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DROSOPHILA MELANOGASTER MELANOGASTER De los diversos organismos utilizados como modelos experimentales, Drosophila melanogaster , es uno de los mas empleados empleados en genética, se ha constituido constituido en un elemento crucial en la biología del desarrollo, y por sus características genotípicas y fenotipicas ha sido el organismo más estudiados en el campo de la genética para el tema de las mutaciones. En el estado salvaje es una pequeña mosca diploide cuyo tamaño es aproximadamente de 2-3 mm y con peso aproximado de 0.8-1.5 mg según sea macho o hembra respectivamente. El ciclo de vida del díptero Drosophila melanogaster incluye las etapas de huevo, larva pupa y adulto, a partir del huevo, los primeros hechos embrionarios producen en estado larvario conocido como I instar, con un crecimiento rápido; la larva muda 2 veces (II , III instar), y entonces se forma el estado de pupa, en el cual la cutícula de la larva es remplazada por las estructuras adultas . Una mosca adulta emerge de la cáscara de la pupa lista para aparearse, en el caso del macho. (Strickberger, 1978). Drosophila melanogaster posee cuatro pares de cromosomas, de los cuales: el par I es sexual siendo en la hembra (XX), largo y telocéntrico, mientras que en el macho, uno largo y telocéntrico (X) y otro corto y acrocéntrico; los pares II y III, son Largos y metacéntricos; y el par IV, corto y telocéntrico. La asignación de cromosomas X y Y en el cariotipo de D melanogaster fue realizada por Wilson y Stewens, quienes vieron en la hembra dos cromosomas largos X, en el macho uno solo y un cromosoma corto Y (Puertas, 1992)
Fig,.2 Cromosomas D. m.
Se ha determinado el sexo homogamético a la hembra por la presencia de dos gametos iguales (XX) y heterogamético al macho, que solo posee un cromosoma X. En especies
Guías de genética Juan B. López. con machos heterogaméticos como Drosophila los descendientes machos poseen el cromosomas X solamente de sus madres y el Y del padre (Strickberger, 1988) Drosophila melanogaster tiene un número cromosómico bajo (2n = 8) y sus larvas presentan cromosomas gigantes en sus glándulas salivares por lo que es de gran utilidad para estudiar la morfología cromosómica y la evolución cariotípica. Además se cuentan con gran cantidad de líneas mutantes que producen fenotipos claros tales como los que muestran diferencias en forma, color y tamaño de diversas partes de su cuerpo entre otras. otr as. Por tales motivos, Drosophila melanogaster es un organismo ideal para la demostración de muchos principios biológicos y el análisis de ciencia descriptiva, bioquímica y molecular, se utiliza para estudiar problemas de desarrollo y nutrición fisiológicas y conducta animal, comportamiento, reacciones en el apareamiento y respuestas a la luz de diversos colores. Dada la variación de mutaciones que presenta la Drosophila melanogaster se ha escogido como material biológico preferido para estudiar el fenómeno de la herencia. Y genética del desarrollo. Existen varios factores que contribuyen a su elección como organismo adecuado para la demostración de muchos principios genéticos en eucariotas, como son:
Es muy abundante y fácil de capturar facilidad de cultivo. pequeño tamaño tamaño del organismo adulto. tiempo de generación muy rápido (10 días a 25ºC y 20 días a 18ºC). produce gran cantidad de descendientes, lo que facilita la comprobación estadistica de los resultados. solo tiene cuatro cromosomas y es sencillo el cartografiado de sus genes en mapas citológicos en cromosomas politénicos de las glándulas salivares. existen cromosomas balanceadores letales homozigóticos con múltiples puntos de ruptura que impiden la recombinación con los que se mantienen poblaciones en heterozigosis de letales recesivos. se han obtenido moscas transgénicas t ransgénicas con gran facilidad existen mutantes para casi cualquier proceso biológico reconocible
Fig,.1
Guías de genética Juan B. López. Los primeros estudios acerca de los mecanismos de la herencia, son atribuidos a Gregorio Mendel quien por primera vez utiliza diferentes variedades del tipo de guisantes para formular toda una experimentación cuantitativa basado en un procedimiento científico capaz de darle explicación a las observaciones cotidianas que apuntaban a la existencia de un proceso complejo de herencia. Sus trabajos fueron redescubiertos en 1900, son la base fundamental de la Genética Moderna, pues constituyen la primera aproximación lógica, descriptiva y racional del estudio de los mecanismos de la herencia. Mendel formuló dos grandes leyes; la primera expone que los miembros de la pareja genética se distribuyen separadamente entre los gametos (segregan), de forma que la mitad de los gametos llevan un miembro de la pareja génica y la otra mitad llevan el otro miembro de la pareja génica. Las proporciones fenotípicas que obtuvo Mendel para la segunda generación filial fueron de 3:1.(Griffiths, 1995, p.27) En su segunda Ley, Mendel propone que: "Durante la formación de los gametos, la segregación de los alelos de un gen se produce de manera independiente de la segregación de los alelos de otro gen". Las proporciones fenotípicas para la segunda generación filial fueron 9:3:3:1.(Griffiths, 1995, p.30.) A Mendel se le atribuye haber establecido las reglas básicas del análisis genético, ya que su trabajo permitió conocer la existencia de unidades hereditarias, que contenían la información hereditaria que se transmitía de una generación a otra. Los términos dominante y recesivo fueron acuñados por Mendel, los mismos se mantienen en la actualidad; a las unidades hereditarias las denominó factores En 1912 Sutton y Boveri, propusieron la teoría cromosómica de la herencia, que estableció que los factores de Mendel eran los genes ubicados en una estructura definida llamada cromosoma y que estos los genes, estaban ubicados sobre los cromosomas. Los trabajos de estos investigadores fueron reforzados y esclarecidos por los trabajos de Morgan quien estudió los mecanismos de la herencia, utilizando mutaciones en Drosophila melanogaster como marcadores genéticos, que le permitieron observar y entender estos procesos. No