Universidad autónoma de Chiapas Facultad de ciencias químicas Campus IV LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA PRACTICA NO. 3 “FAGOCITOSIS”
CATEDRATICO: DRA. MARISOL ESPINOZA RUIZ
ALUMNO: RODAS HERRERA MIGUEL ANGEL
SEMESTRE: 6° GRUPO: “A”
TAPACHULA CHIAPAS A 22 DE MARZO DEL 2010
MARCO TEORICO 1
La composición de la sangre
El volumen promedio de sangre de un hombre es de 5,5 litros, y el de una mujer de aproximadamente un litro menos. Algo más de la mitad de este volumen volumen está formado formado por el plasma plasma,, la parte parte líquid líquida a de la sangre. sangre. Por él circulan las células sanguíneas, que son de diversos tipos: los eritrocitos o glób glóbul ulos os rojo rojos, s, los los leuc leucoc ocit itos os o glób glóbul ulos os blan blanco coss y las las plaq plaque ueta tass o trombocitos. El plasma sanguíneo Tiene el aspecto aspecto de un fluido claro, algo semejante semejante a la clara de huevo, y el 90% está formado de agua. En él se hallan disueltas importantes sales minerales, como el cloruro sódico, el cloruro potásico y sales de calcio, escindidas en sus componentes. Su concentración oscila muy poco para que no se rompa su equilibrio con el líquido que baña los tejidos ni con el intracelular. Gracias a ellas pueden disolverse las proteínas en el plasma, para ser transportadas por la sangre, y la acidez de los líquidos del cuerpo se mantiene dentro de estrechos límites. Las proteínas más importantes que se hallan disueltas en el plasma son el fibrinógeno fibrinógeno y la protrombina, protrombina, que intervienen en la coagulación coagulación sanguínea; sanguínea; las albúminas, que desempeñan un importante papel en el transporte y para mantener el volumen de plasma, y las globulinas, que son parte del sistema 2
defensivo de nuestro cuerpo. Todas estas proteínas, a excepción de las últimas, se forman en el hígado. Además, en el plasma existen todas las sustancias transportadas por la sangre, como las partículas de alimento y los productos que son el resultado del metabolismo, y, como ya hemos mencionado, las hormonas. Los glóbulos blancos Los leucocitos o glóbulos blancos son las células sanguíneas encargadas de la defensa. Su tamaño es variable, de 6 a 20 micras de diámetro, y se encuentran en la sangre, según su tipo, en un número que oscila entre los 5.000 y los 9.000 por milímetro cúbico. Todos ellos tienen núcleo, aunque la form forma a de éste éste es muy muy dis distint tinta. a. Algu Alguno noss de ello elloss, el grup grupo o de los los granulocitos, poseen unos gránulos en el citoplasma, mientras que otros, los agra agranu nulo loci cito tos, s, ca care rece cen n de ello ellos. s. Lo Loss gran granul uloc ocit itos os se subd subdiv ivid iden en en neutró neutrófilo filos, s, eosinó eosinófilo filoss y basófll basófllos, os, y los agranu agranuloc locito itoss en monoci monocitos tos y linfocitos. Neutrófilos Se orig origin inan an en la mé médu dula la ósea ósea roja roja,, dond donde e gran gran prop propor orci ción ón de ello elloss permanece hasta que son necesarios en la sangre. Constituyen el 70% del total de los granulocitos, y sus gránulos son pequeños y muy numerosos. El núcleo posee varios lóbulos, y el diámetro es de unas 10 micras. Su función es la fagocitosis, es decir, devorar los cuerpos extraños, después de lo cual el neutrófilos muere y es destruido, formándose partículas de pus. La vida media de estas células es de una semana. Eosinófilos Originados de la misma forma que los neutrófilos, los eosinófilos constituyen el 3% del total de granulocitos y su núcleo presenta sólo dos nódulos ovalados. Sus gránulos son grandes y numerosos y su diámetro de unas 10 micras. Su función es la fagocitosis, al igual que la de los neutrófilos, y su núme número ro aumen aumenta ta much mucho o dura durant nte e las alerg alergia iass y las las enfer enferme meda dades des por por parásitos. Basófilos Los gránulos de los basófilos son gruesos pero escasos. Son células de unas 10 micras de diámetro y su núcleo tiene una forma que recuerda a una 5. Se originan en el mismo lugar que el resto de los granulocitos, y son los menos numerosos, numerosos, ya que constituyen constituyen sólo el 0,5% del total. Su función función no se conoce bien, pero parece que evitan la coagulación dentro de las arterias y las venas. Monocitos Son los más grandes de entre los glóbulos blancos, con un tamaño que oscila entre las 15 y las 20 micras. Su núcleo tiene forma arriñonada y poseen gran cantidad de citoplasma, citoplasma, que no tiene gránulos. gránulos. Constituyen Constituyen el 5% de los glóbulos blancos, y se dedican a devorar partículas de un tamaño considerable. Por tanto, al igual que los tipos antes descritos, los monocitos 3
