LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA (BI-2105)
KROMATOGRAFI PIGMEN MATA Drosophila melanogaster Tanggal Praktikum: 26 September 2014 Tanggal Pengumpulan: 3 Oktober 2014
Disusun oleh : Dary Aulia Muhammad 10613016 Kelompok 13
Asisten : Sandika Restiana 10611044
PROGRAM STUDI BIOLOGI SEKOLAH ILMU DAN TEKNOLOGI HAYATI INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG BANDUNG 2014
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Pada tahun 1941, Beadle dan Tatum merumuskan istilah “one gene one protein”, yang berartikan, “di dalam suatu gen terdapat satu protein”. Pada tahun tersebut juga, mereka melakukan percobaan terhadap jamur Neurospora crassa yang dikenal sebagi jamur roti merah. Beadle dan Tatum mengarahkan sinar UV ke jamur tersebut yang menyebabkan mutasi, dan mereka mengamati bahwa beberapa jamur mengalami kehilangan kemampuan memproduksi senyawa organik tertenti untuk bertahan hidup. Mereka menambahkan senyawa berbeda namun serupa dan menyaksikan bila jamur menggunakan enzim tersebut, ternyata terjadi reaksi kimia yang menyintesis bahan kimia yang diperlukan. Akhirnya disimpulkan bahwa karakteristik fungsi gen adalah mengendalikan sintesis enzin tertentu. (Judd, 2010) Setelah melakukan percobaan tersebut, akhirnya Beadle dan Tatum menarik hipotesis bahwa gen mengkode enzim dan mereka juga berhipotesis bahwa satu gen menyintesis satu enzim ( one gene one enzyme). Namun beberapa puluh tahun kemudian, teori one gene one enzyme yang disusun oleh Beadle dan Tatum akhirnya terbantahkan. Hal ini didasarkan pada ditemukannya suatu fakta bahwa gen mengkode protein yang tidak hanya berfungsi sebagai enzim saja. Selain itu, beberapa protein tersusun dari dua atau lebih enzim. Dengan ditemukannya hal tersebut, teori one gene one enzyme Beadle dan Tatum dimodifikasi menjadi teori one gene one protein. (Judd, 2010) Manfaat percobaan yang dilakukan Beadle dan tatum adalah mereka membuktikan bahwa pembentukan enzim atau kelompok enzim diatur oleh gen atau kelompok gen dalam kromosom. Mereka
menemukan gen pengendali sintesis protein dan enzim
yang
disimpulkan dala suatu teori “one gene, one enzyme”. (Judd, 2010)
1.2 Tujuan Adapun tujuan dari praktikum ini adalah : 1. Menentukan nilai Rf dari hasil kromatografi pigmen mata Drosophila melanogaster 2. Menentukan kelompok pigmen mata pada mutan berdasarkan hasil pemberian sinar UV
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Hubungan Gen, Protein, DNA dan Enzim Gen merupakan bagian dari kromosom (DNA) yang dapat ditranskripsi dan ditranslasi sehingga menghasilkan suatu protein. DNA menentukan sifat makhluk hidup, menentukan urutan asam amino pada setiap protein yang disintesis. DNA mengontrol metabolisme dengan memerintahkan sel untuk menghasilkan enzim spesifik dan protein lain. Diantara fungsi protein di dalam sel adalah sebagai enzim yang mengkatalisis reaksi yang terjadi ataupun sebagai protein struktural yang membentuk sel (Beament, 1970). DNA berada di inti sel (nukleus) dan tidak dijumpai di sitoplasma. Protein yang berperan dalam metabolisme ada di sitoplasma dan tidak ada di inti. Oleh karena itu perlu adanya penghubung antara DNA dengan protein, yaitu molekul yang terdapat di inti maupun di sitoplasma, yakni RNA. Transkripsi dan translasi merupakan proses utama yang menghubungkan gen ke protein. Transkripsi adalah transfer informasi nukleotida-nukleotida dari DNA ke RNA, sementara translasi merupakan transfer informasional dari urutan nukleotida dalam RNA ke urutan asam amino dalam suatu polipeptida. Asam nukleat (DNA) maupun protein merupakan polimer informasional dengan urutan monomer linear yang masing-masing adalah nukleotida dan asam amino (Campbell et al., 2008). Nukleus merupakan pusat utama dari sebuah sel. Informasi genetika dari suatu organisme terdapat di dalam kromosom. Di dalam nukleus terdapat kromosom yang terbentuk dari benang-benang halus kromatin. Kromosom terdiri atas dua komponen yaitu DNA dan protein. Molekul DNA akan berikatan dengan protein histon dan non-histon yang
