PRACTICA 5: ANALISIS MICROBIOLOGICO DE HUEVOS

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ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE HUEVOS

PRACTICANº 5

ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE HUEVOS I. TRODUCCIÓN 1.1.- ESTRUCTURA Y COMPOSICIÓN GENERAL DEL HUEVO En nuestro país, por consumo de huevos se suele entender consumo de huevos de gallina, si bien en los últimos años se están utilizando también los huevos de codorniz y de otras aves, con fines fundamentalmente ornamentales de diferentes preparaciones culinarias. Así pues, en el Código Alimentario Español, cuando se habla de huevos se hace referencia a los huevos de gallina, y los de otras especies deben ir acompañados obligatoriamente de la denominación de la especie de que se trate. Podemos intuir el valor bromatológico del huevo si pensamos que su destino es la alimentación completa de un embrión hasta su salida del cascaron. No obstante, es un alimento delicado, que se altera con facilidad y que puede trasmitir graves toxiinfecciones para el ser humano. El huevo huevo es un compo componen nente te culina culinario rio usado usado tanto tanto en aperit aperitivo ivoss como como en postres. También se emplea en la preparación de determinadas bebidas y es además, un útil de laboratorio de primer orden. Se aconseja su consumo en cantidades adecuadas a todas las edades, y por si solo basta para completar algunas dietas dietas adaptadas adaptadas a diferentes patologías. patologías. Los huevos de las diversas especies animales que los producen, sobre todo, los de aves domesticas tienen una composición característica y poco variable. Como ya se ha indicado, el huevo de gallina es el mas utilizado en la alimentación humana y por tanto, el mejor estudiado. El peso promedio de los huevos producidos por razas de gallinas seleccionadas es de 58 gramos, con

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Biol.. Ms C. Alicia Decheco Egusquiza

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un reparto porcentual promedio promedio de un 8% a un 11% de cáscara, cáscara, de un 51% a un 61% de clara y un 27% a un 32% de yema. Podemos hablar de tres constituyentes básicos del huevo: uno mineral externo, la cáscara y dos orgánicos: El Vitelo o yema, que es la célula gigante formada en el óvulo, y el albumen o clara, que recubre la yema a lo largo de su migr migrac ació ión. n. Adem Además ás exis existe ten n unas unas memb membra rana nass que que cubr cubren en al rest resto o de los los constituyentes orgánicos. (Fig. 1). Los tipos de microorganismos contaminantes de los huevos, en el momento de la post postur ura, a, son son esté estéri rile less o cont contie iene nen n muy muy poco pocoss micr microo oorg rgan anis ismo mos. s. La cont contam amin inac ació ión n se prod produc uce e desp despué uéss de la pues puesta ta,, y es caus causad ada a por por las las materias del nido, la suciedad, y las materias fecales. La flora dominante son los cocos grampositivos ; los bacilos gramnegativos, aunque presentes en menor numero, penetran mas fácilmente a través de las membranas de la cáscara y se multiplican mejor que los cocos grampositivos. El numero de bacter bacterias ias conten contenida idass en un produc producto to ovular ovular liquid liquido o depend dependerá erá del del estado estado bacteriológico de las cáscaras de los huevos en el momento de romperlos de las las cond condic icio ione ness higi higién énic icas as de la fábr fábric ica a y de las cond condic icio ione ness en que que se almacena el liquido. Los géneros más comunes de las bacterias encontradas en los huevos son la Pseudomona, Alcalígenes, Proteus y Escherichia Estos organismos son los principales causantes de la descomposición, con los cambios de olor y de color característicos. Las bacterias que sobreviven a la pasteurización de los huevos, son por lo gene genera ral,l, espe especi cies es del del gene genero ro Bacillus, que es res resiste istent nte e al calor, lor, los los enterococos y los micrococos. El patógeno más importante de los huevos y sus productos es la Salmonella, el cual muere a las temperaturas de pasteurización, por lo consiguiente la presencia de éste microorganismo se debe exclusivamente a recontaminación.