viven muy poco tiempo, pues mueren destruidos después de fagocitar. Algunos de ellos se desplazan hasta donde los necesitan, pero también los hay fijos en el hígado, el bazo, los ganglios linfáticos y la médula. Linfocitos Tienen el tamaño de un glóbulo rojo, y su núcleo es esférico y bastante grande, con una concavidad en uno de sus lados. Constituyen el 30% de todos linfocitos y se forman en la médula ósea roja. Sin embrago cuando salen de ella sufren un proceso de maduración por el cual se forman dos tipos: los linfocitos B, que pasan a los ganglios linfáticos, y los linfocitos T, que se albergan en el timo. Todos ellos viven unos cien días y se encargan del sistema de defensa específico, también llamado inmunitario, por el cual el linfocito distingue las sustancias que debe destruir de las que son propias del cuerpo. Para ello los linfocitos deben tener un cierto tipo de (
FAGOCITOSIS La fagocitosis se lleva a cabo en células especializada especializadass llamadas llamadas fagocitos, fagocitos, donde se incluyen los macrófagos, neutrófilos y otros glóbulos blancos de la sangre. La invaginación produce una vesícula llamada fagosoma, las cual usualm usualment ente e se fusion fusiona a con uno o más lisoso lisosomas mas conten contenien iendo do enzimas enzimas hidrolíticas. Los materiales en el fagosoma son rotos por estas enzimas y degradados. La fagocitosis (del griego -phagos, “el que come”, kytos, “célula”), es un tipo de endocitosis por el cual algunas células rodean con su membrana citoplasmática a una sustancia extracelular (un sólido generalmente) y la intr introd oduc ucen en al inter interior ior ce celu lular lar.. Esto Esto se prod produc uce e grac gracia iass a la em emis isió ión n de pseudópodos alrededor de la partícula u microorganismo hasta englobarla complet completamen amente te y formar formar alreded alrededor or de él una vacuola, vacuola, la cual cual fusion fusionan an posteriormente con lisosomas para degradar la sustancia fagocitada, la cual recibirá el nombre de fagosoma. En orga organi nism smos os mult multic icel elula ulare res, s, este este proc proces eso o lo lle lleva van n a ca cabo bo cé célu lulas las espe especi cial aliz izad adas as,, ca casi si siemp iempre re co con n el fin fin de defe defend nder er al conj conjun unto to del del organismo frente a potenciales invasores perjudiciales.
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En muchos muchos organi organismo smoss superio superiores res,, la fagoci fagocitos tosis is es tanto tanto un medio medio de defensa ante microorganismos invasores como de eliminación (e incluso reciclaje) de tejidos muertos.
Células fagocitarias Muchos de los protistas son fagocíticas, sin embargo, en los animales, la fagocitosis es una función de células especializadas del sistema inmune capaces de remover cuerpos extraños y combatir infecciones como primera línea de defensa natural. Estas células existen tanto en humanos como en otros animales, como pájaros, mamíferos y peces. De hecho, la fagocitosis es la función principal de algunas células, por lo que se les llama fagocitos profe profesi sion onal ales. es. Vari Varias as cé célu lulas las en el cuer cuerpo po huma humano no ejerc ejercen en func funcion iones es fago fagoci cita tari rias as,, neut neutró rófi filo los, s, ma macr cróf ófag agos os,, cé célu lula lass dend dendrí ríti tica cas, s, eo eosi sinó nófi filo los, s, basófil basófilos, os, etc. Otras Otras célula célulass como como las células células de Kupffer Kupffer en el hígado hígado,, las células de la microglía en el SNC son fagocitarias en la mayoría de los animales.
