PRACTICA 6: ANALISIS MICROBIOLOGICO DE LOS HONGOS

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ANÁLISIS MICROBIOLOGICO MICROBIO LOGICO HONGOS

PRACTICA Nº 6

ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE LOS HONGOS

I.- INTRODUCCIÓN a) OBSERVACIÓN DE LOS HONGOS Frecuentemente pueden observarse crecimiento de hongos sobre los alimentos y otros materiales. Se examinan estos sustratos con un lente simple pueden dist disting ingui uirs rse e el cuer cuerpo po vege vegeta tatitivo vo form formad ado o por por una una masa masa de filam filamen ento toss ramificados e interlazados denominada Micelio. Cada filamento de micelio constituye una Hifa. En algunos hongos, el protoplasma recorre las hifas en forma interrumpida, constituyendo hifas Aceptadas o Cenociticas. Las hifas de otros hongos tienen paredes transversales llamadas septos con uno o varios poros que permiten el paso del protoplasma. A este tipo de hifas se les denomina denomina Septadas. Septadas. Los hongos hongos se reproduce reproducen n asexualmente asexualmente a través través de espora esporass asexua asexuales les desarro desarrolla llada dass dentro dentro de un espora esporangi ngio, o, se denomi denominan nan Esporangiosporas. Si las esporas se reproducen libremente en el extremo o al lado de las hifas, se denominan Conidiosporas. Existen hongos unicelulares que no forman estructuras filamentosas, estos reciben el nombre de levaduras y pueden distinguirse de las bacterias por su mayor tamaño y por la presencia de un núcleo simple. Ocasionalm Ocasionalmente ente puede puede observarse observarse el desarrollo desarrollo de estructuras estructuras conspicua conspicuass denominadas Cuerpos Fructíferos los cuales portan las esporas sexuales de reproducción. Estas estructuras se utilizan como base de l a clasificación natural de los hongos hongos.. De esta esta manera manera se

define definen n tres divisio divisiones nes:: Zygomicota,

Ascomicota y Basidiomycota.

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Biol. Ms. C. Alicia Decheco Egusquiza

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El micelio de los Zygomycota es aceptado excepto en las estructuras de reproducción. Los miembros de esta división forman esporas asexuales de tipo esporangiosporas. Las esporas sexuales son la denominadas Zigosporas que desarrollan en ausencia de un cuerpo fructífera. Los hongos hongos al igual que la mayoría de las bacterias bacterias son heterótro heterótrofos, fos, ningún ningún hong hongo o es capa capazz de crec crecer er bien bien en ause ausenc ncia ia de sust sustan anci cias as alim alimen entic ticia iass orgánicas. Ningún hongo posee pigmentos fotosintetizantes y ninguno es capaz de utilizar el dióxido de carbono. Sin embargo, en presencia de un suministro exterior de azucares de otro alimento orgánico, muchos hongos exhiben una sorprendente capacidad de síntesis y produce una gran variedad de sustancias orgánicas complejas. La mayor parte de hongos son filamentosos. Los filamentos fil amentos conocidos por hilos está están n ordin ordinar aria iame ment nte e muy muy rami ramififica cado doss y form forman an cole colect ctiv ivam amen ente te el talo talo vegetativo vegetativo o Micelo. Micelo. En los hongos hongos superior superiores es las hifas puede pueden n agregarse agregarse para formar estructuras sólidas complejas que en algunas especies pueden alcanzar un tamaño muy considerado. Los Ascomycotas tienen micelio septado. La reproducción asexual es muy variada involucrando procesos procesos de de fisión, gemación, gemación, fragmentación, fragmentación, formación de Clamidiosporas o formación de conidias, dependiendo de las especies y de las condiciones ambientales. La fisión y la gemación son son comunes en levaduras mientras mientras que la mayoría de ascomi ascomicet cetos os forman forman uno uno o varios varios grupos grupos de esporas esporas terminale terminaless llamad llamadas as Conidia que desarrollan a partir de hifas ramificadas llamadas Conidioforos y Esterigmas. Las esporas sexuales son llamadas Ascosporas desarrolladas dentro de sacos y prot proteg egid idos os en cuer cuerpo poss fruct fructíf ífer eros os deno denomi mina nado doss Asco Ascosc scar arpo pos. s. Esta Estass

