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ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE LACTEOS
PRACTICA N°3
ANALISIS MICROBIOLOGICOS MICROBIOLOGICOS DE LA LECHE Y SUS DERIVADOS I. INTRODUCCION La leche, cuando se extrae de la ubre de una vaca, contiene algunas bacterias, después puede ser contaminada por el cuerpo del animal, la atmosférica de granja, el cubo de la leche o la ordeñadora, los recipientes donde se deposita, las manos del lech lecher ero o o de otro otross trab trabaj ajad ador ores es de la lech lecher ería ía,, etc, etc, pero pero pued puede e ser ser tamb también ién contaminada por varios agentes patógenos por un animal infectado, entre ellos Streptococ Streptococcus, cus, Brucella, Brucella, Staphyloco Staphylococcus ccus , Baci Bacilo los s de la Tube Tubercu rculo losi sis s o
levaduras. La contaminación de la leche con organismos patógenos del hombre es muy grave, especialmente cuando se produce después de la pasterización. La concentración o evaporación de la leche, si se lleva a cabo adecuadamente, adecuadamente, da por resulta resultado do un produc producto to esteril esteriliza izado do o microb microbian ianame amente nte establ estable, e, es decir, decir, un producto comercialmente estéril.
MARCO TEORICO LOS PRODUCTOS LACTEOS De acuerdo a la clasificación CIIU Revisión 3, los productos bajo estudio pertenecen a la rama 15200 “Elaboración “ Elaboración de productos lácteos” En este trabajo se dividirá la materia prima “leche” en sus dos principales destinos industriales: Las “leche “lechess fluidas fluidas”” (tradic (tradicion ionalm alment ente e denom denomina inadas das “leche “leche consu consumo” mo”), ), que se ofre ofrece cen n en form forma a liqu liquid ida a al cons consum umid idor or y que que incl incluy uyen en las las past pasteu euri riza zada das, s, esterilizadas y chocolatadas. Los “productos lácteos” también conocida como “leche industria”, en cuyo caso la leche sufre un mayor proceso de transformación.
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CONTAMINACION DE LA LECHE Los diferentes microorganismos alcanzan la leche por dos vías principales: la vía mamaria y el medio externo. 1.
Mamaria: Los microorganismos que pueden alcanzar la ubre, igualmente pueden llegar a contaminar la leche antes o después del ordeño. Estos microorganismos pueden alcanzar la leche por vía mamaria ascendente o descendente. Por vía ascendente lo hacen bacterias que se adhieren a la piel de la ubre y posterior al ordeño entran a través del esfínter del pezón ( Staphilococcus aureus, Streptococcus , coniformes). La vía descendente o hematógena la utilizan los microorganismos que pueden causar enfermedad sistémica o tienen la propiedad de movilizarse por la sangre y a través de los capilares mamarios llegar a infectar la ubre (Salmonellas, Brucellas, Mycobacterium tuberculosos) .
2.
contaminación de la leche puede ocurrir una vez que Medio Externo: La contaminación esta ha sido extraída de la glándula mamaria. Los utensilios, tanques de almacenamientos, transportes e incluso el personal que manipula la leche, son fuentes de contaminación de microorganismos que utilizan esta vía, que en algunos casos son los más abundantes, causantes de grandes pérdidas en la calidad del producto.
FUENTES DE CONTAMINACION DE LA LECHE CRUDA Las principales fuentes de contaminación de la leche cruda son: 1.
El animal: teóricamente la leche al salir del pezón debería ser estéril, pero siempre contiene de 100 a 10000 bacterias / ml., una baja carga micr microb obia iana na que que pued puede e no lleg llegar ar a mult multip iplilica cars rse e si la lech leche e es manipulada adecuadamente los microorganismos pueden entrar por la vía mamaria ascendente a través del esfínter del pezón, es por ello que cual cualqu quie ierr lesi lesión ón que que afec afecte te la inte integr grid idad ad del del mism mismo, o, faci facilit litar ara a un
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aumento en la contaminación la leche puede también contaminarse al salir por medio de pelos o sucio que se desprenden de los animales. La ubre esta en contacto con el suelo, heno y cualquier superficie donde las vacas se echen, de allí que los pezones sean considerados como una fuente importante de esporas bacterianas. En animales enfermos, (vacas, con mastitis) aumenta el numero de microorganismos en leche.