obstante, mientras Mendel Solo necesitó obtener 34 variedades de semillas, Morgan tenía que generar sus propias variedades de organismos. Morgan esperaba que diferentes variedades o mutantes del tipo silvestre aparecieran y así cruzar las suficientes cantidades de moscas. En un año aproximadamente, y entre miles de moscas, encontró su primer mutante, tenía ojos blancos, en lugar de rojos como era la normal. Posteriormente T.H. Morgan, en 1910, presentó pruebas de que un carácter específico de Drosophila melanogaster , ojos blancos, se hallaba ligado a la herencia del sexo y muy probablemente asociado a un cromosoma determinado, el cromosoma X. Según los datos de Morgan en un cultivo normal de moscas de ojos rojos había apreciado que un macho de ojos blancos que entonces fue cruzado con sus hermanas de ojos rojos, todos los individuos de la F1 de dicho cruzamiento presentaban los ojos rojos con excepción de tres machos con ojos blancos que Morgan atribuyó a mutaciones posteriores. Lo que presentaba un interés especial era el hallazgo de que al cruzar entre sí las moscas con ojos rojos de la F1 daban lugar a hembras con los ojos blancos. Sin embargo, aparecían hembras con los ojos blancos al efectuar el cruzamiento retrógrado de las hembras con ojos rojos de F1 con el progenitor masculino de ojos
Guías de genética Juan B. López. blancos, este último tipo de cruzamiento dio lugar a cuatro clases de descendiente, hembras y machos de ojos blancos, hembras y machos de ojos rojos. Para dar explicación a estos resultados Morgan propuso que las hembras de la F1 de ojos rojos eran heterocigotas para el carácter ojos blancos, recesivo. De este modo la aparición de hembras de ojos blancos solo podía darse en las hembras homocigotas para el gen white. Por otra parte, un descendiente masculino tenía la misma probabilidad de tener los ojos rojos que blancos si su madre era un heterocigoto sin reportar el genotipo de su padre. Estos resultados se relacionan con los hallazgos de Wilson, Stevens y otros de que el macho sólo tenía un cromosoma X y la hembra dos. Según esto, el macho original de ojos blancos tenía un gen white localizado en un cromosoma X único, aunque white es recesivo ese macho presentaba de todas formas los ojos blancos a causa de la ausencia de otro cromosoma X normal. Sin embargo, en las hembras el color de los ojos depende de los genes presentes en los dos cromosomas X y sólo pueden presentarse ojos blancos cuando ambos cromosomas X llevan el gen recesivo white. Un factor de gran interés en el estudio de la genética, son las mutaciones, según Griffiths (1995) "las mutaciones son cambios que se dan en los organismos de un estado hereditario a otro". Las mutaciones han constituido una herramienta fundamental en el estudio genético, pues se han convertido en verdaderos marcadores especiales que permiten seguir los procesos biológicos y se pueden utilizar con dos propósitos (1) para estudiar el proceso de mutación por si mismo y (2) para analizar una función biológica desde un punto de vista genético. Las mutaciones más fáciles de detectar son las mutaciones morfológicas, que afectan al color o la forma de cualquier órgano de un animal o planta, pues son rápidamente visibles y medibles.(Puertas, 1992). Los estudios de mutaciones han permitido evidenciar situaciones en las cuales las Leyes de Mendel se ven alteradas en las proporciones fenotípicas, como lo son las interacciones alélicas que se dan entre alelos de un mismo gen, por ejemplo la codominancia la dominancia incompleta, pleiotropía, dominancia completa, y las interacciones no alélicas que surgen entre alelos de diferentes genes como las epístasis. Otro tipo de situaciones que afectan las proporciones fenotípicas de Mendel son las referidas a la existencia de ligamientos físicos absolutos y parciales. El ligamiento es una concepción que surge del estudio de ubicación y observación de los genes en los cromosomas, estableciendo que si dos genes se encuentran en un mismo cromosoma estarán ligados físicamente por lo cual no podrán segregar de forma independiente uno del otro tal como lo exponía Mendel. El ligamiento constituye entonces un mecanismo que permitió explicar aquellas situaciones donde las leyes de Mendel no podían explicar los procesos de la herencia. Con el estudio detallado de los procesos de herencia y el establecimiento de los procesos de Mitosis y Meiosis, se determinó que durante la Meiosis los cromosomas homólogos eran capaces de intercambiar material genético, proceso al que se denominó recombinación, y que se ve evidenciado en la formación de estructuras visibles llamadas quiasmas. Para que ocurra la recombinación deberán acontecer una serie de procesos que lleven a la formación del complejo sinaptonémico, que mantendrá unidos a los cromosomas homólogos y permitirá el intercambio de material genético entre estos. La hembra en Drosophila melanogaster, constituye el sexo homogamético, puede recombinar ya que presenta ligamiento que le permiten poder romper porciones del cromosoma y establecer quiasmas para el intercambio de material genético. En el macho, que constituye el sexo heterogamético, existe un ligamiento absoluto que impide
Guías de genética Juan B. López. la recombinación por no darse los procesos de rompimientos cromosómicos, esenciales para el intercambio de material genético. La recombinación es un proceso que puede influir en la herencia, los estudios han determinado que los gametos que resultan de la recombinación siempre serán en frecuencia menor a los que llevan genes donde no se ha dado la recombinación, es decir, los parentales. Sturtevant, propuso la existencia grosso modo de la siguiente proporcionalidad: conforme mayor es la distancia entre genes ligados, mayor es la probabilidad de que ocurra un entrecruzamiento entre cromátidas no hermanas en la zona que separa esos genes y, por lo tanto, mayor la proporción de recombinantes que se producen. En el estudio experimental y teórico de los procesos de la herencia, se ha desarrollado métodos matemáticos y estadísticos que tienen como objeto realizar comprobaciones de fenómenos en estudio, tal es el caso de cruces experimentales en Drosophila melanogaster.
