PRINCIPALES ENZIMAS DE LA MIEL INTRODUCCIÓN La miel es una sustancia natural producida por las abejas ( Apis mielifera) a partir del néctar de las flores o de secreciones de partes vivas de plantas. Esta contiene al menos 60% de azucares y no mas de 21% de humedad, de acuerdo a Ajlouni y Sujirapinyokul (2010), esta composición es ampliamente influenciada por la región y las condic condicion iones es climát climática icas. s. La miel miel como como product producto o natural natural contien contiene e difere diferente ntess enzimas, lagunas producidas por la abeja y otras proporcionadas por la sustancia de su proce procede denci ncia a (néct (néctar, ar, pole polen, n, flui fluidos dos de plant plantas) as),, entre entre las más más impo import rtant antes es podemos encontrar enzimas como las amilasas, invertasas, glucosidasas, catalasas y fosfatasas. Según Ureña, Arrieta, Umaña, Zamora y Arias Echandi en el 2007, la miel como cualquier producto alimenticio debe cumplir con ciertas normas de calidad, propi propieda edade dess organ organol olépt éptic icas, as, fisi fisico coquí quími mica cass y micro microbi biol ológi ógica cas, s, entr entre e esto estoss se destacan destacan como lo indica indica Voldric Voldrich, h, Rajchl Rajchl,, Cizkova Cizkova y Cuhra Cuhra (2009), (2009), la activi actividad dad de dias diasta tasas sas (α-β(α-β-γγ- amil amilas asas) as) y la relaci relación ón de esta esta enzi enzima ma con con el conte conteni nido do de Hidrometilfurfural (HMF) que según Ureña Varela, Arrieta Bolaños, Umaña, Zamora y Arias Echandi en 2007, indican adulteración, sobrecalentamiento y envejecimiento de una muestra de miel.
DIASTASA (α-, β-, AMILASA) La α-amilasa (1,4-α-D-glucano-glucanohidrolasa o glucogenasa) tiene la función de romper las cadenas de almidón al azar produciendo dextrinas y β-amilasa (1,4-α-Dglucano-maltohidrolasa o amilasa sacarogénica)
Grafico 1: Acción enzimática de la diastasa. Enzimas de la miel 2010
Según Según la proposi proposició ción n del Codex Codex Alimen Alimentar tario io (2001), (2001), existen existen dos indica indicadore doress de calidad en la miel, el 5-hidrometilfurfural y la actividad de la amilasa (diastasa), los cuales ayudan a identificar cuando una miel es adulterada, esto de acuerdo con (Voldrich, Rajchl, Cizkova y Cuhra 2009) puede ser producto de daño por calor excesivo, adición de diferentes tipos de azucares como sacarosa invertida, jarabe de maíz de alta fructosa, e incluso azúcar de cocina, hacen que la concentración de HMF aumente y el numero diastasico disminuya, debido a que si la miel es tratada por un tiempo prolongado en calor, la actividad enzimática se reduce y a un menor número diastasico, menor la calidad del producto en el mercado. Existen varios métodos que se han ido desarrollando par detectar y cuantificar la actividad enzimática de la diastasa entre los principales tenemos: •
Según lo planteado por Ajlouni y Sujirapinyokul en 2010, la evaluación de
la actividad de la amilasa (α-amilasa), se toma una muestra de 5g de miel tratada con calor, se disuelven con 15 ml de agua Mili-Q y 5 ml de una solu soluci ción ón buff buffer er de acet acetat ato o de pH 3.5, 3.5, esto esto se tran transf sfie iere re a un fras frasco co
volumétrico que contiene 3 ml de solución de cloruro de sodio y se lleva a volumen. Usando una pipeta volumétrica, 10 ml de la solución son trasferidos a un frasco de 50 ml y puestos en baño de agua a 40ºC con un segundo frasco frasco que contien contiene e 10 ml de solución solución al 1% de almidó almidón. n. Después Después de 15 minutos, alicotas de 5 ml de la solución de almidón son agregados a la solución de miel, mezclados y medidos. En intervalos periódicos, para un primer tiempo de 5 minutos, alicotas de 0,5 ml de la mezcla son diluidos en 5 ml de solu soluci ción ón de yodo odo (I2KI) KI) y 22 ml de agua agua Mili ili-Q, -Q, mezc mezcllados ados e inmediatamente medidos a 660 nm contra un blanco de agua. Una grafica de absorbancia contra tiempo es usada para determinar el tiempo t x, en el que una absorbancia especifica de 0,235 fue medida. •
El número diastasico es calculado siguiendo los métodos establecidos por
la Comisión internacional de miel en el 2002, en los cuales se plantea la unidad Gothe es definida como el monto de enzima que puede convertir 0,01 gramos de almidón antes de prescribir el punto final en una hora a 40ºC bajo las condiciones del test. La solución de almidón reacciona formando un complejo con el yodo, de un color característico, el cual va disminuyendo por la acción de la diastasa (α-amilasa), lo que ocasiona una perdida de color. La ecuación para el calculo del número de diastasa es:
