Ingeniería bioquímica UGR 2012-2013 Javier Fuertes Martín José Antonio Olivares Peña Miguel Ruiz Bailón
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INDICE 1. INTRODUCCION A LA BIOTECNOLOGIA 1.1.
Historia.
1.2.
Principales compañías y productos de la industria biotecnológica.
2. PRODUCCION DE PROTEINAS PROTEINAS RECOMBINANTES RECOMBINANTES CON E.coli. E.coli. 2.1.
E.coli; fisiología y metabolismo. 2.1.1. Oxidación de la glucosa. 2.1.2. Fermentación de la glucosa. 2.1.3. Oxidación del acido acético.
2.2.
Aspectos genéticos E.coli; técnicas rADN.
2.3.
Interferón: clasificación y acción.
3. DISEÑO DEL PROCESO 3.1.
modos de cultivo.
3.2.
Aspectos generales del proceso. 3.2.1. Medio de cultivo. 3.2.2. Alimentación.
3.3.
Condiciones de operación y control.
3.4.
Proceso de purificación 3.4.1. Formación, aislamiento aislamiento y caracterización caracterización de IB. 3.4.2. Purificación de proteínas desnaturalizadas. desnaturalizadas. 3.4.3. Renaturalización de proteínas a conformación conformación bioactiva. 3.4.4. Mejora de las moléculas bioactivas. 3.4.5. Técnica purificación purificación seleccionada seleccionada para IFN- α.
4. SIMULACION DINAMICA: 4.1.
Modelo complejo.
4.2.
Modelo simplificado
5. ANEXO 1: diagrama proceso. 6. BIBLIOGRAFA 2
INDICE 1. INTRODUCCION A LA BIOTECNOLOGIA 1.1.
Historia.
1.2.
Principales compañías y productos de la industria biotecnológica.
2. PRODUCCION DE PROTEINAS PROTEINAS RECOMBINANTES RECOMBINANTES CON E.coli. E.coli. 2.1.
E.coli; fisiología y metabolismo. 2.1.1. Oxidación de la glucosa. 2.1.2. Fermentación de la glucosa. 2.1.3. Oxidación del acido acético.
2.2.
Aspectos genéticos E.coli; técnicas rADN.
2.3.
Interferón: clasificación y acción.
3. DISEÑO DEL PROCESO 3.1.
modos de cultivo.
3.2.
Aspectos generales del proceso. 3.2.1. Medio de cultivo. 3.2.2. Alimentación.
3.3.
Condiciones de operación y control.
3.4.
Proceso de purificación 3.4.1. Formación, aislamiento aislamiento y caracterización caracterización de IB. 3.4.2. Purificación de proteínas desnaturalizadas. desnaturalizadas. 3.4.3. Renaturalización de proteínas a conformación conformación bioactiva. 3.4.4. Mejora de las moléculas bioactivas. 3.4.5. Técnica purificación purificación seleccionada seleccionada para IFN- α.
4. SIMULACION DINAMICA: 4.1.
Modelo complejo.
4.2.
Modelo simplificado
5. ANEXO 1: diagrama proceso. 6. BIBLIOGRAFA 2
1. INTRODUCCION A LA BIOTECNOLOGIA
1.1. Historia.
Se puede definir la biotecnología como el uso de un organismo vivo para producir un producto o ejecutar un proceso. Aunque popularmente se crea que la biotecnología es un sector nuevo, sus raíces las encontramos hace más de 6000 años con la fermentación de la cerveza. La palabra biotecnología en sí, se remonta a 1917 cuando se comienza a cultivar a gran escala microbios y microorganismos. Algunas definiciones más estrictas se refieren a la biotecnología biotecnología sólo como la ingeniería genética y la tecnología de ADN A DN recombinante. La ingeniería genética se convirtió en una realidad cuando por primera vez se utilizó para fabricar una proteína humana en una bacteria. En 1978, en el laboratorio de Herbert Boyer en la Universidad de California en San Francisco, se descubrió una versión sintética del gen de la insulina humana y se insertó en una bacteria Escheria coli. A partir de este momento la biotecnología se ha ido desarrollando de tal forma que se ha convertido en una herramienta clave para diagnósticos y terapias clínicas. El término de biotecnología fue ideado por Karl Ereky, un ingeniero húngaro, en 1919. Lo definía como el proceso en el cual los productos son producidos a partir de materias primas con la ayuda de organismos vivos. Ereky prevé una edad bioquímica similar a la edad de piedra y hierro. El hombre desde siempre ha estado manipulando seres vivos para solucionar problemas y mejorar su forma de vida. Las plantas y los animales se fueron f ueron criando selectivamente y los microorganismos se usaron para hacer alimentos tales como bebidas, queso y pan. A finales del siglo XVIII y principios del XIX llegaron las vacunas pero fue a finales f inales de este siglo cuando se descubrieron los microorganismos, se llevó a cabo cabo el trabajo de Mendel sobre genética genética y se investigaron sobre el proceso de fermentación y otros procesos microbianos de la mano de Koch, Pasteur y Lister. A comienzos del siglo XX XX se empezaron a unir la industria con con la agricultura. Durante la Primera Guerra Mundial, se desarrollaron procesos de fermentación para producir acetona a partir de almidón de disolventes y pinturas para la industria automotriz de rápido crecimiento. En1930 se orientó hacia el uso de 3
excedentes de productos agrícolas para abastecer a la industria en lugar de importaciones. La llegada de la Segunda Guerra Mundial trajo la fabricación de la penicilina. El foco biotecnológico se trasladó a los productos farmacéuticos. Los años de la “guerra fría” estuvieron dominados por el trabajo con
microorganismos para la preparación de una posible guerra biológica, así como la investigación en antibióticos y en procesos de fermentación. La biotecnología moderna o la biotecnología de segunda generación surgieron a partir de la biología molecular y la ingeniería genética, la cual surgió después de la Segunda Guerra Mundial. Se trataba de la integración de la microbiología a la bioquímica y a la ingeniería química de fermentación a gran escala, al tratamiento de aguas residuales, así como para aplicaciones en la industria química y farmacéutica. Actualmente la biotecnología biotecnología se utiliza en muchas áreas tales tales como la agricultura, biorremediación, procesamiento de alimentos y la producción de energía. La producción de insulina y otros medicamentos m edicamentos se lleva a cabo a través de clonación de vectores que llevan l levan el gen escogido. Los inmunoensayos se están utilizando no sólo en la medicina para el nivel de drogas y pruebas de embarazo, sino también por los agricultores para ayudar en detección de niveles peligrosos de pesticidas, herbicidas y toxinas en los cultivos y en los productos de origen animal. Estos ensayos también proporcionan pruebas de diagnóstico de campo de productos químicos industriales en las aguas subterráneas, sedimentos y el suelo. En la agricultura, la ingeniería genética se está utilizando uti lizando para producir plantas que son resistentes a los insectos, malezas y enfermedades de las plantas. Las nuevas técnicas biotecnológicas han permitido a los científicos manipular las características deseadas. Antes de la promoción de los métodos de ADN recombinante, los científicos se limitaban a las técnicas de su época (polinización cruzada, crianza selectiva, pesticidas y herbicidas). La biotecnología actual tiene sus "raíces" en la química, la física y la biología. El avance de las técnicas bioquímicas han dado lugar a tres grandes ramas: ingeniería genética, técnicas de diagnóstico, y técnicas de células-tejidos. Ahora los científicos pueden pueden manipular el ADN, el bloque de construcción construcción fundamental de la vida. Los primeros resultados van desde l a fabricación de medicamentos de ingeniería genética hasta la clonación de la oveja Dolly. Con la finalización del proyecto del genoma humano, el siguiente paso será ser la identificación de nuevos tipos de medicamentos. Se espera que el número de fármacos identificados, probados y comercializados aumenten seis veces en los próximos 20 años.
