri terfiksasi dikenai larutan sebagai berikut : ungu kristal, larutan yodium, alcohol (bahan pemucat), dan safranin atau beberapa pewarna tandingan lain yang sesuai. Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini dibagi menjadi 2 kelompok yaitu Gram positif mempertahankan zat pewarna ungu kristal dan karenanya tampak ungu tua. Kelompok lain, bakteri gram negatif, kehilangan ungu kristal ketika dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi pewarna tandingan dengan merah safranin, tampak bewarna merah (Pelczar, 1986). Bakteri Gram violet sewaktu
negatif adalah bakteri yang
proses pewarnaan
tidak
Gram sehingga
mempertahankan zat
akan
berwarna
merah
warna kristal bila
diamati
dengan mikroskop. Bakteri Gram negatif (seperti E. coli) memiliki sistem membran ganda di mana membran plasmanya diselimuti oleh membran luar permeabel. Bakteri ini mempunyai dinding sel tebal berupa peptidoglikan, yang terletak di antara membran dalam dan membran luarnya. Banyak spesies bakteri Gram negatif yang bersifat patogen, yang berarti mereka berbahaya bagi organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel Gram negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau endotoksin) (Anonima, 2011). Gram negatif yang paling terkenal adalah Veillonella alcalescens (dahulu Micrococcus lactilyticus) dan Megasphaera (dahulu Pepto streptococus). Kedua-duanya tidak mampu untuk meragikan karbohidrat. V. alcalescens ditemukan dalam ludah manusia dan hewan, dan juga perut besar hewan pemamah biak. Bakteri ini meragikan asam-asam organik menjadi propionat, asetat, CO2, H2 (Schlegel, 1994). E.coli adalah suatu bakteri Gram negatif berbentuk batang, bersifat anaerobic fakultatif, dan mempunyai flagella peritrikat. E.coli dibedakan atas sifat scrologinya berdasarkan antigen O (somatik),
K
(kapsul),
H(flagella).
Medium
selektif
yang
dapat
digunakan
untuk
mengisolasi E.coli misalnya DHL (Desoxycholate Hydrogen Sulfide Lactose) Agar atau MacConkey Agar. Koloni E.coli pada DHL dan MacConkey Agar berwarna merah dan dikelilingi oleh areal yang menunjukkan pengendapan bile. E.coli akan menfermentasikan laktosa dalam medium menjadi asam, sehingga mengakibatkan terjadinya pengendapan bile dan penyerapan indikator merah netral (Fardianz,1990). Lactobacillus adalah suatu bakteri berbentuk batang, bervariasi dari panjang dan ramping sampai kokobaksilus pendek. Pembentukan rantai umum dijumpai, terutama pada fase pertumbuhan logaritma lanjut. Tidak membentuk spora. Gram positif berubah menjadi gram negatif dengan bertambahnya umur dan derajat keasaman. Beberapa galur memperlihatkan tubuh-tubuh bipolar, granulasi internal atau penampilan seperti batang dengan reaksi gram atau pewarna biru metilen (Pelczar, 1988). Pewarnaan negatif adalah cara pengamatan mikrobiologi yang biasa dilakukan untuk membedakan
spesimen
kecil
dengan
cairan
optiknya.
Untuk mikroskop medan terang, pewarnaan negatif biasanya menggunakan cairan hitam misal nigrosin. Spesimen seperti bakteri dalam cairan disebar dalam preparat kaca yang dicampur dengan pewarna negatif dan dibiarkan kering. Ketika diamati dengan mikroskop, bakteri atau kadang sporanya terlihat bersinar dengan latar belakang yang gelap. Pewarnaan negatif atau pewarna asam dapat terjadi karena senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral, dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel. Oleh karena itu sel menjadi tidak berwarna. Contoh pewarna yang biasa digunakan yaitu tinta cina, larutan nigrosin, asam pikrat dan eosin (Anonim b, 2011). Bakteri tahan asam adalah bakteri yang pada pengecatan Ziehl-Neelsen (ZN) tetap mengikat warna pertama, tidak luntur oleh asam dan alkohol, sehingga tidak mampu mengikat warna kedua. Bakteri tersebut ketika diamati dibawah mikroskop tampak berwarna merah dengan warna dasar biru muda. Terdapat lebih dari 50 spesies Mycobacterium, antara lain banyak yang merupakan saprofit (Anonimc,2011). Prosedur pewarnaan yang umum digunakan pada masa kini yaitu pewarna Ziehl – Neelsen, prosedur ini menggunakan pewarna utama dengan pemanasan, dan biru metilena loeffler sebagai warna tandingan. Alkohol-asam merupakan pemucat yang sangat intensif dan jangan dikelirukan dengan alkohol aseton yang banyak digunakan dalam pewarnaan gram. Pada kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat warna itu dikatakan tahan asam dan tampak merah. Pada bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai
sel
dapat
dengan mudah dipucatkan
dikatakan tak tahan asam (Hadioetomo, 1990) D. METODOLOGI
oleh alkohol
asam dan
karenanya
1 a. b. c. d. e. f. g. h. i. 2. a. b. c. d. e. f. g. h. i. j. k.