Figura 2: Calculo del número diastasico. International Honey Commission 2002. El método establecido establecido por la comisión Internaciona Internacionall de miel esta basado en el trabajo original de Schade et al (1958). El procedimiento procedimiento de detección detección de adición de azucares azucares u otros diluyentes diluyentes por medio del número número diasta diastasic sico o puede puede ser reducid reducido o median mediante te la agregaci agregación ón de amilas amilasas as
foráneas, foráneas, para evitar esto, esto, Voldrich, Voldrich, Rajchl, Rajchl, Cizkova y Cuhra (2009), (2009), plantean la comparación del número diastasico para diferentes sustratos. Existe una relación directa entre los métodos de conservación y la calidad de este valioso producto, el HMF es el resultado de un sobrecalentamiento para lograr la perdida de humedad, aunque su producción es my común al pasar la miel por grandes periodos de almacenaje, de acuerdo a Ajlouni y Sujirapinyokul (2010) el alma almace cena naje je a una una temp temper erat atura ura de 20 ºC aume aument nta a el HMF HMF en ± 1mg por cada kilo kilogr gram amo o mens mensua ualm lment ente. e. La adul adulte terac ració ión n de miel mieles es por adic adició ión n de azuca azucares res invertidos, aumenta los niveles de HMF, los cuales son altamente tóxicos para las abejas. La comisión internacional de miel (2002), establece la determinación de HMF, mediante el uso del método de Jeuring y Kupers (1980), por medio de HPLC en fase inversa con detección de UV, la señal producida producida es comparada comparada con algunos estándares de concentración conocida, mediante el siguiente cálculo:
Figura 3: Calculo de la concentración de HMF. International Honey Commission (2002). INVERTASA La invertasa es una de las enzimas más importante en el desarrollo del producto final, ya que esta según Kotwal y Shankar en 2009 esta enzima realiza muchas de las transformaciones químicas del néctar, este tipo de enzimas (β-D-fructofuranosida fructohidrolasa, β-fructofuranosidasa, sacarasa) cataliza la hidrólisis de sacarosa y glucósidos relacionados a simples carbohidratos (fructosa y glucosa), lo que aumenta el conte conteni nido do de azúca azúcarr sin sin crist cristal aliz izac ació ión n del del mism mismo o reacc reacció ión n orig origin inad ada a por las las glándulas hipofaringeas de la abeja mielifera ( Apis mielifera). Esta enzima tiene un
gran valor comercial, principalmente la extraída de Saccharomyces sp., pero su uso comercial comercial es limitado limitado por los altos costos de producción producción y su poca estabilida estabilidad d frente a cambios de factores como pH, Temperatura y presión osmótica. Para su detección y cuantificación la comisión internacional de miel en el 2002, plantea el uso del método Signthaler (1977), expresando en unidades, donde una unidad es definida como el número de micromoles de sustrato destruidas por minuto y expresadas por kilogramos de miel. Para esta prueba se usa como sustrato el pnitrof nitrofenol enol-α-D -α-D-gl -gluco ucopira piranosi nosido do (pNPG) (pNPG) el cual cual es transf transforma ormado do en glucosa glucosa y pnitrofenol. La reacción enzimática es detenida en un pH de 9.5 y al mismo tiempo el nitrofenol es transformado a anión nitrofelato, que corresponde a la cantidad de sustrato convertido y es determinado por fonometría a 400 nm. El cálculo de la actividad de la invertasa o numero invertasico se calcula de la siguiente manera:
Figura Fig ura 4: Cálcul Cálculo o del número número invert invertasi asico. co. Intern Internati ationa onall Honey Honey Commis Commissio sion n 2002 GLUCOSA-OXIDASA Según Pontoh y Low (2002) la β-Glucosidasa (β-d-glucoside glucohidrolasa) hidroliza los
puente puentess 1,4-β-G 1,4-β-Gluco lucosa sa dejando dejando β-d-glu β-d-glucosa cosa de oligo oligo y polisa polisacár cáridos idos.. Esta Esta
enzima se ha descubierto en plantas, animales hongos y bacterias. En los insectos la β-glucosidasa se subdivide en tres clases de acuerdo aun sustrato especifico. La clas clase e I incl incluye uye enzi enzima mass con acti activi vidad dad β-gl β-gluc ucos osid idasa asa y aril aril β-gl β-gluco ucosi sida dasa, sa, estas estas enzimas tiene la capacidad hidrolizar celubiosa, lactosa, β-p-nitrofenil-glucosidasa (βPNPG PNPG), ),
