Pract Fit 2016 (1)

UNIVERSIDAD INCA GARCILASO GARCILASO DE LA L A VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA

GUÍA DE PRÁCTICAS ASIGNATURA:

FITOQUÍMICA AUTOR: NORA HERRERA HERNÁNDEZ CICLO ACADÉMICO: VI

SEMESTRE ACADÉMICO: 2016 - II LIMA – PERÚ 2016

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FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA

INTRODUCCIÓN Las plantas poseen una gran cantidad de metabolitos primarios y secundarios que le permiten crecer, multiplicarse, defenderse y sobrevivir. El metabolismo secundario de las plantas puede definirse como el nivel funcional del metabolismo que, aunque no es indispensable para el crecimiento y desarrollo del vegetal, lo es para la supervivencia de la especie. Dada la riqueza química de las plantas, éstas fueron consideradas la fuente natural de numerosos medicamentos y por ello fueron usadas en la medicina tradicional, popular o folklórica y sus cualidades fueron transmitidas a través de las culturas de los pueblos. El estudio fitoquímico de los vegetales permite conocer los principios activos y evaluar la complejidad de sus caminos de biosíntesis y degradación así como los mecanismos de regulación. Es necesario que los futuros Químico Farmacéuticos conozcan los principales métodos y técnicas de obtención de los metabolitos secundarios presentes en los productos naturales. Las experiencias aquí reunidas se han adaptado de diversas fuentes bibliográficas, todas ellas de muy alto nivel académico y pedagógico; se pretende mostrar que la química está ampliamente distribuida en la naturaleza, se busca que el encuentro de los estudiantes con la química de los productos naturales sea motivador, didáctico, en lo posible correctivo y muy formativo, buscando estimular la intuición química en los estudiantes a partir del entrenamiento experimental. En la Guía de Prácticas se describen los procedimientos para el desarrollo de la investigación fitoquímica que incluye incluye técnicas de extracción, extracción, aislamiento, purificación y caracterización de los metabolitos secundarios. Dentro de los aspectos novedosos de la Guía de Prácticas, resalta la vinculación de la parte práctica con el contenido teórico del sílabo de Fitoquímica, así como la pertinencia del equipo y reactivos acorde con los actuales recursos de los laboratorios de la Facultad. Por el contenido y el formato en la que se presentan cada una de las prácticas, este Guía de Prácticas está dirigida en especial a estudiantes de licenciatura, no obstante, esta obra puede ser considerada como material de referencia para profesionales y docentes en el campo.

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FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PRÁCTICA Nº 1: ESQUEMA DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN EN FITOQUÍMICA MARCO TEÓRICO La investigación científica es un proceso libre y creativo. Sin embargo, esto no significa que carezca de sistematicidad y organización. Mucho menos si se trata de la etapa de planificación, la cual se concreta en el proyecto de investigación. La investigación científica es un proceso dirigido a la solución de problemas del saber, mediante la obtención de nuevos conocimientos. Dicho proceso comprende las siguientes etapas: a) Planificación. b) Ejecución o desarrollo. c) Divulgación Planificación, en este caso, significa trazar el plan o proyecto de la investigación por realizar. El desarrollo de la investigación científica entonces, empieza con la formulación de un proyecto de investigación. Esta etapa se divide en los siguientes pasos: 1°) Selección del tema: consiste en "... la definición y posterior delimitación del campo de conocimientos sobre el que piensa trabajar." (Sabino, 1994, p. 74). 2°) Identificación de un problema: significa detectar algún aspecto no conocido dentro de un área temática y que amerite de una indagación para su solución. 3°) Formulación del Anteproyecto: se refiere a la realización de un primer borrador de trabajo con las ideas básicas sobre la investigación que se llevará a cabo. Los investigadores en el área de los productos naturales deben aspirar a ser parte de un grupo de investigación de reconocida excelencia, en el contexto regional, nacional e internacional, en términos de la formación de profesionales Químicos Farmacéuticos y profesionales en el campo de química con pensamiento universal, y congruentes con las tendencias mundiales en la búsqueda del conocimiento y de la solución de los problemas sociales relacionados con la Salud. El financiamiento de las investigaciones se consigue elaborando y presentando proyectos en las convocatorias internas y externas.

COMPETENCIAS 1. Elabora proyectos de investigación fitoquímica.

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FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA 2. Realiza estudios fitoquímicos de plantas con el fin de impulsar la la investigación en productos naturales como una fuente alternativa alternativa para solucionar problemas de tipo tipo medicinal a la comunidad académica y general. 3. Aísla metabolitos secundarios de extractos con acción biológica comprobada. 4. Purifica y determina estructuras de los metabolitos secundarios aislados por métodos espectroscópicos. 5. Realiza ensayos biológicos con los compuestos puros. 6. Estandariza extractos vegetales y garantíza la calidad de productos fitoterapéuticos.

MÉTODO Se presenta el esquema de un proyecto de investigación: 1. Titulo 2. Planteamiento del estudio 2.1 Descripción del problema 2.2 Formulación del problema 2.3 Delimitación de objetivos 2.4 Justificación e importancia del estudio 3. Marco Teórico Conceptual 3.1 Investigaciones relacionadas con el estudio / Estado del arte 3.2 Bases Teórico-científicas 3.3 Definiciones de términos básicos 4. Hipótesis y Variables 4.1 Hipótesis general 4.2 Hipótesis especifica 4.3 Identificación y relación entre variables 5. Metodología 5.1 Tipo de investigación 5.2 Población y muestra de estudio 5.3 Técnicas de recolección de datos 5.4 Técnicas de procesamiento y análisis de datos que llevan a resultados. 6. Resultados, Discusión

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7. Conclusiones 8. Aspectos Administrativos 8.1 Recursos humanos y materiales 8.2 Presupuesto del proyecto 8.3 Cronograma de acciones 8.4 Evaluación del proyecto 9. Fuentes de información 9.1 Referencias bibliográficas 9.2 Referencias hemerográficas 9.3 Referencias electrónicas 10. Anexos

FUENTES DE INFORMACIÓN Referencias bibliográficas Referencias hemerográficas Referencias electrónicas

FUENTES DE INFORMACIÓN 1. Amiel, J. (1993) Metodología de la Investigación Científica. Lima a. b. 154 pp. 2. Avila R. (1997) Introducción a la Metodología de la Investigación. La Tesis Profesional, Aplicaciones y Ejemplos. Lima, W. H. Editores. 206 pp. 3. Bunge, M. (1995) La Ciencia, su método y su filosofía. Lima, Editorial Lima, 160 pp. 4. Day, R. (1990) Cómo escribir y publicar trabajos Científicos; OPS/OMS. Publicación Científica Nº 256. The Orys Press; W ashington 5. Eco, H. (1997) Cómo se hace una tesis. Técnicas y procedimientos de investigación, estudio y escritura. Barcelona, Gedisa. 268 pp.

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FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PRÁCTICA Nº 2: Y RECOLECCIÓN DE LA ESPECIE VEGETAL A INVESTIGAR MARCO TEÓRICO Los Andes es uno de los centros de diversidad, donde existen 38 especies de plantas domesticadas, pero solamente en Perú existen 25000 especies, que corresponde a un 10% de las especies de todo el mundo. Entre las domesticadas tenemos tuberosas, raíces, granos, frutas y vegetales, mientras que un gran número de plantas medicinales y ornamentales no están domesticadas todavía. La biodiversidad del altiplano peruano incluye los seres vivos y comprende los biomas terrestres (pisos bioclimáticos) y acuático (lago Titicaca). En estos ambientes, la flora y la fauna han evolucionado genéticamente y se han adaptado a las variaciones climáticas de mayor riesgo a la sobrevivencia. Los pisos bioclimáticos y el lago Titicaca poseen características abióticas y bióticas peculiares, por cuya razón, la diversidad de especies, variabilidad genética, los ecosistemas y la diversidad étnica son componentes básicos en la expresión actual de la diversidad biológica. La biodiversidad del bioma terrestre posee ventajas comparativas y competitivas excepcionales en relación a otras regiones o países, así, los granos quinua (Chenopodium quinoa Willd.), cañihua (Chenopodium pallidicaule Aellen), kiwicha ( Amaranthus caudatus L.) y tarwi (Lupinus mutabilis Sweet), tienen características nutritivas prodigiosas para resolver problemas de

desnutrición humana. Las raíces maca ( Lepidium meyenii ) y kuchuchu (Xanthoxylaceae), poseen propiedades medicinales que influyen en la longevidad y fecundidad del hombre, además, la p’irka y wachanq’ha son plantas medicinales poco conocidas p or la ciencia, sin embargo en la formacopia andina se usa como laxante y para malestares hepáticos (Mujica & Jacobsen, 2001). Diversos factores extrínsecos relacionados con el clima, pueden afectar el cultivo de las plantas medicinales. El crecimiento y desarrollo de las plantas y generalmente, la naturaleza y cantidad de sus metabolitos secundarios se ven afectados por la temperatura, lluvia, orientación, duración del día (incluyendo la calidad de la luz) y altitud. Estos factores han sido estudiados mediante el cultivo de determinadas plantas en diversas áreas climáticas y la observación de sus variaciones. Las drogas pueden ser recolectadas a partir de plantas espontáneas o cultivadas y la labor puede realizarse por personal nativo e inexperto (caso de la ipecacuana, por ejemplo) o por trabajadores expertos y de un modo altamente científico cuando se trata de la digital, belladona y quina. No obstante, la recolección de especies vegetales depende de las características de cada especie. Se puede hacer de forma manual o mecanizada. La recolección manual es mucho mas selectiva y artesanal, pero más lenta y poco rentable.

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COMPETENCIAS Reconoce el ejemplar adquirido en los lugares de expendio. Da su nombre común. Investiga acerca de la zona geográfica de origen. Investiga acerca de los factores edáficos y climáticos que afectan su cultivo.