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1.2. Principales compañías y productos de la industria biotecnológica.
Existen cerca de 500 productos biotecnológicos desarrollados o en desarrollo a nivel mundial. Mediante la ingeniería i ngeniería genética, los vegetales se pueden utilizar para producir farmacológicamente proteínas activas, incluyendo l os anticuerpos de mamíferos, sustitutos de productos sanguíneos, vacunas, hormonas, citocinas, y otros agentes terapéuticos. La eficiente pro ducción biofarmacéutica en vegetales implica la selección apropiada de la propia planta y del sistema de expresión génica. Las cuestiones de seguridad y salud del producto es uno de los temas más importantes para pacientes, trabajadores y el público en g eneral. Por ello deben ser abordados, y debe existir una adecuada regulación y supervisión del producto antes de comercializarlo. Las compañías de productos farmacéuticos tienen un gran potencial, y pueden ser la base de producción una importante variedad de productos biofarmacéutica nuevos. Centrándonos en el tema fundamental de este estudio, los interferones, algunos de los productos más comercializados son: Acctimmune (gamma interferón) por Genentech, Inc. Intron A (alpha-interferon) por Schering-Plough Corp. Procrit (epoetin Procrit (epoetin alfa) por Ortho Biotech. Roferon-A (recombinante alfa-interferón) por Hoffman-La Roche. De los 187 fabricantes biofarmacéuticos y las organizaciones de fabricación por contrato (CMOs) que respondieron a la encuesta llevada a cabo por BioPlan Associates Inc en 2005, 2005, el 53% se dedicaron a la gran producción producción de cultivo de células, el 42% estuvieron involucrados en la fermentación ferment ación microbiana a gran escala para fines terapéuticos, el 30% a la fabricación por contrato, y el 27% a la fabricación por contrato de otros productos biofarmacéuticos.
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Figura 1. Áreas de trabajo de las industrias bioquímicas que se
sometieron a la encuesta de BioPlan Associates, Inc en 2005 Cerca del 60% de los encuestados eran de los Estados Unidos, el 29% Europa representa de encuestados. Otros países representados en la encuesta incluyen: Cuba, España, Finlandia, Francia, Irlanda, Israel, Ital ia, Portugal, Eslovenia, Suecia y Suiza.
Figura 2. Localización de las empresas biofarmacéuticas encuestadas.
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2. PRODUCCION DE PROTEINAS RECOMBINANTES “ Once we understand the biology of Escherichia coli, we will understand the biology of an elephant” .
Jaques Monod A finales de 1960 el desarrollo de técnicas para la manipulación genética “in vitro” permitió la expresión de genes en células microbianas, estableciéndose las bases de la producción, para E.coli, de proteínas bioactivas que hasta el momento no se habían podido aislar. La comercialización de estas proteínas requiere desde el punto de vista de la producción industrial de: -
Un cultivo recombinante genéticamente estable. Un proceso fermentativo de alta productividad. Bajo coste en su aislamiento y purificación.
La elección de la bacteria E.coli como “biofabrica”, esto es, para la expresión de genes heterólogos, se debe principalmente (Blight and Holland) a: -
Facilidad de manipulación genética. Rápido crecimiento. Secuencia genómica completa. Rutas metabólicas conocidas.
Aunque la E.coli no se puede usar para producir proteínas largas o complejas, si es posible para otras proteínas de alto valor como el interferones o hormonas. La producción de proteínas con esta bacteria requiere de un control exhaustivo en las condiciones del proceso fermentativo para lograr un buen rendimiento y obtener altas concentraciones del producto.
2.1. E.coli; fisiología y metabolismo. La E.coli fue descubierta en 1885 por un bacteriólogo alemán llamado Theodore Escherich. Es una bacteria Gram negativa, lo que significa que posee una pared celular intermedia o periplasma entre las dos membranas; interna y externa. La acumulación de proteínas recombinantes en esta bacteria se produce en el citoplasma aunque también puede darse en el periplasma o ser secretadas al medio extracelular. 7
Los principales inconvenientes en la obtención de altos rendimientos para la acumulación de proteínas recombinantes en el citoplasma son (Blight and Holland): -
Degradación proteica. Dificultades en la purificación. Y sobre todo la formación de “orgánulos de inclusión (IB)”.
Los IB son agregados intracelulares de polipéptidos, que se producen debido al mal plegamiento de proteínas ocasionado a su vez por la existencia de áreas hidrofobicas y de interacciones intermoleculares tipo unión sulfuro (Villaverde A. et al.). Suelen presentar nula actividad biológica (excepto algunos IB enzimáticos), son partículas densas e insolubles que necesitan de un tratamiento especial para su conversión a la forma activa por desnaturalización y desdoblamiento.
Micrografía de células E.coli produciendo proteína betagalinsulina (x17,500). Las flechas indican los IB. De William et al.extraido de Asok M.et al.
La E.coli es una bacteria facultativa anaeróbica, corta y con forma de bacilo. Como mesófila puede crecer en un rango de temperaturas de 8-48ºC con una 8
velocidad de crecimiento máximo a 39ºC y con una actividad acuosa de 0.95, tolera bien ambientes ácidos y puede crecer a valores de pH desde 4 a 10. La E.coli puede desarrollarse en diferentes substratos en presencia o no de oxígeno. La glucosa es el sustrato más común ya que se metaboliza fácilmente, proporcionando la fuente de carbono y la energía para la biosíntesis. Para una mejor comprensión del comportamiento del microorganismo se describen a continuación algunos aspectos relacionados con su metabolismo.