nantinya akan membentuk nukleosom dan akan menjadi lipatan solenoid akibat adanya pemadatan pada bentuk benang. Lipatan solenoid ini akan membentuk
kromatin
dan kromatin
akan
membentuk
menjadi
kromosom. Kromosom terdiri atas molekul-molekul DNA yang dibungkus oleh protein. Protein merupakan bentuk utama dari suatu gen. akibat aktivitas dari protein dapat kita lihat fenotip-fenotip yang dapat kita amati (Campbell et al., 2008). Percobaan Beadle dan Tatum tahun 1941 pada strain mutan Neurospora memunculkan hipotesis one gene one enzyme (satu gen-satu enzim). Hal ini menerangkan bahwa gen bertanggung jawab untuk memproduksi sebuah enzim tunggal dalam jalur metabolisme. Kemudian teori ini dimodifikasi dan dikembangkan menjadi one gene one polypeptide (satu gen-satu polipeptida) oleh Vernon melalui sidik jari protein, bahwa variasi genetik dapat dibedakan dalam rantai polipeptida tunggal dalam protein multinumerik. Atau dengan kata lain suatu gen menentukan urutan asam amino rantai polipeptida (Fruton, 1999).
2.2 Hubungan Kerja Protein Dengan Pigmen Mata Aktivitas dalam kromosom, yaitu aktivitas gen merupakan faktor yang memengaruhi serta membentuk pigmen mata pada Drosophila melanogaster. Gen menghasilkan protein di dalam sel sebagai enzim katalisator reaksi dalam sel. Ketika terjadi mutasi dengan mutan yang bersifat
resesif,
suatu
protein
kehilangan
fungsinya.
Hal
ini
menyebabkan terbentuknya pigmen mata yang beragam pada mutan Drosophila melanogaster. Pada umumnya, Drosophila melanogaster memiliki pigmen mata yang berwarna merah yang disebabkan oleh pteridin. Pteridin itu sendiri terdiri atas drosopterin yang menyebabkan warna merah dan ommokrom yang menyebabkan warna cokelat. Ketika salah satu dari ommokrom maupun drosopterin mengalami malfungsi
yang menyebabkan kegagalan pada sintesis protein, terbentuklah pigmen baru yang disebut pigmen mutan (Wolpert, 2002). Protein di dalam sel berfungsi sebagai enzim yang mengkatalis reaksi-reaksi yang terjadi di dalam sel. Protein adalah produk utama dari suatu gen. Aktivitas dari protein terlihat dari fenotipe yang teramati. Jika suatu gen termutasi yang menyebabkan urutan nukleotida dari gen tersebut berubah membuat protein yang dihasilkannya pun berubah, sehingga aktivitas protein dan fenotipenya yang teramati terjadi perubahan. Jika dilihat pada mutan eyemissing, terdapat mata titik atau tidak sama sekali. Hal ini disebabkan pada perubahan urutan nukleotida yang menyebabkan tidak terjadinya sintesis drosopterin dan ommokrom sehingga tidak terbentuk pigmen mata pada mutan eyemissing. (Strickberger, 1962).
2.3 Alur Sintesis Pigmen Mata Drosopterin dan Ommokrom Sintesis protein yang terjadi pada mata Drosophila melanogaster umumnya menyebabkan adanya pigmen mata. Pada Drosophila melanogaster wildtype, pigmen matanya berwarna merah. Tetapi jika dilihat pada mutan lalat, terjadi perubahan warna pigmen mata. Ketika terjadi mutasi, terjadi perubahan susunan nukleotida (terjadi delesi, insersi, transklokasi, duplikasi, inversi) yang menyebabkan disfungsi pada protein tertentu sehingga sintesis ommokrom dan sintesis drosopterin tidak berjalan dengan lancar (Warianto, 2011).