β-pβ-p-ni nitr trof ofen enililga gala lact ctos osid idas asa a
(β-P (β-PNP NPGa Gal) l),,
β-pβ-p-ni nitr trof ofen enililfr fruc ucto tosi sida dasa sa
(β(β-
pPNP pPNPFr Fru) u) y otros otros sustr sustrat atos os simi simila lares res.. La clas clase e 2 incl incluye uye solo solo los los que que posee poseen n actividad actividad glicosil β-glucosidasa, β-glucosidasa, sin embargo embargo ella solo puede hidrolizar sustratos sustratos con celubi celubiosa osa y lactos lactosa. a. La clase clase 3 incluy incluye e enzima enzimass con solo activi actividad dad aril (o alkil) alkil) βgluc glucos osida idasa sa,, estas estas enzim enzimas as tien tiene e una una activ activid idad ad simi simila larr a la β-PNP β-PNPG, G, así así como como sustratos similares. La identificación hecha por Pontoh y Low (2002), para la detección de actividad βglucosidasa en la miel, y como esta actividad esta correlacionada con la formación de puentes tipo β-O-glicosid β-O-glicosidicos, icos, detectan detectan la presencia presencia de actividad β-glucosidasa β-glucosidasa en el intestino intestino medio y posterior de la abeja melífera melífera ( Apis mielifera). El origen de la activi actividad dad β-glucos β-glucosida idasa sa en miel no ha sido sido totalmen totalmente te identi identific ficado, ado, pero puede puede porvenir de la abeja de la miel, luego la β-glucosidasa puede estar presente en el saco de miel y los órganos segregan enzimas digestivas a la boca. Muchas glándulas descargan secreciones en las partes bucales de la abeja, algunas torácicas, de la cabeza y de las glándulas hipofaringeas, pueden relacionarse con la actividad βglucosidasa en la miel
Estudios recientes como los realizados por Zhang, Zheng, Shen en 2007, muestran la localización de la la glucosidasas tipo I esta presente en ventrículo, la glucosidasas de tipo II esta presente en ventrículo y hemolinfa y la glucosidasas tipo III esta presente en glándulas hipofaringeas. En abejas obreras, la glándula hipofaringea hidroliza la sacarosa presente en el néctar, la glucosa y la fructosa mediante αglucosidasa, la estructura de la glucosidasa presente en las glándulas hipofaringeas de la abeja de la miel, son muy similares a las presentes en mosca de la fruta y mosquito Los métodos para la detección y cuantificación de la glucosidasa de acuerdo con lo establecido por Pontoh y Low en 2002, se baso en el método Low (1986) en el cual un volumen seleccionado de muestra fue diluido con una muestra buffer a un volumen total de 0,1 ml y fue añadido de 1 a 2 ml de β-PNPG 0,02 M en un buffer de acetato acetato 0,1 M a un pH 5,0 en un tubo de prueba. Esta Esta mezcla fue incubada en baño de agua (35 ºC) por 20 minutos. A esta solución se le agrego 0,01 ml de buffer Tris 3 M y pH 10,0 0,0. Despues de enfri nfriar arsse, la solu olución fue transferida rida en un espectofotometro y la absorbancia fue medida a 400 nm. De la mism misma a mane manera, ra, se real realiz iza a una una prue prueba ba para para dete determ rmin inar ar la pres presenc encia ia de glucos glucosidas idasas, as, median mediante te la producc producción ión de peroxid peroxido o de hidroge hidrogeno. no. Se toam toam una muestra de 10 gr de miel y se diluye en 40 ml de agua Mili.Q a una temperatura de 20ºC. luego de una hora se mide el máximo de peroxido de hidrogeno producido mediante Marckoquant hydrogen-peroxide testtrips Nr. 10.011. Se compara el color de la tira con la escala de 0 a 25 mg de peroxido/litro, este valor se multiplica por 5 para determinar la cantidad de microgramos de peroxido, creados por 1 gramo de miel en una hora Una unidad de β-glucosidasa es definida como la cantidad de enzima requerida para producir un µmol de p-nitrofenol por minuto en las condiciones del ensayo.
CATALASA Como Como lo plante plantea a Weston Weston (2000), la sustanc sustancia ia identi identific ficada ada en la miel miel con mayor mayor propiedad antibacterial es el peroxido de hidrogeno, el cual es producido por la enzima glucosa oxidasa, cuando la miel esta diluida. La catalasa descompone el peroxido de hidrogeno en agua y oxigeno, esta enzima también se encuentra en la miel, pero es originada por el polen de las flores, mayormente, aunque existen pequeños rastros de catalasa en néctar.
Figura 5: Reacción de la catalasa. Enzimas presentes en la miel 2010.
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