CLEISTOT OTECI ECIO, O, PERITE PERITECIO CIO Y estr estruc uctu tura rass pued pueden en ser de tres tres tipo tipos: s: CLEIST APOTECIO, dependiendo de las características de cada grupo de Ascomycota. GUIA DE LABORATORIO MICROBIOLOGIA II

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Los Los pres presen enta tant ntes es de los los Basi Basidi diom omyc ycot ota a incluy incluyen en espe especi cies es fila filame ment ntos osas as levaduriforme. Entre las formas filamentosas y levaduriforme. Entre las formas filamentosa filamentosass puede puede encontrars encontrarse e especies especies microscópi microscópicas cas y macroscóp macroscópicas. icas. Estas últimas forman cuerpos fructíferos visibles que portan las Basidias y esta estass a las las Basi Basidi dios ospo pora rass o espo espora rass sexu sexual ales es.. Los Los basi basidi diom omic icet etos os se repr reprod oduc ucen en asex asexua ualm lmen ente te a trav través és de coni conidi dias as,, el mice micelilio o es sept septad ado o y mayormente constituido en porciones anastomosadas a manera de pseudotejido, que forma los Cuerpos. Fructiferos.

b) HABITAD: Los hongos ocupan una amplia variedad de ambientes. La mayoría ocupa los lugares húmedos de la tierra, aunque algunos en particular las especies de Aspergillus, Penicillum pueden resistir unas condiciones de mayor sequedad.

Much Muchos os hong hongos os son son pari parien ente tess acti activo voss de plan planta tas, s, incl inclus uso o de las las más más importantes plantas cultivadas y algunas especies causan enfermedades en el hombre y en los animales domésticos.

C) REPRODUCCIÓN: La reproducción en los hongos se realiza habitualmente por esporas. esporas. Los más frecuentes son unas células aisladas incoloras, pero pueden poseer gruesas membranas esculpidas pueden llamar apéndices o pueden estar rodeadas de una cubierta gelatinosa. gelatinosa. La mayor parte de los hongos producen producen mas de una especie de esporas, cuando las condiciones son favorables al crecimiento de estas. La mayoría de los hongos son muy variables, tanto en condiciones naturales como en el cultivo cultivo de laboratorio. Algunas veces la variación esta inducida por cambios en las condiciones ambientales y el hongo regresa a la forma manual cuando revierten los cambios ambientales. GUIA DE LABORATORIO MICROBIOLOGIA II

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También ocurren al tener tener una base genética genética de los cultivos de de placas petri se pued pueden en prod produc ucir ir sect sector ores es que que difi difier ere e del del rest resto o del del cult cultiv ivo o con con algu alguna nass cara caract cter erís ístitica cas, s, como como la form forma, a, el color color,, la velo veloci cida dad d de crec crecim imie ient nto o y la intensidad de esporulación.

d) VARIACIÓN AMBIENTAL: Los hongos hongos son afecta afectados dos por mucha muchass influe influenci ncias as ambien ambiental tales, es, como como la natu natura rale leza za y la conc concen entr trac ació ión n del del sumi sumini nist stro ro nutr nutrititiv ivo, o, la hume humeda dad, d, la temperatura, la luz y la concentración concentración de hidrogeniones. Los cambios de estos factores pueden inducirnos cambios tan grandes en la morfología, que hace difícil el reconocimiento reconocimiento del hongo. hongo.

e) VARIACIÓN GENETICA: Los estudios recientes sobre las bases genéticas de la variación en los hongos han han demo demost stra rado do que que son vali valido doss los los mism mismos os prin princi cipi pios os que que para para los los organismos superiores.

II.- OBJETIVOS: 

Obse Observ rvar ar el desa desarr rrol ollo lo de hong hongos os mice micelia liare ress

y leva levadu duri rifo form rmes es y

sustratos de diferentes orígenes e identificación de los géneros mas frecuentes. 

Aisl Aislar ar en medi medio o de culti cultivo vo los los dife difere rent ntes es géne género ross de hong hongos os que que frecuenta el medio ambiente y determine sus características.