Tabel 2.1 Biosintesis pigmen mata Drosophila melanogaster (Warianto, 2011).
A. Sintesis Ommokrom
B. Sintesis Drosopterin
Triptofan
Guanosin triposfat Dihidroneopteri triposfat
N- formilkinurenin
dihidropterin sepiapterin
dihidropterin
Kinurenin cn 3-hikdroksikinurenin
Xanthopterin
St
Drosopterin
Isoxanthopterin
Xanthomatin
2.4 Prinsip Dasar Kromatografi dan Rf Kromatografi adalah istilah umum yang digunakan untuk bermacammacam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu fasa gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan fasa diam yang juga bisa berupa cairan atau suatu padatan (Sisunandar, 2011). Metode kromatografi terbagi menjadi 2, yaitu column chromatography dan planar
chromatography.
kromatografi
planar
Kromatografi
adalah
yang
kromatografi
termasuk
lapisan
tipis
didalam (TLC),
kromatografi kertasn (PC), dan elektrokromatografi (Skoog et all, 1996). Kromatografi digunakan untuk mengidentifikasi suatu protein tunggal dari suatu komponen sel atau jaringan suatu makhluk hidup. Langkah-langkah yang dilakukan adalah menggiling jaringan tersebut agar jaringan mengalami lisis.
Selanjutnya adalah memisahkan
komponen-komponen kimiawi yang ada dalam jaringan tersebut. Cara pemisahan menggunakan prinsip interaksi molekul yang berbeda
melalui medium stasioner (fase diam) di bawah pengaruh fase gerak. Cara pemisahan tersebut berdasarkan kecepatan migrasi tiap-tiap komponennya melalui medium stasioner (fase diam) di bawah pengaruh fase gerak (mobile). Aliran (gerakan) fase gerak tersebut menyebabkan perbedaan migrasi campuran, sehingga dapat terpisahkan (Pai & Apandi, 2011).
Kromatogram yang dihasilkan diuraikan dan zona-zona dicirikan oleh nilai-nilai Rf. Menurut Heftmann (2004), Rf digunakan untuk mengukur kecepatan bergeraknya suatu zona relatif terhadap garis depan (Heftmann, 2004). Nilai Rf dirumuskan dengan :
R
Harga Rf digunakan mengukur kecepatan bergeraknya zona relatif terhadap garis depan pengembang. Nilai Rf menunjukkan identitasidentitas asam amino dan intensitas zona itu dapat digunakan sebagai ukuran konsentrasi (Basset 1998: 226).
BAB III METODE KERJA
3.1 Alat dan Bahan Tabel 3.1 Alat dan Bahan Percobaan Kromatografi
Alat Kertas saring Whatman no 1
Bahan Drosophila
melanogaster
normal
(wild type) Gunting
Mutan white
Penggaris
Mutan claret
Pensil
Mutan sepia
Jarum pentul
Larutan NBA (N-butanol : asam asetat glasial : akuades = 20 : 3 :7)
Staples
Vaselin
Pengering rambut/oven
Sinar UV
Bejana kromatografi dengan tutup kaca
3.2 Cara Kerja Kertas Kromatografi digunting dengan ukuran 16x20cm. Dibuat dua garis lurus dengan pensil sejajar pada sisi yang 16 cm, yang pertama 2cm dan sisi yang kedua 10 cm dari garis pertama. Diberi tanda o dengan pensil pada garis pertama,dengan jarak masing-masing 2cm. Nama kelompok ditulis disebelah atas kertas kromatografi dengan menggunakan pensil Bejana kromatografi diisi dengan larutan NBA setinggi 1cm. Pada bagian mulutnya diberi vaselin dan ditutup dengan kaca. Kemudian lalat buah diambil masing-masing 3 dengan fenotipe yang sama. Kepala lalat
buah tersebut dipotong dengan jarum pentul. Satu kepala diletakkan diatas tanda o dan kepalanya ditekan hingga mengeluarkan cairan. Langkah pemotongan di ulangi untuk fenotipe berbeda untuk tanda o berikutnya. Pada kertas saring harus ada kepala lalat normal, white, claret, dan sepia. Kertas saring digulung sehingga letak sisi kiri dan kanan bersebelahan dan jepret kertas saring dua kali di sebelah atas dan dua kali di sebelah bawah. Hati-hati jangan sampai kedua sisitersebut bersentuhan atau tumpang tindih. Kertas saring dimasukkan secara tegak di dalam bejana. Bejana ditutup dan diberi vaselin sehingga bejana tertutup dengan rapat. Didiamkan beberapa jam sampai larutan eluen bergerak melewati garis kedua. Kertas saring diambil, buat garis dengan pensil pada batas pergerakan eluen. Kertas saring dikeringkan dan diamati di bawah sinar putih dan sinar ultra violet. Diberi tanda dengan pensil sekeliling bercak yang terlihat dan catat warna fluorosensinya.
