PRACTICA 9: ANALISIS MICROBIOLOGICO DE MARISCOS

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ANÁLISIS MICROBIOLOGICO MICROBIO LOGICO DE MARISCOS

PRACTICA N° 9

ANALISIS MICROBIOLOGICO DE MARISCOS I.INTRODUCCIÓN Alteraciones en la manipulación almacenamiento de mariscos

1.1

Cambios bioquímicas Las modificaciones sufridas por el marisco desde su captura hasta que llega al consumidor tienen aspectos similares a las del pescado, pero difieren notablemente en otras. El envejecimiento y el deterioro de los tejidos ocurren de modo parecido al del pescado, y se ve influido por idénticos factores. La escasa cantidad de glúcidos en los crustáceos y la riqueza en enzimas proteoliicos determinan una leve caída del pH y una rápi rápida da alte altera rabi bililida dad, d, con con libe libera raci ción ón de comp compue uest stos os nitr nitrog ogen ena a dos dos volá volátil tiles es.. Algu Alguno noss enzi enzima mass oxid oxidan an pigm pigmen ento tos, s, que que dan dan luga lugarr a un enne ennegr grec ecimi imien ento to de la cabe cabeza za cono conoci cido do como como mela melano nosi sis. s. En los los moluscos, la cifra de glúcidos permite un mantenimiento mas prolongado de su buen estado.

1.2 Derivado Derivadoss de los mariscos mariscos Los Los prod produc ucto toss deri deriva vado doss de los los mari marisc scos os que que reco recoge ge el Códi Código go Alimentario Español son: semiconservas, conservas, sopas de mariscos y bullabesas y platos cocinados. Tienen características parecidas a las de los derivados del pescado, pero lógicamente la base la constituyen los crustáceos y los moluscos. GUIA DE LABORATORIO MICROBIOLOGIA II

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Biol. Ms. C. Alicia Decheco Egusquiza

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ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE MARISCOS

•

Semiconservas.-Son productos a base de crustáceos y de

moluscos sometidos a un tratamiento apropiado y mantenidos en recipientes

impermeables

al

agua

a

presión

normal.

Las

semiconservas deben almacenarse en frigorífico y su conservación es limitada en el tiempo. Pueden darse como mariscos enteros o troceados y suelen llevar un líquido de cobertura, que puede ser aceite vegetal, vinagre o la mezcla de ambos en diferentes proporciones y con distintos condimentos.

•

Conservas.- Son aquellos productos hechos (OR moluscos o

crustáceos, con o sin adición de sustancias autorizadas, contenidos en envases herméticamente cerrados y tratados exclusivamente por el vapor, para asegurar su conservación.

1.3 Alteraciones en e almacenamiento El marisco congelado almacenado sufre, al igual que el pescado, procesos que cambian su composición lipidia. Las grasas modificadas con las proteínas, dando lugar a complejos lipoproteicos y a compuestos de molécula pequeña. Aparecen pigmentos castaño-rojizos, equivalentes a la lipofucsina, que se utilizan para determinar la edad de los crustáceos marinos. La interacción lipídico-proteica retarda la oxidación de las grasas durante e almacenamiento. En los mariscos enlatados y sometidos a la acción del calor se precisa realizar una serie de tareas. Las gambas y otros crustáceos, después de descongeladas, se lavan, separado los ejemplares rotos, decolorados o alterados y los residuos extraños. Más tarde, se les quita la cabeza y se pelan; posteriormente, se escaldan en salmuera hirviente. Estas gambas precocidas se lavan de nuevo, se revisan, se categorizan y se envasan a mano o a máquina. GUIA DE LABORATORIO MICROBIOLOGIA II

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Por último, se añade salmuera, aceite o salsa y se cierran los envases. En cuanto a las almejas y otros moluscos, en primer lugar se lavan para que desaparezca la arena y el barro; luego, se precuecen al vapor. Mas tarde, se extraen de las conchas a mano o a maquina y se cortan por un lado para eliminar completamente la arena o el barro que pudiera quedar. Tras un nuevo lavado se extirpan el sifón, las paredes laterales del cuerpo y el estómago, procediendo, por último, al envasado y a la adición de agua, salmuera, aceite, jugo o salsa. Como ocurre en el pescado, tras someter a gambas, langostas y cangrejos a la acción del calor, pueden aparecer manchas negras en la superficie por el depósito de sulfuro de hierro.

Microbiología de los mariscos

2.

2.1

Características microbiológicas La presente de bacterias en la superficie de los crustáceos es similar a la del pescado. En el caso (de los moluscos, la contaminación se reduce ostensiblemente cuando se someten a depuración en tanques con agua marina limpia circulante. La posible existencia de gérmenes patógenos se corresponde con el lugar donde viven y con la forma de alimentarse, caracterizada, en los moluscos bivalvos, por la filtración de muchos litros de agua cada día. Los microorganismos más ubicuos son Salmonella, Shigella, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Clostridium perfringens y virus.