Determinar las características del desarrollo vegetativo de los hongos a través través de un cultiv cultivo o en cámara cámara húmeda húmeda y median mediante te observ observaci acione oness periódicas al microscopio.


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III.- MATERIALES Y METODOS 

Material infectado

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Lamina porta y cubre objeto

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Solución colorante: azul de metileno

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Dispositivo para cultivo en cámara húmeda

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Asa de siembra con con mango de kolle

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Tubos de ensayo con tapa estériles

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Placa petri Pyrex estériles

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Agua destilada estéril

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Gradilla de tubos

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Lunas de reloj, espátula y baguetas

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Vasos precipitados y Erlenmeyers

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Probetas y Pipetas estériles

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Goteros

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Varilla de Vidrio en *U*

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Gillette estéril

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Mechero Bunsen

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Incubadora

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Estufa

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Autoclave

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Balanza Analítica

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Microscopio

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Aceite de Inmersión.

Reactivos y medios de cultivo -

Agua destilada

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Agua Peptonada

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Agar Sa Saboraud

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Agar Nutritivo

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Agar Plate Count


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IV.- PROCEDIMIENTOS 1.- OBSERVACIÓN DE HONGOS FILAMENTOSOS Y LEVADURAS a).- OBSERVACIÓN MACROSCOPICA 

Observe cuidadosamente cada substrato infectado y determine el tipo de colonia que desarrolla.



Describa el aspecto externo de las colonias de hongos.

b).- OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA 

Coloque Coloque una gota gota de azul de metileno metileno en una porta objetos objetos limpio limpio y drenado.



Con ayuda del asa de kolle en forma de gancho o de un estilete, extraiga una pequeña cantidad del micelio de una muestra y colóquelo en la gota de colorante.



Coloque sobre sobre la preparación la lamina cubre objeto.



Observe al microscopio bajo el objetivo de 10-40 de aumento.



Reconozca las estructuras más características del cuerpo vegetativo del hongo.



Con la ayuda de láminas referentes trate de identificar él o los géneros que observe.

2.- AISLAMIENTO DE HONGOS DEL MEDIO AMBIENTE 

Elija un punto determinado del ambiente que quiera evaluar.



Destape la placa petri exponiendo el medio de cultivo al aire (se asume que las esporas de hongo se encuentran suspendidas). El tiempo de exposición puede ser de 5 a 10 minutos, vuelva a tapar la placa, identifíquela con su nombre, grupo y el lugar de muestreo.



Trabaje de manera similar para cada placa y lugar.

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En el laboratorio incube las placas en una estufa de 30 ºC por 4 a 5 días.


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


Transcurrido el tiempo, examine las placas y realiza una descripción detallada de las mismas.

2.1.- PREPARACIÓN DE MEDIOS a).- Preparación del Agar Nutritivo .- Pesar 2 gr. de agar nutritivo y disolverlo en 100 ml de agua destilada. Licuarlo y luego colocar 9 ml de este en 3 tubos y luego luego esterilizar. b).- Preparación de Agua Peptonada .- Pesar peptona peptona al 0.1% para 120 ml de agua agua dest destililad ada, a, es deci decirr pesa pesar r 0.012 gr. de de peptona. Luego colocar colocar también 9 ml en en 3 tubos tubos y luego luego llevar a esterilizar en la autoclave a temperatura de 121ºC por un espacio de 15 minutos.

2.2. - CONTEO EN PLACAS En teor teoría ía,, la enum enumer erac ació ión n de bact bacter eria iass y hong hongos os en much muchos os tipo tiposs de especimenes, se basa en el supuesto de que cada microorganismo dará origen a una colonia después de la incubación en medios adecuados. Una cantidad medida del especimen o de una dilución de la misma mezcla en una una plac placa a petri petri este esteri riliz lizad ada a que que cont contie iene ne agar agar derr derret etid ido. o. Desp Despué uéss de la incubación se cuenta el número de colonias que están creciendo en el agar, para obtener el cálculo de la población bacteriana del espécimen original. Aunque existen diversos factores que limitan contra este como un método inexacto, la técnica es sencilla y rinde resultados bastante satisfactorios para el uso rutinario. -

Obse Observ rve e la plac placa a contra ntra el fon fondo ilum ilumin inad ado o y cuent uente e él núme úmero de colonias.