Origen de los Microorganismos de la Leche Origen
Numero de Bacterias/mL
Salida del pezón
500-1000
Equipo de ordeño
1000-10000
Tanque de refrigeración
5000-20000
Una vaca padeciendo de mastitis clínica puede producir una leche con 107 bacterias / ml. Y si es subclínica de 105-106 bacterias / ml . Str. agalactiae, Str. dysgalactiae son bact bacter eria iass comú comúnm nmen ente te asoc asocia iada dass a cuad cuadro ross de mast mastititis is y Str Str uber uberus us son Escherichia coli , Pseudomona aeruginosa, Clostridium, Bacillus, Pasteurella,
Unos de los microo microorga rganis nismos mos mas frecue frecuente ntess causa causante nte de Proteus, Proteus, Serratia Serratia. Unos mastitis es el Staphylococcus aureus, el cual además es resistente al tratamiento antibiótico común y es capaz de producir una enterotoxina, que por su termoresi resist sten enci cia a no es dest destru ruid ida a en la past pasteu euriz rizac ació ión n pudi pudien endo do a lleg llegar ar a caus causar ar enfermedad en el consumidor.
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Cantidad de Flora en Leche Recien Ordeñada Contaminación de la leche
Frecuencia (%)
<100
41
100-1000
35
1000-10000
23
>10000
1
2. Aire: El aire aire repr repres esen enta ta unos unos de los los medi medios os mas mas host hostililes es para para la supervivencia de los microorganismos debido a la constante exposición al oxigeno, cambios de temperatura y humedad relativa, radiación solar, etc. Es por ello que solo aquellos microorganismos resistentes podrán ser capaz de permanecer en el aire y llegar a contaminar los alimentos. Los microorganismos Gram negativos mueren rápidamente mientras que los Gram positivos y aquellos esporulados pueden resistir por largo tiempo. En el aire se pueden encontrar Micrococcus, Streptomyces y esporas de mohos como Penicilliu levaduras ras rarame raramente nte se Penicillium m y Aspergillu Aspergillus. s. Las levadu encuentran en suspensiones aéreas. 3.
Agua: El agua utilizada para la limpieza de los equipos y utensilios de ordeño, la higiene del animal y del personal, debe ser lo mas limpia posible. El agua puede ser una fuente importante de microorganismos psicrófilos (Pseudomonas) y por contaminación de esta, de bacterias coliformes
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4.
Suelo: El suelo es la principal fuente de microorganismos termoduricos termófilos. La leche nunca entra en contacto con el suelo pero si los animales, utensilios y personal, de manera que es a través de ellos que los microorganismos teluricos ( Clostridium) pueden alcanzar a contaminar la leche.
5.
legar a jug jugar un papel importante en la El ordeña ordeñado dor: r: Puede lleg contaminación de la leche, sobre todo cuando el ordeño es manual. En nuestro medio es frecuente observar como el personal del ordeño no se lava las manos y peor ahun se las humedece en la misma leche para lograr lubricación que facilite el ordeño. Se ha señalado al ordeñador como resp respon onsa sabl ble e de la cont contam amina inaci ción ón de la lech leche e con con micr microo oorga rgani nism smos os Aureu us, Lepto eptosp spir ira as, E. Coli Coli,, M. tub tubercu erculo losi sis, s, pato patoge geno noss (S. Aure Streptococcus, etc). Las heridas infectadas en manos y brazos pueden
ser fuentes de algunos de estos microorganismos. 6.
Estiércol: El esti estiér érco coll es la fuen fuente te prin princi cipa pall de micr microo oorg rgan anis ismo moss coliformes. Estos pueden alcanzar la leche a través del animal o del ordeñador así como también por medio de los utensilios mal higienizados.
7.
Utensilios y Transporte : El contacto de la leche con el material de ordeño y su permanencia en los tanques y transporte puede multiplicar por un factor de 2 a 50 la flora microbiana presente. De ahí que la higiene adec adecua uada da de esto estos, s, por por medi medio o de agen agente tess desi desinf nfec ecta tant ntes es,, afec afecta ta significativamente la calidad sanitaria de la leche. La flora microbiana proveniente de esta fuente puede ser diversa, pero la mas frecuente es flora termoresistente, razón mas que suficiente para exigir al máximo la higiene.