Descripción De Drosophila melanogaster El numero especies conocidas del genero Drosophila es muy alto, pero la mas utilizada en estudios genéticos generales es D. melanogaster ampliamente extendida por todo el mundo y abundante en frutales, principalmente sobre uvas, plátanos y ciruelas, por lo que se la conoce por «mosca de la fruta », especialmente si ésta está en fermentación, ya que aparte de los jugos de las frutas, la levadura constituyen una parte importante de su dieta 1. Clasificación sistemática Philum...................... ARTHROPODA Clase......................... HEXAPODA Orden........................ DÍPTERA Familia...................... Drosophilidae Género................ ...... Drosophila Especie...................... melanogaster
2. Ciclo De Vida D. melanogaster tiene metamorfosis complicada. Su ciclo biológico, desde la fecundación hasta el adulto, pasa por cuatro estados de desarrollo: huevo - larva - pupa imago o adulto. (Fig. 3). El desarrollo embrionario tiene lugar en el huevo, tras la fecundación y formación del cigoto. La hembra pone huevos incluso sin estar fecundada. La ovoposición comienza en la hembra adulta al 2° día después de su emergencia, pudiendo llegar a poner hasta 50-75 huevos por día, llegando hasta 400-500 en 10 días. Lógicamente sólo aquellos huevos que han sido fecundados se desarrollarán. La hembra después del apareamiento acumula el esperma en un receptáculo espermático y los huevos son fecundados posteriormente conforme pasan a través del oviducto hacia el orificio de salida (placa vaginal).
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Fig. .3 ciclo de vida de D. melanogaster . La meiosis en el huevo se desencadena por la penetración del espermatozoide.
HUEVO. Los huevos son ovoides con unas dimensiones de 0.19x 0.5 mm, son blancos y están recubiertos de una fuerte envoltura con dos apéndices delgados en el extremo anterior (Fig. 4). En el extremo anterior del huevo hay un poro diminuto por donde penetra el espermatozoide para fecundar el pronúcleo femenino, mientras el huevo se encuentra en el útero. En condiciones ambientales óptimas el huevo es puesto en el momento en que los dos pronúcleos se unen, cariogámia, aunque en las condiciones de mantenimiento en el laboratorio siempre existe un porcentaje de hembras que pueden retenerlos por un tiempo indeterminado. El desarrollo embrionario comienza inmediatamente después de la fertilización y, como en la mayoría de los insectos, se distinguen dos periodos: el período embrional que transcurre dentro del huevo y comprende desde la fertilización hasta que emerge la larva, y el período postembrionario, que se inicia con la eclosión del huevo y comprende la: etapas de larva, pupa e imago o insecto adulto. El huevo tiene dos membranas que permiten únicamente intercambios gaseosos del embrión con el medio: la membrana cortónica o cortón en el exterior, y la membrana vitelina situada debajo de la anterior. Se presume la existencia de una tercera membrana de tipo celular. El núcleo diploide formado tras la cariogamia se sitúa en el tercio anterior del huevo (Fig. 4) y se divide mitóticamente al cabo de 20 minutos, a partir de este momento se origina un sincitio donde los núcleos comparten un mismo citoplasma. Los núcleos se dividen periódica y sincrónicamente cada 10 minutos, con una fase S de 3,5 minutos. Durante estas divisiones existe un origen de replicación cada 3,7 Kb de DNA.
Guías de genética Juan B. López. A partir de la séptima división, los núcleos, que están homogéneamente repartidos por el citoplasma, empiezan a migrar a la periferia del embrión, migración que termina después de la novena división, momento que coincide con la aparición de las primeras células polares, precursoras de las células germinales, en el polo posterior del embrión. En este momento se inician las primeras transcripciones de mRNA en los núcleos periféricos. La síntesis de proteínas anterior a este momento se hacía a partir de mRNA de procedencia materna. Desde la décima hasta la decimotercera división, el embrión es un blastema (o blastodermo sincitial), y sus divisiones, aún
Fig. 4 Embriogenesis de D. melanogaster .