MÉTODO Para el desarrollo de esta práctica el estudiante buscará la información relacionada con las características de las plantas medicinales. Una vez encontrada la información, el estudiante procederá a la realización y presentación del respectivo informe que debe contener un listado de las plantas observadas con el nombre común, la zona geográfica de origen, los factores edáficos y climáticos que afectan su cultivo.

CUESTIONARIO 1. Consultar sobre las 10 especies de plantas medicinales de mayor comercialización en Perú, sus condiciones de cultivo y el uso terapéutico aprobado por el DIGEMID. 2. Consultar la monografía de una planta medicinal asignada por el profesor, teniendo en cuenta los siguientes aspectos: nombre científico, descr ipción botánica, descripción microscópica, uso terapéutico aprobado, droga aprobada, reacciones adversas, advertencias y contraindicaciones. Esta información se encuentra en las farmacopeas oficiales y textos de referencia en farmacognosia.

FUENTES DE INFORMACIÓN 1. BRUNETON, J. (2001) Farmacognosia: Fitoquìmica, Plantas Medicinales, 2ª ed. 2. Acribia, Zaragoza. 3. KUKLINSKI, C. (2000), Farmacognosia. Estudio de las drogas y sustancias medicamentosas de origen natural. Ediciones Omega, Barcelona. 4. SORZA, L; VALENCIA, G. (2009) Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia. Universidad de Antioquía, Bogotá. 5. EVANS, W. C. (1991) "Farmacognosia. Trease-Evans". 13a Ed. Interamericana McGraw Hill,Madrid-Auckland-Bogotá.

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FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PRÁCTICA Nº 3: CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA DE LA ESPECIE A INVESTIGAR

MARCO TEÓRICO La asociación de un mismo nombre vulgar a varias especies vegetales y viceversa, puede acarrear problemas sanitarios y también, posiblemente, creencias erróneas sobre la eficacia de un remedio. Se recomienda que ante una consulta sanitaria el paciente indique a su médico si toma infusiones u otros preparados vegetales, especialmente en el caso de tratarse de especies autóctonas utilizadas como remedio en Medicina Popular, ya que como ejemplo, es muy diferente tomar “tila” procedente de Crataegus monogyna , planta utilizada desde la antigüedad por su acción sedante o tranquilizante y perteneciente a la familia Rosaceae, o "tila" procedente de especies de árboles conocidos como Tilos pertenecientes al género botánico Tilia (como Tilia platyphyllos o Tilia cordata). Las diferencias entre Crataegus monogyna y las especies del género Tilia son claramente detectables por cualquier persona simplemente a través de la observación de su porte, hojas, flores o frutos. A estas diferencias morfológicas podemos añadir otras de tipo ecológico, biogeográfico, evolutivo, farmacológico, etc. Por otra parte se debe considerar que ante un remedio popular hay que tener mucha prudencia, pues el nombre de un remedio puede referirse a varias preparaciones debido a la sinonimia de los nombres vernáculos de las especies vegetales según el lugar donde nos encontremos o la procedencia del remedio. Sólo la nomenclatura científica aceptada actualmente nos permite establecer un único nombre para una especie vegetal sin riesgo de confusión.

COMPETENCIAS Da el nombre científico de la especie botánica a investigar. Investiga la clasificación taxonómica de la especie botánica a investigar. Da una pequeña descripción botánica. Da su uso terapéutico. Identifica cuál es la droga vegetal.

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FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA MÉTODO EXPERIMENTAL El estudiante debe realizar en un laboratorio de control la clasificación taxonómica de la especie botánica a investigar y su nombre científico. También debe describir la morfología de la planta e investigar acerca de los usos medicinales y la parte de la planta que se usa.

CUESTIONARIO 1. ¿Qué es un Herbario y que pasos deben seguirse en la formación de un herbario? 2. ¿Qué datos debe tener la etiqueta de identificación de una especie vegetal en un herbario?

FUENTES DE INFORMACIÓN 1. BRUNETON, J. (2001) Farmacognosia: Fitoquímica, Plantas Medicinales, 2ª ed. Acribia, Zaragoza. 2. KUKLINSKI, C. (2000), Farmacognosia. Estudio de las drogas y sustancias medicamentosas de origen natural. Ediciones Omega, Barcelona. 3. SORZA, L; VALENCIA, G. (2009) Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia. Universidad de Antioquía, Bogotá. 4. EVANS, W. C. (1991) "Farmacognosia. Trease-Evans". 13a Ed. Interamericana McGraw Hill,Madrid-Auckland-Bogotá.

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FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PRÁCTICA Nº 4: PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS PARA EL TAMIZAJE FITOQUÍMICO

MARCO TEÓRICO La cosecha de las plantas medicinales está relacionada con el órgano de la planta que contiene los principios activos relevantes para la medicina natural; es importante también considerar la etapa fenológica de la planta, la época del año y la hora de la cosecha. Por ejemplo los alcaloides y los aceites esenciales se concentran más durante la mañana. Lavado

Consiste en aplicar agua potable a la parte de la planta que se va a deshidratar con el propósito de eliminar la tierra y otros materiales extraños. El lavado es otro aspecto de interés en el manejo post cosecha de cualquier planta medicinal. Es muy importante cuando la parte a usar de la planta ha estado expuesta al suelo tal como la raíz y partes del tallo. El agua debe ser potable para garantizar la eliminación de agentes contaminantes, Desinfección

Consiste en la eliminación de los microorganismos patógenos para el hombre por diferentes vías, hasta los niveles establecidos por las normas. Puede ser: a) Química: Consiste en inmersiones del material a deshidratar, en soluciones de sales cloradas de otro tipo (Hipoclorito de sodio, Calcio) a fin de reducir la población microbiana hasta los parámetros aceptados por las normas. b) Física: Consiste en exponer el material a deshidratar a radiaciones gamma, este método se emplea cuando la desinfección química no resulta eficiente y cuando la entrega de material vegetal proviene de áreas tecnificadas donde el flujo de entrega es constante y la aparición de materias inorgánicas es poca Blanqueo

Esta operación se realiza para evitar la oxidación y el pardeamiento enzimático. Consiste en un choque térmico por inmersión en agua caliente o con vapor, con el propósito de inhibir la acción de las enzimas responsables de la oxidación. Secado

De nada sirve producir material de excelente calidad si en el periodo de secado se pierden sus propiedades curativas. Como regla general, Ocampo y Valverde (2000) recomiendan una temperatura de 30 a 60° C para el secado de rizomas, cortezas y raíces; estas deben tener una humedad final de 12%; para hojas, sumidades y flores recomiendan una temperatura entre 20 y 40° C y una humedad final de 5 a 10%. Secado y deshidratación son términos que están asociados. En el secado ocurre pérdida de agua por métodos naturales (sol, aire), mientras que en la deshidratación esta pérdida ocurre por métodos artificiales diseñados por el hombre. El secado es una técnica, un arte antiguo

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muy utilizado para preservar plantas y alimentos. De la calidad del secado dependerá la calidad del producto final. Los tejidos de las plantas seca deben ser

seleccionados para eliminar los decolorados,

mohosos o partes dañadas, mezclas extrañas y contaminantes.

COMPETENCIAS Selecciona y recolecta las muestras para el reconocimiento de metabolitos secundarios. Conoce el proceso de lavado y desinfectar las muestras Estabiliza las muestras por el secado Prepara los reactivos de identificación de metabolitos secundarios

MÉTODO EXPERIMENTAL Materi ales y equipos

Estufa con recirculación de aire

Fiolas x 10, 25, 50, 100 y 500 mL

Beaker x 1 L

Balanza analítica

Pipetas x 10 mL

Papel filtro

Bagueta

Baño maría

Probeta x 100 mL Reactivos

HCl

Ácido sulfúrico

H2O2

NaOH con amoníaco

Acetato de plomo con ácido acético

Frascos color ámbar de 50, 100, 250 y 1 000 mL

úrea

Ácido cítrico

FeCl3 Procedimiento:

TRATAMIENTO DE LA MUESTRA Tratamiento 1.

Lave las partes de la planta (hojas, flores) seleccionadas Desinféctelas con solución desinfectante

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FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA Séquelas en estufa con recirculación de aire a temperatura entre 37 y 40o C durante 24 horas. El material secado debe ser troceado de forma mecánica hasta obtener un producto de partículas pequeñas, enváselo en frascos de color ámbar de boca ancha. Tratamiento 2.

Lave y desinfecte los rizomas o cortezas, primero con agua y un cepillo con cerdas flexibles para remover tierra y elementos extraños de la superficie de la raíz. Sumérjalos en una solución de agua y cloro de uso doméstico, a una proporción de 2 gotas por cada litro de agua, por 15 minutos, para lograr un efecto germicida y bactericida en la superficie de la raíz, para proceder a realizar el troceado y así facilitar el proceso de escaldado, que evita el deterioro del material por pardeamiento, inhibiendo de esta manera la acción enzimática y además reduciendo

la contaminación por

actividad microbiológica. El escaldado se realiza en 500 mL de solución de ácido cítrico al 1% a 50ºC

por 30

segundos en un baño maría, luego se enfrían en agua destilada por 30 segundos y se dejan drenar durante 5 minutos. Realice el secado en un secador de bandejas, donde el insumo principal es el aire seco caliente, para facilitar la deshidratación del material a una temperatura promedio de 60 a 70ºC de aire caliente.

Preparación de reactivos. Prepare los siguientes reactivos, en las concentraciones indicadas: HCl, H 2O2, acetato de plomo con ácido acético, úrea, FeCl 3, ácido sulfúrico e

NaOH con amoníaco en las

concentraciones indicadas. Envasar las soluciones en frascos limpios y secos de color ámbar.

CUESTIONARIO 1. ¿En qué consiste el escaldado de una muestra y cuál es su importancia? 2. Realice los cálculos correspondientes necesario en la preparación de los reactivos a emplear en la práctica 3. ¿Qué tipos de secado existen? Explíquelos. 4. Mencione los pasos a seguir en la preparación de soluciones valoradas.