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CASCARA La cáscara esta formada por una matriz de fibras entrelazadas de naturaleza proteic proteica a y por crista cristales les de calcit calcita, a, (carbo (carbonat nato o cálcic cálcico). o). Presen Presentes tes en una proporción de 1:50 en su intersticio (Fig. 2). En la matriz se distinguen dos zonas: Una está constituida por protuberancias mamilares, que penetran parcialmente en las membranas y la otra es la matriz esponjosa. Las fibras de la matriz no rodean los cristales no rodean los cristales de calcita, sino que los atraviesan. Esta estructura, que influye significativamente en la resistencia de la cáscara, esta esta forma formado do por por comp comple lejo joss de prot proteí eína na–m –muc ucop opol olis isac acár árid idos os,, que que son, son, fundamentalmente, Codroitin Sulfatos, Galactosamina, glucosamina, galactosa, manosa, fucosa y ácido ácido siálico. Los Los elem elemen ento toss mine minera rales les que que comp compon one e la cásc cáscar ara a son: son: calc calcio io (98, (98,2% 2%), ), magnesio (0.9%) y fósforo (0,9%) en forma de fosfato. La dureza de la cáscara está en relación directa con su contenido de magnesio. Existen numerosos poros distribuidos por toda la cáscara, entre 7.000 y 17.000 por huevo. Tienen forma de embudo y están rellenos de fibras proteicas que dificultan la entrada de microorganismos. En la zona externa externa de la cáscara cáscara hay una capa capa de unas 10 um a 30 um de espeso espesorr constitu constituida ida por

proteí proteínas nas insolu insoluble bless en agua, agua, la Cutícula. Esta

formada formada por Mucoproteínas Mucoproteínas con polisacári polisacáridos dos en los que están presentes presentes la Glucosa, la Manosa, la galactosa y la Fucosa. Aunque Aunque es insoluble en agua, la cutícula cutícula puede desprenders desprenderse e por frotamiento frotamiento bajo ella aumentando, así, la permeabilidad a las bacterias.


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FIGURA 1. ESQUEMA DE LA ESTRUCTURA DE UN HUEVO DE GALLINA

En los huevos de gallina, la cáscara tiene una coloración siempre uniforme, variando del blanco al marrón en función de la raza de la ponedora. En huevos de otras especies, la cáscara puede tener manchas o pintas identificativas. En contra de las creencias generales, el color de la cáscara no influye en las característ características icas nutriciona nutricionales les del huevo: huevo: así, aunque se dice que los huevos huevos morenos son los mejores que los blancos, no hay ningún dato científico que avale esta afirmación.


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Corion Llamamos Corion a las dos membranas situadas inmediatamente después de la cáscara cáscara.. La más externa externa,, de unas 48 um de espesor espesor,, esta esta íntimame íntimamente nte unida a la cáscara cáscara por interrelaciones con con los núcleos mamilares – centro de de origen de los cristales de calcita calcita y por asociaciones asociaciones de fibras. La forman seis capas de fibras orientadas de manera alternativa en diversas diversas direcciones. La membrana más interna de aproximadamente, 22 um de espesor, delimita la clara y la constitu constituyen yen tres tres capas capas paralelas paralelas a la cáscar cáscara a que forman forman ángulo ángulo recto entre sí. Ambas membranas están están constituidas por fibras de proteínas de tipo queratina y por polisacáridos que contienen galactosamina, glucosamina, ácido sialico, glucosa, manosa y fucosa. Su estructura en capas superpuestas en diferentes direcciones le confiere confiere resistencia y contribuye contribuye a impermeabilizar el contenido contenido del huevo de los microorganismos. Las dos membranas siempre están unidas, excepto en la región de la cámara de aire, en la zona del polo grueso del huevo. El volumen de esta cámara se modifica con el tiempo, debido en parte, a intercambios gaseosos y en parte, a perd perdid ida a de vapo vaporr de vapo vaporr de agua agua.. Adem Además ás de aire aire,, se alma almace cena na gas gas carbónico procedente de los bicarbonatos; este CO se libera con más o menos rapidez, según la temperatura a la que se mantenga el huevo. Teniendo en cuenta esta característica del aumento de la cámara cámara con el paso del tiempo, sirve como criterio de frescura su altura expresada en milímetros; sin embargo, esta pauta no revela con total precisión la evolución del huevo, pues si se conserva en una atmósfera húmeda, la cámara de aire se desarrolla poco, y pueden existir riesgos microbiológicos.


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FIGURA 2. ESQUEMA DE LA SECRECIÓN RADIAL DE LA CÁSCARA DE HUEVO


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ALBUMEN O CLARA La clara está constituida por tres capas: una zona externa, delgada y fluida, una zona intermedia gruesa y densa, a veces denominada saco de albúmina y, finalmente, una zona interna, también delgada y fluida. Además, existen unas estructuras filamentosas, las chalazas, dos condensaciones de la clara cuya misión es mantener la yema en una posición central. Las Chalazas de aspecto trenzado, se unen a los polos del huevo y a la yema. yema. El objetivo de la clara es aislar la yema de los golpes y de las variaciones de temperatura. Las grandes variaciones que se producen en la proporción de cada una de las capas se atribuyen a la raza, a condiciones ambientales, al tamaño del huevo y al nivel de producción. El constituyente mayoritario de las distintas capas es el agua, cuyo contenido desciende ligeramente desde las capas externas a las internas (cuadro 1).