PROCESO DE LA FAGOCITOSIS Fenó Fenóme meno no que que favor favorec ece e el reco recono noci cimie mient nto, o, fijac fijació ión, n, englo engloba bamie mient nto, o, formaci formación ón de vesícu vesícula la fagocí fagocític tica a y degrad degradaci ación; ón; se ve favorec favorecida ida por las opsoninas IgG y C3b. Consiste en 3 pasaos interrelacionados y son:
RECONOCIMIENTO Y FIJACIÓN Las cel. fagocít fagocítica icass pueden pueden unirse unirse a partícu ículas las inert ertes o a bac bacteri erias sin que halla un pro proceso de reco recono noci cimi mien ento to espe especí cífi fico co,, pero pero se sabe sabe que que la fago fagoci cito tosi siss de un microorganismo se facilita si éste está cubierto por opsoninas (Ig G y C3b). La unión de estas opsoninas (fijadas a la superficie bacteriana) con los receptores para la fracción constante (Fc.) de la Ig G y/o a receptores para C3b, constituyen la etapa de Reconocimiento Leucocitario.
ENGLOBAMIENTO → La unión opsonina – receptor induce al leucocito a encerrar la bacteria e incluirla en una vesícula citoplasmática llamada Fagosoma. FORMAC FORMACIÓN IÓN DE VACUOLA VACUOLA FAGOCÍ FAGOCÍTIC TICA A Al fago fagossom oma a se le une unen gránulos citoplasmáticos designados como lisosomas primarios; y este complejo lejo al unirse a los liso isosoma mass secundario rios confor forma el “Fagolisosoma”. La unión del fagosoma con los gránulos citoplasmáticos citoplasmáticos (lisosomas 1rios o 2rios) desestabiliza la membrana de estos por por lo que descargan su contenido dentro del Fagolisosoma (Desgranulación) con la fina finali lida dad d de dest destru ruir ir al agen agente te agre agreso sor. r. Sin Sin em emba barg rgo, o, dura durant nte e la Desgranulación, algunos gránulos descargan su contenido antes de que el fago fagoso soma ma este este co comp mple leta tame ment nte e ce cerr rrad ado o por por lo que que las las enzi enzima mass lisosómicas y radicales libres de O2 liberados actúan sobre el tej. normal circundante dando lugar a lesiones hísticas a la vez que algunas de las sust sustan anci cias as libe libera rada dass ac actú túan an co como mo me medi diad ador ores es de la Re Resp spue uest sta a Inflamatoria y provocan la activación de diversos mediadores químicos.
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DEGRADACIÓN → La ac acci ción ón de las enzi enzima mass liso lisosó sómi mica cass ca casi si siemp siempre re terminan destruyendo al microorganismo englobado en el fagosoma; sin emba em barg rgo o, hay hay mic microor roorga gani nism smo os muy muy viru virule lent ntos os que que res resiste isten n la Desg Desgra ranu nula laci ción ón o la inhi inhiben ben e inclu incluso so son son ca capa pace cess de dest destru ruir ir al leucocito. Así, algunas bacterias como las BAAR (bacterias ácido-alcohol resi resist sten ente tes) s) pued pueden en sobr sobrevi evivir vir dent dentro ro de leuc leucoc ocit ito o por por lo que que son son transportad transportados os dentro de ellos por la linfa hacia los los ganglios ganglios linfáticos linfáticos pudiendo diseminar la infección si superan esta barrera. Los factores que determinan si el microorganismo englobado será destruido o sobrevivirá al ataq ataque ue del del leuc leucoc ocit ito o son son poco poco co cono noci cido dos; s; No obst obstan ante te,, que que los los mecanismos bactericidas de las células fagocíticas se clasifican como: •
• •
Mecanismos dependientes de oxígeno: Se activa una ruta metabólica (hexosa monofosfato) que consume grandes cantidades de oxígeno, lo que a su vez produce grandes cantidades de radicales tóxicos antimicrobianos (como el O2-, H2O2, OH-, O21), que a su vez pueden reaccio reaccionar nar para para dar otras otras sustan sustancia ciass tóxica tóxicas, s, como como hipocl hipoclorit oritos os y cloruros. cloruros. Estas Estas sustancia sustanciass provocan provocan una intensa intensa halogenació halogenación n que afecta a muchas bacterias y virus. Mecanismos dependientes de óxido nítrico (NO). Meca Mecanis nismo moss inde indepe pend ndien iente tess de oxíg oxígeno eno:: Libe Libera raci ción ón de enzi enzima mass hidr hidrol olít ític icos os:: lisoz lisozima ima,, prot proteín eínas as ca cati tión ónic icas as,, prot proteas easas as,, etc. etc.,, que que ejecutan un efecto bactericida o bacteriostático.