2.1.1. Oxidación de la glucosa. Se produce la glucolisis en condiciones aeróbicas en las que parte de la glucosa se oxida a dióxido de carbono con oxígeno como aceptor terminal de electrones. Este proceso es exergético y permite la formación de ATP, el cual es requerido en la biosíntesis de los constituyentes celulares. La reacción global para la oxidación de la glucosa es:
Hay que tener en cuenta que en esta ecuación química no se incluye la utilización de la glucosa para la ruta de biosíntesis. 9
2.1.2. Fermentación de la glucosa. Cuando se produce un exceso de glucosa o hay condiciones anaeróbicas, la glucosa puede reaccionar vía fermentativa después de la etapa de glucolisis, se convierte en metabolitos ácidos como: succinato, formico, acetato, lactato, etanol e hidrogeno gas. De entre todos los productos de la fermentación el ácido acético es el más abundante. Ignorando la utilización anabólica de la glucosa la reacción general para la fermentación de la glucosa es:
Se ha demostrados que un elevado flujo de glucosa a la célula y la alta velocidad de crecimiento consecuente, inducen la producción de ácido acético. El valor crítico para el consumo de glucosa depende de: la cepa bacteriana, las condiciones y composición del medio de cultivo. (Isabel C.A.) La producción de ácido acético en fermentaciones aeróbicas de la E.coli constituye uno de los mayores problemas impidiendo alcanzar un alto rendimiento y productividad. La acumulación de ácido acético en el medio provoca, entre otras, la reducción en la producción de proteínas recombinantes.
2.1.3. Oxidación del ácido acético. Si la concentración de ácido acético no se encuentra en niveles de inhibición y la capacidad del ciclo TCA (ciclo ácido tricarboxilico) no está cubierta con glucosa, el acético se usa como fuente de carbón secundaria prolongando la vida de la célula. 10
En sistemas fed-batch se produce consumo de ácido acético por las células, no está catabólicamente reprimido de manera que las células pueden crecer en medio compuesto de una mezcla de glucosa y ácido acético siempre que no se sobrepase la capacidad oxidativa de las células. En sistemas discontinuos la glucosa limita el uso celular del ácido acético exógeno que se consume solo cuando se ha agotado la glucosa.
2.2. Aspectos genéticos E.coli. De acuerdo con el Instituto Americano de Salud las técnicas de recombinación genética (rADN) comprenden; generalmente, la formación de moléculas recombinantes de ADN uniendo fragmentos de ADN naturales o sintéticos a moléculas de ADN originales, con la capacidad de replicarse. Los procesos de recombinación in vitro hacen posible separar genes específicos de la cadena de ADN mediante el uso de encimas de restricción y unirlas o parearlas de forma controlada. A continuación se muestra un esquema del proceso.
Una de las técnicas empleadas para llevar a cabo la clonación de genes consiste en moverlos de un genoma complejo a otro más simple, para ello una vez aislada la secuencia de interés, se incorpora esta a un vector de clonado. Resultando una molécula con ADN propio y capacidad de reproducirse, que 11
introduce ADN extraño producto de la recombinación (rADN) en una célula hospedadora. El tipo de vectores de clonado más habitual para E.coli son los plásmidos. Son organismos con ADN (extracromosómico) que se encuentran normalmente en las bacterias y que pueden reproducirse fuera de la célula hospedadora. El vector plásmido se fabrica con plásmidos naturales eliminando los segmentos innecesarios y añadiendo las secuencias deseadas. Posee de esta manera las secuencias genéticas que expresan, en este caso, la producción de proteínas y también secuencias de genes que actúan como activadores o fenotipos, regulando la expresión genética. Los factores que afectan negativamente a la fisiología de la célula durante la producción de proteína recombinante en cultivos densos de E.coli son: [Ref.3] -
Intracelulares: Presencia de vectores de expresión multicopia. o Toxicidad de los productos genéticos. o Alta expresión genética. o Desdoblado de proteínas. o
-
Extracelulares: Acumulación de desechos metabólicos tóxicos. o Limitación de nutrientes. o Limitación de oxígeno. o Presencia de otros comensales. o
De entre todos estos factores cabe destacar la estabilidad del plásmido, ya que un microorganismo que contenga un plásmido recombinante debe de asignar parte de sus recursos al mantenimiento y reproducción del plásmido, por lo que se producirán diferencias en las velocidades de crecimiento de células con plásmido y células libres de plásmidos. En ingeniería genética se utilizan de plásmidos que suelen tener uno o dos genes resistentes a un antibiótico, esto es; contienen un marcador genético que le confiere un fenotipo por el cual puede ser seleccionado a favor o en contra. Otra técnica muy habitual consiste en introducir un control vía gen activador que permita separar las fases de crecimiento y producción. Esto se realiza introduciendo un gen que actúa como interruptor químico (sustancia) o físico (temperatura) de la expresión del plásmido. Una vez se ha optimizado la elección de un antibiótico e interruptor adecuado hay que tener en cuenta la formación de cuerpos u orgánulos de inclusión (IB) durante el proceso de producción, seleccionado las técnicas necesarias para su aislamiento y purificación. 12
Aunque se ha avanzado mucho en las técnicas de producción por rADN con la E.coli, todavía se hace necesaria mucha investigación complementaria para poder simplificar y mejorar el proceso en su conjunto.
2.3. Interferones: clasificación y acción. Los interferones son una familia de pequeñas proteínas con pesos moleculares de entre 15 a 27’6 kDa que pertenecen al grupo de las citoquinas. Tienen una alta actividad antiviral e inhiben la proliferación de células cancerosas. Se describieron por primera vez en 1957 por Isaacs y Lindermann del National Medical Research (UK). Se producen de forma natural por células del cuerpo (en mamíferos) como: leucocitos o fibroblastos y su función principal es regular la respuesta inmune y antiinflamatoria.