CUADRO 1: PROPORCIÓN Y CONTENIDO EN HUMEDAD DE LAS CAPAS DE CLARA DE HUEVO. % DE CLARA capa Ext. delgada gruesa Int. delgada chalazas

media 23.2 57.3 16.8 2.7

rango 10 – 60 30 –80 1 – 40 –

Humedad (%) 88.8 87.6 86.4 84.3

Las Las prot proteí eína nass son son el comp compon onen ente te mayo mayorit ritar ario io de los sóli sólido doss (ent (entre re 9,7% 9,7% 10,6%); El contenido en lípidos (0,3%) es insignificante en comparación con la yema; los glúcidos presentan una concentración cercana cercana al 1%, tanto unidos a proteínas como en estado libre, siendo la glucosa el carbohidrato mayoritario en estado libre; sus cationes más importantes son el potasio y el sodio. El albumen, tras la puesta, presenta una estructura de gel, pero, poco a poco, se va fluidificando, especialmente en las primeras cuarenta y ocho horas. Este


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efecto no se debe debe a una hidrólisis de las proteínas, sino sino a la evolución de uno de sus complejos proteicos, la Ovomucina–limosina; su disociación se favorece aumentado el pH y se retarda con altas concentraciones de iones divalentes. El pH de la clara del huevo fresco gira en torno a 7,4 y puede aumentar hasta 9 en los tres días siguientes a la puesta, puesta, sufriendo pocos pocos cambios después después La conservación de los huevos en una atmósfera con un 4% de CO y a 10ºC limita la evolución del pH y la licuefacción de la clara, Igualmente, se consigue efectos similares conservado a –1ºC y con una 90% de humedad relativa.

YEMA O VITELO La yema esta envuelto y separa de la clara por el saco de la yema o

membrana vitelina, en la que se anclan los filamentos de las chalazas que sitúan la yema yema en el centro, centro, aunque permiten su giro. giro. Normalmente la yema esta formada por una pequeña esfera de yema blanca, rode rodead ada a de

germinativo o o enga yema yema amar amarri rilla lla.. El disco germinativ engalla lladu dura ra en la

superficie de la yema se une a la blanca por una estructura tubular, la latebra. En conjunto la yema es una dispersión de partículas en una fase acuosa o plasma. La yema de un huevo fresco contiene entre un 52% a un 53 % de sólido sólidos, s, cuya cuya tasa tasa desc descien iende de aprox aproxima imadam dament ente, e, un

2%

al almac almacena enarse rse

refrigerado durante doce semanas a consecuencia de intercambios entre la clara y la yema. Sus componentes mayoritarios son las proteínas y los lípidos, con cantidades menores de carbohidratos y minerales; el conjunto engloba a los lípidos del huevo. El contenido proteico es de un 16%, con tasas bastantes constantes. La fracción lipidica varía entre un 32% y un 35%; estas variaciones se atribuyen a la raz raza del ave más que a su dieta. Esta fracción tiene un 66% de Triacilgliceroles, un 28% de Fosfolipidos, un un 5% de colesterol colesterol y otros lípidos en cantidades menores. Los ácidos palmítico y esteárico suponen un 30% de los ácidos grasos de los triglicéridos y un 50% de los ácidos de las lecitinas. Los GUIA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA II

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ácidos oleicos y Linoleico se encuentran en mayor proporción en los ácidos grasos de los triglicéridos que en los fosfolipidos. La composición en ácidos grasos de los lípidos de la yema depende de los ácidos suministrados en la dieta (cuadro 2). El contenido de glúcidos libres y combinados es similar al encontrado en la clara. En cuanto a los elementos minerales, los más abundantes son el calcio, el potasio potasio y el fósforo. fósforo. Las dos fraccion fracciones es de la disper dispersió sión n tienen tienen alguna algunass características especiales:



Las Las part partíc ícul ulas as se pued pueden en sepa separa rarr por por cent centrif rifug ugac ació ión. n. corp corpús úscu culo loss esféricos con diámetro de entre 25 um y 50 um. No son muy sólidas y tiende tienden n a

disgre disgregar garse se

con con las man manipu ipulac lacion iones. es. Supo Suponen nen 25% 25% del del

extracto seco de la yema.