PERITONEO
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M e m b r a n a El perit erito oneo neo es una una me memb mbra rana na serosa (llamada así porque cubre q cavi ca vida dades des inter interio iores res del del cuerp cuerpo o u humano), fuerte y resistente, que e tapiza las paredes de la cavidad abdomin abdominal al y forma forma pliegu pliegues es (los (los c mesos, los epiplones y los u ligamentos) que envuelven, total o b parcia parcialmen lmente, te, gran gran parte de las r vísceras situadas en esa cavidad, e sirv irviend endo de sostén para las l mismas. a Está en contacto, por un lado, con la cara interna de la cavidad c abdominal y, por el otro, con la a cara externa de los órganos. Este v doble contacto es posible gracias i al aspecto característico del d perito peritoneo neo de ser una membra membrana na a serosa de dos capas u hojas. d La capa exterior, llamada peritoneo parietal, está adherida a a la pared abdomin minal y la capa b interior, peritoneo visceral, d envu envuel elve ve los los órga órgano noss situa ituado doss o m dentro de la cavidad abdominal. El espacio entre ambas capas se i deno denomi mina na ca cavi vida dad d peri perito tone neal al;; y n contiene una pequeña cantidad de a fluido lubricante (alrededor de 50 l ml) que permite a ambas capas . desl desliz izar arse se entr entre e sí y faci facili lita tarr el movimiento de las vísceras. Esta cavidad peritoneal está cerrada en el hombre y abierta en la mujer al nivel del pabellón de la trompa de Falopio y del ovario. La mayor parte de los órganos abdominales están adheridos a la pared abdominal abdominal por el mesenterio, mesenterio, que es una parte del peritoneo a través de la cual los órganos son alimentados por los vasos sanguíneos, linfáticos y nervios. Debajo Debajo de las célula células s mesot mesoteli eliale ales s se encuen encuentr tra a la matr matriz iz extra extracel celula ular r cons consti titu tuida ida por por colá coláge geno no,, glic glicop opro rote teína ínas, s, glic glicos osam amino inoglu gluca cano nos, s,
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proteoglucanos, linfocitos, macrófagos, PMN; las estructuras vasculares y linfáticas se encuentran por debajo de la serosa. La serosa peritoneal tiene diversas funciones entre las que se encuentran: Funciones Funciones inmunitarias inmunitarias y de barrera barrera a las infecciones. infecciones. Y la producción producción de numerosos mediadores como Interleucinas, FNT, ICAM-1, prostaglandinas, etc.
Las estructuras estructuras del abdomen están clasificadas clasificadas como intraperiton intraperitoneales eales y extraperitoneales, dependiendo de si están cubiertas de peritoneo visceral o no lo están y tienen mesenterio. Las estructuras o vísceras abdominales que se encuentran recubiertas por el peritoneo se llaman vísceras intraperitoneales. Estas vísceras o estructuras son: el estómago, estómago, el hígado, la porción superior del duodeno, el yeyuno, el íleon, el apéndice, el bazo, el colon transversal, el colon sigmoide, y en las mujeres: el útero y las trompas de Falopio.
E s t r u c t u r a b á s i c Otras vísceras vísceras o estructuras estructuras quedan por detrás o a fuera del peritoneo denominándose retroperitoneales o extraperitoneales, ya que no d están totalmente recubiertas por esta e membrana. l Estas son: el hígado (zona desnuda), la vesícula p biliar biliar,, los conduc conductos tos biliar biliares, es, partes partes del tracto tracto e gastro gastroint intest estinal inal (duode (duodeno, no, páncreas, páncreas, colon r ascendent ente, colon desc escend endent ente, rec ectto), i principales vasos sanguíneos (aorta, vena cava t inferior), las glándulas suprarrenales, los riñones, o n los uréteres, la vejiga, los ovarios. e o .