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FUENTES DE INFORMACIÓN 1.

CYTED. (1995) Manual de Técnicas de Investigación. Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo. Bogotá, Colombia.

2.

DOMINGUEZ, X. (1973). Métodos de Investigación Fitoquímica . Limusa, México. FARNSWORTH, N. (1966). Biological and Phytochemical Screening of Plants. J. Pharm Sci 55 , 225 - 275 .

3.

HOSTETTMANN, K. , GUPTA, M., MARSTON, A., FERREIRA, E. (2008) Plantas Medicinales Iberoamericanas. 1º edición. CYTED. Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología.

4.

SHARAPIN, N. (2000) Fundamentos de Tecnología de productos fitoterapéuticos. Primera edición. Area de Ciencia y Tecnología del convenio Andrés Bello & Red Iberoamericana de Productos Fitofarmacéuticos (RIPROFITO) del Subprograma X del CYTED.

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FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PRÀCTICA Nº 5: MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE COMPONENTES FITOQUÍMICOS

MARCO TEÓRICO La extracción, el fraccionamiento y la purificación de mezclas para obtener compuestos puros, son aspectos decisivos para cualquier investigación experimental. El extracto obtenido es filtrado para separarlo del residuo sólido (marco) y el disolvente es evaporado a presión reducida en un evaporador rotatorio. Al residuo sólido o aceitoso se le conoce como extracto cr udo. La obtención de una sustancia pura a partir de él, requiere de fraccionamientos y purificaciones ulteriores. La tendencia es aplicar una técnica estándar para obtener un extracto crudo, sin embargo la gran diversidad de metabolitos secundarios obliga a utilizar técnicas individuales, según el tipo de compuesto. Los disolventes deben ser re-destilados antes de ser usados

FUNDAMENTO El proceso de extracción es una operación de separación basada en la característica de ser selectiva e implica el tratamiento de la mezcla con un disolvente apropiado, que en el caso ideal disuelva sólo el constituyente deseado, permaneciendo sin disolver las demás sustancias. En la práctica se obtiene una mezcla de compuestos solubles en el disolvente empleado y otras arrastradas por co-solubilidad.

COMPETENCIAS 1. Desarrolla una extracción por la técnica de maceración 2. Realiza una extracción por la técnica de reflujo 3. Implementa una extracción por la técnica de Soxhlet 4. Realiza una extracción por la técnica de percolación 5. Desarrolla una extracción por la técnica de reparto o partición 6. Implementa una extracción por la técnica de destilación por arrastre con vapor de agua.

MÉTODO EXPERIMENTAL Materiales y equipos: Estufa con recirculación de aire

Desecador

Beaker x 50, 100 mL

Papel filtro

Pipetas x 5, 10 mL

Embudo simple

Bagueta

Frascos color ámbar de 50, 100, 250 y 1 000 mL

Probeta x 100 mL

Equipo de reflujo con balón de 100 mL

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FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA Balanza analítica

Evaporador rotativo

Papel filtro

Pera decantación x 100, 250 mL

Baño maría

Equipo soxhlet

Matraz erlenmeyer x 200 mL

Equipo destilación por arrastre con vapor

Agitador magnético

Papel indicador (0-14 unidades de pH)

Reactivos: Cloroformo

Acetato de etilo

Etanol

Carbonato de sodio

Metanol

Sulfato de sodio anhidro.

Éter de petróleo

Procedimiento: I.

Extracción Líquido – Sólida: Operación de separación por contacto en la que ciertos componentes de una matriz sólida se extraen selectivamente mediante el uso de un disolvente.

1. MACERACIÓN Pesar la muestra seca y pulverizada. Colocar la muestra pesada en un matraz erlenmeyer y adicionar un volumen de solvente, con agitación constante. Filtrar, lavar el filtrado dos veces con el disolvente y evaporar en un evaporador rotatorio hasta sequedad, llevar a un desecador hasta peso constante y determinar el peso del extracto obtenido.

2.

REFLUJO Colocar en un balón el peso indicado de droga pulverizada y adicionar un volumen de solvente, reflujar y filtrar en caliente.

3.

SOXHLET: Pesar la muestra seca y pulverizada. Colocar la muestra en un cartucho de papel filtro. Extraer con el disolvente indicado durante 2 horas. Evaporar el disolvente a presión reducida hasta sequedad y llevar a un desecador. Pesar, hacer el cálculo del % de grasa Evaporar el disolvente del marco (en la campana extractora) y guardarlo. Extraer el marco con el segundo disolvente.

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Evaporar el disolvente a presión reducida hasta sequedad y llevar a un desecador.

4.

PERCOLACIÓN: Pesar la muestra seca y molida. En un percolador, colocar una pequeña torunda de algodón embebido en el sistema extractor de disolventes. Colocar la muestra pesada en el percolador. Adicionar gota a gota el disolvente extractor hasta cubrir la muestra y macerar. Colectar el percolado gota a gota. Renovar el disolvente extractor, macerar y colectar el segundo extracto. Repetir el proceso anterior por tercera vez y colectar el tercer percolado. Reunir todos los percolados y concentrar hasta 40 mL.

II.

Extracción Líquido – Liquido: Operación de separación por contacto en la que ciertos componentes de una matriz líquida se extraen selectivamente mediante el uso de un disolvente.

PARTICIÓN O REPARTO: Extraer inmediatamente la fase acuosa con tres porciones sucesivas del disolvente indicado. Colectar los extractos, añadir el desecante y dejar reposar toda una noche. Filtrar y guardar refrigerado en un frasco de vidrio ámbar herméticamente cerrado. Concentrar a presión reducida hasta sequedad y pesar. III. Extracción Gas - Sólida: Operación de separación por contacto en la que ciertos componentes de una matriz líquida se extraen selectivamente mediante el uso de un disolvente.

EXTRACCIÓN POR ARRASTRE CON VAPOR DE AGUA: Montar un aparato para destilación por arrastre de vapor. Colocar la muestra fragmentada en trozos pequeños, en el matraz y adicionar agua. Adicionar algunos trozos de porcelana porosa y destilar la mezcla manteniendo el volumen interno próximo al volumen inicial. Destilar la mezcla por arrastre de vapor, hasta que no aparezcan gotas de aceite en el refrigerante. Recibir el destilado en un embudo de separación con una solución saturada de cloruro de sodio y un poco del disolvente indicado.

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Separar la fase orgánica y colocar el agente desecante por unos minutos, decantar y concentrar a temperatura ambiente. Pesar y anotar el volumen del aceite obtenido. Calcular el rendimiento con base en el material vegetal de partida.

CUESTIONARIO 1. ¿Cuál es el fundamento físico químico de la extracción por reparto? 2. ¿Qué características físico químicas presenta el aceite esencial de clavo de olor ? 3. ¿Puede realizarse una extracción en Soxhlet con mezclas de disolventes? ¿Porqué? 4. ¿Puede realizarse una destilación por arrastre con vapor de etanol?



2.

DOMINGUEZ, X. (1973). Métodos de Investigación Fitoquímica. Limusa, México.

3.

FARNSWORTH, N.

(1966). Biological and Phytochemical

Screening of Plants. J.

Pharm Sci 55, 225 - 275. 5.

SHARAPIN, N. (2000) Fundamentos de Tecnología de productos fitoterapéuticos. Primera edición. Area de Ciencia y Tecnología del convenio Andrés Bello & Red Iberoamericana de Productos Fitofarmacéuticos (RIPROFITO) del Subprograma X del CYTED.

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PRÁCTICA Nº 6: MARCHA DE SOLUBILIDAD Y TAMIZAJE FITOQUÍMICO MARCO TEÓRICO En el análisis de los metabolitos secundarios presentes en las plantas, existen una serie de métodos utilizados para su detección. Los métodos empleados pueden ser: 1. Histológicos, 2. Biológicos 3. Fisicoquímicos 4. Químicos La evaluación fitoquímica en el laboratorio se realiza en un extracto crudo preparado por extracción del material vegetal seco y molido. Las plantas herbáceas son utilizadas en su totalidad, pero las plantas leñosas es preferible seccionarlas en sus diferentes partes botánicas: corteza, madera, frutos, semillas, raíces, hojas, etc. Metabolitos pri marios

Son los productos químicos resultantes del metabolismo vital de todo ser vivo, son: los carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. Metabolitos s ecundarios

Son subproductos de rutas metabólicas normales que ocurren en ciertas especies, siendo particulares dentro de un grupo taxonómico, estado de vida o tejido, presentando una distribución restringida dentro del Reino vegetal, dando origen a la quimiotaxonomía. Su ocurrencia depende de ataque de patógenos, predadores, cambios térmicos o lumínicos, deficiencias nutricionales o presencia de otros organismos intra o interespecíficos. El metabolismo secundario determina la especialización, puede no ser importante para la célula, pero si para el organismo como un todo. R econocimiento de los metabolitos

Se realiza mediante pruebas fitoquímicas preliminares, consisten en reacciones químicas que producen una alteración rápida en la estructura molecular del compuesto, por ejemplo modificación de un grupo funcional, apertura de un anillo, formación de un aducto o un complejo, lo cual da por resultado un cambio de color, la formación de un precipitado o el desprendimiento de un gas, lo cual nos indica la presencia o ausencia de un metabolito secundario en particular. R econocimiento de alcaloides.

La base de un alcaloide es soluble en solventes orgánicos y pueden formar sales solubles en solventes polares, cuando se encuentran en ácidos minerales diluidos.

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Su presencia se observa con los reactivos yodados de Dragendorff, Mayer, Wagner, Bouchardat , etc., con los cuales precipita. R econocimiento de Flavonoides

Son compuestos fenólicos con 15 átomos de carbono, su esqueleto se representa por el sistema C6-C3-C6. La aparición de colores naranja, rosado, rojo o violeta con el reactivo de S hinoda es prueba positiva para la existencia de flavonoides en la muestra.