La fase fase cont contin inua ua pres presen enta ta un 75% 75% de extr extrac acto to seco seco en form forma a de lipoproteínas de baja densidad y proteínas globulares procedentes del plasma sanguíneo. sanguíneo. El color rojo de la yema yema varía desde el amarillo claro al anaranjado rojizo; este color se debe debe a los carotenoides carotenoides que contiene, contiene, que que varí varían an con con la alim alimen enta taci ción ón del del ave: ave: así, así, los los huev huevos os de aves aves alimentadas con maíz tienen yemas bastante amarillentas. La mayoría de los pigmentos carotenoides de la yema no se se traducen directamente directamente en vitamina A;

esto es, las las yemas mas coloreadas no son,

necesariamente, más ricas en vitaminas A Existen transferencias de pequeñas moléculas entre la clara y la yema:



De la clara a la yema: yema: difusión de agua y paso de iones divalentes



De la yema a la clara: paso de aminoácidos libres y hierro.


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COMPOSICIÓN PROMEDIO EN ÁCIDOS GRASOS DE LAS FRACCIONES LIPIDICAS DE LA YEMA YEMA DE HUEVO % DEL TOTAL DE ACIDOS GRASOS Ac. graso Lip.totales triacilglicerol 16:0 23.5 22.5 16:1 3.8 7.3 18:0 14 7.5 18:1 38.4 44.7 18:2 16.4 15.4 18:3 1.4 1.3 20:4 1.3 0.5 20:5 0.4 0.2 22:6 0.8 0.6

lecitina 37 0.6 12.4 31.4 12 1 2.7 0.8 2.1

cefalina 21.6 32.5 17.3 7 2 10.2 3 6.4

COMPOSICIÓN PROMEDIA EN PORCENTAJE DE LA CLARA, YEMA Y HUEVO ENTERO Comp..del huevo Clara Yema Huevo entero

Sol.totales 11.1 52.3 –53.5 25-26.5

proteínas 9.7-10.6 15.7-16.6 12.8-13.4

lípidos 0.03 31.8-35.5 10.5-11.8

Carbohidratos 0.4-0.9 0.2-1.0 0.3-1.0

cenizas 0.5-0.6 1.1 0.8-0.1

PROTEÍNAS DEL HUEVO Durant Durante e mucho mucho tiempo tiempo,, las vitaminas vitaminas del huevo huevo entero entero de gallin gallina a se han considerado como alimento tipo. Su composición en aminoácidos esenciales sirv sirve e para para calc calcul ular ar los los índi índice cess de cali calida dad d quím químic ico o de otra otrass prot proteí eína nas: s: composición especialmente estable y muy poco dependiente de la raza y de la alimentación del animal.

EL HUEVO FRESCO


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Las características del huevo fresco están claramente definidas en el código alimentario Español y a su epígrafe 3.14.03 nos remitimos: son huevos frescos “aquello que, presentando un color y sabor característicos, no hay sufrido mas manipulaciones que una limpieza en seco. Observados al ovosc ovoscopi opio o aparec aparecerá erán n comple completam tament ente e claros claros,, sin sombr sombra a alguna alguna,, con yema apenas perceptible y cámara de aire pequeña, de no más de 7 milímetros de altura. La cáscara será fuerte, homogénea y limpia; la clara firme, transparente y sin enturbiamientos, y la yema de color uniforme, pudi pudien endo do osci oscila larr des desde el amar amarilillo lo clar claro o al anar anaran anja jado do roji rojizo zo,, sin sin adherencias con la cáscara y conservándose centrada y entera”. Los Los huev huevos os se clas clasifific ican an en dife difere rent ntes es cate catego gorí rías as segú según n su tama tamaño ño,, clasificación que en nada hace referencia a la frescura del alimento, de tal modo que un huevo de cuarta clase, en un momento determinado, puede estar más fresco que todo de clase superextra.

CATEGORÍAS DEL HUEVO SEGÚN SUS TAMAÑOS CATEGORIA Superextra Extra Primera Segunda Tercera Cuarta

PESO EN GRAMOS Mas de 65 gramos De 61 a 65 gramos De 56 a 65 gramos De 51 a 55 gramos De 46 a 50 gramos 45 o menos gramos

HUEVOS DEFECTUOSOS Son Son defe defect ctuo uoso soss los los huev huevos os roto rotos, s, incl inclus uso, o, parc parcia ialm lmen ente te,, pero pero cuya cuyass memb membra rana nass perm perman anec ece e inta intact ctas as;; aque aquello lloss que, que, sin sin esta estarr exte exterio riorm rmen ente te altera alterados dos,, carec carecen en del olor olor y sabor sabor caract caracterí erísti sticos cos;; los que, al ovosc ovoscopi opio, o, muestran una sombra oscura; finalmente, los que tienen una cámara de aire con una una altura superior a 12mm.