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En color azul el contorno del peritoneo (se apre apreccian ian el híga ígado, do, pánc páncre rea as, estóma estómago, go, colon, colon, intest intestino ino delgado delgado y la cavidad abdominal). Propiedades del peritoneo Se puede estimar la importancia del peritoneo considerando la variedad y el número de sus propiedades: 1. Propie Propieda dades des mecán mecánic icas as,, ya que que sirv sirve e co como mo sost sostén én para para los los órga órgano noss ubicados en la cavidad abdominal y permite su movimiento interior. 2. Propiedades Propiedades hemodinámicas hemodinámicas,, que tiene relación relación con el flujo sanguíneo y los mecanismos circulatorios en el sistema vascular. 3. Prop Propied iedad ades es prot protec ecto toras ras,, sirvi sirvien endo do co como mo barr barrera era defen defensi siva va frent frente e a microorganismo y partículas inertes, para los órganos que cubre. 4. Propiedades de aislante térmico, mantiene la temperatura de los órganos que cubre. 5. Propied Propiedade adess de interc intercamb ambio, io, al ser semiper semipermea meable ble permite permite el paso paso de moléculas de pequeño tamaño, lo cual permite aplicar hoy en día la técnica de la Diálisis peritoneal.
MECANISMOS DE DEFENSA PERITONEAL EN EL SER HUMANO El macrófago peritoneal La célula mesotelial como presentadora de antígeno El neutrófilos peritoneal 9
El Macrófago (M0) Peritoneal. Tipos ✔ ✔ ✔ ✔ ✔
El M0 perivascular El M0 intersticial El M0 submesotelial El M0 adherido a la superficie externa mesotelial El M0 flotante
La Célula Mesotelial como Presentadora de Antígenos La célula mesotelial es probablemente la primera célula peritoneal que contacta con los gérmenes Tiene capacidad para reclamar células defensivas a través de producción de Il- 1 (M0) e Il-8 (PMN) La respuesta se amplifica por los M0 y PMNs El Neutrófilos Peritoneal (PMN) Condiciones de estabilidad: tercera población peritoneal, después de M0 y Linfocitos • 1-1.7 millones primer año • 0.1-0.6 millones después Condiciones de inflamación: primera población • Apoptosis vs. lisis (R. libres, enzimas) • Sintetizan y liberan MCP-1 e IL-8
OBJETIVO
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Que el alumno lleve acabo la inoculación del ratón por vía peritoneal
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Que el alumno pueda ver el mecanismo de la fagocitosis in vitro (mediante la utilización de plasma humano) e in vivo (mediante las células células del sistema sistema inmune localizadas localizadas en el peritoneo del ratón) con la utilización de la bacteria de Cándida sp.
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Materiales y reactivos 3 jeringas de 3ml
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Torundas empapadas de alcohol Liga comparado
* plasma sanguíneo *ratón *solución cándida sp.
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con el tubo 3 de Mc-farland ✔
Guantes
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Alcohol
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Anticoagulante EDTA
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Tubos de ensaye de 13 * 100
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Pipeta Pasteur y Bulbo
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Gradilla
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Masking tape
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Estufa o incubadora
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Microscopio
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Porta objetos
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Aceite de inmersión
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Reactivos para la tinción de Wright
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Centrifuga
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Material de disección
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Jeringas para insulina
METODOLOGÍA FAGOCITOSIS IN VITRO
Punción venosa Segú Según n la prac practi tica ca,, nece necesi sita tamo moss del del plas plasma ma sang sanguí uíne neo o para para la realización del proceso de fagocitosis in vitro y este se consigue con anticoagulante EDTA. ✔
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Tom Tomam amos os una una de las las jeri jering ngas as y co con n esta esta reco recole lect ctam amos os 2 ml de anticoagulante EDTA el cual hacemos pasar por las paredes de la jeringa y tiramos el remanente a fin de que quede vacía de anticoagulante. ✔
Tomamos Tomamos la otra jeringa de la cual nada mas necesitaremos necesitaremos la aguja para cambiarla por la aguja de la jeringa con la que tomamos el anticoagulante, ya que la jeringa con EDTA nos servirá servirá para realizar realizar la punción punción venosa. (Lo hicimos de esta manera ya que la sangre no la centrifugaremos, nada mas haremos que se separe al transcurrir un tiempo determinado) ✔
La sangre se extrae de una vena, usualmente usualmente de la parte interior del codo o del dorso de la mano. ✔
✔
El sitio de punción se limpia con un desinfectante (antiséptico).