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Agriado o Formación de Ácido: Cuando la leche se agria suele considerarse alterada. La formación de ácido se manifiesta inicialmente por el olor agrio y la coagulación de la leche, que produce una cuajada de consistencia gelatinosa o más débil, que libera un suero claro. La fermentación ácido láctica tiene lugar en general cuando se abandona la leche cruda durante algún tiempo a temperatura ambiente. Los
gérmenes
lác láctico icos
causantes
de
esta
ferme rmentación
pueden
ser
homofermentativos que producen casi exclusivamente ácido láctico y cantidades mínimas de otras sustancias o heterofermentativos, que producen además de ácido láctico cantidades apreciables de productos volátiles. El agriado de la leche cruda a temperaturas entre 10 y 37ºC es generalmente causado por el streptococcus lactis, ayudado quizá por coliformes, micrococos, lactobacilos y enterococos.
Las bacterias termofilas crecen a temperaturas superiores a estas y se destacan: bacillus calidolactis, lactobacillus thermophilus. A temperaturas proximas a 0ºC
apenas si hay producción de acido, pero la leche puede sufrir procesos proteolíticos (escisión de las cadenas proteicas). Los gérmenes lácticos no son los únicos de provocar la fermentación acida de la leche; pueden producirla muchos otros, especialmente si las condiciones no son favorables a las bacterias ácido lácticas. Entre los gérmenes capaces de acidificar la leche fundamentalmente por producir ácido láctico, se encuentran diversas especias de los generos: micrococccus, pero en genera generall ordina ordinaria riamen mente te son incapa incapace cess de microbacterium y bacillus, pero compet competir ir con los gérme gérmenes nes láctic lácticos. os. Divers Diversas as espec especies ies del género género clostridium producen ácido butírico en condiciones que impiden o inhiben inhiben la formación normal normal de ácido láctico. La leche, sometida a un tratamiento térmico capaz de destruir todas las las form formas as bact bacter eria iana nass pero pero no los los espo esporo ross de clostridium, pued puede e sufr sufrir ir la fermentación acidobutírica con formación de hidrógeno y dióxido de carbono.
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Producción de gas: la producción de gas por las l as bacterias va siempre acompañada de la formación de ácido las especies formadoras de gases más importantes son las del género clostridium, las bacterias coliformes, los aerobacilos (especies del género bacillus formadoras de gas) que liberan tanto hidrogeno como dióxido de carbono y las levaduras y gérmenes propiónicos y lácticos heterofermentativos que producen solo dióxido de carbono. La probabilida probabilidad d de que se produzca produzca gas o no y el tipo de microorgan microorganismos ismos que lo originan depende del tratamiento al que previamente se halla sometido la leche y de la temp temper erat atur ura a a la que que se mant manten enga ga.. En la lech leche e crud cruda, a, a temp temper erat atur uras as comprendidas entre la de la sangre y la del hielo, los gérmenes productores de gas con más probabilidad de multiplicarse son los coliformes porque pueden competir bien con otros formadores de ácido. El agriado de la leche o la crema por las bacterias favorecen el subsiguiente desarrollo de las levaduras que se multiplican y actúan mejor en un medio ácido. A temperatura que se mantienen la leche y la crema en la nevera es difícil que se desarrollen los clostridium y bacillus formadores de gas, que no son capaces de compet competir ir ventaj ventajosa osamen mente te con con los acidiformes a temper temperatu aturas ras eleva elevadas das,, pero pero pueden actuar si estos no existen o si su actividad no es muy grande. Proteólisis: la hidrólisis de las proteínas lácticas por acción microbiana se acompaña en general de la producción de un sabor amargo producido por algunos polipéptidos. Las alteraciones producidas por los microorganismos proteolíticos son: •
Proteólisis ácida en la que tienen lugar simultáneamente la proteólisis y la producción de ácido.
•
Proteólisis con acidez mínima e incluso con alcalinidad.
•
Leche “cortada” producida por enzimas bacterianas del tipo de la renina en una etapa inicial de la proteólisis.
•
Proteólisis lenta por endoenzimas liberadas por bacterias después de su autolisis.