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HUEVOS AVERIADOS Los huevos averiados proceden de gallináceas o palmípedas; son impropios para para el cons consum umo o huma humano no por

conc concur urrir rir en ello elloss una una de las sigu siguie ient ntes es

circunstancias:



Tiene mal olor o sabor



Están contaminados por bacterias u hongos



Están podridos



Tienen la clara de color verdosos



Son sanguíneos o encubados



Su cámara de aire tiene mas de 20 mm de altura y es muy movible



Han sido conservados mediante procedimientos no autorizados

ALTERACIONES POR MICROORGANISMOS La contam contamina inació ción n del interi interior or del huevo huevo por microo microorga rganis nismos mos es bastan bastante te frecue frecuente nte,, ya que, que, contr contraria ariamen mente te a lo que que se cree, cree, los microo microorga rganis nismos mos penetran en él por los poros de la cáscara. La práctica del lavado de los huevos, que se hace en muchas granjas avícolas, acelera este proceso, ya que elimina la cutícula protectora que cierra los poros. Inicialmente, los procesos alterativos ocasionados por microorganismos tienen lugar en el interior del huevo, de modo que en el exterior no podemos apreciar nada más que un típico ruido de bamboleo cuando los agitamos, el cual es consecuencia de la rotura de la cámara de aire. Cuan Cuando do se casc cascan an,, esto estoss huev huevos os pres presen enta tan n dist distin inta tass cara caract cter erís ístic ticas as de alteración que pueden ayudar a identificar el agente contaminante: •

Putrefacción blanca, causada por Coliformes y Micrococcus.

•

Putrefacción roja, causada por Pseudomonas

•

Putrefacción verde, causada por el bacilo piociánico.


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•


Putrefacción negra, causada por Proteus melanogenes.

A esto hay que que añadir el típico típico olor a huevo podrido, podrido, cuyo cuyo origen está en la producción de anhídrido sulfuroso. A medida que la putrefacción avanza, aparecen modificaciones en la cáscara, normalmente, aspectos jaspeados de distintas tonalidades grises o azuladas. Por Por otra otra part parte, e, se pued pueden en prod produc ucir ir tamb tambié ién n alte altera raci cion ones es fúng fúngic icas as,, ocasionada por diferentes tipos de hongos y que se manifestarán sólo en la cáscara o en el interior del huevo:

•

Hongos que crecen en la cáscara: como consecuencia de la humedad existente en los locales de almacenaje, surgen moteados verdosos de consistencia más o menos mucosa.

•

Hongos que crecen en el interior del huevo : estos hongos atraviesan la cáscara formando colonias en el interior, concretamente, en la zona de la clara. Las colonias son verdosas si el contaminante es Aspergillus; azuladas en el caso de contaminación por Penicillium; grises cuando el contaminante es el Mucor. Al ovoscopio pueden verse manchas de diferentes tamaños.

1.8

MÉTODOS DE DE CO CONSERVACIÓN Se ha de distinguir entre la conservación que se hace por el frío, ya sea de forma industrial o doméstica, y la que se practica por métodos tradicionales.

Conservación por el frío


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La acción del frío, en sus distintas modalidades, permite la conservación idónea de los huevos, así como también la regularización del mercado, manteniéndose los precios dentro de unos márgenes más o menos estrec estrechos hos.. El Código Código Alimen Alimentar tario io Españ Español ol especi especific fica a claram clarament ente e los métodos de conservación: •

Huevos Huevos refrigera refrigerados: dos: son son huev huevos os ente entero ross que, que, dura durant nte e un

tiemp tiempo o supe superi rior or a quin quince ce días días,, sin sin exce excede derr de trei treint nta a desd desde e su puesta puesta,, se mantie mantienen nen aislad aislados os del medio medio ambien ambiente te en cámara cámarass frigoríficas o en locales con temperaturas que no superen los 4°C. •

Huevos conservados : son aquellos que han permanecido en

cámara frigorífica a 0°C durante un período de tiempo superior a treinta días e inferior a seis meses.