Se coloca una banda elástica alrededor de la parte superior del brazo con el fin de aplicar presión en el área y hacer que la vena se llene de sangre. ✔
Luego, se introduce suavemente la aguja (de la jeringa con la que tomamos el antico anticoagu agulant lante) e) en la vena vena y se recoge recoge la sangre. sangre. La La banda banda elástic elástica a se retira del brazo. ✔
Una vez que se ha recogido la muestra de sangre, se retira la aguja y se cubre el sitio de punción para detener cualquier sangrado ✔
Después de haber recogido la muestra mue stra de sangre, se toma con mucho cuidado la jeringa con la sangre y se pegara en una superficie vertical, a fin de que se separa el plasma sanguíneo transcurrido el tiempo. ✔
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Ya que se pego la jeringa (de preferencia con masking tape), doblar la aguja con su tapa de plástico de esta forma. ✔
✔
Y esperar que se separe el plasma sanguíneo.
Ya que se separo el plasma, decantarlo con mucho cuidado en un tubo de ensaye ensaye sin traerse consigo el paquete paquete de glóbulos rojos. (Ayudarse (Ayudarse con la pipeta pasteur) ✔
Ya que se tenga al plasma en un tubo de ensaye adicionarle solución salina, en proporción proporción 1:1 y centrifugar centrifugar a 1200 rpm por 10 min., separar y decantar en otro tubo ✔
Ya que se tenga al plasma en el tubo agregarle 0.2 uL de la solución de Bacterias de Candida sp. e incubar durante 30 minutos ✔
Al término de la incubación, incubación, centrifugar centrifugar a 1200 rpm por 10 min. y retirar el botón celular que se forme, para después depositarlo en un porta objetos ✔
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Realizar la tinción de Wright
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observar al microscopio
FAGOCITOSIS IN VIVO
Este Este proc proced edimi imient ento o se reali realiza zara ra en el rató ratón n media mediant nte e la punc punción ión intra intra peritoneal. Primeramente se tendrá que sujetar al ratón de la manera correcta, como se indica a continuación: Tomándolo por la base de la cola, saque el ratón de la jaula y apóyelo sobre una superficie rugosa contra la que pueda ejercer resistencia. ✔
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Sin soltarlo, soltarlo, tome en forma forma rápida, rápida, suave suave y firmeme firmemente nte,, la piel del cuello cuello con los dedos índice y pulgar y luego sujete la cola entre el dedo menique y la palma de la mano. Levante el animal.
Despué Despuéss de una correc correcta ta sujeci sujeción, ón, proseg proseguim uimos os al proced procedimie imiento nto para la inyección de la solución de bacterias de candida: ✔
Se pueden usa jeringas y aguja calibre 25 –27 G. ½ a 1 pulgada, de bisel pequeño. Nosotros utilizamos las jeringas para insulina ✔
Aplicando la sujeción con una mano e inmovilizando la pata izquierda del ratón, se incli inclina na al rató ratón n co con n una una direc direcci ción ón haci hacia a el crán cráneo eo para para prod produc ucir ir un desplazamiento de las vísceras con el fin de no lesionarlas. ✔
Se inserta la aguja en la piel en el cuadrante izquierdo inferior del abdomen, lueg luego o se llev lleva a en dire direcc cció ión n del del crán cráneo eo y se intr introd oduc uce e en la ca cavi vida dad d peritoneal, levantando la aguja en contra de la pared abdominal para evitar la punción en el interior del intestino; la jeringa con aguja debe estar paralela a la columna vertebral. ✔
CUIDADO Una rápida administración del fluido puede causar daños en el tejido y hemorragia debido a la presión interna. ✔
La cantidad cantidad de soluci solución ón de bacteri bacterias as que se inoculo inoculo es de 2 uL. Al termino de la inyección, inyección, soltar soltar al ratón de forma forma adecuada adecuada y esperar 1 hora. hora. Al término de la hora, proseguir con la disección del animal: ✔
sacrificar los animales tomado su cola y cuello y tirar hasta separar las vertebras. No tirar solo de la cola ya que esta puede desprenderse del ratón. ✔
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colocar coloc ar los anima animales les boca boca arrib arriba a sobr sobre e la char charol ola a de dise disecc cció ión n y fijarlos a las 15
misma utilizando alfileres o agujas ✔
limpiar toda la superficie del animal con una torunda empapada en alcohol.