Reconocimiento de cardiotónicos

Una aglicona cardiotónica es un núcleo esteroidal con los grupos metilo C18 y C19, un grupo hidroxilo en el C3 y un anillo lactónico α, -insaturado de 4 miembros, unido al C17, estimulan el músculo cardíaco cuando están en la forma de glicósidos.

Reconocimiento de Saponinas

Son glicósidos solubles en agua que pueden hemolizar la sangre y disminuir la tensión superficial del agua, formando abundante espuma. Por hidrólisis se desdoblan en carbohidratos y una aglicona llamada sapogenina.

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FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA La sapogenina puede tener el sistema anular esferoidal o de un triterpeno pentacíclico. Los anillos E y F de la saponina esferoidal conforman el llamado sistema espirostanal. El enlace glicosídico se forma siempre con el carbono 3. R econocimiento de C umarinas

Son compuestos fenólicos con la estructura de1-benzopiran-2-ona. Presentan fluorescencia bajo la luz ultravioleta a 365 nm.

R econocimiento de taninos

Son productos de excreción de muchas plantas, como mecanismos de defensa contra organismos parásitos. Comúnmente están en hojas, ramas y debajo de la corteza. Son polímeros de polifenoles y se clasifican en: Taninos hidrosolubles o pirogálicos, son ésteres fácilmente hidrolizables, se reconocen con el reactivo gelatina – sal y con solución de FeCl 3 con el que dan color azul. Son comunes en plantas dicotiledóneas. Taninos condensados, por hidrólisis dan azúcar y ácido elágico, algunos son llamados proantocianidinas. También se reconocen con solución de FeCl 3 , con el que dan coloración verde. R econocimiento de esteroides y/o triterpenoides

Presentan la estructura del ciclopentano perhidrofenantreno, metilos en los carbonos 10 y 13 y un radical lineal en el carbono 17. La formación de colores rojo, azul o violeta o verde con el reactivo de Liebermann Bourchard , es positivo de la reacción. R econocimiento de quinonas

Son dicetonas cíclicas insaturadas, pueden ser benzoquinonas, naftoquinonas, antraquinonas, fenantroquinonas. Se reconocen con el reactivo de Borntrager , si la capa acuosa se colorea de rosado a rojo intenso es una prueba positiva

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R econocimiento de antocianinas

Son pigmentos flavonoides que se comportan como indicadores ácido base. Se encuentran en la savia de las plantas y en forma de sólidos amorfos o cristalinos en las hojas de tejido leñoso y en frutos.

COMPETENCIAS Detecta los metabolitos secundarios derivados de la ruta del shikimato como taninos, compuestos fenólicos, cumarinas, leucoantocianidinas,etc. Reconoce los metabolitos secundarios derivados de la ruta del mevalonato (terpenos, las saponinas, esteroides, cardiotónicos, etc. Identifica los metabolitos secundarios derivados de la ruta de los aminoácidos, presentes en las plantas como son los alcaloides. Reconoce los metabolitos secundarios derivados de la ruta del acetato, presentes en las plantas como son las quinonas. Identifica

los metabolitos secundarios derivados de rutas biogenéticas mixtas,

presentes en las plantas, como son los flavonoides y los antocianos.

MÉTODO EXPERIMENTAL S us tancias R eactivas

Materi ales y equipos ins trumentales

Nitrato de Bismuto pentahidratado

matraz erlenmeyer

Acido nítrico concentrado

probetas

Yoduro de potasio

pipetas graduadas

Cloruro de mercurio ( I )

tubos de ensayos

Yodo, NaOH, cloruro férrico

Baguetas

Magnesio , limaduras

gradilla para tubos de ensayos

Acido clorhídrico concentrado

lunas de reloj

Metanol, cloroformo, etanol, tolueno

pinzas para tubos de ensayos

Eter isopropílico

hot plate

Gelatina

Pizeta

Cloruro de sodio

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I. MARCHA DE SOLUBILIDAD La muestra seca se extrae en alcohol de 70 ° por 8 días (maceración), con movimiento del macerado periódico y en oscuridad, en un envase de vidrio de color ámbar con tapa hermética. Cada uno de los extractos filtrados se deshidrató o concentró durante 48h hasta obtener un extracto seco a una temperatura no mayor de 40ºC. Del extracto etanólico del material vegetal seco se toman alícuotas en tubos de ensayos con solventes de polaridad creciente (n-Hexano, Benceno, Diclorometano, Acetato de Etilo, Metanol, Etanol y Agua)

II. TAMIZAJE FITOQUÍMICO Fundamento La detección de metabolitos secundarios se basa en su extracción y su identificación por reacciones de coloración y/o precipitación. Procedimiento:

Colocar el extracto seco en un matraz erlenmeyer y adicionar el disolvente indicado. El extracto obtenido (15 mL), dividirlo en 4 alícuotas y disolverlo en cloroformo, metanol, agua y ácido clorhídrico al 1%: 1° En la solución metanólica, verificar la presencia de Flavonoides , con la prueba de Shinoda, esteroides, con la prueba de Lieberman Burchard, alcaloides, quinonas con la prueba de Bornatrager y taninos con las siguientes reacciones: A la 1° porción del extracto inicial agregarle solución de cloruro férrico. A la 2° porción agregar solución de cloruro de sodio. A la 3° adicionar solución de gelatina y A la 4° el reactivo gelatina-sal. La precipitación con este último reactivo o con el 2° y el 3°, es indicativo de la presencia de Taninos. Si sólo ocurre con el 1° el test, es falso. 2° En la solución ácida, comprobar la presencia de Alcaloides, con las pruebas de Dragendorff , Mayer, Soneschein y Wagner . 3° En la solución acuosa verificar la presencia de: flavonoides, leucoantocianidinas con la prueba de Rosenheim, saponinas con la prueba de la espuma, carbohidratos con la reacción de Molish, azúcares reductores con los reactivos de Fehling y de Benedict, sesquiterpenlactonas con las pruebas de Legal y Baljet, aminoácidos con el reactivo de Ninhidrina.

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CUESTIONARIO 1. ¿En qué se fundamenta la prueba a la gota? 2. Escriba las ecuaciones químicas de las reacciones que ocurren en el tamizaje fitoquímico. 3. ¿Qué criterios deben considerarse al analizar los resultados del tamizaje fitoquímico? 4. ¿Porqué se recomienda realizar cinco ensayos para identificar alcaloides?

FUENTES DE INFORMACIÓN 1. CYTED. (1995) Manual de Técnicas de Investigación. Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo. Bogotá, Colombia. 2. DOMINGUEZ, X. (1973). Métodos de Investigación Fitoquímica. Limusa, México. 3. FARNSWORTH, N. (1966). Biological and Phytochemical Screening of Plants. J. Pharm Sci 55, 225 - 275. 4. SHARAPIN, N. (2000) Fundamentos de Tecnología de productos fitoterapéuticos. Primera edición. Area de Ciencia y Tecnología del convenio Andrés Bello & Red Iberoamericana de Productos Fitofarmacéuticos (RIPROFITO) del Subprograma X del CYTED.

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PRÁCTICA Nº 7: TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS DE FRACCIONAMIENTO Y PURIFICACIÓN MARCO TEÓRICO Los extractos crudos obtenidos a partir de productos naturales son mezclas muy complejas, que necesitan fraccionamientos y purificaciones. El fraccionamiento de un extracto o la purificación de una sustancia de interés, se realiza siguiendo los criterios de separación basados en alguna propiedad física o química que diferencia al compuesto en cuestión de otros que en principio estarían unidos a él. La cromatografía (chromo= color y graphie=escritura, escribir en colores) fue inventada el 1903 por el botánico ruso Mikhail Tswett. Es un método de separación para la caracterización de mezclas complejas de origen natural. Se basa en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Las técnicas cromatográficas son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase móvil que consiste en un fluido (gas, líquido o fluido supercrítico) que arrastra a la muestra a través de una fase estacionaria que se trata de un sólido o un líquido fijado en un sólido. Entre los diversos mecanismos de separación cromatográfica tenemos: Aquéllos que fraccionan las moléculas en base a sus tamaños, como la Cromatografía de Filtración en gel. Aquéllos que separan a las moléculas atendiendo a las diferencias en la carga eléctrica neta del compuesto, como la Cromatografía de intercambio iónico. Los que se basan en la retención específica de sólo uno o varios tipos de moléculas, como la Cromatografía de Afinidad. Los que se basan en la adsorción diferencial a determinadas matrices o Cromatografía de Adsorción. Los procedimientos de separación basados en las diferencias de solubilidad, como la Cromatografía de Reparto o Partición.

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA (CC) Es una técnica de separación en la que el lecho estacionario está contenido dentro de un tubo de vidrio vertical.

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (CCF) Es la técnica de separación en la que la fase estacionaria está sobre un plano formando una capa de partículas sólidas extendida sobre un soporte, tal como una placa de vidrio o aluminio ((Thin Layer Chromatography, TLC). El revelado de las placas se puede realizar mediante dos métodos: · Método químico

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FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA · Método físico (ópticos).

CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA PREPARATIVA (CCDP) La cromatografía preparativa se diferencia en que la papilla debe hacerse con menos agua que de ordinario. El espesor óptimo oscila desde un mínimo de 1 mm. hasta un máximo de 2 mm. La siembra debe realizarse a lo ancho de la placa. Una vez localizados los compuestos, éstos se extraen de la fase estacionaria, uno a uno, con la ayuda de una espátula, sobre un papel de filtro u otro soporte. Una vez disuelto el compuesto se filtra varias veces para separar el compuesto y la fase estacionaria. Las placas utilizadas en cromatografía preparativa son placas grandes, de aproximadamente 20x20 cm. En la práctica desarrollaremos algunas técnicas cromatográficas como: Cromatografía en Columna, CC, Cromatografía en Capa Delgada, CCD y Cromatografía en Capa Delgada Preparativa, CCDP.