Conservación por métodos tradicionales Todos los métodos tradicionales tienen como objetivo esterilizar, en la medida de lo posible, la cáscara del huevo y, además, taponar sus poros para que los posibles gérmenes contaminantes no penetren por ella. Algunos de los sistemas utilizados son los siguientes: •

El método chino. Consiste en pincelar toda la superficie de los huevos con una fachada de cal apagada, al 1 %. Esta cal reacciona con el dióxido de carbono atmosférico, formando carbonato cálcico que tapa los poros.

•

Utiliz Utilizaci ación ón de salici salicilato lato sódico sódico o vidrio vidrio solubl solublee. Se trata de un método más moderno que el precedente que permite conservar los huevos durante meses en cuevas o locales fríos. El sistema es muy parecido al método chino: los huevos se sumergen en soluciones al 1%, pero tiene el inconveniente de que adquieren un cierto sabor jabonoso.


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•


Adición de sal común . Los huevos se introducen en disoluciones de salmuera (15 gramos de sal por litro de agua). Así se conservan más de un mes.

•

Otros métodos métodos. Exis Existe ten n much muchas as otra otrass vari varian ante tess de los los sist sistem emas as anteriores, con resultados más o menos buenos: enterrar los huevos con sal seca y ceniza de madera, pincelar con bórax, alumbre o glicerina, etc.

CONTAMINACIÓN

DEL

HUEVO

Y

PROTOCOLO

DE

CONTROL

MICROBIOLÓGICO Ya se ha señalado que los huevos frescos poseen numerosas medidas de defe defens nsa a físi física cass y quím químic icas as que que les les permi permite ten n resi resist stir ir la inva invasi sión ón micr microb obia iana na.. En ause ausenc ncia ia de mani manipu pula laci cion ones es extr extrao aord rdin inar aria ias, s, las las defensas naturales mantienen su eficacia a lo largo de la conservación y evitan el deterioro del producto. No obstante, por sus características de composición nutricional, en los huevos los gérmenes pueden proliferar bastante; hay dos momentos en los que se pueden contaminar: antes y después de la puesta .

Contaminación antes de la puesta Evid Eviden ente teme ment nte, e, ante antess de la pues puesta ta,, la cont contam amin inac ació ión, n, con con microorganismos, patógenos o no, está ligada a su presencia en el aparato genital de la ponedora, lo que es difícil de evidenciar no siempre la toma de muestras estériles del interior del huevo es fácil, ni las técn técnic icas as de este esteri rililiza zaci ción ón de la cásc cáscar ara a efic eficac aces es,, y el ries riesgo go de contaminación a partir de! aire siempre existe. Diferentes estudios han puesto de manifiesto que casi una de cada dos ponedoras tiene el oviducto y el ovario contaminados con bacterias no patógenas, pertenecientes, por lo general, a los géneros GUIA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA II

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Lactobacillus


y

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Micrococcus,

Estos huéspedes habituales de los genitales de las gallinas

se encuentran raramente en los huevos y su función es poco importante en su alteración. Es diferente lo que ocurre con algunos gérmenes que llegan al huevo en el curso de su formación: suelen proceder de los alimentos que recibe el animal y transitan por la vía digestiva y sanguínea hasta el ovario; ésta es

caso de las las

Salmonelas

pató patóge gena nass para para el ser ser huma humano no.. No, No,

obstante, esta transmisión Trans-ovárica necesita un elevadísimo nivel previo de contaminación de los alimentos, Al parecer, el origen más frecuente es el agua que se bebe, Gracias a los progresos que se han logrado en la cría y en la alimentación animal en la actualidad, el grado de infección por Salmonelas en ponedoras es bajísimo. Se han señalado otros gérmenes como responsables de contaminación de los los huev huevos os ante antess de la pues puesta ta,, entr entre e ello ellos, s, Staphylococcus, Pasteurella, Listeria y Pseudomonas , si bien se puede afirmar que el

80% se contamina tras la puesta. La contaminación depende de la limpieza de los lugares de puesta y de la manera en que los huevos son manipulados tras obtenerlos. Hay que tener en cuenta que la integridad de la cáscara es fundamental para asegurar la correcta conservación del huevo: si permanece intacta, la única posible vía de penetración de los microorganismos son los poros. En ambientes húmedos se pueden desarrollar en su superficie mohos que hidrolizan la cutícula, provocando un agrandamiento de los poros y facilitando la penetración de los gérmenes. Así pues, es fundamental que el embalaje embalaje utilizado

para el transporte de los huevos contribuya a

eliminar esta humedad, por lo que son preferibles los envases de cartón o celulosa a los de plástico.