sincrónicas, se van alargando progresivamente. Durante estas cuatro divisiones el período S se va alargando, el número de unidades de replicación disminuye, aumentando correspondientemente su tamaño, y aparecen invaginaciones membranosas que, sin envolver totalmente a los núcleos, empiezan a definir los compartimentos del embrión. Después de la decimotercera división, el número de núcleos periféricos se eleva a 6.000. Cuando se inicia la nueva fase S empieza la celularización (150 minutos después de la fertilización), que se completa en 30 minutos. Coincidiendo con la fase S (unos 20 minutos) se activa por primera vez la transcripción del rDNA. Con la celularización desaparece la sincronización mitótica; los posteriores ciclos tendrán una hora de duración. Doscientos minutos después de la fertilización empieza la formación de la grástula. Son visibles dos invaginaciones, una ventro-lateral en el límite posterior del primer tercio del cuerpo (surco cefálico) y otra a lo largo de la región ventral de los dos tercios posteriores (surco ventral). A partir de ellas, especialmente de la última, se originan los procesos organogenéticos que conducirán a la formación y emergencia de la larva al cabo de 22 horas. LARVAS. El huevo eclosiona, por tanto, al cabo de un día, y de él sale una larva blanca, con mandíbulas negras y un par de espiráculos con función traqueal en cada extremo. Las
Guías de genética Juan B. López. larvas viven dentro del medio de cultivo, son muy activas y voraces, creciendo muy rápidamente. Pasan por tres estadios larvarios («instars»). Los cuales se muestran en la figura 1 con dos mudas. Al final del 3º estadio, la larva llega a alcanzar una longitud de 4,5 mm. PUPA Tras unos cuatro días y dos mudas las larvas abanonan el medio de cultivo, o algún otro soporte, y se fijan comenzando el estadio de «pupa». Los espiráculos se transforman en «antenas pupales», disminuye la lorgitud de su cuerpo y se vuelve más oscura para formar «puparium». Esta «prepupa» puede considerarse como el cuarto estadio larvario, que termina con una muda, comenzando a partir de entonces el período de «pupa» o «crisálida». La cutícula, que al principio es blanca y flexible (Estadio de prepupa), se va oscureciendo y endureciendo progresivamente. Inmediatamente después de pupar los tejidos de la larva se histolizan y las estructuras embrionarias, denominadas discos imaginales crecen y producen secciones del organismo adulto. Por tanto, el metabolismo pupal se centra en la sustitución de tejidos larvarios por los del adulto, utilizando los tejidos de desecho de la larva como materia y energía, para esta función. Al cabo de unos 5 días de iniciada la pupación aparece el adulto (imago). El ciclo total de desarrollo, a una temperatura óptima 25 °C, suele tener una duración de aproximadamente 10 u 11 días. A temperaturas superiores se producen fenómenos de esterilidad y a temperaturas más bajas el ciclo se alarga. ADULTO o imago. Aparece, tras romper el puparium, con el cuerpo muy pálido y sin desplegar las alas. Éstas se despliegan al cabo de una hora, y tras otras pocas horas alcanza la pigmentación corporal normal, un color amarillo pajizo. Los adultos pueden llegar a vivir un mes o poco más. Los adultos tienen la morfología básica de los Dípteros. El género Drosophila se separa de los géneros próximos p: la «arista» provista de dos filas de «pelos» que posee •-• el extremo de la antena. (Ver Figs. 5. y 6)
fig. 5. Aspecto de los individuos adultos D. melanogasrer. Macho a la derecha y hembra a la izquierda
Guías de genética Juan B. López. El cuerpo está dividido en: cabeza, tórax y abdomen. CABEZA Con antenas; dos grandes ojos compuestos de forma redondeada, formada por cientos de omatidios de color rojo mate situados en posición lateral; tres ojos simples ocelos en posición dorsal, carina, palpo y probóscide y una serie de quetas o cerdas (fig. 6)
Fig. 6 Aspectos de los individuos adultos de Drosophila melanogaster .
TORAX Dividido en mesonoto y escutelo, recorrido por una serie de filas de microquetas alineadas antero-posteriormente poseyendo también varios grupos de macroquetas (o quetas simplemente) en posición dorsal (dorsocentrales y es cutelares) y lateral. Poseen tres pares de patas compuestas de: coxa, trocánter, fémur, tibia, tarsos y uña Los machos poseen en el tarso del primer par de patas ur «peine sexual» compuesto de pelos gruesos y cortos Existen también dos halterios o balancines y un par de alas transparentes formadas por pequeñísimas celdillas que tienen 5 venaciones longitudinales y dos transversales (Fig. 10.4). ABDOMEN Consiste en tergitos en la parte dorsal y esternitos en la parte ventral donde hay un par de orificios en cada uno de ellos: espiráculos. La parte final del abdomen es diferente en machos y hembras. En aquéllos es de forma redondeada con la parte dorsal completamente oscura (negra) y la ventral portando el pene y el arco genital (Fig. 7). En las hembras termina en forma más puntiaguda, menos amplia la franja oscura dorsal y la parte ventral con la placa vaginal. En general el tamaño de la hembra es mayor que el de los machos.
Fig. 7. aspecto de la parte ventral del abdomen de un macho, parte izquierda y una hembra parte derecha de D. melanogaster.