COMPETENCIAS Preparar y desarrollar una Cromatografía en Capa Delgada, CCD. Preparar y desarrollar una Cromatografía en Capa Delgada Preparativa, CCDP. Preparar y desarrollar una Cromatografía en Columna, CC.

MÉTODO EXPERIMENTAL Materi ales y equipos

Materiales Estufa con recirculación de

Baño maría

aire

punto de fusión

Beaker x 50, 100 mL

Desecador

Pipetas x 5, 10 mL

Cromatoplacas de sílica gel 20 x 20 cm y cámara cromatográfica

Bagueta

Equipo para medir

Cromatofolios de sílica gel GF -254, 5 x 10 cm ycubeta cromatográfica

Probeta x 100 mL

Columna cromatográfica

Balanza analítica

Tubos de ensayos y gradilla

Papel filtro

Lámpara UV, longitud de onda corta y onda larga

Espectrofotómetro

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Reactivos Sílicagel para CC

Acetona

Tolueno

Cloruro férrico

Cloroformo

Acetato de etilo

Ácido sulfúrico

Agua destilada

concentrado Metanol

Diclorometano

Hidróxido de sodio

1. CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA PREPARATIVA, CCDP Procedimiento: A) Tratamiento de la Muestra: pesar el extracto seco de la muestra.

B) C romatogr afía En C apa Delg ada Pr eparativa Sembrar en banda el extracto pesado, en un cromatofolio de 20 x 20 cm y utilizar como fase móvil la mezcla indicada Desarrollar la Cromatografía Desorber la banda de interés con el disolvente adecuado. Recristalizar. Reconocer la sustancia con los reactivos de coloración indicado. Determinar su punto de fusión Leer su espectro en EtOH

2. PURIFICACIÓN POR CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA Procedimiento: A ) Tratamiento de la mues tra : pesar el extracto de la muestra. B ) C romatogr afía en columna

Lavar y secar la columna cromatográfica, colocar algodón o lana de vidrio en la columna para evitar que la sílica pase a través de la salida inferior. Preparar la fase estacionaria en un beaker, mezclando silicagel con el disolvente elegido hasta formar una suspensión. Empacar la columna por llenado húmedo, el llenado debe ser uniforme. Eliminar el aire contenido en la columna. Dejar en reposo para que sedimente la fase estacionaria. Preparar la muestra en forma de papilla. Aplicar la muestra sólida por la parte superior de la columna. Eluir la columna con los disolventes indicados, en gradiente. Recibir los eluatos en tubos de ensayos y analizarlos por CCD.

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3. IDENTIFICACIÓN POR CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA Procedimiento:

El extracto obtenido y pesado, re disolverlo en el disolvente elegido y sembrar en una cromatoplaca de sílica gel GF -254, desarrollar en la mezcla de disolventes. Retirar la placa luego de desarrollar, dejarla secar en un extractor de vapores y analizarla con una lámpara UV.

CUESTIONARIO 1. Al realizar una TLC ¿Qué criterios utiliza en la elección de la fase móvil y la fase estacionaria? 2. ¿Qué se entiende por Rf? 3. ¿Qué etapas comprende el empaque de una columna cromatográfica? 4. ¿Cuáles son las diferencias entre HPTLC y TLC? 5. Explique el mecanismo de adsorción en la separación cromatográfica. 6. ¿Cómo se identifican los componentes no coloreados eluidos de una columna cromatográfica?



2.

DOMINGUEZ, X. (1973). Métodos de Investigación Fitoquímica . Limusa, México.

3.

FARNSWORTH , N.



Pharm Sci 55, 225 - 275. 4.

HOSTETTMANN, K., GUPTA, M., MARSTON, A., FERREIRA, E. (2008) Plantas Medicinales Iberoamericanas. 1º edición. CYTED. Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología.

5.

SHARAPIN, N. (2000) Fundamentos de Tecnología de productos fitoterapéuticos. Primera edición. Área de Ciencia y Tecnología del convenio Andrés Bello &

Red

Iberoamericana de Productos Fitofarmacéuticos (RIPROFITO) del Subprograma X del CYTED.

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PRÁCTICA Nº 8: COMPUESTOS FENÓLICOS: FENILPROPANOIDES Y CUMARINAS

MARCO TEÓRICO La producción de aceites esenciales es uno de los principales procesos donde se aplica la destilación por arrastre de vapor de agua Los aceites esenciales son los constituyentes odoríferos o “esencias” de una planta. La palabra esencial fue derivada del latín “quinta essentia” que significaba el “quinto elemento” asignado a estos aceites ya que la tierra, aire, fuego y agua fueron considerados los cuatro primeros elementos.

Los aceites esenciales están constituidos químicamente por terpenoides

(monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos, etc.) y fenilpropanoides, compuestos que son volátiles y por lo tanto arrastrables por vapor de agua. El clavo de especia es el botón floral del árbol de las Indias Occidentales, Eugenia aromática, familia Mirtaceae. Su olor se describe como punzante y especiado, tiene aplicaciones como analgésico dental de uso tópico y se usa también en la producción comercial de vainillina. Tiene un agradable olor a clavo. Eugenol (C10H12O2) es guaiacol con una cadena alil sustituda. i.e. 2 metoxi-4-(2-propenil)fenol. El eugenol es un miembro de los compuestos de la clase alilbencenos. Es un líquido oleoso de color amarillo pálido extraído de ciertos aceites esenciales, especialmente del clavo de olor, la nuez moscada, y la canela. Es difícilmente soluble en agua y soluble en solventes orgánicos. Las cumarinas son metabolitos secundarios que derivan de la ruta del shikimato y actúan como anticoagulantes orales (4-hidroxicumarinas),

como vitamina K falsa, interfieren en la

regeneración de epóxidos, provoca carencia de la vitamina K activa. En humanos están presentes como metabolitos (7-hidroxicumarinas).

COMPETENCIAS Aisla el eugenol a partir del aceite esencial de clavo por particiones sucesivas con disolventes y álcalis. Identifica el eugenol por sus propiedades físicas. Identifica el eugenol por su Espectro de absorción. Sintetiza una cumarina.

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MÉTODO EXPERIMENTAL S us tancias r eactivas


Aceite esencial de

Embudo de separación, Soportes universales

clavo de olor

Beakers, Probetas

Diclorometano

Pipetas x 10 mL

Solución de KOH al 5%..................................... Balanza analítica Solución de HCl al 5%

Potenciómetro, Rotavapor

Sulfato de sodio anhidro

Baño maría

Cloruro de sodio

Trozos de porcelana porosa

Procedimiento:

Mezclar el aceite esencial con diclorometano, extraer la fase orgánica por reparto en un embudo de decantación con solución de KOH al 5%. Reunir las fases acuosas alcalinas y lavarlas una vez con diclorometano. Pasar la disolución acuosa alcalina a un beaker y acidificar lentamente (reacción exotérmica) hasta un pH de 1 con HCl Extraer la solución ácida con diclorometano, separar la fase acuosa y desecharla. Reunir las capas orgánicas y lavarlas sucesivamente con agua destilada y de solución semisaturada de cloruro de sodio. Secar la disolución orgánica sobre Sulfato de sodio anhidro. Decantar el agente desecante y eliminar el diclorometano a presión reducida en el rotavapor, el eugenol se obtiene como un aceite amarillo pálido con un intenso olor a clavo. Pesar el aceite y calcular el rendimiento de eugenol, a partir del aceite de clavo empleado. Obtener su índice de refracción. Obtener su espectro de absorción en el UV en el rango de 200 a 300 nm.

CUMARINAS Síntesis 1: En un matraz bola o pera de 25 ml agregar: resorcinol (5 mmol), acetato de etilo (6 mmol), etanol (5mL) y HCl (5mL) Calentar a reflujo la mezcla de reacción por 30 minutos en baño de arena. Enfriar la mezcla a temperatura ambiente y adicionar hielo. Agitar hasta la formación de un precipitado. Filtrar y lavar el sólido con agua fría. Recristalizar en etanol mediante reflujo.

Síntesis 2: Mediante microondas:

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FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA En un matraz erlenmeyer de 150 mL agregar: resorcinol (5mmol), acetoacetato de etilo (6 mmol) y HCl (5 mL). Introducir al horno de microondas a una potencia de P-3 durante 30 minutos, cada 10 minutos en intervalos (agitar en cada uno de ellos). Adiciona a la mezcla de reacción hielo y agitar. Filtrar y lavar con agua fría. Recristalizar con etanol.

CUESTIONARIO 1. Escriba las ecuaciones químicas que representen la obtención del Eugenol a partir del aceite esencial de clavo de olor. 2. ¿Qué es un aceite esencial y cómo se clasifican por su composición química? 3. ¿Porqué las capas orgánicas se lavan con solución semisaturada de cloruro de sodio? 4. ¿Cuál es el uso del eugenol? 5. ¿Qué estudios existen acerca de la toxicidad del eugenol al ser usado en la salud?

FUENTES DE INFORMACIÓN 1. CYTED. (1995) Manual de Técnicas de Investigación. Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo. Bogotá, Colombia. 2. DOMINGUEZ, X. (1973). Métodos de Investigación Fitoquímica . Limusa, México. 3. FARNSWORTH, N.



Pharm Sci 55 , 225 - 275 . 4. HOSTETTMANN, K., GUPTA, M., MARSTON, A., FERREIRA, E. (2008) Plantas Medicinales Iberoamericanas. 1º edición. CYTED. Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología. 5. SHARAPIN, N. (2000) Fundamentos de Tecnología de productos fitoterapéuticos. Primera edición. Area de Ciencia y Tecnología del convenio Andrés Bello & Red Iberoamericana de Productos Fitofarmacéuticos (RIPROFITO) del Subprograma X del CYTED.