Contaminación después de la puesta En la cáscara de un huevo, la cantidad de microorganismos presentes GUIA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA II

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puede puede variar de algunos algunos cientos a varias varias decenas decenas de millones, millones, con una media de cien mil. Esta contaminación depende muy estrechamente de las condicione condicioness de higiene de la cría; así, los huevos huevos procedente procedentess de granjas no industriales suelen estar mucho más contaminados que los de granjas industriales. Una parte importante de esta contaminación externa procede de las camas de los animales, de sus heces y del polvo del del aire. aire. La flora flora que se encuentr encuentra a suele estar estar constit constituid uida a por G+, bastante resistente a las condiciones de sequedad que representa la superficie de la cáscara.(cuadro 5).


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CUADRO MICROFLORA EN HUEVOS DE GALLINA. GALLINA. (SEGÚN BOURGEOIS, BOURGEOIS, C.M. MESCLE, J. F. Y ZUCCA J. MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA. ED. ACRIBIA. ZARAGOZA, 1994). Frecuencia Sobre la En

Tipo de Microorganismo

cásca

huevos

podridos

ra Micrococcus

+++

Achromobacter

++

+

Aerobacter

++

-

Alcaligenes

++

+++

Arthrobacter

++

+

Bacillus

++

+

Cytophaga

++

+

Escherichia

++

+++

Flavobacterium

++

+

Pseudomonas

++

+++

Staphylococcus

++

-

Aeromonas

+

++

Proteus

+

+++

Sarcina

+

-

Serratia

+

-

Streptococcus

+

+

II. OBJETIVOS Determinar en muestras analizadas de huevo y ovo-productos: •

Recuento de colonias Aerobias Mesófílas (31

•

lnvestigación y Recuento de Colifomes.

•

Investigación y Recuento de Escherichia coli

•

Investigación de Salmonella.

•

±

1°C).

Recuento de Mohos y Levaduras,

III.- MATERIALES Y METODOS GUIA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA II

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

Muestras de huevo y ovoproductos



Asa de siembra con con mango de kolle



Tubos de ensayo Pirex con tapa estériles



Placa petri Pyrex estériles



Gradilla de tubos



Lunas de reloj, espátula y baguetas



Vasos precipitados y Erlenmeyers



Probetas y Pipetas estériles



Mechero Bunsen



Incubadora



Estufa



Autoclave



Balanza Analítica



Jarra de Anaerobiosis.

Reactivos y medios de cultivo -

Agua destilada

-

Agua Peptonada

-

Caldo Lactosado

-

Caldo Selenito

-

Agar Sa Saboraud

-

Agar Ba Baird Parker

-

Agar Nutritivo

-

Agar Plate Count

-

Agar SS

-

Agar TSI

-

Agar LIA

-

Agar Cirato

IV. PROCEDIMIENTO GUIA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA II

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PROTOC PROTOCOLO OLO DE ANÁLIS ANÁLISIS IS MICROB MICROBIOL IOLÓGI ÓGICOS COS DE HUEVOS HUEVOS Y DERIVADOS La prep prepar arac ación ión de las las mues muestr tras as pres presen enta ta cier cierta tass cara caract cter erís ístitica cass peculiares según el producto que se quiera analizar. Se debe seguir como norma general el uso de material estéril y la realización de las tomas extremas de las medidas de asepsia. En los casos en que sea necesario analizar algún producto fresco sin cáscara y se prevea que este análisis se puede demorar más de veinte minutos se aconseja congelar la muestra. Los huevos enteros con cáscara se deben lavar y cepillar suavemente con agua jabonosa, aclarar y mantener en contacto con alcohol durante unos diez minutos. La extracción del huevo y la eventual separación de componentes se han de hacer con material estéril. En cuanto a productos congelados, se descongelarán en refrigeración, pero no más de dieciocho horas. Los productos líquidos y en polvo se homogeneizarán bien antes de hacer la toma de muestra. En todos los casos se procederá

con

material estéril y extremando las medidas de

asepsia. •

Análisis Microbiológico Para descartar la presencia de Salmonelas en los huevos se realizan análisis bacteriológicos, tanto de la cáscara corno de su contenido.

1. Detección de Salmonella a.

En la cáscara. - Los huevos deben ser colectados en bolsas plásticas de primer uso, en el lugar de postura de las gallinas; y en esas condiciones deben llegar al laboratorio.

1ra Fase: dentro de las bolsas se agregan en forma estéril 150 ml GUIA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA II

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de caldo lactosado, se cierran bien y se embalsan a 37°C por 24 horas.