BAB IV HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN
4.1
Hasil Pengamatan 4.1.1
Foto Hasil Pengamatan
Foto Sebelum NBA
Sumber : Dokumentasi Pribadi
Sumber : Dokumentasi Pribadi
Foto Sesudah NBA
Foto Sesudah Terpapar Sinar UV
Sumber : Dokumentasi Pribadi
Sumber : Dokumentasi Pribadi
4.1.2
Perhitungan RF Nilai RF Wild Type :
4.2
Nilai RF White
:
Nilai RF Sephia
:
Nilai RF Claret
:
; Rf :
738
Pembahasan Hasil pemendaran cahaya mata dari Drosophila melanogaster beserta mutannya yang didapatkan pada praktikum ini memiliki hasil yang berbeda. Hal ini disebabkan oleh sebuah peritiwa fluorosensi. Fluoresensi merupakan pemancaran sinar oleh atom atau molekul setelah terlebih dahulu disinari sinar UV. Peristiwa fluororesensi merupakan peristiwa pemantulan warna atau berpendarnya warna yang tersembunyi karena absorbsi cahaya tertentu yang diberikan secara disengaja. Peristiwa ini biasanya terjadi terhadap senyawasenyawa tertentu (dalam praktikum ini dimaksudkan pigmen warna mata) yang mempunyai sifat memendarkan cahaya (Dahmann, 2008). Pigmen pada mata Drosophila melanogaster disebabkan oleh kehadiran Pteridin. Pada Drosophila melanogaster normal (wild type), pteridin ini terdiri dari dua kelompok, yaitu Drosopterin yang menyebabkan warna mata menjadi merah; dan Ommokrom yang menyebabkan warna mata menjadi coklat. Jika terjadi mutasi pada gen yang berperan dalam pembentukan pteridin, maka warna mata yang teramati akan bergantung pada kombinasi jenis pteridin yang ada. Warna mata akan menjadi coklat, bila kelompok drosopterin tidak ada; sedangkan warna mata akan menjadi merah terang jika kelompok ommokrom tidak ada. Dengan kata lain, mutasi akan
menyebabkan terhambatnya ekspresi suatu gen/enzim yang berperan dalam pewarnaan mata Drosophila melanogaster (Judd, 2010). Menurut Ignat dan Bara (2003), nilai Rf pada pigmen mata keempat jenis Drosophila melanogaster didapatkan dalam data seperti berikut Tabel 4.1 Nilai RF
Jenis
Nilai RF Literatur
Nilai
Rf
hasil
percobaan Wild type
0,0483
0,46
White
0
0
Claret
0,229
0,36
Sepia
0,385
0,783
Berdasarkan hasil pengamatan, nilai Rf yang tertinggi ditunjukkan oleh pigmen mata sepia. Hal ini membuktikan bahwa pigmen mata sepia paling non-polar jika dibandingkan dengan pigmen mata white, claret, serta wildtype. Sementara itu, pigmen white bersifat paling polar karena nilai Rf yang dimilikinya paling kecil (Warianto, 2011). Fungsi larutan NBA adalah sebagai eluen karena memiliki perbandingan N-Butanol : Asetat Glacial : Akuades = 20 : 3 : 7. Larutan NBA merupakan campuran dari larutan yang memiliki tingkat kepolaran: polar, semi-polar, dan non-polar. Sehingga larutan NBA dapat memisahkan pigmen-pigmen pada mata lalat buah yang memiliki tingkat kepolaran hampir sama. Fungsi vaselin adalah agar udara yang berada di dalam bejana tidak dapat keluar dan udara yang diluar tidak dapat masuk melalui celah-celah antara bejana dengan penutup. Pemberian vaseline pada tutup bejana berfungsi agar bejana tempat eluen kromatografi kedap udara. Sehingga eluen yang merupakan larutan NBA tidak habis karena menguap (Falk, 2009).