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PRÁCTICA Nº 9: FLAVONOIDES: DETERMINACIÓN DE RUTINA EN RUTA GRAVEOLENS O RUTA spp , “RUDA”, UTILIZANDO TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

MARCO TEÓRICO El género Ruta (Familia Rutaceae) comprende alrededor de 60 especies; etimológicamente Ruta deriva del griego ruomai, que significa refrenar, en alusión a la supuesta acción afrodisiaca. Las especies de este género se conocen comúnmente como “ruda”, y la Ruta graveolens L. es una antigüa planta medicinal nativa del Sur de Europa; entre sus diversas aplicaciones encontramos que se utiliza la infusión de las hojas como digestivo, calmante nervioso, para gases intestinales y cólicos hepáticos y menstruales, así como en lavados para la inflamación de ojos y oídos. Otros usos son: contra el aire (frotar las sienes con las hojas), contra la fiebre (aplicar el cocimiento en aguardiente de la planta machacada sobre el vientre y cabeza), en prácticas de chamamismo para alejar los malos espíritus (poner un manojo en la puerta o en la casa), etc. Las “rudas” se caracterizan por contener flavonoides, entre ellos la rutina, que se presenta como cristales color amarillo pálido, el que puede oscurecer gradualmente por exposición de la luz. Descompone con efervescencia a 214-215 °C, su rotación específica [α]

D

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es +13,82

(etanol) y da un color verde en solución diluída de cloruro férrico. La rutina tiene importante uso en el tratamiento de la fragilidad capilar, encontrándose en formulaciones farmacéuticas con ese fin.

COMPETENCIAS Detecta la rutina de la “ruda” a través de cromatografías de capa delgada. Separa la rutina de la “ruda” a través de cromatografía de columna. Purifica la rutina por Cromatografía en Capa Delgada Preparativa, CCDP. Elucida estructuralmente la rutina por Espectroscopia de Absorción UV e IR.

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Hojas secas de ruda

Matraz erlenmeyer

Metanol

beakers, bagueta

Cromatofolios de sílicagel 4 x 10 cm

pipetas, probeta

Solución de FeCl3 al 1%.................................. ..embudo simple, capilares Diclorometano

Lámpara de luz UV

Sílica gel 0,063 – 0,2 mm

Tubos de ensayos, gradilla y pinzas

Cromatoplacas de sílicagel gruesa de

Espectrofotómetro UV

20 x 20 cm

Espectrofotómetro IR

Procedimiento: 2.1 Tr atamiento de mues tra

• Macerar en un recipiente tapado 10 gramos de hojas secas y molidas con suficiente metanol por 48 horas con agitación constante. • Filtrar y evaporar a sequedad en un evaporador rotatorio. Pesar el extracto seco y calcular el rendimiento.

2.2 Análisis cualitativo por cromatografía de capa delgada, CCD • Correr una CCD utilizando las siguientes condiciones: - Adsorbente: cromatofolios de sílica gel o cromatoplacas - Dimensión: 4 x 10 cm - Volumen aplicado: 5 uL (10 mg del extracto 1 en mL de metanol) - Sistema de elución: CH 2Cl2:MeOH , 100:15 - Revelador: luz UV 366 nm, y solución etanólica al 1% de FeCl3 • Corra paralelamente una muestra de rutina estándar.

2.3 Separación de rutina por cromatografía de columna (CC) • Hacer una CC utilizando 200 mg del extracto metanólico obtenido en 2.1, utilizando las siguientes condiciones: - Adsorbente: sílica gel 0,063 – 0,2 mm - Relación extracto: adsorbente 1: 30 - Sistema de elución: CH2Cl2: MeOH (en proporciones)

Volumen total (mL)

100

15

30

100

20

30

100

30

30

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FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA • Proceder de la siguiente manera: - Aplicar los sistemas de elución, recogiendo fracciones de 10 mL cada una. - Observar las fracciones colectadas bajo luz UV 366 nm. - Realizar el análisis comparativo por CCD de las fracciones obtenidas, utilizando una muestra estándar de rutina, y el sistema eluyente CH2Cl2: MeOH, 100: 15. - Reunir las fracciones que contengan rutina, evaporar a sequedad. - Si es necesario purificar por CCD preparativa usando el sistema eluyente CH2Cl2: MeOH (100 : 15). Recristalizar y pesar el producto. - Obtener los espectros IR y UV

CUESTIONARIO 1. ¿Cuál es la ruta biogenética a partir de la cual se forman los flavonoides? 2. ¿Cómo se clasifican los flavonoides, en base a su diferencia estructural química? 3. ¿Qué señales de absorción en el espectro UV se observan en la rutina? Adjunte el espectro obtenido. 4. ¿Qué señales de absorción en el espectro IR se observan en la rutina? Adjunte el espectro obtenido. 5. ¿Cuál es la aplicación de la rutina?

FUENTES DE INFORMACIÓN 1. CYTED. (1995) Manual de Técnicas de Investigación. Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo. Bogotá, Colombia. 2. DOMINGUEZ, X. (1973). Métodos de Investigación Fitoquímica . Limusa, México. 3. HOSTETTMANN, K., GUPTA, M., MARSTON, A., FERREIRA, E. (2008) Plantas Medicinales Iberoamericanas. 1º edición. CYTED. Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología. 4. SHARAPIN, N. (2000) Fundamentos de Tecnología de productos fitoterapéuticos. Primera edición. Area de Ciencia y Tecnología del convenio Andrés Bello & Red Iberoamericana de Productos Fitofarmacéuticos (RIPROFITO) del Subprograma X del CYTED. 5. LOCK DE UGAZ, O. (1994) Investigación fitoquímica. Métodos en el estudio de los productos naturales. 2º ed. Lima: Fondo editorial Pontificia Universidad Católica del Perú.

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PRÁCTICA Nº10: ELUCIDACIÓN DE FLAVONOIDES POR ESPECTROSCOPÍA UV – VISIBLE

MARCO TEÓRICO Los FLAVONOIDES, unas sustancias llamadas así porque las primeras que se lograron aislar eran de color amarillo, pero también hay incoloras ó con otros colores diferentes del amarillo como son el rojo, el violeta y el azul. Químicamente son moléculas que tienen dos anillos bencénicos (ó aromáticos, para los químicos orgánicos) unidos a través de una cadena de tres átomos de carbono, puesto que cada anillo bencénico tiene 6 átomos de carbono, los autores los denominan simplemente como compuestos C6C3C6.

Figura 1. Estructura básica de un flavonoide

Espectroscopía ultravioleta-visible Los espectros UV de los flavonoides en metanol presentan bandas características debidas a los sistemas conjugados de los anillos aromáticos. Las flavonas y flavonoles muestran dos bandas definidas: La banda I, de mayor longitud de onda en el rango 300-390 nm asociada con la funcionalidad cinamoílo, y la banda II, entre 250280 nm debida al anillo aromático A (funcionalidad benzoílo), aunque a veces se observan otras bandas de absorción. La posición de la banda I depende del tipo de flavonoide: las flavonas la muestran en 310-350 nm, los flavonoles 3-O-sustituidos en 330-360 nm, y los flavonoles en 350-385 nm. La presencia de hidroxilos fenólicos en diferentes posiciones de la molécula puede establecerse estudiando el comportamiento del espectro UV metanólico al añadirle los denominados reactivos de desplazamiento: metóxido de sodio (NaOMe), acetato de sodio (NaOAc), cloruro de aluminio (AlCl3) con y sin HCl, y ácido bórico (H3BO3). El NaOMe es una base fuerte que ioniza los hidroxilos fenólicos presentes en la molécula y

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FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA particularmente permite reconocer la existencia de grupos hidroxilo en 3 y 4'. El NaOAc es una base más débil que el NaOMe, y ioniza solo los hidroxilos fenólicos más ácidos: 3, 4' y 7. La ionización del hidroxilo en 7 afecta la banda II y por lo tanto el NaOAc es un reactivo útil para determinar la presencia de dicho hidroxilo. El H3BO3 en medio alcalino forma quelatos con hidroxilos fenólicos en posición relativa orto: La formación del quelato produce desplazamiento batocrómico en la banda I. Si el desplazamiento es de 12-36 nm se trata de un flavonoide (flavona, flavonol, aurona o chalcona) orto-dihidroxilado en el anillo B, pero si el desplazamiento batocrómico es menor es un flavonoide orto-dihidroxilado en el anillo A.

El AlCl3 anhidro también forma quelatos con flavonoides orto-dihidroxilados, 3-hidroxilados y 5hidroxilados. En el caso de los orto-dihidroxilados el quelato es inestable a pH ácido, mientras que los quelatos formados con 3- y/o 5-hidroxilados son estables: Por lo anterior, si al determinar el espectro con AlCl3 y HCl se mantiene un desplazamiento batocrómico de 35-55 nm en la banda I (comparando con el espectro metanólico) se trata de una flavona o un flavonol 5-hidroxilado.

COMPETENCIAS 1. Reconoce las señales de los espectros UV y Visible en los espectros de flavonoides. 2. Interpreta espectros de absorción en metanol, de los flavonoides

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FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA 3. Interpreta espectros de absorción con reactivos de desplazamiento, de los diferentes tipos de flavonoides.

MÉTODO EXPERIMENTAL El estudiante aprenderá a diferenciar los espectros de absorción en el UV y visible de los diferentes tipos de flavonoides, en metanol y con reactivos de desplazamiento.

CUESTIONARIO 1. -Investigar que derivados vegetales o animales poseen flavonoides. 2. -Explique ejemplos particulares en la salud y en la ecología en el que los flavonoides tienen importancia.

3. La morina es un flavonoide de fórmula molecular C 15H10O7 y que presenta los espectros UV mostrados a continuación. Determine la estructura más probable para esta sustancia.