-

Multipl Multipliqu ique e el númer número o de colon colonias ias por por la diluc dilución ión de de la muest muestra. ra.

-

Escoge Escogerr la placa placa que conte contenga nga 30 – 300 colon colonias ias..

Para evitar una actitud física y sin embargo expresar los resultados numéricos mediante un método conforme con la precisión de la técnica empleada, el GUIA DE LABORATORIO MICROBIOLOGIA II

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núme número ro regi regist stra rado do de bact bacter eria ia por por ml no debe debe incl inclui uirr más más de 2 cifr cifras as significativas. Por ejemplo un conteo de 142 se registra como 140 y un conteo de 155 como 160 y mientras que que un conteo de 35 se registra como como 35.

3 .- CULTIVO EN CAMARA HUMEDA Un dispositivo para cultivo en cámara húmeda es un sistema que consta de una placa petri conteniendo un disco de papel filtro y una varilla de vidrio de “U” que soporta dos laminas porta y cubre objetos. Asépticamente se selecciona una pequeña porción de medio de cultivo estéril (Agar Saboraud), y se coloca sobre la lámina porta objetos. Realizada la siembra del hongo en estudio, la preparación se cubre con la otra lamina y el papel filtro humedece conservando la asepsia. La placa es incubada a temperatura ambiente (20 – 25º C) por 4 a 5 días.


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PROCEDIMIENTO 1. Utili Utiliza zand ndo o aguj aguja a de koll kolle e o estil estilet ete, e, piqu pique e una una colo coloni nia a y extr extrai aiga ga una una fracción mínima de esporas o micelio. 2. En forma forma asép aséptic tica a

depo deposi site te esta esta fracc fracció ión n sobre sobre la porci porción ón de agar agar

dispuesta en el porta objeto de la cámara húmeda. 3. Con la ayuda ayuda de una pinza pinza estéril estéril cubra cubra cuidadosam cuidadosamente ente la preparac preparación ión con la lamina cubre objetos. 4. Humedezca Humedezca el el papel filtro filtro de la placa placa con con agua destil destilada ada estéril. estéril. 5. Incube Incube la placa placa a temper temperatura atura ambiente ambiente (20 – 25 º C). C). 6. Examine Examine diariament diariamente e al microscopio microscopio la lámina lámina sembrada sembrada hasta hasta verificar verificar el completo desarrollo del hongo. Retire cada vez la lamina de cultivo de la cámara húmeda y una vez realizada la observación vuélvala a su lugar cuidando de mantener la humedad constante, si es necesario añada mas agua al sistema. 7. Observa Observa la germinació germinación n de las esporas, esporas, el crecimien crecimiento to y ramificación ramificación del del mice micelilio, o, la apar aparic ició ión n de hifa hifass dife difere renc nciad iadas as y el desa desarr rrol ollo lo de las las estructuras de reproducción. 8. Con la ayuda ayuda de un manual manual de identific identificac ación ión de hongos hongos determi determine ne el género correspondiente. 9. Elabore Elabore en detalle detalle los los esquemas esquemas de de cada etapa etapa de desarrollo. desarrollo.

VI- RESULTADO Y DISCUSION VII.- RECOMENDACIONES VIII.-CONCLUSIONES


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IX.- CUESTIONARIO: 1. Defina Defina:: Factor Factores es intrín intrínsic sicos, os, Factor Factores es extrín extrínsec secos, os, microo microorga rganis nismos mos endógenos, microorganismos exógenos. 2. ¿Qué ¿Qué consid considera eracio ciones nes se deben tener tener para para elegir elegir la Temper Temperatu atura ra de incubación? 3. Explique Explique los microo microorganis rganismos mos como como productor productores es de almidón. almidón. 4. ¿Cuá ¿Cuále less son son los los cont contro role less de cali calida dad d que que se real realiz izan an dura durant nte e la elaboración de productos de confitería. 5. Expliq Explique ue sobr sobre e las las levad levadura uras. s.


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