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2.2 Cambios microbiológicos Las alteraciones microbiológicas que sufren los mariscos constituyen, en muchos casos, graves problemas de salud pública. Los crustáceos se suelen capturar en regiones alejadas de la costa, por lo que no suelen portar gérmenes patógenos. No obstante, se ha extendido su cultivo en viveros de regiones costeras, en las que el peligro de contaminación se multiplica; de hecho, se han descrito importantes brotes de intoxicación por Vibrio parahaemolyticus, procedente de residuos terrestres, en mariscos cocidos y recontaminados con posterioridad. En los moluscos con alteraciones de detecta un crecimiento de bacterias Gram negativas proteolíticas: Pseudomonas y Vibrio, y sacarolíticas: Lactobacillus. Las primeras generan aminas y amoniaco; las segundas reducen el pH. Tomar ciertos moluscos bivalvos crudos puede ocasionar toxiinfecciones graves por Salmonella, Shigella, Vibrio cholerae, Escherichia

coli, Clostridium

botulinum, Clostridium perfringens,

Staphylococcus aureus enterotoxigénico, Vibrio parahaemolyticus y virus. El consumo de otras alteradas puede acarrear cuadros de fiebres tíficas, paratíficas, hepatitis víricas. Los mejillones crudos, mal cocinados o recontaminados, pueden ser origen de fiebres tíficas y de salmonelosis. Mención aparte merece la contaminación por biotoxinas marinas fabricadas por los dinoflagelados presentes en el plancton. Algunos biotoxinas afectan al sistema nervioso las neurotoxinas – y otras, al tubo digestivo – enterotoxinas -. En determinadas circunstancias favorables, los dinoflagelados ascienden hacia la superficie marina y se reproducen rápidamente, dando lugar a coloraciones extrañas, entre las que predomina el rojo; este fenómeno se conoce como marca roja o purga de mar. Los moluscos, en especial, los mejillones y las almejas, filtran cada día grandes cantidades de agua y se alimentan de estos organismos, y las toxinas se fijan al hepatopáncreas o al sifón. Al ser GUIA DE LABORATORIO MICROBIOLOGIA II

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consumidos por el ser humano, sobreviene la intoxicación que, en el caso de la neurotoxina, puede ocasionar la muerte y en el de la enterotoxina, provocar trastornos gastrointestinales.

2.3 Control microbiológico de los mariscos Las muestras de crustáceos con caparazón se

consiguen

desinfectando, su superficie con alcohol de 70°C y, luego, se retiran asépticamente con material estéril. Si carecen de caparazón, la carne se debe manipular también (le modo aséptico con material estéril). Si se trata de moluscos se debe tomar un número suficiente (los individuos para que el volumen de carne y de líquido intervalvar no sea inferior a 0 ml. Se deben limpiar concienzudamente a chorro y mediante un cepillo para retirar todo tipo de sustancias extrañas adheridas a las conchas como algas, tierra, etc. Tras un ligero flameado, las valvas se abren y recogen los cuerpos y el líquido intervalvar sobre pro beta estéril. Se añade diluyente hasta obtener un dilución 1:10 0; se puede utilizar como diluyente solución Ringer a 1/4 agua de triptona. Finalmente, la mezcla se tritura y homogeneiza y se usa como solución madre. El protocolo de estudio microbiológico en los mariscos es el siguiente:

•

Recuento de colonias aerobias revivificables.

•

Investigación y recuento de Escherichia coli.

•

Investigación y recuento de Enterobacteriaceae totales.

•

Investigación de Salmonella y Shigella.


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•

Investigación

y

recuento

de

Streptococcus

aureus

enterotoxigénico. •

Investigación y cuento de Streptococcus D. de Lancefield.

•

Investigación de Vibrio paraharahaemolyticus

•

Investigación de biotoxinas marinas hidrosolubles (PSP).

•

Investigación de biotoxinas marinas liposolubles (DSP).

•

Investigación de toxinas botulínicas.

Para la investigación de toxinas marinas se puede recurrir a métodos biológicos, inmunológicos y químicos. El bioensayo en ratón es el Procedimiento oficial para determinar biotoxinas PSP, y es el mejor método de que se dispone. Se valora la posibilidad de sustituirlo por algún otro método, especialmente, fluorométrico o HPLC. Para las biotoxinas DSP se puede utilizar el bioensayo en ratón o HPLC.

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE MARISCOS Preparación de la muestra Mariscos con valvas: 1. Recipiente con boca ancha con capacidad de 20 unidades de mariscos con valvas aprox. 10 gr. 2. Recipiente con escurridero de agua. 3. Vaso de precipitación con 500 ml. de capacidad. 4. Vaso de licuadora estéril. 5. Escobilla dura. 6.