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FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA FUENTES DE INFORMACIÓN 1. Lock, O. (1994) Investigación Fitoquímica, Método en el Estudio de Productos Naturales. Fondo Editorial PUCP. Lima. pp. 114-130 2. Mabry, T.J., Markham, K.R. and Thomas, M.B., (1970) The Systematic Identification of Flavonoids. Springer-Verlag, Berlín. 3. Oliveira, C.M., et. al. (1999) Farmacognosia, da Planta ao Medicamento. Editora DAUFSC, Florianapolis. pp. 489-493 4. Wagner, H., Bladt, S., Zgainski, E.M. (1996) Plant Drug Analysis A Thin Layer Chromatography. Springer-Verlag, Berlín. 5. Park, Y., Koo, M., Ikegaki, M., Contado, J., (1997) Comparison of the flavonoid aglycone contents of Apis mellifera propolis from various regions of Brazil. Arq. Biol. Tecnol. 40 (1), 97106. 6. Martínez, A. (2005) Flavonoides. Universidad de Antioquía. Medellín. https:/ /www.repositorio.utp.edu.co/dspace/bitstream/11059/4609/.../547869M385.pdf

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PRÁCTICA N° 11: PIGMENTOS, COLORANTES, TERPENOIDES MARCO TEÓRICO Los suplementos son adicionados a los alimentos con el fin de mejorar su apariencia, sabor, color, y ayudar a su preservación. Actualmente hay un considerable interés mundial en el desarrollo de los colorantes naturales debido a su seguridad y beneficio para el organismo. La cúrcuma (Cúrcuma longa Linn) conocida también como turmeric o haldi (Asia), de origen asiático pertenece a la familia Zingiberaceae. Se cultiva principalmente en China, India, Indonesia, Jamaica y Perú. Las propiedades del turmeric son muy importantes para la industria debido a que cuando se adiciona a preparaciones alimentarias preserva su frescura e imparte un sabor característico además, de su uso en la medicina tradicional principalmente contra afecciones estomacales.

La cúrcuma cuenta en su composición química con compuestos volátiles y no volátiles. La curcumina es el principal polifenol curcuminoide encontrado en el turmeric, junto con la demetoxicurcumina, bisdemetoxicurcumina y la recientemente descubierta ciclocurcumina forman el complejo conocido como azafrán indio, raíz amarilla, jengibre amarillo o amarillo natural 3. La curcumina (C 21 H20 O6 ) es también conocida como diferuloilmetano o 1,7-bis-(4-hidroxi-3-metoxifenil)-1,6-heptadieno-3,5-diona, es un compuesto enólico de bajo peso molecular (369.37g/mol) con punto de fusión 183ºC, de color amarillo en medio ácido (pH 2,5-7) y rojo en medio básico (pH> 7), es soluble en solventes orgánicos como dimetilsulfoxido, etanol, metanol o acetona y muy poco soluble en solventes acuosos.

COMPETENCIAS •

Extrae la curcumina de los rizomas de cúrcuma, (Cúrcuma longa L.).

•

Caracteriza cromatográficamente la curcum ina de los rizomas de cúrcuma.

•

Caracteriza espectroscópicamente la curcum ina de los rizomas de cúrcuma,

MÉTODO EXPERIMENTAL Preparación de Harina:

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Los rizomas se cortan en rodajas y se secan por circulación con aire caliente a 40ºC por dos días, se muelen y tamizan hasta obtener un tamaño de partícula adecuado para las extracciones, la harina obtenida fue almacenada para los análisis posteriores. Extracción del Colorante:

La harina fue desengrasada con hexano durante 9 horas. El material desengrasado se sometió a extracción soxhlet con etanol absoluto por 9 horas con el fin de obtener el extracto de colorantes. Separación y Purificación de Curcumina:

El extracto se concentró y analizó por cromatografía de capa delgada utilizando placas de sílica gel y una mezcla de cloroformo y acetato de etilo (7:1), como fase móvil. La separación del extracto se hizo por columna cromatográfica. Una posterior purificación para la caracterización de esta fue realizada por cromatografía preparativa. Caracterización Espectroscópica:

Las fracciones recolectadas se recristalizan, con estos cristales se realizan los análisis espectroscópicos. Análisis por Ultravioleta visible (UV-Vis): se realiza en un espectrofotómetro de ultravioleta visible, usando etanol y cloroformo como blancos y una celda de cuarzo de 1cm de longitud.

CUESTIONARIO 1. ¿Qué señales en el Infrarrojo presenta la curcumina? 2. ¿Qué usos tiene la curcumina? 3. ¿Qué señales de RMN 1H y de 13C presenta la curcumina? 4. ¿Qué señales en Espectrometría de Masas presenta la curcumina?

FUENTES DE INFORMACIÓN 1. Tafoya, A. y García F. Colorantes. En: Biotecnología Alimentaria. México: Limusa. 1993. pp. 479-617. 2. Ríos, E; Duque, A; León, D. (2009) Caracterización espectroscópica y cromatográfica de curcumina extraída de los rizomas de Cúrcuma ( Cúrcuma longa l.) Cultivada en el departamento del Quindío

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PRÁCTICA N° 12: ANÁLISIS DE ACEITES ESENCIALES DE SEMILLAS DE umbelíferas MARCO TEÓRICO Los aceites esenciales pertenecen al grupo de los terpenoides. Bajo este término se agrupa a una enorme cantidad de sustancias vegetales que tienen como característica fundamental originarse a partir de una ruta biosintética común. Todos los terpenoides tienen como punto de partida la molécula del isopreno: CH 2 = C (CH3 ) - CH = CH2 y su esqueleto carbónico se constituye a partir de dos o más de esas unidades de 5 carbonos. En su calidad de terpenoides, los aceites esenciales pueden ser químicamente divididos en 2 grupos: mono y sesquíterpenoides (C10, C15), los cuales difieren en el intervalo de su punto de ebullición: monoterpenoides entre 140 a 180°C y sesquiterpenoides > 200°C. Los aceites esenciales son los responsables de los aromas y sabores característicos encontrados en muchas plantas. Por ello son comercialmente importantes en la perfumería, la industria de la alimentación y la medicina. Entre las familias de plantas que son especialmente ricas en aceites esenciales se incluye a las compuestas, pináceas, rosáceas, rutáceas y umbelíferas, estas últimas serán motivo de estudio en esta práctica.

COMPETENCIAS Obtiene aceites esenciales de semillas de um belíferas y su detección por cromatografía en capa fina. Identifica los compuestos volátiles de semillas de umbelíferas por reacciones cromógenas.

Reactivos y disolventes Semillas de anís (Pimpinella anisum L.), cilantro (Coriandrum sativum L.), comino (Cominum cyminum L.), eneldo ( Anethum graveolens L.), perejil (Pertroselinum crispum L.), Cardamomo

(Elleteria cardomomum L. Maton), Eter etílico, tolueno, revelador de anisaldehído en medio ácido, Revelador vainillina-ácido sulfúrico, Revelador 2, 4-dinitrofenilhídrazina.

Materiales y equipo

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FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA 2 Pipetas de 1 mL 1 Mortero con pistilo 1 Matraz volumétrico de 25 mL 2 Vasos de precipitados de 10 mL 1 Vaso de precipitado de 250 mL 1 Probeta de 25 mL 1 Matraz bola de 250 o 500 mL 5 Micropipetas 1 Agitador de vidrio 2 Placas cromatográficas de silicagel FG254, de 20 X 20 cm. 1 Cámara cromatográfica con tapa Plancha eléctrica. Estufa de aire forzado Lámpara de luz UV

Procedimiento: Moler las semillas en el mortero, cubrirlas con éter y dejar reposar el extracto durante 30 min. Decantar y concentrar el extracto a baño María o tomar una placa cromatográfica y trazar una línea horizontal, a una distancia de 2 cm. del borde inferior de la placa. Sobre la línea trazada, aplicar con las micropipetas los extractos por analizar, es decir, apoyando el capilar sobre la línea. Repetir varias veces la aplicación de las muestras. Preparar otra placa de la misma manera. Introducir las placas cromatográficas en la cámara de elusión la cual deberá contener la mezcla de tolueno:acetato de etilo 93:7, tapar la cámara y esperar a que el eluyente suba hasta 0.5 cm. del borde superior, (40-60 min. aproximadamente). Sacar las placas de la cámara, marcar inmediatamente con el lápiz la distancia recorrida por la mezcla eluyente y dejarlas secar. Observar las placas bajo luz UV y marcar las manchas. Aspersar la primera placa con el revelador vainillina-ácido sulfúrico, calentar a 100°C durante 10 minutos para desarrollar color. Asperjar la segunda placa con el revelador 2,4dinitrofenilhídrazina (DNP) y observar las manchas de color naranja, alternativamente la placa se puede asperjar con el revelador de anisaldehído-ácido sulfúrico, calentando a 100°C por 10 minutos para desarrollar color (Ver apéndice para la preparación de los reveladores).

RESIDUOS Y SU MANEJO: Tejido vegetal macerado Se coloca en una bolsa de papel de estraza y se deposita al cesto de la basura. Mezcla de elusión tolueno:acetato de etílo Se vierte en el recipiente de los residuos orgánicos.

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FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA Gel de Sílice Una vez que se tomaron todos los datos se retira la silicagel de la placa raspando con una navaja de un filo y se coloca en el recipiente de desechos de silica gel, para su posterior limpieza y reutilización. Tener la precaución de realizar esta actividad con mascarilla y lentes.

CUESTIONARIO 1.- Describe las principales funciones de los aceites esenciales en las plantas 2.-. Describe por lo menos 3 métodos de análisis que se reportan para el estudio de aceites esenciales 3.- Escribe cual es la ruta metabólica de biosíntesis de los aceites esenciales.

FUENTES DE INFORMACIÓN 1. Ikan, R. 1991. Natural Prroducts. A Laboratory Guide. Academic Press, New York.360p. 2. Harborne, J. B. 1991. Phytochemical Methods. 3rd ed. Chapman & Hall. Londres. 288p. 3. Wagner, H., S. Bladtt. 1996. Plant Drug Analysis A Thin Layer Chromatography Atlas. 2d. Ed. Springer Verlag. New York. 384 p. 4. Soto, H. M. R. 2007. Fitoquímica, Manual de prácticas. Colegio de Postgraduados Campus Montecillos. 102 p

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PRÁCTICA Nº13: ESTEROIDES. EXTRACCIÓN E IDENTIFICACIÓN DEL SITOSTEROL MARCO TEÓRICO Con el nombre de terpenos se conoce a un grupo importante de componentes vegetales que tienen un origen biosintético común. Todos, aunque con estructuras químicas muy distintas, proceden de la condensación, en número variable, de unidades isoprénicas.