Guías de genética Juan B. López. 4. PRINCIPALES MUTANTES DE Drosophila melanogaster. A continuación se relacionan algunos de los mulantes de D. melanogaster más usados en prácticas de Genética. Se indica el nombre de cada mutante, su denominación abreviada, y una descripción del fenotipo característico. Genotipo ap
Nombre apterus
b
black
B
Bar
Bd
Beaded
bw
brown
c
curved
ca
claret
cn
cinnabar
ct
cut
cu
curled
Cy
Curly
dp
dumpy
e
ebony
ey
eyeless
f
forked
g
garnet
gl
glass
H
Hairless
Fenotipo Sin alas Cuerpo, tarso de las patas y venas de las alas de color negro. Ojos reducidos a una estrecha barra vertical en los machos y en las hembras homocigóticas. Intermedio en las hem bras heterocigóticas. Buena viabilidad. Alas en forma de cinta. Letal en homocigosis. Ojos oscuros de color vino que se tornan a púrpura con la edad. Alas divergentes y curvadas hacia abajo. Ojos color rubí claro. Alas ligeramente puntiagudas. Ojos de color rojo vivo Alas recortadas en punta. Ojos pequeños y arriñonados. Alas curvadas hacia arriba y afuera Asociado a la inversión Curly en el brazo izquierdo del cromosoma II. Las alas están fuertemente curvadas hacia arriba y lados. El homocigoto es letal. Alas truncadas y reducidas a 2/3 de su longitud. Cuerpo que se vuelve negro gradualmente con la edad. Ojos reducidos y de tamaño variable, incluso en una misma mosca; pueden llegar a estar ausentes. Influenciado por la temperatura. Quetas y cerdas acortadas, nudosas, bifurcadas o retorcidas. Ojos púpura claro que se oscurecen con la edad. Omatidios redondeados y juntos en superficie plana. Ojos pequeños, en la hembra amarillo-rosados y en el macho barmellón punteados. Ausencia de quetas postverticales, dorso-centrales anteriores y
Guías de genética Juan B. López. abdominales. Los homocigotos son letales.
lz
Lozenge
m
miniature
Pm
Plum
pr
Purple
px
Plexus
ri
radius incompletus
Sb
Stubble
sc
scute
se st
sepia scarlet
v
vermilion
vg w
vestigial white
wa
white-apricot
y
yellow
Ojos más estrechos que el normal, con áreas rugosas y suaves a causa de sus omatidios anormales y fusionados. El ojo es de color rojo con áreas oscuras y brillantes. Alas pequeñas que no sobresalen del abdomen. Ojos púrpura con manchas oscuras. Letal recesivo. Ojos púrpura-rosado. Venas extras en las alas, sobre todo en los márgenes. Segunda vena longitudinal del ala interrumpida. Quetas diminutas y en forma de maza. Letal en homocigosis. Faltan quetas, sobre todo las escutelares posteriores, las ocelares y las postverticales. Ojos oscuros de color sepia. Ojos rojo brillante Ojos color bermellón. Junto al gen bw produce ojos blancos Alas y balancines muy reducidos. Ojos blanco nieve. Ojos rosa-amarillentos en los machos y más amarillentos en las hembras. Cuerpo de color amarillo
A continuación se muestran los grupos de ligamientos en Drosophila melanogaster. GRUPOS DE LIGAMIENTO EN Drosophila melanogaster Cromosoma X
Cromosoma II
Cromosoma III
0,0 yellow
0,0 nert
0,0 roughoid
Cromosoma IV 0,0 shaven
0,0+ silver
0,0 aristaless
0,2 veinlet
0,0+cubitus
0,0+ suppessor of sable 0,1 expanded 0,0+ scute 1,3 Star
20,0 Moiré 26,0 sepia
0,0+ groveless 0,0+ sparkling
0,6 broad
26,5 hairy
0,2 eyeless
4,0 heldout
0,6 6-fosfogluc. Deshi. 6,1 Curly
35,5 eye-gone
0,8 prune
36,8 esterasa 6
1 1 ,0 echinoid
Guías de genética Juan B. López. 1 ,5 white
12,0 fat(yGull)
37,0 rotated
3,0 facet
13,0 dumpy
40,4 Dichaete
5,5 echinus
16,5 clot
40,5 Lyra
7,5 ruby
41,4 Glued
13,7 crossveinless
20,0 Bgalactosidasa 31,0 dachs
43,2 thread
18,9 carmine
41,0 Jammed
43,4 fosfoglucomutasa
19,9 fumarasa 20,0 cut
44,0 abrupt 47,0 nubbin
44,0 scarlet 46,0 Wrinkled
21,0 singed
48,5 black
47,0 radius ¡ncompletus
23,1 ocelliless 27,7 lozenge
50,1 lcoholdeshid. 47,7 proboscipedia 53,9 hook 48,0 pink
32,8 raspberry
54,5 purple
48,5 tetraltera
33,0 vermillon
54,8 Bristle
48,7 blistery
35,7 RNA polimerasa 55,0 light
49,2 octanol-deshidrog
36,1 miniatura
55,1 straw
50,0 curled
36,4 tiny
55,4 apterus
52,0 karmoisin
38,3 furrowed 41,9 wavy
55,9 tarsi irregular 52,4 rosy 56,0 lightoid 58,2 Stubble
44,4 garnet
57,5 cinnabar
58,5 spineless (y
45,2 narrow abdomen 62,0 engrailled 51,5 scalloped 67,0 vestigial
58,8 bithorax 63,1 glass
56,7 forked
67,7 waxy
62,0 stripe
57,0 Bar
71,1 comb-gap
64,0 kidney
59,2 outstretched 59,4 Beadex
72,0 Lobe 75,5 curved
66,2 Delta 69,5 Hairless
62,5 car
83,0 abero
70,7 ebony
63,0 Glucosa 6 64,0 shortwing
95,5 rRNASS 100,5 plexus
75,7 cardinal 76,2 white ocelli
64,8 maroonlike
104,5 brown
79,1 bar-3
66,0 bobbed
107,0 orange
91,1 rough
107,4 bailón
93,8 Beaded 100,7 claret 104,3 brevis
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Fig.7 . Ala normal de D. melanogaster, y aspecto de las dos mutantes: radius incompletas (izquierda) y crossveinless (derecha). Se han indicado /os nombres de las celdillas del ala. L1 a L5 y M señalan respectivamente las venas longitud/nales 1 a 5 y la vena marginal; A y P señalan las venas transversales anterior y posterior respectivamente.