Se han estudiado principalmente tres tipos de interferones (IFNs), que se pueden clasificar según su actividad biológica: [Ref. 6,7]
-
Tipo I: incluye subtipos y (humanos), (ratón) , (gatos), (rumiantes), (cerdo). IFN (interferón leucocitario) incluye a su vez mas de 15 tipos de o moléculas diferentes, siendo IFN a , IFN b las más estudiadas. IFN (proveniente de fibroblastos), es la variedad comercializada o en mayor medida actualmente cuya procedencia puede ser: De fibroblastos diploides creciendo en anclados una superficie adecuada, técnica más segura. De bacterias a las que se les ha insertado un plásmido que por técnicas de recombinación genéticas ha sido asociado con el gen humano correspondiente. Tipo II: subtipo (IFN inmune). Tipo III: subtipo se une específicamente a receptor IL10R2.
-
Los interferones tipo 1 se producen principalmente en respuesta a los productos antígenos como glucoproteínas virales, ARN viral, endotoxinas virales… Su metabolismo y producción tiene lugar principalmente en los
riñones. De su unión a receptores específicos en la célula antígena objetivo 13
resulta la producción de una proteína que alerta a las células T y B (constituyentes de los linfocitos) sobre el posible ataque. De esta manera las células T atacan y provocan la eliminación de las células antígenas. También inhiben reproducción de los virus mediante enzimas que a su vez inhiben la síntesis proteica de los virus en su multiplicación.
Los interferones presentan actividad frente a células tumorales, las detectan de forma que las células T (linfocitos), las atacan y destruyen. El IFN-gamma está involucrado en la regulación de las respuestas antiinflamatorias, normalmente tienen baja actividad contra antígenos y agentes cancerosos pero si potencia los efectos de los IFN-alfa y IFN-beta. Los IFNs están también relacionados con los desórdenes autoinmunes, la alteración de la membrana celular, la estimulación en la diferenciación celular, la regulación del factor de crecimiento, la alteración del sueño…
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3. DISEÑO DEL PROCESO El empleo de procesos basados en obtención de productos a partir de E.Coli recombinada es cada vez más frecuente, ya que han permitido obtener rendimientos muy superiores respecto otras técnicas, y ahora mismo hay un creciente interés sobre métodos de alta densidad celular frente a conseguir una alta expresión de la proteína, y más aún desde que hay indicios de disminución de la fidelidad de la recombinación en sistemas de alto nivel de expresión, por lo que puede interesar producir con meno r expresión pero en las condiciones adecuadas para conseguir un producto de mayor calidad. 3.1. Modos de cultivo
Un error típico a la hora de producir proteínas por recombinación genética es centrarse sólo en alcanzar una alta expresión de las proteínas o bien en conseguir una alta densidad celular. Ambos aspectos son importantes y no podemos considerar tan sólo uno de ellos si queremos que nuestro proceso sea económicamente viable. Con frecuencia lo que se busca es la alta expresión de las proteínas sin ser consciente de que una alta densidad celular aporta grandes ventajas frente a un cultivo de baja densidad: -
Altas concentraciones de producto. Aumento de la productividad. Disminución de los costes de producción. Reduce el volumen de cultivo. Facilita las operaciones aguas abajo, es decir, la extracción y purificación de la proteína. Reduce la cantidad de efluentes residuales. Reduce el coste de producción y de inversión en equipos. (Lee et al, 1996)
El problema está en que conseguir altas densidades celulares no es tan sencillo. Con E.Coli no recombinada se consiguen cultivos de alta densidad celular, por encima de 125 g/l con relativa sencillez, sin embargo para E.Coli recombinada normalmente son mucho menores, pocos autores confirman haber alcanzado concentraciones superiores a los 50 g/l. Con frecuencia para estos casos se ha empleado el reactor semicontinuo que nos permite obtener densidades celulares superiores cuando es necesario controlar el crecimiento debido a limitaciones en la transferencia de oxígeno, de calor o incluso problemas con el sustrato y subproductos. Los problemas de limitación de oxígeno conducen a subproductos de fermentación que actuarán como inhibidores del crecimiento del microorganismo y disminuirán el rendimiento del 15
proceso como se ha comentado anteriormente. Además es también necesario evitar restricciones en el crecimiento debido a concentraciones iniciales de sustrato demasiado altas o demasiado bajas. Por tanto si queremos una alta densidad celular deberemos evitar tanto las limitaciones de oxígeno como el exceso de glucosa. A la hora de operar tenemos tres alternativas para la configuración del reactor: continuo, discontinuo y semicontinuo. Estos métodos difieren en la forma de aportar los nutrientes al cultivo. En los discontinuos todos los nutrientes excepto el oxígeno están en el reactor de fermentación en el momento de inoculación. En el continuo el medio de cultivo es constantemente añadido al cultivo y la misma cantidad de caldo de cultivo es retirada de forma que se trabaja en estado estacionario. Y por último en el semicontinuo hay una adición de nutrientes a lo largo de la fermentación pero no se elimina caldo de cultivo.
Isabel Cristina de Almeida Pereira da Rocha (2003) El proceso en continuo presenta la ventaja de una gran versatilidad a la hora de imponer una velocidad específica de crecimiento, pero tiene el inconveniente de que se consume mucho tiempo para estabilizarlo en el estado estacionario. Otro aspecto a considerar es la inestabilidad del plásmido que es muy alta y que la probabilidad de contaminación en estos reactores es mucho mayor que en el resto. No obstante, aunque a nivel industrial no es empleado se sigue utilizando para experimentos de laboratorio en los que se quieren velocidades de crecimiento específicas. En caso de tener un proceso continuo con inducción deberemos realizarlo en dos etapas, una de crecimiento bacteriano y otra de producción de la proteína, lo que aumenta aún más el riesgo de contaminación y no todas las células que dejan el primer reactor tendrán el mismo tiempo de residencia dando lugar a células de diferentes edades en la 16
etapa de inducción. A pesar de esto existen ejemplos de aplicación de cultivos continuos en dos etapas Fu et al. (1993) o Kim et al. (1992). Para trabajar de esta forma un ejemplo lo podemos encontrar en Park et al. (1990) que realizan una inducción por temperatura, en la primera etapa se opera a temperatura inferior a 37ºC en la que se produce el crecimiento y en la segunda etapa se sobrepasan los 38ºC favoreciendo la biosíntesis y acumulación del producto del gen clonado. Respecto a la operación en discontinuo es sin duda el método más usado en procesos industriales de biotecnología debido a su simplicidad de operación y al menor riesgo de contaminación. Según esto podríamos pensar que es el reactor ideal para nuestro caso pero hay que tener en cuenta que tradicionalmente en estos reactores se han conseguido densidades celulares mucho más bajas que en las otras configuraciones, normalmente de 1-2 g/l y con un máximo de 12 g/l debido a las restricciones por limitación de nutrientes o aparición de inhibidores del crecimiento. Obviamente con estas concentraciones de microorganismo no se conseguirá un proceso rentable, por lo que habrá que recurrir al reactor semicontinuo que aunque desde el punto de vista operacional es más complejo permite obtener mejores rendimientos. En las siguientes figuras aparece un ejemplo de comportamiento de diferentes parámetros a lo largo del tiempo para el reactor discontinuo y semicontinuo.