Cuchillo estéril

7.

Cuchara estéril

8.

Servilleta estéril.


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9. Balanza de capacidad no inferior a 2500 gr. y una sensibilidad de 0.1 gr. 10.Licuadora de 2 velocidades. 11.

Alcohol etílico de 70%.

12.Solución buffer de fosfato o agua de peptona el 01%. 13.

Mechero.

14.

Asa de siembra.

15.

Tubo con cultivo puro.

16.

Tubo con TSI.

17.

Tubo con SIM.

18.

Tubo con LIA.

19.

Tubo con citrato.

PROCEDIMIENTO 1.

Colocar 20 unidades de mariscos valvados en un recipiente de boca ancha. Cepillar cada uno de ellos bajo el chorro de agua potable, con especial atención a las grietas y uniones de las valvas.

2. Colocar las muestras limpias en un recipiente con calador y dejar escurrir el agua. 3. Lavar y desinfectar las manos con alcohol de 70%. 4. Colocar la muestra en la mano sobre una servilleta de papel limpia, de tal forma que una de las partes convexos, descanse sobre la palma de la mano. 5.

Insertar el cuchillo en el punto de unión de las valvas. Cortar el músculo de la valva superior, palanquear las valvas y dejar que el líquido caiga


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sobre el vaso de precipitados previamente tapados. Retirar la bañada superior y transferir la carne al vaso contenido el líquido valvar. 6. Pesar el vaso con la muestra extraída. 7. Transferir la muestra al vaso de la licuadora. 8. Adicionar una cantidad igual al peso de la muestra de solución buffer de fosfato o agua peptonada al 0.1%. 9.

Homogenizar tomando las precauciones indicadas en preparación y dilución de las muestras de alientos ( 2 ml de este, homogenizado contienen 1 gr. de mariscos).

En caso de que el homogenizado resulte de consistencia pesada y difícil de pipetear, adicionar 3 partes de diluyentes en peso de la muestra (4 ml., de esta muestra contiene 1 gr de las muestras en examen). Corregir las proporciones a ser tomadas para la siembra.

MEDIOS UTILIZADOS CALDO AZIDA – GLUCOSA Art. Num 1590 Para ensayo previo orientativo de enterecocos y para enriquecimiento selectivo de los mismos.

Este medio de cultivo corresponde a las recomendaciones de los Estándar Methods for the Examination of Water and Wastewater (1975).


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Forma de preparación

La sodio-asida presenta en una concentración que respeta al máximo a los enterococos e inhibe notablemente a la flora gram-negativa que les puede acompañar.

La utilización de sodio-azida como sustancia inhibidora selectiva de bacterias gramnegativas se remonta a los trabajos de EDWARS (1933 – 1938) y HARTMANN (1936) sobre el aislamiento del Str. Agalactiae, Ulteriormente, MALLMANN (1940) y SNYDER aislamiento de enterococos a partir de aguas. La demostración de enterococos (Streptococcus faecalis, S. bovis y S. Equinus) sirve como un indicador de contaminantes fecales, especialmente de corrientes de agua, aguas residuales que contengan cloro y baños Yodo, en todos los cuales pueden estar ya extinguidas en el momento de la investigación las bacterias coliformes menos resistentes, inclusive E. Coli.

Composición (g/litro) Peptona de caseína 15.0; extracto de carne 4.8; D (+)-Glucosa 7.5; Sodio cloruro 7.5; Sodio azida 0.2.

Preparación Disolver 35 g o 70 g por litro, distribuir y esterilizar autoclave. No recalentar. GUIA DE LABORATORIO MICROBIOLOGIA II

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Empleo e interpretación Si la cantidad de producto a ensayar es pequeña (hasta 1 ml, se incorpora en el caldo de concentración sencilla (35 g/litro) que queda así diluido a la concentración habitual. Incubación : desde 254 hasta 48 horas, a 37°C. La producción de enturbamiento durante la incubación (crecimiento) permite sospechar la presencia de enterecocos. En este caso, y para su confirmación, se resiembra en Calco-purpura de bromocresol – axida (MERCK, Art. Num 30332). Si no se presenta turbidez alguna, puede desecharse con seguridad la presencia de enterococos. Agar ENDO-C (Agar-fucsina-lactosa seg. ENDO, tipo) ENDO-C Agar Art. Num 4044

Medio de cultivo selectivo, para demostración y aislamiento de E. Coli fecal y coliformes en los más diversos materiales.

Este medio de cultivo corresponde a lo prescrito en los Estándar Methods for the Examination of Dairy Products (1967) y en los Estándar Methods for the Examination odf Water and Wastewater (1975).