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La prot proteo eolilisi siss ácid ácida a pued puede e esta estarr prod produc ucida ida por por dive divers rsas as espe especi cies es del del géne género ro micrococcus, algunos de los cuales se hallan en la l a ubre de la vaca. Uno de los estreptococos intestinales, el S. faecalis es un organismo ácido láctico muy proteolitico. Como los demás enterococos es termodúrico y capaz por tanto de producir proteolisis en la leche pasteurizada. Los esporos de las cepas proteoliticas de lagunas especies de bacillus fermentadores de lactosa, como el B. cereus, sobreviven a la pasteurización e incluso a tratamientos térmicos más drásticos, produciendo luego proteolisis ácida.
micrococccus, cus, pseudomo pseudomonas, nas, proteus, proteus, Entr Entra a las las espe especi cies es de los los géne género ros: s: micrococc achromobacter, flavobacterium y serratia hay gérmenes muy proteoliticos. Obsérvese que estas especies desarrollan a temperaturas bajas por lo que son capaces de producir proteolisis y amargor aún en leche refrigerada. La proteolisis lenta carece de importancia en la leche en circunstancias normales, pero la posee cuando las bacterias disponen de una cantidad considerable de tiempo. Determinaciones Microbiológicas en Leche y Productos Lácteos Unidades formadoras de Colonias Se considera que una leche con menos de 10000 unidades formadoras de colonias (UFC) por ml es de excelente calidad. •
El recuento de organismos mesófilos es una medida de las condiciones de higiene del establecimiento. La causa mas frecuente de altos recuentos de organismos mesófilos es la insuficiente higiene del sistema de leche. No es una una indi indica caci ción ón conf confia iabl ble e de la prev preval alen enci cia a de mast mastiti itiss en un rode rodeo. o. Sin Sin emba embarg rgo, o, en algu alguno noss tipos tipos de infe infecc ccion iones es intra intrama mama mari rias as el núme número ro de bacterias patógenas de mastitis puede aumentar, por lo que el uso de esta técnica en conjunto con un recuento de patógenos de mastitis puede dar cierta orientación sobre el tipo de organismos que predominan en la muestra.
•
El recuento de organismos coniformes indica un pobre manejo higiénico de la rutina de ordeño, así como una deficiente higiene del equipo de ordeño.
más de 150 150 co coli lifo form rmes es po porr ml son indica Valore Valoress de más indicativ tivos os de higien higiene e deficiente y muy raramente podrían ser el resultado de ordeñar vacas con mastitis causadas por estos organismos.
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•
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El recuen recuento to de organi organismo smoss termod termodúri úricos cos
es indi indica catitivo vo de higi higien ene e
inadecuada del equipo de ordeño o de practicar el ordeño con ubres mojadas o cargadas de suciedad. Otras cusas comunes de elevados recuentos son bombas que pierden, uniones sanitarias viejas, pesoneras u otras piezas de goma gomass dete deteri rior orad adas as y depó depósi sito toss de “pie “piedr dra a de lech leche” e”.. Se cons consid ider eran an aceptables valores de 200 a 300 UFC/ml. •
El recuento de organismos patógenos de mastitis orienta sobre la flora bacteriana predominante en las infecciones mamarias del rodeo. Cuando se practican estos recuentos, se considera que tanto Staphylococcus aureus como Streptococcus agalactiae provienen de glándulas mamarias infectadas y no son el result resultado ado de conta contamin minac ación ión extern externa. a. La prese presenci ncia a de estos estos organismos en leche de tanque indica por lo tanto que están causando infecciones intramamarias en le rodeo. Sin embargo, la falta de aislamiento de estos patógenos no indica su ausencia del mismo. El numero de patógenos aislados no guarda una relación directa con el número de vacas infectadas dentro de un rodeo sino que debe interpretarse en conjunto con otras pruebas como el recuento de células somáticas.
•
El recuento de células somáticas (RCS) es una indicación tanto del nivel de mastitis de un rodeo como de la calidad de la leche. Si bien los valores limites de RCS varían en distintos países, se considera que por encima de las 500000 cél./ml se trata de leche proveniente de un rodeo con alta prevalencia de infecciones intramamarias y es por lo tanto considerado como un rodeo problema.