Desde el punto de vista farmacéutico, los grupos de principios activos de naturaleza terpénica más interesantes son: monoterpenos y sesquiterpenos constituyentes de los aceites esenciales, derivados de

monoterpenos correspondientes a los iridoides, lactonas

sesquiterpénicas que forman parte de los principios amargos, algunos diterpenos que poseen actividades farmacológicas de aplicación a la terapéutica y por último, triterpenos y esteroides entre

los

que

se

encuentran

las

saponinas

y

los

heterósidos

cardiotónicos.

Este grupo de principios activos está constituido por numerosos compuestos, estructuralmente muy similares, derivados mayoritariamente del epoxiescualeno o en menor número del propio escualeno. Todos ellos poseen un hidroxilo en el C 3 que les permite la unión con una o varias moléculas glucídicas, dando lugar a estructuras heterosídicas. Pueden establecerse dos grandes grupos dependiendo de su estructura química: triterpenos (tetra y pentacíclicos) y esteroides. Se encuentran en estos grupos compuestos de gran interés farmacéutico como son los saponósidos y los heterósidos cardiotónicos. Los Esteroides son moléculas policíclicas de 21 a 29 átomos de carbono. Desde el punto de vista químico son derivados del ciclopentanperhidrofenantreno y del punto de vista biosintético derivan del lanosterol o del cicloartenol. El

-sitosterol es un fitosterol con una estructura parecida al colesterol producido

por los animales, está en muchos productos alimenticios y es también un suplemento dietético.

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COMPETENCIAS Extrae y fracciona esteroides a partir de la maca Purifica el -sitosterol Identifica el -sitosterol por TLC



Estándar de -sitosterol

Fiola x 10 mL

Diclorometano

Beakers, bagueta

Cromatofolios de sílicagel 4 x 10 cm Maca en polvo

Pipetas, probeta

................................... .Embudo simple, capilares

Acetato de etilo

Lámpara de luz UV

Ácido sulfúrico concentrado

Equipo de soxhlet con balón x 100 mL

Cromatoplacas de sílicagel 20 x 20 cm

Estufa

Vainillina

Hot plate

Tolueno

Agitador magnético

Hexano

Centrífuga,

Etanol

Rotavapor

Procedimiento: Pr eparación del es tándar:

Pesar 10 mg del estándar en una fiola de 10 mL, adicionar 5 mL de diclorometano. Sonicar hasta disolución completa. Enrasar con diclorometano y homogenizar.

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Pr eparación de la mues tra:

Pesar 15 g de maca y hacer una extracción en Soxhlet con 30 mL de Diclorometano – MeOH (7:1) en el balón y aproximadamente 80 mL de Diclorometano – MeOH (7:1) en el cuerpo del soxhlet. Extraer a 50ºC por un tiempo mínimo de 4 horas. Concentrar a sequedad y disolver con 10 mL de Tolueno, sonicar por 5 minutos, centrifugar por 15 minutos y separar el sobrenadante, concentrar a sequedad, redisolver con 1 mL de diclorometano en un tubo de ensayos y hacer TLC, considerando: Fase estacionaria: silicagel Fase móvil: n-hexano-Acetato de etilo (4:1) Reveladores: Solución A: solución de ácido sulfúrico al 5% (volumen / volumen) en etanol p.a. Solución B: solución de vainillina al 1% (peso / volumen) en etanol p.a. Frente de solvente: 16 cm Volumen de siembra: Estándar: 10 L

Muestra: 20 L

Marcar la placa cromatográfica a 2 cm del borde inferior y a 16 cm de esta línea de referencia Sembrar 10 L del estándar y 20 L de la muestra. Colocar la placa en el sistema de solventes hasta llegar a un frente de solvente de 16 cm. Retirar la placa cromatográfica, dejar secar a temperatura ambiente en la campana extractora por 15 minutos. Aspersar la placa con la solución A y seguidamente con la solución B, secar la placa durante 15 minutos a temperatura ambiente y luego calentar a 105ºC en la estufa por 5 minutos. Hallar el Rf = 0,43

CUESTIONARIO 1. ¿Cuál es la ruta biogenética a partir de la cual se forma el -sitosterol? 2. ¿Cómo se clasifican los esteroides, en base a su diferencia estructural química? 3. ¿Qué señales de absorción en el espectro UV se observan en el -sitosterol? Adjunte el espectro obtenido. 4. ¿Qué señales de absorción en el espectro IR se observan en el -sitosterol? Adjunte el espectro obtenido. 5. ¿Cuál es la aplicación del

-sitosterol?

FUENTES DE INFORMACIÓN 1. CYTED. (1995) Manual de Técnicas de Investigación. Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo. Bogotá, Colombia.

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FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA 2. DOMINGUEZ, X. (1973). Métodos de Investigación Fitoquímica. Limusa, México. 3. HOSTETTMANN, K., GUPTA, M., MARSTON, A., FERREIRA, E. (2008) Plantas Medicinales Iberoamericanas. 1º edición. CYTED. Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología. 4. SHARAPIN, N. (2000) Fundamentos de Tecnología de productos fitoterapéuticos. Primera edición. Área de Ciencia y Tecnología del convenio Andrés Bello & Red Iberoamericana de Productos Fitofarmacéuticos (RIPROFITO) del Subprograma X del CYTED. 5. LOCK DE UGAZ, O. (1994) Investigación fitoquímica. Métodos en el estudio de los productos naturales. 2º ed. Lima: Fondo editorial Pontificia Universidad Católica del Perú.

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FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PRÁCTICA N° 14: ALCALOIDES: EXTRACCIÓN DE LA CAFÉINA EN HOJAS DE TÉ NEGRO MARCO TEÓRICO La cafeína es uno de los más importantes metil derivados naturales de la xantina (1, 3, 7trimetilxantina). La concentración de este alcaloide, que se encuentra en el café, té, nuez de cola, mate, etc., varía dependiendo de las condiciones climáticas y topográficas en las que se desarrollan los cultivos de donde se extrae. Se ha encontrado un intervalo de variación entre 2.0 a 4.6% de cafeína en dichos vegetales. La cafeína presenta varias acciones farmacológicas de interés terapéutico. Es fisiológicamente activa produciendo un efecto estimulante sobre el sistema nervioso central (SNC). La popularidad de las bebidas que contienen cafeína es parcialmente debida a este efecto; sin embargo, su consumo en exceso puede causar efectos irritantes tales como nerviosismo e insomnio. Además de su efecto sobre SNC la cafeína actúa sobre el riñón para producir diuresis; estimula el músculo cardiaco y relaja el músculo liso, especialmente el bronquial.

COMPETENCIAS •

Aisla cafeína de hojas de té negro.

•

Caracteriza el producto obtenido por su punto de fusión, pruebas de color y formación de un derivado.

MÉTODO EXPERIMENTAL Reactivos y disolventes: Hojas de Té Negro Camellia sinensis L. o en su defecto bolsitas de te negro (alumno), Diclorometano, Acetato de plomo al 10%, Agua destilada, Hidróxido de amonio Acetona, Yoduro de potasio, Yodo, Metanol, Acetato de etilo, Agua oxigenada, carbonato de calcio, Papel filtro, Ácido clorhídrico, Tela de algodón.

Materiales y equipo 1 Matraz Erlenmeyer de 125 mL 1 Anillo metálico 2 Vasos de precipitados de 400 mL 1 Embudo de vidrio tallo corto 1 Probeta graduada de 100 mL 1 Vaso de precipitado de 50 mL

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FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA 1 Embudo de separación de 500 mL 1Matraz Erlenmeyer de 50 mL 1 Matraz Kitazato de 500 mL 1 Vidrio de reloj 1 Embudo Büchner de 8 cm diam. 1 Agitador de vidrio 1 Recipiente p/baño María 1 Pipeta Pasteur 1 Soporte metálico 1 Parrilla de calentamiento 1 Espátula 1 Cápsula de porcelana Balanza analítica Rotaevaporador

Procedimiento: Poner a hervir 100 mL de agua destilada en vaso de precipitados de 400 mL. Sumergir en el vaso 10-11 g de hojas de té (cinco bolsitas de té negro) y hervir por 15 min. Enfriar, remover las bolsas de té, exprimiéndolas con unas pinzas. Añadir 5.0 g de carbonato de calcio y calentar por 5 min. Filtrar la mezcla a un vaso limpio a través de la tela de algodón y exprimir la tela. Filtrar ahora con vacío en un embudo Büchner para eliminar por completo el residuo de té. Enfriar el filtrado a temperatura ambiente y pasarlo al embudo de separación; añadir 30 mL de diclorometano y agitar el embudo suavemente, dejar separar las fases, quitar el tapón del embudo y drenar la fase orgánica inferior de la fase acuosa superior. Repetir la extracción de la fase acuosa con dos porciones más de diclorometano (30 mL c/u). Evaporar el disolvente en el rotaevaporador. Purificar la cafeína cruda con acetona. Dejar secar los cristales. Pesar el producto, determinar su p.f. y efectuar las siguientes pruebas: a).- Poner unos cuantos cristales de cafeína en una cápsula de porcelana y añadir 3 gotas de H202 + 3 gotas de HC1. Evaporar a sequedad con calor y añadir 2 gotas de hidróxido de amonio; observar la formación de un color púrpura. (Prueba de la Murexida). b).- Como prueba adicional obtener el espectro UV de la cafeína, observándose λ max a 278 nm. c).- Alternativamente realizar la cromatografía en capa fina utilizando como mezcla eluyente acetato de etilo: metanol: agua (100:13.5:10). Revelar con el revelador de yodo/yoduro de potasio en medio ácido.

Pract Fit 2016 (1)

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