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Lars Strafberg and Sven-Olof Enfors (1991) En el semicontinuo la velocidad específica de formación de la proteína es máxima durante las primeras horas tras de la inducción y después disminuye. Esta disminución puede ser debida al incremento en la concentración de amoniaco y acetato, así como a la falta de glucosa 4.2 horas después de la inducción. Tras la inducción se ve un aumento en la velocidad de generación de acetato que conduce a un aumento de su concentración. Esto a su vez lleva a un aumento del amoniaco ya que éste es usado para regular el pH. Existen otras sustancias como KOH o NaOH válidas para sustituir al amoniaco en esta función aunque del mismo modo altas concentraciones de sales tendrán acción inhibidora por lo que no son una solución real. Por otro lado con el semicontinuo se pretende alcanzar densidades celulares superiores con tiempos de cultivo relativamente cortos y siendo más fácil mantener la esterilidad que en los sistemas continuos. Además la inhibición por nutrientes o subproductos se puede evitar gracias a la posibilidad de controlar la velocidad de crecimiento, evitar limitaciones en la transferencia de oxígeno o calor, y controlando la alimentación de sustrato. En el ejemplo de Lars Strafberg and Sven-Olof Enfors (1991) la alimentación comienza cuando tenemos un peso seco celular de 11.6 g/l, que es cuando la glucosa inicial está casi consumida. La corriente de alimentación de glucosa va aumentando exponencialmente durante tres horas a partir de ese momento se mantiene constante con lo que se pretendía conseguir una velocidad de crecimiento constante en 0.3 h -1 sin embargo primero fue de 0.35 h -1 y luego bajó hasta 0.25 h-1. El acetato inicialmente formado va a ser consumido al principio del periodo de alimentación. 18
Al igual que en el reactor continuo se produce un incremento transitorio de la concentración de oxígeno y de dióxido de carbono durante la primera hora tras la inducción aunque no tan pronunciado. Para evitar la limitación de oxígeno se aumenta la presión en la alimentación. En ambos métodos los plásmidos se mantienen estables, sin embargo una cantidad significativa se redujo a partir de la temperatura de inducción en el reactor semicontinuo y algo parecido ocurre en el discontinuo también, y ha sido asumido como una consecuencia de excesiva síntesis de ARN o de acumulación de subproductos. La disminución en el semicontinuo probablemente no es causada por la alta concentración intracelular de proteína como en el discontinuo que fue un 50% mayor, si no que puede ser consecuencia de una falta de carbono para los procesos que no generan energía, ya que al principio del carbono alimentado el 33% pasa a CO 2 y al final pasa el 66%.
Lars Strafberg and Sven-Olof Enfors 1991 En definitiva el empleo del sistema semicontinuo garantiza un incremento en la productividad y una disminución de los costes de producción respecto al discontinuo. Además el reactor semicontinuo nos abre un amplio abanico de opciones para realizar el control que podrá ser tanto por realimentación como anticipativo. Incluso dentro del control por realimentación existen varias opciones, el sistema indirecto en el que se usan parámetros como el oxígeno disuelto, pH y presión parcial de CO2 en gas de salida para regular la alimentación de nutrientes. O el sistema directo en el que directamente la concentración de sustrato en el medio de cultivo es usada como parámetro para el control.
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3.2. Aspectos generales del proceso
Para formar el cultivo se tienen las cepas bacterianas a -196ºC en nitrógeno líquido, primero formaremos el inóculo en un matraz o tanque de menor tamaño y posteriormente lo añadiremos al caldo de cultivo que introduciremos en el reactor. Una vez se da por completo el proceso se inactivan los microorganismos añadiendo ácido sulfúrico, se concentra mediante centrifugación y directamente tras la centrifugación se procede a la purificación que va a ser una etapa de gran importancia. Se puede apreciar que tenemos dos reactores. Esta configuración va a ser la más frecuente ya que como se ha comentado lo recomendable es realizar el proceso en dos etapas, una primera etapa en la que se favorece el crecimiento del microorganismo y una segunda etapa en la que se corta el crecimiento y se fomenta mediante una inducción la generación de la proteína, además este sistema nos permite trabajar a diferentes condiciones en los dos tanques, lo que puede ser muy ventajoso si las condiciones óptimas de crecimiento no son las mismas que para la producción . La mejor manera de realizar la inducción es algo sobre lo que no se ha conseguido llegar a un acuerdo, hay varias formas de llevarla a cabo. En general la inducción conlleva un cambio que puede ser provocado tanto por un agente químico como por un agente físico. A día de hoy la preferida por la mayoría es la inducción térmica, en la que con una variación de la temperatura se impulsa el cambio en la bacteria. Los defensores de la inducción térmica critican las inducciones por agentes químicos como pueden ser el isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) o antibióticos basándose en su elevado coste y toxicidad. El empleo de estas sustancias implica su presencia en el producto final y en los efluentes residuales del proceso representando un peligro por lo que tendrán que ser eliminados. Esto requiere controles adicionales y operaciones aguas abajo para eliminar los inductores, especialmente en el caso de proteínas de calidad farmacéutica y productos para consumo humano, de forma que se encarece y complica el proceso. Una posible solución es el reciclado de los agentes químicos aunque todavía no se ha avanzado lo suficiente en este campo. Otro tipo de inducción se basa en el agotamiento de algún tipo de nutriente como puede ser algún aminoácido concreto, pero esta falta puede afectar al metabolismo de la célula o a la síntesis de la proteína recombinante, además de la dificultad que tiene una correcta sincronización de la inducción, es decir, añadir dicho nutriente en la cantidad justa para que se consuma por completo en el momento oportuno. Otro caso típico es la inducción por pH, que pretende con un cambio en el pH conseguir el cambio en el comportamiento de la célula, pero no se ha 20
desarrollado demasiado todavía. El cambio del pH puede provocar una salida del intervalo de pH óptimo de condiciones fisiológicas para el correcto desarrollo del cultivo. Por tanto la técnica más exitosa hasta el momento es la inducción térmica que tiene probada su eficacia y evita el empleo de medios de cultivo especiales, o caros y tóxicos agentes químicos. Consiste en mantener la temperatura por debajo de 37ºC (normalmente entre 28 - 32 ºC) para la primera etapa en la que se produce el crecimiento del cultivo ya que a esta temperatura la expresión del gen estará inhibida y para la segunda etapa se incrementa la temperatura por encima de 37ºC. Unos valores factibles según Lars Strandberg et al. (1991) pueden ser 30ºC para la etapa de crecimiento y 40ºC para la etapa de producción, y se procederá a la inducción cuando el peso seco celular sea de 4 g/l. Habrá que tener cuidado de que el golpe de calor no afecte a la cantidad y calidad del producto. Las bacterias que hayan sufrido una inducción no son reutilizables.