•
Otras pruebas que pueden aportar datos de interés para un diagnostico en leche de tanque son el cultivo de organismos psicrotrofos y Micoplasma. Estas podrán utilizarse de acuerdo con las necesidades ante la falta de detección de problemas luego de usar las pruebas sugeridas.
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Producto
Aceptabilidad
Rechazo
De color blanco opaco ligeramente azulado; sabor sui generis, ligeramente
Leche fresca pasteurizada
Se rechazara la leche con
dulce; olor característico. Los envases se presentaran íntegros y bien sellados y deben estar protegidos
olor y sabor ácido, olor y color anormales.
por hielo o conservados en refrigeración permanente Color blanco cremoso, consistencia ligeramente espesa, olor y sabor característico.
Leche evaporada
Los envases deben estar íntegros, debidamente rotulados con fecha
envases con abolladuras, hinchados u oxidados
de expiración vigente del producto color blanco cremoso, consistencia
Leche condensada
espesa, olor y sabor característico, envases con abolladuras, envases íntegros, rotulados con
hinchados u oxidados
fecha de expiración vigente del producto De color blanco cremoso, masa pulverulenta, de olor y sabor
Leche en polvo
característico; sus envases deben
Envases con grumos o
estar íntegros, rotulados y con
roturas
fecha de expiración vigente del producto
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de color blanco cremoso, olor y sabor característicos, se preferirá el queso pasteurizado procedentes de fabricas
Queso fresco
formales; en caso de queso
con presencia de materias
artesanales, podrá
extrañas, como paja, tierra
adquirirse para utilizarse en preparaciones que serán sometidas a cocimiento posterior, este ultimo tratamiento será obligatorio especialmente cuando se trata de queso de cabra De color amarillo, olor sabor característicos, consistencia sólida
Mantequilla
(conservado en frío) y aspecto
con exudación de líquido
homogéneo
(suero)
en envases o envolturas íntegros, fecha de expiración vigente.
II. OBJETIVOS 1.-Determinar la presencia de hongos y levaduras l evaduras en la leche en polvo. 2.-Lograr reconocer el numero de bacterias Termoduricas por mililitro en la leche. 3.-Reconocer los coliformes fecales (Géneros Escherich Escherichia ia y Aerobacter Aerobacter ) en la mantequilla. 4.-Establecer los métodos de ensayo microbiológicos (Prueba de Esterilidad) para la leche evaporada. 5.-Determinar el numero de bacterias coniformes en los quesos.
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III. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS 3.1 Materiales
•
Tubos de 160 mm x 16 mm.
•
Placa Petri de vidrio de 100 mm x 15 mm.
•
Pipetas Graduadas de 5 ml a 25 ml.
•
Termómetro Certificado, de 0ªC a 110ªC, con divisiones de 1ªC.
•
Gradillas metálicas para tubos de prueba.
•
Asa de Kolle.
•
Tubos de Cultivo de vidrio de 200 mm x 20 mm.
•
Mechero Bunsen.
•
Mortero o vaso de licuadora.
3.2 Equipos •
Bañomaria, termoregulable a 62.8ªC.
•
Microscopio Compuesto.
•
Estufa de incubación regulada a 37ªC.
•
Balanza analítica.
•
Autoclave.
•
Horno de esterilización.
•
Homogenizador apropiado
3.3 Reactivos •
Violet Red Bile Agar o Tergicol 7 Agar.
•
Agua Triptonada.
•
Caldo RM – VP
•
Agar Citrato de Simmons.
•
Reactivo de Indol.
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•
Reactivo Rojo de Metilo.
•
Reactivo Voges Proskauer.
•
Parafina.
•
Caldo cerebro corazón.
•
Bacto coagulasa plasma EDTA.
IV.- PROCEDIMIENTO 4.1 Leche en polvo •
Se mezcla por duplicado en placas Petri estériles, 1cm3 de la serie de diluciones con aproximadamente 15 cm3 del medio estéril mantenido a la temperatura de 45 AC +/- 1 AC.
•
•
Se deja solidificar y se incuba a 22 AC +/- 2 AC. Se cuenta sobre las placas que contienen de 20 a 100, el número de colonias que se han desarrollado en 3 días a 8 días.
•
Seis necesario, se controla un número suficiente de colonias por microscopia directa.
