PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVOS 1. INTRODUCCIÓN Los microorganismos pueden ser aislados y propagados por diferentes métodos: su utilización varía según el propósito y tipo de microorganismo que se deseen aislar. Para su identificación se utilizan diferentes métodos como son el estudio de su morfología que también incluye sus reacciones frente a diferentes colorantes y el tipo de estructura que pueden poseer como endosporas, cápsula, etc. La esterilización es un método de eliminación total de todo tipo de organismo que asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente. Una esterilización deficiente o manipulación incorrecta de materiales y medios de cultivo conlleva a contaminaciones, resultados erróneos o pérdida del material biológico. Por ello, se requieren buenas prácticas de laboratorio para su adecuado manejo. La esterilización por calor seco o húmedo son los métodos que se utilizan con mayor frecuencia en el Laboratorio de Microbiología. El calor seco destruye a los microorganismos por oxidación, por ejemplo, al exponerlos directamente a la flama de un mechero o en horno a 150-180°C durante 2 horas. Estos métodos se aplican en la esterilización de asas de inoculación y para todo tipo de material de vidrio y quirúrgico. Los procesos con calor húmedo afectan la estabilidad de estructuras celulares y proteínas; se aplican para esterilizar medios de cultivo, soluciones termoestables, materiales de vidrio y cultivos bacterianos que se desechan. El equipo de uso común es la autoclave, que utiliza vapor de agua a presión (15 lb/in2); con esta presión el material alcanza una temperatura de 121 °C y si se mantiene durante 15 minutos se asegurará la inactivación de endosporas, que son las estructuras bacterianas más resistentes al calor. Para cualquiera de los casos anteriores (morfología, coloración o reacción bioquímica) se necesitan medios de cultivo adecuadamente seleccionados, preparados y almacenados. Independientemente de los medios de cultivo y métodos utilizados, el éxito del trabajo en el laboratorio de microbiología depende de la adecuada elección y buen uso de los métodos de esterilización y técnicas t écnicas asépticas.
2. OBJETIVOS
Conocer los diferentes tipos de medios de cultivo existentes para el crecimiento de microorganismos en el laboratorio.
Identificar los diferentes pasos a seguir en la elaboración de un medio de cultivo.
3. MARCO TEORICO El estudio de los microorganismos lleva consigo la utilización de una amplia gama de medios de cultivo tanto líquidos como sólidos pero previamente es necesario obtener cultivos puros de aquellos. Cualquier inoculo primario contendrá probablemente varios tipos distintos de microorganismos que darán lugar a un cultivo mixto. Efectuando una cuidadosa inoculación en un medio sólido en placa de cultivo se obtienen colonias separadas de cada microorganismo presente, cada una de las cuales procede en la mayoría de los casos de la multiplicación de un solo
microorganismo.
Una sola célula
da
origen a
una población
genéticamente homogénea y es denominada clon, colonia o cultivo puro. Entonces, un medio de cultivo es un sustrato natural o artificial o una solución de ciertos nutrientes que permiten cultivar los microorganismos de una manera más eficiente para su posterior uso en el laboratorio.
4. MEDIOS DE CULTIVO Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artifi ciales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad.
Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes. El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él. La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre
completa
se
añaden
para
promover
el
crecimiento
de
los
microorganismos menos resistentes. También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoria de las bacterias Grampositivas).
5. CONDICIONES PARA UN CULTIVO El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio.
a. disponibilidad de nutrientes adecuados
Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar. Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaban la pérdida de los factores nutritivos lábiles. Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, además, representa una fuente f ácilmente asequible de nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la peptona.
b. consistencia adecuada del medio Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio.
c. presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida),
mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.
d. condiciones adecuadas de humedad Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.
e. Luz ambiental La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos.
f. pH La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales.
g. Temperatura Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los temófilos a 80ºC o incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los saprofítos tienen rangos más amplios.
h. Esterilidad del medio Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante).
6. CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO De acuerdo a la consistencia o estado físico: a. Medios líquidos:
Son medios de cultivo que carecen de un
polisacárido denominado agar-agar extraído de algas marinas del género Gellidium sp. un medio típico es el caldo nutritivo o el caldo BHI. Al crecer en un medio líquido un microorganismo utiliza los compuestos del mismo así como excreta los productos metabólicos bacterianos en él y puesto que en el medio originalmente no contenía estos productos sirven como una ayuda para la identificación del microorganismo en cuestión. b. Medios sólidos: Estos medios son usados frecuentemente para aislar microorganismos, en los medios líquidos los microorganismos al encontrarse libres pueden desplazarse en tanto que en los medios sólidos se multiplican localmente en el punto de la inoculación y forman colonias cuya apariencia frecuentemente es típica de cada especie determinada. Para conseguir medios sólidos se agrega a un medio líquido agar en una proporción del 1.5% al 2%. Hoy en día se presenta en forma de polvo que incluye el agar, el punto de fusión de estos medios oscila alrededor de los 98ºC y se solidifica al enfriarse al 42-45ºC. La gelatina también puede emplearse como agente solidificante, se trata de una proteína obtenida a partir del colágeno de la piel, cuero, tendones, y huesos y forma un gel de buenas características a concentraciones de 12-15% en caldo nutritivo siendo su punto de fusión de 22ºC quedando destruidas sus propiedades al alcanzar temperaturas por encima de 100ºC. Una variante de los medio sólidos son los medios condensados preparados a partir de materias coagulables como el suelo o la albúmina de huevo y condensados en forma de pico de flauta a temperaturas cuidadosamente controladas en la zona de los 75ºC. c. Medio semisólidos: son medios que usualmente contienen una pequeña cantidad de agar, esta cantidad promedio es de
0.5%, estos medios
son muy usados para determinar la movilidad de un microorganismo gracias a su escaso poder retenedor, es decir, que
no impiden que el microorganismo
móvil se desplace por el medio.
Según las sustancias primarias los medios de cultivo se pueden clasificar en: a. Medios naturales: son aquellos medios empleados tal como se encuentran en la naturaleza para cultivar microorganismos, como ejemplo de estos medios encontramos la leche, los extractos vegetales o la sangre diluida.
b. Medios sintéticos: como su nombre lo indica son medios que han sido creados por el hombre y por lo tanto se conoce su formulación completamente, son utilizados para el cultivo de microorganismos coincidiendo de antemano los requerimientos nutricionales que estos organismos necesitan. podemos mencionar todos
los
Como ejemplo
medios deshidratados que distribuyen las
casas comerciales.
c. Medios semisintéticos: son medios de cultivo que llevan una mezcla de medio naturales y medios artificiales, ya que algunos de los componentes pueden ser susceptibles a los tratamientos empleados durante la elaboración de estos medios o tratamientos posteriores.
Como ejemplo de estos medios
podemos encontrar el agar Baird Parker o el agar sangre.
d. Medio vivos: son aquellos medios que contienen células u organismos vivos y que son ampliamente utilizados para demostrar reacciones susceptibles de organismos superiores en presencia de microorganismos causantes de alteraciones, también tienen importancia en el estudio y cultivo de los virus. Ejemplos de estos medios pueden ser las células de riñón de mono, huevos embrionados o células de intestino de cobayos y conejos.
De acuerdo a los nutrientes en: a. Medios simples: son medios que poseen los nutrientes mínimos para permitir el desarrollo de microorganismos menos exigentes, como ejemplo encontramos el caldo nutritivo o el agar nutritivo.
b. Medio enriquecidos: son aquellos medios a los cuales se les han incorporado sustancias que proporcionan características complementarias nutritivas
para
que
el
medio
pueda
servir
como
sustrato
para
los
microorganismos más exigentes. Estos medios, tales como agar sangre, suero o chocolate en caldo o en agar, se emplean para conseguir el crecimiento de aquellos microorganismos sensibles que no crecen en medios corrientes.
c. Medios selectivos: son aquellos medios a los que se les incorporan sustancias para
inhibir
al
crecimiento
de
la
mayor
parte
de
los
microorganismos con excepción de aquellos para los que fueron ideados, por ejemplo, el medio telurito para el bacilo productor de la difteria y el agar citratodexosicolato para los grupos de Salmonella sp y Shigella sp.
d. Medios diferenciales: son medios que contienen sustancias o indicadores que permiten la diferenciación de un microorganismo a otro. Por ejemplo, el agar Mac- Conkey permite distinguir los microorganismos fermentadores de la lactosa de los no fermentadores por la coloración que toman.
Otro ejemplo claro de estos medios es el agar sangre que permite
distinguir los microorganismos que lisan o producen hemólisis de los eritrocitos de aquellos que no son, es decir, que al mismo tiempo se pueden distinguir microorganismos productores de hemólisis alfa, beta o gamma.
e. Medio auxanográficos: son determinados medios a los que les faltan ciertos factores nutritivos. El medio, generalmente sólido se inocula con un microorganismo, y luego se distribuye por la superficie discos con diferentes compuestos nutritivos que puedan requerir los microorganismos en estudio y de esta manera determinar que nutrientes favorecen o no al desarrollo por el crecimiento del microorganismo alrededor del disco.
f. Medios para transporte o carriers: son medios sólidos o semisólidos
que pueden
contener
o
no
sustancias
selectivas.