Karena pigmen mata pada Drosophila melanogaster tidak bisa terlihat apabila menggunakan cahaya putih (contoh seperti lampu neon), digunakan sinar ultraviolet
untuk membantu
pemendaran cahaya. Ketika sinar UV menyinari kertas saring, komponen pigmen mata akan mengabsorbsi cahaya UV dengan panjang gelombang tertentu dan memendarkan warna yang lebih kontras sesuai dengan warna asli senyawa tersebut. Pigmen mata pteridin tidak dapat terlihat dalam cahaya putih (lampu neon/lampu pijar),
tetapi
akan
(Strickberger, 1962).
berfluorensi
dalam
cahaya
ultraviolet.
BAB V KESIMPULAN
1.
Berdasarkan percobaan dan pengamatan yang telah dilakukan, telah ditentukan nilai Rf dari masing-masing pigmen mata Drosophila melanogaster yang didapat sebagai berikut :
Rf Wild Type = 0,46 (isoxantopterin) ; Rf = 0.131 (drosopterin)
Rf White = 0
Rf Sephia = 0,738
Rf Claret = 0,36 (isoxantopterin) ; Rf = 0.0983 (drosopterin)
2.
Setelah melakukan pemaparan sinar UV pada kertas kromatograf, kita dapat menentukan kelompok pigmen mata pada tiap jenis mutan
maupun
pada
Drosophila
melanogaster
wildtype.
Drosophila melanogaster wild type tergolong dalam kelompok pigmen mata drosopterin dan ommokrom. Mutan white tergolong dalam kelompok pigmen mata yang memiliki pteridin dan ommokrom tetapi karena adanya mutasi, pigmen mata tersebut tidak terekspresikan. Mutan sephia tergolong dalam kelompok pigmen mata yang memiliki sepiapterin. Mutan claret tergolong dalam kelompok pigmen mata yang memiliki drosopterin tanpa tersintesisnya pigmen ommokrom yang menyebabkan warna merah terang.
DAFTAR PUSTAKA
Beament J.W.L.1970. Advances In Insect Physiology. Academic Press, inc : London. Campbell, Reece, Urry, Peterson, Wasserman, Minorsky, Jackson. 2008. Biology Concept and Connection 7th. Pearson International: New York. Dahmann, Christian. 2008. Drosophila: Methods and Protocols. United States : Humana Press Inc. Falk, Raphael. 2009. Genetic Analysis: A History of Genetic Thinking. England : Cambridge University Press. Fruton, J.S. 1999. Proteins, Enzymes, Genes: The Interplay of Chemistry and Biology. Yale University Press : New Haven. Heftmann.E. 2004. Chromatography 6th Edition. Elsevier : San Diego Ignat Valentina, Bara I. Ion. 2003. "Biochemical Seperation Of Eye Pigments of Drosophila melanogaster."Genetica Biologie Moleculara 13(1): 196-198 Judd, Sandra. 2010.Genetic disorders sourcebook. Omnigraphics, Inc : United States. Morange, M. 1998.A History of Molecular Biology. Harvard University Press : Cambridge. Reichsman. 2009. DNA and Biotechnology. Elsevier : California Skoog, D.A., D.M. West & F.J. Holler. 1996. Fundamental of analytical chemistry 7th ed. Saunders College Publishing : Fort Worth Strickberger, M.W. 1962. Experiments in genetics with Drosophila. John Wiley and Sons: New York. Warianto, Chaidar. 2011. Mutasi. http://skp.unair.ac.id/repository/GuruIndonesia/Mutasi_ChaidarWarianto_17.pdf (diakses pada 13/10/2012). Wolpert, Lewis. 2002. Principles of Development 2nd Edition. Oxford University Press : New York.