4.2 Leche •
Se transfi transfiere ere 5 ml de la muestra muestra a uno de los tubos tubos de prueba prueba teniendo teniendo cuidado de no contaminar con la leche ni en borde de la parte superior del tubo.
•
Mientras se prepara una serie de los tubos para la pasterización en el laboratorio, este se mantiene entre 0 AC Y 4 Fc.
•
En uno de los tubos tubos con 5 al de leche, leche, que sirve sirve de testig testigo, o, se coloca coloca el termómetro de control.
•
Se coloca la gradilla con los tubos - incluso el testigo – en el Bañomaria a 62.8 62.8 ºC +/+/- 0.5 0.5º C
de man manera era que que el nive ivel de agu agua del Baño Baño este este
aproximadamente a 8cm debajo del borde de los tubos.
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•
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Las Las cond condic icio ione ness del del Baño Bañoma mari ria a debe deben n ser ser tale taless que que perm permita itan n que que la temperatura de la leche en los tubos alcance por lo menos 62,3ºC dentro de los 5 minutos.
•
Cuando la temperatura en el tubo testigo es de 63,2ºC, se comienza a contar el tiempo de pasterurizacion de 30 minutos.
•
Transcurridos los 30 minutos, se lleva la gradilla con los tubos de prueba a un baño de hielo y se enfrían a 10ºC o menos controlando la temperatura con el termómetro del tubo testigo.
4.3 Mantequilla •
Se coloca1cm3 de la fase acuosa obtenida según la Norma ITINTEC 202.037, y 1cm3 de la dilución 1/10 de dicha fase acuosa en placas Petri estériles.
•
Se agregan 10cm3 del medio de cultivo, manteniendo a 45ºC, se mezcla con la muestra rotando en una dirección y luego en la otra y se deja solidificar durante 10 minutos a 15.
•
Se incuba a 37ºC durante 48 horas +/- 3 horas.
•
Se cuentan las colonias típicas tal como se indica en la Norma ITINTEC 202.019, teniendo cuidado de no confundirlas con partículas del medio no disuelto o materias extrañas.
•
Se aíslan las colonias típicas y se procede a su diferenciación bioquímica por medio del IMVIC (Indol – Rojo de Metilo – Voges Proskauer y asimilación del Citrato).
4.4 Leche Evaporada •
Una vez transcurridos los tiempos de pre – incubación, se desinfectan las latas con alcohol al 70%, dejando algunos cm 3 de alcohol sobre la parte que se va a abrir (opuestas a las claves de identificación).
•
Se flamea rápidamente y con un abridor previamente esterilizado, se abre la lata hasta que por la abertura se puede introducir la pipeta esterilizada.
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•
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De cada lata se siembra una serie de 3 tubos para aerobios y otra serie de 3 tubos para anaerobios.
•
Para la detección de aerobios, se transfiere con una pipeta estéril 3 cm 3 se leche en cada uno de los tubos de la serie conteniendo 27 cm 3 de caldo cerebro corazón adicionado de almidón.
•
Para la detección de anaerobios, se transfiere con una pipeta estéril 3 cm 3 de leche en cada uno de los tubos de la serie conteniendo 27 cm 3 de caldo cerebro corazón adicionado de cisteina y agregando una capa de parafina sólida licuada y estéril.
•
Se incuban las series de tubos indicado por 5 días a la misma temperatura de pre incubación de cada lata.
•
Para la comprobación del desarrollo bacteriano se procede de la siguiente manera:
a) Aerobios •
Se inocula 1 cm 3 de cada uno de los cultivos indicados anteriormente n
igual numero de placas Petri estériles y se adiciona de 15 cm 3 a 20 cm3 del medio Plate Count Agar, fundido y templado alrededor de 45ºC. •
Se mez mezcla cla por medio edio de movim ovimie ien ntos tos de vaivé aivén, n, segui eguido do de
movimientos circulares; se deja solidificar se recubre con aproximadamente 5 cm3 del medio estéril; se deja solidificar y se incuba las placas en posición invertida a las mismas temperaturas pre – incubación hasta 72 horas y se procede a la lectura correspondiente.
b) Anae Anaero robi bios os •
Se inocula 1 cm 3 de cada uno de los cultivos indicados anteriormente, en igual numero de placas Petri estériles y se les adiciona de 15 cm 3 a 20 cm3 del medio Agar anaeróbico según Brewer, fundido y templado alrededor de 50ºC.