Se
preparan para detener la viabilidad de los microorganismos durante varias horas o días, permitiendo de esta manera el aislamiento de las especies menos
resistentes después de transcurrido cierto tiempo entre la toma de la muestra y la entrega al laboratorio.
7. MEDIOS DE CULTIVOS COMUNES Son los más corrientemente utilizados, y aunque no vamos a enumerarlos todos, sí son los más conocidos en un laboratorio de Microbiología.
Agar nutritivo El Agar nutritivo es un medio de cultivo usado normalmente como rutina para todo tipo de bacteria. Es muy util porque permanece solido incluso a relativas altas temperaturas. Además, el crecimiento bacteriano en este agar lo hace en la superficie, por lo que se distinguen mejor las colonias pequeñas. En un caldo de nutrientes, la bacteria crece en el líquido, y aparece como una sustancia espesa, con colonias difícilmente observables. El agar nutritivo contiene normalmente (w/v).
10gr Peptona
0.3 % extracto de carne
0.5% NaCl
caldo
Leche 50
nutritivo
Suero 25 ml
Agua destilada 9.250 ml
13-15 gr agar agar en bacterias y 18-20 gr en hongos
pH casi neutro (6.8) a 25 °C.
Agar C.L.E.D. El medio C.L.E.D. (Cistina Lactosa Electrólito Deficiente) está recomendado
para el recuento e identificación presuntiva de los microorganismos de las vías urinarias. Su bajo contenido en electrolitos evita la invasión de los cultivos por Proteus. La presencia de lactosa en su composición le confiere el carácter de medio diferencial, aunque la interpretación sea diferente al anterior medio por la incorporación de
otro
indicador: el
azul de
bromotimol. Las
colonias
lactosa positivas aparecerán de color amarillo y las lactosa negativas lo harán con un color verdoso, blanco o azulado.
Agar S.S. Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas especies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche su presencia.
Agar Hektoen Es un medio más diferencial y menos selectivo que el agar SS. Se utiliza para facilitar el
aislamiento de
las
azúcares (lactosa, sacarosa y
enterobacterias. La presencia de tres salicilina )
permiten ampliar el
poder
diferencial de este medio. Este medio es capaz de detectar los gérmenes formadores de SH2, igual que el SS.
Las cualidades del agar Hektoen se deben a su riqueza en peptonas y azúcares, que neutralizan el efecto inhibidor de las sales biliares respecto a ciertos gérmenes de cultivo delicado (Shigella en particular).
C.P.S. ID3. Medio cromogénico desarrollado por Biomerieux, que permite la identificación de E. coli, P. mirabilisy E. faecalis, con la simple visualización del cambio de color de la colonia sobre el medio (rojo burdeos, azulo marrón). La identificación solo requiere la adición de un reactivo para confirmar o descartar la especie sospechada. Otros microorganismos diferentes requieren los sistemas de identificación habituales (API, p. ej) Granada, Islam o New GBS: Medios utilizados para detección de Streptococcus agalactiae, mediante la utilización de un sustrato cromogénico específico de este microorganismo.
8. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Siempre es recomendable y se incluye como una regla básica la de leer las instrucciones de las etiquetas de los medios de cultivo, por ello no se recomienda reenvasar los medios sino, mantenerlos en los recipientes originales.
Para lograr una preparación adecuada de los medios de cultivo es recomendable seguir las siguientes instrucciones:
Preparación de la solución Los medios de cultivo deben ser mezclados o hidratados en recipientes limpios, libres de detergente y su volumen debe ser el doble de la cantidad que se vaya a preparar. El agua que se utiliza para su mezclado o reconstitución debe ser destilada o desmineralizada. Para su preparación primero debe calcularse la cantidad total y determinar la cantidad de los componentes básicos de los medios que deben ser preparados con elementos individuales o en el caso de los medios deshidratados pesarse la cantidad deseada del medio de cultivo, mezclar con aproximadamente la cantidad del volumen total requerido de agua y agitar vigorosamente hasta obtener un dilución homogénea, luego agregar el resto de agua para enjuagar de las paredes del recipiente el material adherido. Los medios de cultivo que no contienen agar ni gelatinas, (líquidos) pueden ser disueltos en agua fría o ligeramente caliente. Pero si contienen alguna de las dos sustancias deben ser calentados hasta ebullición para solubilizar el agar. Nunca sobre calentar porque se puede alterar su composición. Los medios que presentan turbidez debido a sus componentes insolubles, deben ser agitados para homogeneizarlos adecuadamente. Normalmente si se trabaja con agua neutra el pH debe coincidir con el rótulo del medio comercial, pero si no es así debe corregirse adicionando NaOH ó HCl0.1N, a una muestra de volumen conocido y calcular el pH para añadir ácido base en la proporción correspondiente para lograr el pH adecuado. Antes de distribuirlo en los recipientes definitivos, enfriar a 50ºC-60ºC, ya que el agar hirviendo es peligroso de manejar, puede rajar el vidrio frío y dar lugar a condensaciones excesivas.