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Practica OBJETIVOS. • • • •
Determinar los diversos fenotipos de D. melanogaster Realizar diferentes cruces con el fin de comprobar o refutar las leyes de Medel Identificar en cada generación las mutaciones y sus proporciones Determinar si las mutaciones son ligadas o no al sexo.
MATERIALES Organismos Se utilizará normalmente una cepa silvestre de Drosophila melanogaster y otra cepa mutante para uno o varios caracteres, en algunos casos ambas cepas a usar serán de tipo mutante.
Productos y equipos
Como material para el manejo y observación de Drosophila melanogaster se utilizará:
• • • • • • • • • • •
esteriomicroscopio o lupa binocular, anestesiador (cloroformo, eter o CO2) éter sulfúrico, reetificador, placa petri de cristal, lápiz graso o etiquetas adhesivas para marcar las botellas, botellas y tubos con alimento (ver composición en el Anexo ), pincel pequeño (n.° 0) y suave para mover las moscas, papel de filtro esterilizado. frasco «cementerio» con tapa, de boca ancha, conteniendo alcohol de 70° para introducir las moscas desechadas. Embudo. Algodón
PROCEDIMIENTO 1.
Anestesiamiento y reconocimiento de cepas
Para la observación, clasificación y recuento de las moscas es preciso anestesiarlas previamente con éter, a esta operación se le llama «anestesiado» o «eterización». Se procede de la siguiente for ma Golpear la botella de cultivo sobre una almohadilla de algodón corcho o goma-espuma para que caigan las moscas al fondo del medio de cultivo.
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Quitar el tapón de la botella, y en su lugar colocar el eterificador. Invertir las posiciones de modo que la botella de cultivo queda arriba. Sacudir los lados de la botella de modo que todas las moscas caigan dentro del frasco anestesiador. Tapar el frasco.
Mantener las moscas expuestas a los vapores del éter hasta que se duerman. El tiempo que tardan las moscas en dormirse es variable y depende de la edad (alrededor de un minuto). Hay que tener cuidado pues una exposición prolongada al éter puede producir su muerte, lo que se notará porque las alas aparecerá perpendiculares al cuerpo. Si el medio de cultivo no está debidamente solidificado, puede desprenderse y matar las moscas. En este caso no se debe invertir la botella de cultivo sobre el anestesiador, sino inclinar éste hacia un foco de luz y esperar a que las moscas entren en él ( Drosophila melanogaster es fototrópica positiva y geotrópica negativa). Una vez anestesiadas, sacar las moscas y alinearlas sobre una cartulina blanca y llevarlas al estereomicroscopio para su observación. Normalmente una mosca anestesiada permanece inmóvil durante 5 o 10 minutos. Si empiezan a moverse mientras se las está observando se pueden volver a anestesiar utilizando el reeterificador, pulverizando suavemente con éter en la cámara formada por una caja petri invertida colocada sobre las moscas, o bien adosando un pequeño algodón impregnado de éter en la cara interior de la placa. Figura X Para mover las moscas de un lado a otro se utiliza un pincel de pelo de camello o niño recién nacido con el que se pueden empujar y trasladar. Una vez examinados, hechos los recuentos, o seleccionados determinados fenotipos, puede ser que se tengan que pasar a un nuevo frasco de cultivo o que se hayan de desechar determinados individuos; si las tenemos que pasar a un nuevo medio, colocarlas dentro de un pequeño embudo de papel que se depositará sobre la papilla, o tumbar la botella que la contiene y colocar las moscas sobre su pared hasta que se despierten (hay que tener cuidado de que la pared esté seca). Si se han de desechar, echarlas en el frasco «cementerio». Otro aspecto que hay que cuidar es el de no mantener abiertas las botellas de cultivo para evitar que las moscas se escapen o entren otras y el cultivo se contamine. Igualmente, hay que tener cuidado de que no quedan moscas en el anestesiador antes de poner las nuestras. No dejar abierto el anestesiador ni la botella de éter, ya que el éter es muy volátil e inflamable.
ALTERNATIVAS DE ANESTESIADO Alternativamente se puede usar dióxido de carbono y helio para anestesiar las moscas, para esto se pone con las moscas de costado tapado con papel aluminio en otro frasco se ponen tres Alka Seltser con agua (aproximadamente 20 ml ) y se conecta mediante
Guías de genética Juan B. López. una manguera al frasco con las sepas, procurando tapar con papel aluminio los frasco minimizando lo mejor posible las fugas, cuando las moscas paren de moverse se quita la tapa y se vacían en una caja de petri que esta sobre un plato con hielo, se observan y se clasifican según los requerimientos.
2.
AISLAMIENTO DE HEMBRAS VÍRGENES
Cuando se han de hacer cruzamientos entre genotipos diferentes es estrictamente necesario que las hembras no se hayan cruzado con machos de su mismo genotipo. Para asegurarnos que son vírgenes existen diversos procedimientos: Por identificación del sexo y aislamiento de hembras adultas de no más de 6 horas de edad. Seis horas es el tiempo que requieren las hembras para adquirir la madurez sexual y poder ser fecundadas. Si eliminamos los adultos de una botella, todas las hembras que recojamos de esta botella en un período de 4 o 5 horas serán vírgenes. Por selección de moscas adultas recién emergidas: se reconocen por no haber desplegado aún sus alas y tener su cuerpo alargado y la quitina blanda y pálida. En este caso hay que tener mucho cuidado de no dañarles las alas. Las hembras se pueden separar de los machos en el estado de pupa madura, ya que en este estado se pueden distinguir los peines sexuales de los machos como dos puntos entre las manchas de las alas. Las pupas se pueden extraer de la botella con un pincel húmedo con el que posteriormente se limpiarán para facilitar su observación. De estas pupas aisladas en una botella emergerán obviamente hembras vírgenes. En cualquier caso hay que extraer del medio de cultivo todas las moscas adultas asegurándose de que no quede ninguna.