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Forma de actuación

El sodio sulfito y la fucsina inhiben a las bacterias gram positivas E. Coli y coliformes utilizan lactosa con formación de aldehído y ácido. Por otra parte, el aldehído libera fucsina a partir de la combinación fucsina-sulfito, lo cual da lugar a la coloración roja de las colonias. En el caso de E. Coli, esta reacción es tan intensa que la fucsina llega a cristalizar y por este motivo, confiere a dichas colonias un brillo metálico estable, de reflejo verde (típico de la fucsina cristalizada).

Composición (g/litro) Peptona de carne 10.0; di-Potadio hidrogenofosfato 3.5; Lactosa 10.0 Sodio sulfito, anhidro 2.5; Fucsina 0.4; Agar – agar 12.5.

Preparación Disolver 39 g/litro, esterilizar al autoclave y verter en placas. Si el medio de cultivo muestra, tras la solidificación, un tono rojo demasiado intenso puede eliminarse dicho exceso de color añadiendo algunas gotas (hasta 1 ml/litro, como máximo) de una solución, anhídrido, MERCK, Art. Num 6657, e hirviendo el conjunto a continuación. Ph 7.4

≠

0.2

Por efecto del oxigeno atmosférico y debido a la consiguiente oxidación del sulfito, el medio de cultivo vertido en placas se vuelve paulatinamente rojo y GUIA DE LABORATORIO MICROBIOLOGIA II

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por lo tanto, inservible. Incluso conservado en la oscuridad y a la temperatura de nevera, solo es utilizable durante pocos días.

Empleo e interpretación

Sembrar las placas en estría por agotamiento Incubación: 24 horas, a 37°C.

Colonias Rojas

Microorganismos Lactosa – positivos

Rojas con brillo metálico Estable

E. coli

Rojas hasta rojizas, semi-esféricas Enterobacter aerogenes, mucosas Incoloras, claras


Klesbsiella y tros. Lactosa – (-)

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ANÁLISIS DE LA MUESTRA: 1.

Preparar las diluciones decimales, siguiendo una de las técnicas

descritas en preparación y dilución de las muestras de alimentos, hasta la dilución 10-4 o 10-5 si es necesario. 2. Efectuar las determinaciones microbiológicas de acuerdo al esquema de trabajo y a la metodología descrita. 3. Reportar los resultados por gramo de muestra.

Pruebas Bioquímicas

La lectura en placa no es suficiente para poder identificar al (los) microorganismos (s) en estudio, para ello emplearemos las pruebas bioquímicas con las cuales podemos llegar a identificar el nombre del espécimen cultivado. Los medios de diferenciación más empleados en el laboratorio de microbiología para la identificación de bacterias son: el agar citrato de Simmons, el medio de SIM, el agar hierro tres azucares (TSI) y el medio de LIA.

Luego se procederá de la siguiente manera: 1. Flamear el asa de siembra 2. Tomar una muestra del cultivo puro y sembrar en estría y por picadura en los tubos con medios TSI, LIA y citrato. En el medio de SIM sembrar únicamente por picadura. GUIA DE LABORATORIO MICROBIOLOGIA II

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3. Incubar los tubos y hacer la lectura de los mismos a las 24 horas después de la siembra. 4. Realizar

la

prueba

de

indol

añadiendo

unas

gotas

de

dimetilaminobenzaldehido. 5. Realizar la prueba de la catalasa para lo cual añadir unas gotas de peróxido de hidrógeno sobre las colonias.


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CUESTIONARIO 1. Explique la importancia de evitar contaminación por Vibrio vulnigicus y Salmonella en mariscos y pescados. 2. Parásitos que puedan ser transmitidos por alimentos marinos. 3. Explique como se realiza el recuento de mohos y levaduras en muestras de alimentos marinos. 4. Explique la toma de muestras, preparación de muestras y análisis microbiológicos de los alimentos marinos. 5.

Que microorganismos se pueden encontrar en el agua de mar, en las lagunas y ríos.

6. Busque en alguno recuento o Internet algún proyecto o trabajo de investigación relacionable a productos hidrobiologicos. 7. Cual es la finalidad del uso del medio TSI, que tipos de azucares participan en este medio y a que microorganismos permite reconocer. 8. Cual es la finalidad del uso del medio de LIA, que reacciones nos permite evaluar y que microorganismos nos permite identificar. 9.

Que pruebas se pueden realizar en el medio citrato y que microorganismos se pueden diferenciar con este medio.

10.Para que se emplea el medio de SIM, que microorganismos se pueden reconocer con éste y como. GUIA DE LABORATORIO MICROBIOLOGIA II

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11. Con que finalidad se realiza la prueba de la catalasa y la prueba del indol.


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