Además, mezclar bien los componentes
insolubles que en algunos casos son parte integral de la formulación y deben ser suspendidos adecuadamente durante su distribución.
9. ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES
Antes de comenzar desinfectar la mesada de trabajo con etanol 70º.
Encender el mechero.
Realizar todos los procedimientos dentro del cono de esterilidad generado por la llama del mechero.
Evitar toda corriente de aire que pueda distorsionar el área de esterilidad cercana al mechero (movimientos bruscos, hablar, toser, puertas o ventanas abiertas, etc.).
El ansa se esteriliza en forma vertical sobre la llama del mechero antes y después de usarla. Recordar dejar enfriar el ansa estéril cerca del mechero antes de usarla.
Rotular siempre las placas y tubos de forma clara.
Al finalizar el trabajo dejar el lugar de trabajo limpio y ordenado.
Se esteriliza por autoclave o por ebullición de acuerdo a las instrucciones para cada
preparación.
Los
tiempos
y
temperaturas
recomendados
están
relacionados con las temperaturas alcanzadas en el medio y el tiempo en el que se mantengan a la temperatura especificada. Cuando se esterilizan volúmenes grandes de medio se debe aumentar el tiempo de esterilización para permitir la penetración del calor al interior del recipiente.
Los autoclaves
varían
en
su
feribilidad
de
calor
y
por
consiguiente, se debe comprobar colocando pares térmicos en los recipientes del medio o cintas indicadoras de esterilidad. La capacidad de los recipientes debe ser lo suficiente para permitir un amplio espacio cuando se sube la espuma.Los cierres de rosca deben estar media vuelta flojos para permitir el flujo de vapor durante el calentamiento por calor. Estos cierres se aprietan firmemente cuando se haya completado su
esterilización. Lo mismo tapones de algodón y gasa deben estar flojos antes y apretarse generalmente luego de la esterilización. Los recipientes deben estar libres de álcalis para impedir la alteración del pH del producto.
No se deben
retirar
del
esterilizador mientras aún estén
calientes, puesto que un cambio brusco en la presión de vapor interna de los recipientes puede dar lugar a ebulliciones explosivas. Todas las instrucciones que indiquen adicionar un reactivo compuesto estéril en el medio después de autoclavado, se deben realizar teniendo en cuenta las precauciones asépticas. Cuando va a adicionar una cantidad importante de enriquecimiento o de inóculo líquido, la cantidad se debe resta al volumen inicial de agua destilada requerido para la reconstitución del medio. De esta manera no se altera la concentración de los ingredientes de la fórmula original, ni tampoco la resistencia del gel de agar en las preparaciones. Cuando un medio de cultivo con un pH de 5 contiene agar, debe ser manejado con mucho cuidado para evitar la hidrólisis del agar ya que la mezcla del calor y la acidez disminuyen la esterilidad del gel.
Servido de los medios de cultivo Una vez estéril los medios de cultivo debe ser enfriados a temperatura promedio de 45º - 55ºC para ser adicionados en los recipientes finales teniendo en cuenta nuevamente las técnicas asépticas.
10. PRUEBA DE ESTERILIDAD DE MATERIALES
Abrir una caja Petri de AN, EMB y PDA, así como un tubo de CN y PDA durante 1 minuto en zonas no asépticas (patio, aulas, comedor) y etiquetarlas.
Abrir una caja Petri de AN, EMB y PDA, así como un tubo de CN y PDA durante 1 minuto en zona aséptica (cerca del mechero) y etiquetarlas.
Colocar los tubos y las cajas Petri en una incubadora ajustada a 30ºC durante 24-48 horas. Las cajas Petri se colocarán con la tapa hacia abajo.
Revisar los tubos y cajas Petri para detectar la presencia de contaminantes, por la aparición de turbidez, nata superficial y/o depósito de material en el fondo de los tubos con medio líquido, así como la
formación de colonias microbianas en la superficie de los medios sólidos.
11. BIBLIOGRAFÍA
Brook Th. 1999. Biología de los Microorganismos. 8ª. Mac Graw Hill.
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm
http://perso.wanadoo.es/sergioram1/medios_de_cultivo.htm
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http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/salmoshigagar.htm
http://www.panreac.es/pdf/ManualCultimed_completo.pdf
http://www.scharlab.com/docs/ebooks/descargarpdf.php?id=6
http://www.condalab.com/
Negroni, Martha. microbiología estomatología 2ªed. 2009. Pág. 551 a 560
Seminarios de Microbiología – 1er Bloque – Medios de cultivo