1. Alat Gelas objek Gelas penutup Batang gelas Jarum oose Pipet tetes Rak tabung reaksi Bunsen spirtus Label dan tissue Mikroskop cahaya Bahan Biakan murni Lactobacillus achidophilus, Escherichia coli dan Lactococcus sp. Larutan cat nigrosin Aquades Alkohol 70% Larutan cat Ziehl Neelsen carbol fuchsin Larutan peluntur alkohol asam Larutan penutup Loeffler methylen blue Larutan cat Huker’s crystal violet Larutan mordan Lugol’s iodine Larutan peluntur alkohol-aseton Larutan Safranin E. Hasil Pengamatan dan Pembahasan
Pewarnaan Gram termasuk pewarnaan differensial karena dapat digunakan untuk membedakan bakteri dalam dua kelompok besar yaitu Gram positif dan Gram negatif. Pada praktikum ini digunakan bakteri L. Achidophilus, E. coli, Lactococcus sp. Pemberian kristal violet pada bakteri Gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan Gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri Gram positif mengandung protein dan Gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri Gram negatif sedangkan pada bakteri Gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu. Perbedaan dasar antara bakteri Gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan
pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri Gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm). Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalahfase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV (warna utama) iodine lepas
dari
sel.
Pemberian
ethanol
jangan
sampai
berlebih
yang
akan
menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada Gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa spesies yang memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter. Pembahasan Pewarnaan acid-fast digunakan untuk membedakan antara bakteri tahan asam dan bakteri tidak tahan asam. Pewarnaan ini dilakukan pada bakteri tahan asam dalam proses warna akibat alkohol-asam, dan penggunaan pembalik warna pada tahap akhir dari proses sehingga menghasilkan warna merah. Pewarnaan menggunakan larutan Ziehl-Neelsen akan menampakkan bakteri tahan asam yang berwarna merah dengan latar berwarna biru. Bakteri tahan asam akan mempertahankan warna pertama yang diberikan. Hasil yang didapat adalah terdapatnya bakteri tahan asam. Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Pembahasan Pewarnaan negatif merupakan pewarnaan dengan mencampurkan sampel dengan zat warna dan disebarkan menjadi lapisan tipis. Zat warna atau cat yang digunakan memiliki pengaruh yang lemah terhadap sel mikroorganisme. Pewarnaan ini dinamakan pengecatan negatif karena sel tidak diwarnai dan dibuat menjadi kasat mata karena latar belakang yang gelap.
Pada praktikum ini digunakan bakteri Lactobacillus achidophilus. Pewarnaan negatif ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina. Pewarnaan negatif atau peawarna asam dapat terjadi karena senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral, dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel. Oleh karena itu sel menjadi tidak berwarna. Untuk pengamatan menggunakan mikroskop elektron transmisi, kemampuan optis elektron berhubungan dengan nomor atom. Beberapa pewarna negatif seperti ammonium
molybdate,
uranil
acetate,
uranyl
foemate,
phosphotungstic
acid
dan
auroglucotnionate dipilih karena mampu menyebarkan elekron dengan baik dan menyerap zat biologi dengan baik. Struktur yang dapat diamati dengan pewarnaan negatif lebih sedikit dari pada dengan pewarnaan biasa. Cara ini biasa digunakan untuk melihat virus, bakteri, flagel bakteri, struktur protein atau gabungan protein biologi membran yang memiliki pancaran elektron dengan kekuatan rendah. Pewarnaan negatif pada mikroskop cahaya atau mikroskop elektron tidak menimbulkan penularan mikroorganisme. Walau demikian keamanan harus tetap diperhatikan. Berbeda dengan pewarnaan lain, pewarnaan negatif memungkinkan organisme terlihat transparan dan tampak jelas diantara medan yang gelap karena pewarna tersebut tidak menembus mikroorganisme. Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini juga berguna untuk bakteri-bakteri tertentu yang sukar diwarnai. F.
Kesimpulan Kesimpulan yang didapatkan dari praktikum Morfologi dan Pewarnaan Bakteri ini antara lain: a. Bakteri Gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang tebal (2550nm) sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm). b. Kelompok bakteri yang merupakan Gram positif adalah L. Achidophyllus dan Lactococcus sp. Sedangkan kelompok bakteri yang merupakan Gram negatif adalah E. coli. c. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri Gram negatif karena akan kehilangan cat utama setelah tahap dekolorasi sedangkan pada bakteri Gram positif menyebabkan sel menjadi berwarna ungu karena mengikat kuat cat utama dan tidak dapat dilunturkan oleh bahan peluntur. d. Pewarnaan menggunakan larutan Ziehl-Neelsen akan menampakkan bakteri tahan asam yang berwarna merah dengan latar berwarna biru karena tahan terhadap pencucian dengan asam dan alkohol sehingga mempertahankan warna pertama yang diberikan. Sedangkan bakteri tidak tahan