hacer una incisión longitudinal en el animal, desde el cuello hasta la cola, afectando solamente la piel y evitando cortar las capas mas profundas (usar pinzas, tijeras y bisturí), en esto nos referimos al peritoneo. Para esto también es importante antes de cortar la piel, jalarla en dirección vertical con el motivo de que se desprenda del peritoneo y evitar su ruptura ✔
util utiliz izan ando do las las pinza inzass y la part parte e roma roma de la tijer ijera, a, romp romper er las las adherencias para separar la piel del cuerpo del animal. No tratar de jalar la piel del ratón para sujeta sujetarla rla de la placa de unicel unicel,, ya que así también también podemos podemos romper romper el peritoneo. ✔
Ya que tenemos expuesto el peritoneo del ratón, con una jeringa de 3 ml llena de solución solución salina introducir introducirla la de manera horizontal, horizontal, tenga tenga cuidado cuidado de no rasgar los recipientes abdominales importantes o usted conseguirá sangre en peritoneo e introducir poco a poco la solución salina (con un golpeteo o sacu sacudi dién éndo dolo lo suav suavem emen ente te trat tratar ar de homo homoge geni niza zarr la solu soluci ción ón sali salina na introducida en el animal). ✔
Después de unos minutos extraer la solución salina poco a poco, ya que sino las vísce víscera rass por por la succ succió ión n se podr podrán án pega pegarr a la aguja aguja.. Si no se pued puede e extraer extraer la misma misma cantid cantidad ad de soluci solución ón salina salina introd introduci ucida, da, no tratar tratar de extraerla. ✔
Se extr extrae aen n las las cé célul lulas as (que (que van van co cont nteni enida dass en la solu soluci ción ón sali salina na extraídas del perito peritoneo neo), ), se centri centrifuga fuga a 1200 1200 rpm durant durante e 10 minutos minutos,, se decant decanta a el sobrenadante y se realiza el frotis del botón celular (el aplicador se debe de rotar) y tinción de Wrigth. ✔
✔
observar al microscopio
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OBSERVACIONES Y RESULTADOS
Plasma sanguíneo ya separado
En el tubo de la derecha tenemos el botón celular
Esta es la foto de la fagocitosis in vitro en la cual se esta llevando acabo una presentación antigénica 17
Aquí estamos realizando la inoculación intra peritoneal
Aquí Aquí tenemo tenemoss descub descubiert ierto o el per perit iton oneo eo para para pros proseg egui uirr a introducir la sol. Salina
Aquí Aquí empe empezam zamos os a reali realizar zar la disecció ción del rató atón p a ra intro introdu duci cirr la sol. sol. Sali Salina na en el peritoneo del ratón
Inyectando Inyectando la solución solución salina salina en el peritoneo del ratón
Después de unos minutos de la sol. Salina dentro del peritoneo del ratón proseguimos a extraerla
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Aquí Aquí pode podemo moss ver ver como como un macr macróf ófag ago o peritoneal tiene ya al antígeno en sus paredes. Fagocitosis in vivo
DISCUSIONES en los dos tipos de experimento, tanto in vitro como en in vivo se llevo acabo el proceso de la fagocitosis por las células del sistema inmune (principalmente por los macrófagos) ✔
en la fagocitosis in vitro utilizamos nuestro plasma, en este proceso podemos ver como hay reconocimiento por parte de los macrófagos del Ag (candida sp.) sp.) y tambi también én se lleva lleva ac acab abo o la prese present ntac ació ión n anti antigé génic nica, a, en el cual cual el macrófago toma el epitope y lo expresa en su superficie mediante la MHC clase II. ✔
Según esta fotografía que muestra la presentación antigénica, nos damos cuenta cuan sorprendente es nuestro sistema inmune ya que reacciono de manera rápida y precisa al poner en contacto células de nuestro sistema inmu inmune ne co con n un Ag. Ag. Po Pode demo moss ver ver co como mo ma macr cróf ófag agos os ya tien tienen en en sus sus superficies a los Ag, ahí comprobamos que las células del sistema inmune son son much muchís ísim imas as ya que que no solo solo un ma macr cróf ófag ago o esta esta fago fagoci cita tand ndo. o. El macrófago es una célula componente de la inmunidad inn innata. Comprobamos también que cuando un Ag entra a nuestro organismo no solo solo la inmunida inmunidad d innata innata o inmuni inmunidad dad adapta adaptativ tiva a trabaj trabajan an por separa separado, do, sino sino que que se llev lleva a ac acab abo o un sin sin fin fin de proc proces esos os que que engl englob oban an,, tant tanto o inmunidad innata como adaptativa. Se comprueba lo que dice la literatura de que que la inmu inmuni nida dad d adap adapta tati tiva va util utiliza iza mecan mecanis ismo moss me media diado doss por por la inmunidad innata, este es el caso de la participación del macrófago el cual fagocita y lleva acabo la presentación antigénica hacia un linfocito. No podemos diferenciar que tipo de linfocito es mediante la tinción utilizada, pero según la literatura los LThelper son los encargados en mandar las señales para la creación de células efectoras y de memoria en contra un Ag. ✔
En el experimento realizado in vivo utilizando las células peritoneales del ratón,
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nos damos cuenta como los macrófagos actúan en contra del Ag inoculado, ya que nos podemos percatar que varios macrófagos englobaron y ya tienen en su interior a los Ags inoculados. Como podemos darnos cuenta, tanto en el experimento realizado in vivo e in vitro los macrófagos son las células que se ven inmiscuidas en el proceso de la fagocitosis, fagocitosis, esto comprueba comprueba lo que dice la literatura literatura que la inmunidad inmunidad innata es la primera línea de defensa frente a microorganismos extraños que entran por primera vez a nuestro organismo por cualquier puerta de entrada. Faltaría hacer un experimento en el cual se demuestre que los macrófagos también están inmiscuidos en la fagocitosis de Ags que ya han entrado a nuestro organismo y que ya se ha creado memoria inmunológica.