Básicamente este método se basa en el empleo del promotor pL/pR del fago lambda (virus que se incrusta en su genoma afectando a su comportamiento). Este promotor está regulado por la proteína cI857, que impide efectivamente la transcripción de los genes bajo control de pL/pR a temperaturas por debajo de los 37 ºC. Dada la naturaleza termolábil de la proteína cI857, cuando la temperatura se incrementa, la expresión es muy potente. El empleo del promotor permite obtener altas densidades celulares, manteniendo el nivel de expresión del gen a un nivel despreciable cuando las temperaturas del cultivo están entre 28 y 32 ºC. Hay que tener en cuenta que el incremento de temperatura es más lento a medida que aumenta la escala del biorreactor. La inducción no será instantánea, no obstante un calentamiento progresivo puede incluso favorecer la producción. Álvaro R. Lara (2009). En las siguientes gráficas podemos seguir el comportamiento de algunos parámetros con el tiempo:
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K. R. Babu et al. (2000)
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La primera parte corresponde a la fase discontinua cuando aún queda glucosa en exceso y no es necesario iniciar la adición de más sustrato. En la segunda fase ya si tenemos la glucosa como sustancia limitante y por tanto se inicia la alimentación con más sustrato para que siga creciendo la E.Coli. Estas dos fases forman lo que se conoce como etapa de crecimiento y en ellas se debe alcanzar la densidad celular suficiente para conseguir la producción esperada. La segunda fase del funcionamiento semicontinuo es la conocida como etapa de producción, entre estas dos fases de funcionamiento semicontinuo se llevará a cabo la inducción para pasar de favorecer el crecimiento del cultivo a favorecer la producción de proteína. Se observa como la mayor parte del interferón generado se produce en las tres primeras horas tras la inducción. A partir de este momento la cantidad de producto obtenida no aumenta significativamente a pesar de continuar con la alimentación de sustrato al medio. También llama la atención como durante la etapa semicontinua la generación de acetato es muy lenta, gracias a que se realiza la alimentación de forma que se minimice su aparición. Esto no concuerda con los resultados observados anteriormente según Lars Strafberg et al. (1991) donde probablemente no se consiguió realizar la alimentación de la mejor forma.
Medio de cultivo
La fabricación de un medio de cultivo adecuado va a ser base fundamental para que el proceso tenga éxito, pues si no conseguimos las condiciones adecuadas para el cultivo no obtendremos el correcto desarrollo de la E.Coli. El medio va ser fundamentalmente una disolución de glucosa enriquecida en sales minerales. Y conforme tenga lugar el proceso iremos adicionando más glucosa. Es recomendable además añadir trazas de algunos metales y vitaminas al medio. En las siguientes tablas observaremos las cantidades que se deben añadir al medio de cultivo tanto para el medio inicial que corresponde a la parte discontinua como a la alimentación, además del tipo de esterilización recomendada, para las 1 y 2 se esteriliza en un autoclave (30 min a 121ºC) los componentes por separado y los que tengan el número 3 son esterilizados mediante una filtración esterilizante. Estas no son las únicas vías de esterilización, existen maneras alternativas como pueden ser la esterilización por sobrepresión de aire pero son es menos común.
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Según Isabel Cristina de Almeida Pereira da Rocha (2003):
Según Xiao-Ming Yang et al. (1992):
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Alimentación
A continuación haremos un repaso de las diferentes formas que hay de controlar la alimentación del reactor semicontinuo: Alimentación exponencial El realizar una alimentación que aumente de forma exponencial es una técnica muy utilizada para conseguir una velocidad de crecimiento constante y en un valor que minimice la formación de acetato. Este procedimiento tiene algunos inconvenientes a la hora de aplicar los cálculos necesarios para predecir cómo debe realizarse la alimentación. Se recomienda que el caudal volumétrico permanezca constante y lo que aumente sea la concentración del sustrato en la corriente. Método del pH Como ya se comentó, los cambios de pH en el medio pueden reflejar el nivel de concentración de glucosa. Un exceso en la alimentación de glucosa puede dar lugar a cambios metabólicos de las células que excretarán acetato y otros ácidos orgánicos reduciendo el pH. Por el contrario la falta de glucosa hace que las células catabolicen ácidos orgánicos o aminoácidos como fuente de carbono aumentando el pH. Por eso existe un método para regular la alimentación basado en el control del pH, de forma que si el pH disminuye se reduce la alimentación y viceversa. Método del oxígeno disuelto Con mucha frecuencia el oxígeno disuelto (DO) ha sido utilizado como parámetro de control por realimentación, entre otras cosas por ser un sistema sencillo, barato y fiable. Básicamente si el DO aumenta debido a una disminución del sustrato el controlador inicia la adición de glucosa provocando la disminución del DO. Cuando se alcanza un mínimo prefijado se detiene la adición de glucosa. Algunos autores encontraron inconvenientes a este sistema porque se sigue generando una cantidad significativa de acetato, para evitarlo hay que complicar el lazo de control añadiendo un control sobre la velocidad de agitación y no siempre merece la pena. Método directo Otra opción es medir directamente la concentración de glucosa en el caldo de cultivo y en función de esto regular la alimentación. La concentración de glucosa se puede determinar por el método de la glucosa oxidasa, que consiste en que la glucosa oxidasa oxida a la glucosa originando ácido glucónico y H2O2. El peróxido de hidrógeno liberado reacciona con un cromógeno (fenol/4aminoantipirina) por la reacción de Trinder, para dar una quinona que absorbe entre 492 y 550 nm. La intensidad de color producida es directamente 25
proporcional a la concentración de glucosa y se podrá determinar con un espectrofotómetro.