3.
OBSERVACIÓN Y DESCRIPCIÓN DEL TIPO SILVESTRE
En Drosophíla melanogaster se han descrito más de mil mulantes diferentes. Bridges y Brehme (1944) y Braver (1956) fueron los pioneros de la descripción y localización génico-cromosómica de gran parte de los mutantes conocidos en esta especie. Continuamente se describen nuevos genotipos en la revista Drosophila Information Service. Es conveniente familiarizarse con el fenotipo silvestre, normal para todos sus caracteres, por lo que se trata de estudiar las partes del cuerpo en donde puede haber mutaciones morfológicas utilizables en los problemas que se desarrollarán en las prácticas siguientes: 3.1. Alas: Sobrepasan del abdomen en una tercera parte de su longitud. Su borde es redondeado y terminado en una ligera punta. (Figs. 3.1y 4.1, 7). Tienen 5 venas longitudinales sobre su superficie y 2 venillas transversales, con lo que el ala queda dividida en: regiones llamadas «celdas». Su superficie es plana y su color blanco transparente. Los mutantes de alas que se utilizarán lo son para los siguientes caracteres: borde, color, curvatura, longitud forma, posición y venación.
Fig. 3.1 D. m. Silvestre
3.2. Ojos: Los ojos están compuestos por cientos de omatidios colocados regularmente en filas y columnas, su superficie es mate su color rojo oscuro, su tamaño y forma grande y redondeada respectivamente. Los mutantes más importantes son para el color, tamaño, forma y textura. 3.3. Cerdas o quetas. Sirven como órganos de los sentidos. Hay dos tipos de quetas, unas más largas llamadas «macroquetas» otras de 1/3 respecto a la longitud de las primeras y más finas llamadas «microquetas» (Fig. 6). Refiriéndose a las primeras, en la cabeza y alrededor de los ojos hay 3 pares de quetas «vertica les» (anteriores y posteriores), por delante de los ocelos hay 1 par de «postverticales». En la parte dorsal del tórax hay un par de «presuturales» (anteriores y posteriores) y 2 pares de «postalares» (anteriores y posteriores). Hacia el borde del dorso del torax hay 2 pares de quetas «notopleurales» y en su zona central 2 pares de quetas «dorsocentrales« (anteriores y posteriores). Sobre el esternón del segundo par de patas hay 3 pares de quetas «esternopleurales». Entre las dorsocentrales anteriores hay 8 filas de
Guías de genética Juan B. López. microquetas «acrosticales». En el margen del escutelo hay 2 pares de quetas «escutelares» (anteriores y posteriores). Los mutantes que se utilizan lo son para cambios en el número y forma de las quetas de la cabeza, tórax y escutelo.
5. MODO DE REALIZAR Y LLEVAR A CABO LOS EXPERIMENTOS CON DROSOPHILA
INTRODUCCIÓN Las prácticas que siguen consisten en una serie de cruzamientos entre diferentes mutantes de Drosophila melanogaster o con genotipos silvestres, con el fin de observar diferentes tipos de herencia. El desarrollo de una de estas prácticas, en el que se deben estudiar las generaciones F1 y F2 de un cruzamiento, ha de estar en relación con el ciclo biológico normal del animal. En el cuadro 5.2 se resumen todas las operaciones a seguir en una práctica de este tipo. Las operaciones a seguir durante la práctica deben hacerse concordar con el estado de desarrollo de los cultivos y no con los días teóricos indicados en la segunda columna y que sirven sólo para condiciones ambientales ideales. A la labor experimental, realizada en el laboratorio, sigue una labor de registro e interpretación de los resultados en la que se incluirán pruebas de análisis estadísticos para comprobar el tipo de herencia
MATERIALES Organismos Se entregará a cada equipo de alumnos un tipo de problema consistente en el cruzamiento de dos genotipos de Drosophila melanogaster , ambos homocigóticos. Hay que recordar que los machos son aquiasmáticos.
Productos y equipos La generación parental se entregará en un tubo con medio y, en su momento, se dará a cada equipo al menos una botella con medio para pasar a los individuos de la F1 y obtener la F2. El resto del equipo se ha descrito anteriormente.
Observaciones Hay que asegurarse adecuadamente que las hembras de la generación parental sean vírgenes. En otros cruzamientos también se requieren hembras vírgenes, si los alumnos no tienen suficiente experiencia en diferenciar las hembras vírgenes, es conveniente que los profesores de prácticas supervisen la selección de hembras y la realización de tos cruzamientos.
PROCEDIMIENTO 1.
2. 3. 4. 5. 6.