CONCLUSIONES ✔
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Gracias a esta practica aprendimos a realizar la inoculación de un ratón ratón por vía intra intra periton peritoneal, eal, y lo hicimo hicimoss correc correctam tament ente e ya que nuestr nuestro o ratón ratón no presen presento to hemorra hemorragia gia ya que si la inocul inoculaci ación ón era muy rápida o mal hecha lo podía haber. Pudimos ver el mecanismo de la fagocitosis in vitro e in vivo, además de que pudimo pudimoss ver la present presentaci ación ón antigén antigénica ica que rea realiza lizaba ba un macrófago ante un linfocito a groso modo. Aprendimos que los mecanismos de inmunidad no trabajan solos, ya que al haber una presentación antigénica, vemos al macrófago que representa a la inmunidad innata y a un linfocito (no se de que tipo) pero al ser un linfocito representa a la inmunidad adaptativa. Estos mecan mecanis ismo moss ac actú túan an en co conju njunt nto o para para así así ac acab abar ar lo ma mass pron pronto to posible con una infección que se este llevando acabo en nuestro organismo.
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BIBLIOGRAFÍA CURSO DE INMUNOLOGÍA GENERAL Introducción al sistema inmune Enrique Iáñez Pareja Departamento de Microbiología Universidad de Granada España Contacto:
[email protected] ABBAS, A.K., LICHTMAN, A.H., POBER, J.S: Inmunología celular y molecular (Tercera edición). Madrid: Ed. Interamericana-McGraw Hill (1999). Sus principales cualidades son su claridad y concisión, ayudado por una maqueta etación y diagramación ión muy didá idáctica icas. Cier Cierttos aspectos especia especializa lizados dos se tratan tratan interc intercala alados dos en el texto texto princip principal al en forma forma de "cuadros", lo que pone al alumno en la pista de algunos de los desarrollos más prometedores de las técnicas actuales o en derivaciones hacia otras ciencias biológicas. ✔
www.profesorenlinea.cl - Querelle y Cia Ltda. E-mail:
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Fabiano, Fabiano, G, et.al. Aderenze Aderenze peritoneali: peritoneali: fisiopatologia. fisiopatologia. Il Giornale Giornale di Chirurgia 2008;29(3):115-125 Cirugia & Tecnología & Cirujanos jóvenes Blog del comité de cirujanos jóvenes de la Asociación Mexicana de Cirugía General http://cirugiaenelsiglo21.blogspot.com/2009/04/fisiopatologia-de-lasadherencias.html ✔
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Dirección de esta página: http://medlineplus.gov/spanish/ Actualizado: 19 marzo 2010 http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003423.htm Versi Versión ón en inglés inglés revis revisad ada a por: por: David David C. Dugd Dugdal ale, e, III, III, MD, MD, Prof Profes esso sorr of Medicine, Medicine, Division Division of General General Medicine, Medicine, Department Department of Medicine, Medicine, University of Washington Washington School School of Medicine. Medicine. Also reviewed by David Zieve, MD, MHA, Medical Director, A.D.A.M., Inc. Traducción y localización realizada por: DrTango, Inc. ✔
Instituto Nacional de Salud Jirón Cápac Yupanqui 1400, Lima 11, Perú Apartado Postal 471, teléfono:(0511) 471-9920 Fax: (0511) 471-0779 Correo electrónico:
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