Para realizar este análisis existen kits comerciales que facilitan el trabajo y de una manera similar se pueden realizar las medidas de la concentración de acetato. Método de consumo de glucosa Este método se basa en regular la alimentación de glucosa en función del consumo. Y para conocer el consumo de glucosa se realiza un análisis del gas expulsado del fermentador, que se hará mediante un analizador de gases con un detector de infrarrojos para el CO 2 y un detector paramagnético para el O 2.
3.3. Condiciones de operación y control.
Se instalarán una serie de lazos de control para los principales parámetros que influyen en el proceso como la temperatura, volumen, desarrollo celular, formación de espumas, presión, velocidad de agitación, flujo de aire y oxígeno, pH y alimentación de glucosa. Para regular el pH usaremos amoniaco y ácido sulfúrico en caso de que sea necesario. El pH debe mantenerse lo más constante posible alrededor de 6,8-7 que será un pH óptimo para el desarrollo de la E.Coli. La formación de espumas puede ser otro inconveniente que con frecuencia aparece en nuestro sistema, para evitarlo se instala un sistema con un detector de espumas que automáticamente añada un antiespumante que podría ser polipropilenglicol. La medida de la turbidez se relaciona con la densidad óptica, se empleará un espectrofómetro y la medida será realizada a 600 nm, con esta medida se controlará el crecimiento de las células. La estabilidad de los plásmidos será estudiada en función de la cantidad de unidades formadoras de colonias en una placa con y sin antibióticos (ampicilina 105 mg/l y kanamicina 30 mg/l), siendo las placas incubadas a 30ºC durante 24 h (Lars Strandberg et al. 1991). Esto es así ya que normalmente el plásmido contiene un gen que proporciona resistencia a los antibióticos, y de esta forma comparando la cantidad de UFC en ambas placas se puede saber la cantidad de células que contienen dicho plásmido. Aspecto de gran importancia pues debido a efectos de segregación el plásmido podría perderse y las células 26
libres al carecer de la carga metabólica impuesta por el plásmido crecerían más rápido desplazando al resto, con la consecuente pérdida de productividad ( Álvaro R. Lara 2009). El volumen del tanque se controla con un sensor de presión diferencial por membranas, aunque se pueden instalar otros sistemas. El caudal de alimentación de glucosa se mide con un caudalímetro másico por inducción. La velocidad de agitación se regula con un variador de frecuencia y debe mantenerse entre unas 200-450 rpm según Lars Strandberg et al. (1991) aunque hay otros autores como B. Wipf et al. (1994) que recomiendan se controle entre 0-350 rpm y K. R. Babu et al. (2000) en 500 rpm. La elevada demanda de oxígeno en los cultivos de alta densidad celular hace necesario alimentar con una corriente de aire enriquecida con oxígeno puro. La proporción entre ambos será controlada mediante unas válvulas accionas por un controlador y se mide con un caudalímetro másico térmico. Se procurará mantener el oxígeno disuelto entre el 50- 80% de la concentración de saturación según B. Wipf et al. (1994) y para medirlo se empleará un electrodo polarográfico. Otros autores como Lars Strandberg et al. (1991) y K. R. Babu et al. (2000) sitúan este valor en un 25% del valor de saturación. Los parámetros que afectan al oxígeno disuelto son la velocidad de agitación, los flujos de aire y oxígeno, y la temperatura. Para un reactor de unos 1000 litros el flujo máximo de aire será de aproximadamente 600 l/min, que previamente pasará por un filtro de unas 0.2 µm para esterilizar y retirar partículas en suspensión. En ese caudal irá incluido el flujo de oxígeno puro que rondará los 100-170 l/min. El caudal de aire, la alimentación de glucosa y el volumen del fermentador se medirán en intervalos de 1 minuto. Mientras que el análisis del gas expulsado oscilará entre 4-10 minutos. Una vez visto todo esto el esquema del reactor resultante puede observarse en la siguiente figura:
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B. Wipf et al. (1994)
Otra imagen correspondiente al dispositivo experimental utilizado a escala de laboratorio
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3.4. Purificación del producto.
La producción de proteínas recombinantes (R-prot.) con E.coli requiere la colaboración interdisciplinar en aspectos como: biología molecular, procesos de fermentación, purificación de productos… Para la comercialización rentable del este tipo de productos se hace imprescindible una alta productividad volumétrica de R-prot. purificada y bioactiva para lo cual es necesario: -
Un proceso fermentativo de alta productividad; dens.celulares>200gr/L Un proceso de purificación adecuado y eficiente.
Dentro del proceso de producción de proteína bioactiva, las etapas de plegamiento y purificación son de vital importancia debido a la las particularidades de la célula hospedadora (E.coli), aunque es extensible a procesos con otros organismos como: levaduras, bacilos, eucariotas superiores... Aunque normalmente la acumulación de proteínas en E.coli se produce en el periplasma, la formación de IB facilita el aislamiento de la proteína en el citoplasma acosta de modificar su estructura primigenia. Es de destacar por tanto, que la viabilidad económica de todo el proceso depende en gran medida de la eficiencia en la recuperación de la proteína bioactiva de los IB. [Ref.4] Proteína recombinante como orgánulos de inclusión (IB)
La formación de IB dentro del citoplasma celular no está del todo justificada actualmente a pesar de la multitud de estudios realizados sobre la materia. Cada proteína tiende por causas específicas y no del todo dilucidadas a formar IB, siendo la causa compartida a todas la sobreexpresión de R-prot. en circunstancias adversas para su plegamiento de manera natural. No hay relación directa entre la tendencia a la formación de IB de una proteína determinada y sus propiedades intrínsecas como: peso molecular, hidrofobia, rutas de plegamiento, etc... En el caso de que la R-prot. tenga puentes de disulfuro, la formación de IB esta inhibida por el ambiente reductor/oxidante del citoplasma. A grandes rasgos y de una manera generalista los procesos de recuperación de proteína bioactiva de IB comprenden las siguientes etapas: [Ref.5] -
Aislamiento de IB. Purificación de la proteína desnaturalizada. Plegamiento de la proteína a la conformación bioactiva. Mejora de la actividad biológica. Purificación. 29
3.4.1. Formación, aislamiento y caracterización de IB.
Como se han descrito anteriormente los IB son agregados proteicos que se encuentran en el citoplasma y periplasma. Se distinguen del resto de orgánulos por ser refractarios, suelen tener un tamaño entre 0’17-1’3μm y pueden presentar estructura amorfa o paracristalina. En muchos casos representan entre el 20-50% del contenido proteico total de la célula, facilitando el aislamiento y recuperación de R-prot en la forma desnaturalizada. Como se ha mencionado anteriormente la razón exacta de la agregación de proteínas formando IB no está del todo clara y puede deberse a: -
La alta concentración de R-prot. en el citoplasma. Falta de compartimentación en la célula además de un ambiente oxidante/reductor en el citoplasma que provoca la no interacción de los puentes disulfuro.