•
Se mezcla por medios de movimientos de vaivén seguido de movimientos circulares; se dejan solidificar, se colocan en posición invertida dentro de
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una jarra de anaerobiosis y se incuban a las temperaturas de pre – inc incubac ubaciión, ón, has hasta 72 hora horass, lue luego se proce roced de a la temp temper erat atu ura correspondiente.
4.5. Leche Condensada •
Se coloca las placas Petri estériles sobre la mesa cerca del mechero Bunsen.
•
Se abre la placa lo suficiente para introducir una pipeta que contiene 1 cm 3 de la primera dilución, se deja fluir el contenido y se procede de la misma forma con cada una de las l as siguientes diluciones.
•
Se vierte inmediatamente el Plate Coun Agar fundido y enfriado a 45ºC en las placas Petri y se mezcla por medios de movimientos de vaivén, seguidos de movimientos circulares.
•
Se deja solidificar el medio de cultivo y se agrega una segunda capa del mismo, a fin de cortar la formación de colonias en la superficie.
•
Una vez solidificado la segunda capa de Agar se invierte las placas y se incuba a 32ºC +/- 1ºC durante 48 horas +/- 3 horas.
•
Al cabo de este tiempo y utilizando un contador de colonias se procede a la lectura.
•
Se expresa los resultados como el número de microorganismos mesofilos aerobios y facultativos viables , por cm3 de muestra.
4.6. Queso •
Se extrae con una sonda estéril y se pesa 10g de muestra, en un mortero o vaso de licuadora tarados.
•
Se homogeniza la muestra con 90 cm 3 de agua peptonada citratada al 2% a la temperatura de 30ºC a 40ºC.
•
Se transfiere la dilución a un matraz y se deja en reposo durante 5 minutos. Se obtiene así la dilución 10 – 1.
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•
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Se extrae con una pipeta 1 cm 3 de la dilución 10 -1 y se transfiere a un tubo cont conten enien iendo do 9 cm3 de agua agua pept pepton onad ada a al 1% esté estéri ril.l. Se mezc mezcla la con con movimiento rotatorio de la muñeca. Se obtiene así la dilución 10 -2.
•
Se extrae con una pipeta 1 cm 3 de la dilución 10 -2 y se transfiere a un tubo conteniendo 9 cm 3 de agua peptonada al 1 % estéril. Se mezcla con un movimiento rotatorio de la muñeca. Se obtiene así la dilución 10 -3; y así sucesivamente por las siguientes diluciones.
V. RESULTADOS Debe reportarse los siguientes resultados: 1.
Enumeración de coliformes totales.
2.
Determinación de Streptococcus spp .
3.
Enumeración de Mesófilos aerobios viables.
4. Núme Número ro más más pro proba babl ble. e. 5.
Determinación de Coliforme fecal .
6.
Enumeración de Clostridium perfringens .
7. Prue Prueba bass bioqu bioquím ímic icas as::
TSI
LIA
Urea
Citrato
Rojo Metilo
Indol
Motilidad
H2S
VI.- RECOMENDACIONES VII.- CONCLUSIONES GUIA DE LABORATORIO MICROBIOLOGIA II
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Biol. Ms. C. Alicia Decheco Egusquiza
UNFV/FIIS
ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE LACTEOS
VIII. CUESTIONARIO: 1.
Defina en que consiste el recuento de Preincubados y recuento de Células Somáticas
2. Peligr Peligros os y los puntos puntos crítico críticoss de contro controll durant durante e el proces procesami amient ento o de los quesos maduros ¿Qué medidas preventivas debe tomarse? 3.
¿Qué pruebas enzimáticas permiten comprobar la calidad de la leche? Explique
4.
Explique detalladamente la Lacto filtración. Aplicaciones
5. Explique Explique el cuadro cuadro de mastitis mastitis vacuno vacuno y los agentes agentes involuc involucrados rados 6. ¿Qué tipo tipo de tratamiento tratamiento térmico térmico se realiza realiza a la leche leche y productos productos lácteos lácteos? ? 7.
¿Cual es la flora contaminante en la leche concentrada, queso, yogur y natillas?
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