Identificar los fenotipos. Observar cuidadosamente ambos párentales con objeto de determinar en qué carácteres se diferencia cada uno de ellos del silvestre (color del cuerpo, forma y superficie de las alas, forma y longitud de las quetas principales, color y tamaño de ojos...) y anotar las diferencias fenotípicas entre ambos sexos. Cruzar 4 o 5 parejas de moscas para obtener la generación F1; observar unas 30 moscas de ambos sexos de esta generación. Anotar el fenotipo de cada uno de los sexos. Pasar unas 10 o 15 parejas de moscas a una botella con medio para obtener la F2. En su caso, realizar un cruzamiento prueba usando hembras vírgenes de la F1 y machos de la cepa mutante, o viceversa. En el cuadro 5.2 se indican los pasos generales en todo el proceso. Observar la F2, o la descendencia del cruzamiento prueba, y anotar los fenotipos observados en cada sexo. Tomar datos de unos 300 individuos. Comprobar la bondad de los resulados observados en las dos generaciones segregantes por comparación con los esperados mediante la prueba estadística de significación de X 2 (Pearson,
Guías de genética Juan B. López. 1898). El X2 es la suma de los cuadrados de las desviaciones entre los valores observados (O) y los esperados (E) divididos por el valor esperado: 2
X =
(0 − E )2
2
X =
E
(n − 1)S X 2 σ
2
X
Es importante tener en cuenta que el X 2 debe aplicarse con valores absolutos y no con porcentajes. Una vez calculado el X 2 se buscará en la tabla de distribución de X 2 (ver tabla 5.1) la probabilidad P de obtener una desviación igual o mayor que la observada, correspondiente a su grado de libertad (número de clases fenotípicas menos uno). Considerar la desviación significativa para valores de P menores de 5 %; para valores menores del 1 % altamente significativa; en ambos casos se acepta que estadísticamente la segregación observada no se ajusta a la esperada. 7.
En caso de que se sospeche ligamiento, calcular el X 2 correspondiente, y en su caso estimar la frecuencia de recombinación p.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN Indicar mediante un esquema el tipo de herencia obtenida atendiendo a los siguientes detalles: 1. Generación parental: observación de machos y hembras y descripción fenotípica de ambos. 2. Generación FI: observación de al menos 30 individuos, y descripción fenotípica de machos y hembras. 3. Generación F2 o cruzamiento prueba: observación de al menos 300 individuos y descripción de sus fenotipos y sexos. 4. Hipótesis y aplicación de las correspondientes pruebas estadísticas para su comprobación. 5. Presentar los resultados rellenando las líneas adecuadas del cuadro 5.3.
Probabilidad
Grados de libertad
0,95
0,80
0,50
0,30
0,10
0,05
0,01
0.001
1
0,004
0,06
0,46
1,07
2,71
3,84
6,64
10,83
2
0,10
0,45
1,39
2,41
4,60
5,99
9,21
13,82
3
0,35
1,01
2,37
3,66
6,25
7,82
11,34
16,27
4
0,71
1,65
3,36
4,88
7,78
9,49
13,28
18,47
5
1,14
2,34
4,35
6,06
9,24
11,07
15,09
20,52
6
1,63
3,07
5,35
7,23
10,64
12,59
16,81
22,46
7
2,17
3,82
6,35
8,38
12,02
14,07
18,48
24,32
8
2,73
4,59
7,34
9,52
13,36
15,51
20,09
26,12
9
3,32
5,38
8,34
10,66
14,68
16,92
21,67
27,88
Tabla 5.1 Distribución del chi-cuadrado
Guías de genética Juan B. López.
G
Días
Desarrollo
P
0
Adultos
F1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
F2
Larvas
A Pupas
Eliminar generación P
F1
Imagos
14
F1XF1
15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
Huevos
15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
Medios
P
Huevos
13
14
Procedimiento Introducir 4-5 parejas en un tubo (A)
Observar 30 individuos de ambos sexos, separar vírgenes (♀) Introducir unas 10 parejas en la botella b
B
Larvas
Pupas
F2
Eliminar la F1 ♀♂
Imagos Cruzamiento prueba huevos
Observar 300 individuos Cruzar (♂♂) recesivos ♀♀ vírgenes F1 (C)
♀♂
C
Larvas
Pupas
Eliminar los progenitores
Imagos
Observar 300 individuos
Cuadro 5.2 procedimiento para el desarrollo de las practicas con drosophila melanogaster
Guías de genética Juan B. López. Grupo Alumno/s FENOTIPO DE LOS PARENTALES Machos Hembras FENOTIPO DE LA F1 No. De individuos observados Machos Hembras FENOTIPOS DE LA F2 No. De individuos Machos
Hembras
Total
Fenotipo 1 Fenotipo 2 Fenotipo 3 Fenotipo 4 Fenotipo 5 Fenotipo 6 Fenotipo 7 Fenotipo 8 Fenotipo 9 ESTIMACION DE LOS VALORES X2 (X2 machos- hembras (1 grado de libertad)) observados
Esperados (N/2)
(O-E)2/E
Machos Hembras 2
Calcular x = ∑
(O − E ) 2
X2 =
E Realizar para cada uno de los fenotipos si es necesario. X2 PARA CADA CARÁCTER CARÁCTER: Observados
Esperados
Dominantes Resecivos
(O-E)2/E
X2 = X2 DE INDEPENDENCIA TOTAL (X2 total) observados
esperados
Fenotipo 1 Fenotipo 2 Fenotipo 3 Fenotipo 4 2
2
X de ligamiento = X total – X
2
1 -
X
2
X2 = 2 =
(O-E)2/E
Guías de genética Juan B. López. Observaciones • • • •
Calcular X2 para cada pareja de loci cundo sea necesario Indicar el coeficiente de coincidencia en su caso. En caso de retrocruzamiento prueba usar las casillas correspondientes a la descripción de los parentales y de la F2. Usar tantas hojas como sean necesarias
Cuadro 5.3 esquema para representar los datos obtenidos en los distintos tipos de cruzamientos