2da Fase: Transcurrido el tiempo se abrirá la bolsa con mucho cuidado al mechero, se toma con una pipeta estéril 2 ml del liqu liquid ido o colo colocá cánd ndos ose e en tubo tuboss esté estéri ril,l, dond donde e se añad añade e cald caldo o selenito hasta completar la mitad de un tubo; la muestra así preparada se encuba en baño maría a 44,5 °C por 24 horas.

3ra Fa Fase se::

Del

cultivo ivo

en

caldo

selenito ito,

previamente

homogenizado se toma asa y se siembra en placas conteniendo Agar SS, encubar a estufas a 37 °C por 24 horas.

4ta Fase: Las colonias sospechosas de Salmonella, que han crecido en agar SS, pasan a la identificación bioquímica en TSI, LIA y Citrato.

b.

En el el co contenido.- De las bolsas colectadas se tomará l o 2 huev huevos os los los cual cuales es será serán n desi desinf nfec ecta tado doss con con alco alcoho holl junt junto o al mec mechero hero,, lueg luego o con con pinz pinzas as esté estéri rile less se quit quita a la cásc cáscar ara a necesaria, para que el contenido pueda vaciarse con facilidad.

1ra Fase: Fase: El cont conten enido ido del del huev huevo o es vaci vaciad ado o dent dentro ro de un Caldo La Lacto ctosad sado o. Es erle erlem mmey meyer que tien tiene en 150 ml de Caldo nece necesa sari rio o que que en lo posi posibl ble e el cont conten enid ido o de huev huevo o no sea sea contaminado con la cáscara, para garantizar, si se encontrasen, que las Salmonellas corresponden al interior. Incubar en estufa a 37 °C por 24 horas.

2.

Recuentos de Coliformes por el el Método de de Placas


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En una placa Petri estéril, que contiene una capa del medio Violet Red, sea mil de la disolución 10-1 e inmediatamente el medio fluido homogeniza bien, esperará que solidifique y añadir otra capa ni para dar el ambiente de anaerobiosis incubar en estufa a 37 °C por 24 horas.

3. Recuento de Staphilococcus aureus El medi medio o de cult cultiv ivo o util utiliz izad ado. o. Bair Baird d Park Parker er.. Tien Tiene e en sus sus componentes TELURITO y yema de huevo, los cuales no pueden ser esterilizados, juntos con los demás ingredientes, por ello son agregados después de la esterilizad del medio base y en la proporción necesaria según la cantidad del inedia reparado. Una vez junto los componentes se vierte dentro de una placa Petri estéril y cuando se solidifique se añade 0.1 ml de la disolución 10 y con la ayuda de la espátula Drigalski se esparce bien, cuando ha secado el inóculo se incuba en estufa a 37°C por 24 horas.

4. Detección de Bacterias Anaeróbicas Se forma una capa con el medio SPS en una placa Petri estéril, cuando esté sólido se agrega, 1 ml de la disolución 10-1 inmediatamente se añade al medio de cultivo, homogenizar bien bien y al agre agrega garr una una capa capa.. Más Más del del medi medio o para para dar dar las las condiciones de anaerobiosis. Incubar dentro de una capa de anaerobiosis en estufa a 37°C por 24 horas.

V- RESULTADOS Y DISCUSIÓN GUIA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA II

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Debe reportarse los siguientes resultados: 1.

Enumeración de coliformes totales.

2.

Determinación de Streptococcus spp .

3.

Enumeración de Mesófilos aerobios viables.

4. Núme Número ro más más prob probab able le.. 5.

Determinación de Coliforme fecal .

6.

Enumeración de Clostridium perfringens.

7. Prue Prueba bass bioq bioquí uími mica cas: s: 

TSI



LIA



Urea



Citrato



Rojo Metilo



Indol



Motilidad



H2S

VI.- CONCLUSIONES VII.- RECOMENDACIONES VIII.- CUESTIONARIO:

1. Defin Defina: a: Condro Condroititin in Sulfa Sulfato to,, Ácid Ácido o Sial Sialic ico o

muco mucopr prot otei eina nas, s, chala chalaza za,,

teluritto. 2. Explique Explique los métodos métodos de cultivo cultivo en anaerobio anaerobiosis sis 3. De que depende depende la calida calidad d microbiológ microbiológica ica de la mayones mayonesa a 4. Cuales Cuales deben deben ser las condic condiciones iones de de crianza crianza de aves aves de corral corral 5. Cuales Cuales son los princip principales ales ovo ovo productos, productos, como como deben deben ser elabora elaborados dos y como debe ser su conservación.


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PRACTICA 5: ANALISIS MICROBIOLOGICO DE HUEVOS

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