Esta primera etapa en el proceso de purificación consta de dos fases fundamentales: 1. Aislamiento de IB. 2. Solubilización de la proteína contenida en IB. La E.coli presenta elevada rigidez en la membrana multicapa por lo que la su ruptura no es posible mediante técnicas como: -
Ultrasonidos (depende de frecuencia y ciclos). Shock osmótico. Permeabilización química (solo periplasma). Ruptura enzimática (solo periplasma).
La técnica más adecuada para ocasionar un alto grado de lisis celular (>95%), consiste en la homogeneización a alta presión (2500 kg/cm^2 aprox.), aunque con el inconveniente de la posible contaminación de la R-prot. por sustancias celulares. Como parámetros de funcionamiento para un equipo de homogeneización a alta presión hay que destacar: -
Presión de trabajo. Diseño de la válvula. Numero de pasos a través de la válvula. Velocidad de flujo. Temperatura de la suspensión.
Una vez rota la membrana celular, dado que los IB presentan una alta densidad (1’3mg/mL apr ox.), es posible su separación del resto de componentes celulares por centrifugación a alta velocidad. Como parámetros de funcionamiento para una centrifugadora industrial continua se destacan: 30
-
Flujo de la corriente procesada. Velocidad de centrifugación. Propiedades físicas de los sedimentables. Densidad y viscosidad de la solución.
En la centrifugación los IB se compactan en agregados o “pellets” que
posteriormente son clarificados por sucesivas ciclos de lavado y centrifugación. La mayor parte de los contaminantes se elimina en 3-4 ciclos de lavado. La estructura densa de los IB es solubilizada minimizando las interacciones hidrofobicas y la formación de enlaces S-S no deseados. Para llevar a cabo la solubilización los (disolventes/detergentes/agentes caotrópicos) a emplear se deben escoger en base a criterios como: -
No crear dificultades en etapas posteriores. Buena solubilización de IB. Inhibición de actividad proteica. No modificar los enlaces de aminoácidos en la R-prot.
A baja concentración de detergente la cadena C-C de este reacciona con el lado hidrófobo del aminoácido, extendiéndose el grupo polar al agua. De esta manera los detergentes “tapan” o cubren las zonas hidrófugas de la superficie
proteica y la solubilizan. El inconveniente de esta técnica radica en la dificultad de eliminar totalmente el detergente de la R-prot. aunque como ventajas tenemos su bajo precio y la baja influencia que ejerce sobre la actividad biológica de la R-prot. Considerando que la formación de IB es muy selectiva, se puede esperar que usando técnicas de lavado adecuadas se obtenga un 90% aprox. de pureza para la obtención de R-prot. solubilizadas. Los agentes caotrópicos habituales son: urea, GdHCl, sales de ti ocianato …, y detergentes como; SDS, cloruro de N- cetiltrimetilamonio, Sarkosyl… La concentración habitual (6-8M) aumenta con la hidrofobia de la R-prot a solubilizar. El grado de solubilización de los IB depende de: -
Concentración de la proteína y del agente desnaturalizante. Pureza de la proteína. pH. Presencia de grupos tioles libres.
En ocasiones es difícil solubilizar IB incluso a altas concentraciones de agente caotrópicos debido fundamentalmente a la formación de enlaces S-S intermoleculares. 31
Una técnica empleada para medir el grado de solubilización consiste en cuantificar la acción de disolventes o buffers de pH por mediciones en fluorescencia y dispersión de la luz al atravesar la muestra. Mediante esta técnica es posible la determinación del máximo de solubilidad. La elección de uno u otro agente de solubilización afecta en gran medida al plegamiento de la molécula, de forma que una etapa de solubilización adecuadamente seleccionada repercute en la economía proceso.
3.4.2. Purificación de la proteína desnaturalizada.
La técnica de purificación que se debe llevar a cabo antes de la etapa de plegamiento, se elige en función de la influencia que las impurezas de la mezcla (IB+proteínas+DNA+lipidos) tengan sobre la etapa de plegamiento Se decide a proceder con la purificación de las R-prot. antes del plegamiento según: -
-
La cantidad y pureza de R-prot. en los IB. o Si la cantidad en <15% de las proteínas celulares totales. o Si la pureza de la R-prot en IB no alcanza 40-50%. Si hay elevado número de proteínas con grupos tioles. La presencia de proteínas de esta clase puede provocar la formación de enlaces intermoleculares con las R-prot.
Técnicas de cromatografía habituales en la purificación de proteínas: -
Cromatografía de fase inversa (RP-HPLC). Cromatografía de filtración en gel (por exclusión de tamaños). Cromatografía de intercambio iónico: es la técnica más útil en purificación. Ambas matrices, catiónica y aniónica, pueden llevarse al pH isoeléctrico y correspondiente al pH de estabilidad de la proteína. Las más habituales son la Q y S-sepharose. Ofrecen escalabilidad y la concentración y purificación se puede alcanzar en un solo paso.
También o conjuntamente la purificación se puede llevar a cabo mediante: -
Centrifugación a alta velocidad. Ultrafiltración: se aplica a operaciones a escala industrial. Como la mayoría de las proteínas de interés se encuentran entre 14-22kDa, ajustando el corte por pesos moleculares de la membrana es posible separar la mayoría de los contaminantes macromoleculares.
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3.4.3. Renaturalización de las R-prot. a la conformación bioactiva.
Para obtener la conformación original, la cadena de polipéptidos debe ser replegada en las estructuras secundarias o terciarias correctas, de forma que puedan ser posteriormente estabilizadas por enlaces de disulfuro. Las estrategias de replegado de desarrollan de acuerdo a condiciones como: -
Reducir la concentración de detergente a niveles en los que no afecten a las fuerza de estabilización intramolecular; enlace H- H, hidrofobia… El proceso de plegamiento se lleva a cabo en una medio buffer que contiene un agente oxidante. La concentración de proteína desnaturalizada en la disolución amortiguadora se mantiene baja para evitar la agregación intermolecular.
Entre las técnicas de plegamiento destacamos: A. Plegamiento por diálisis, tecnología de membrana y filtración en gel: son las técnicas más frecuentes utilizadas en el intercambio del buffer. En las dos primeras se utiliza un tamaño de poro inferior al de la proteína aunque suficiente para la disolución buffer pase y lleve a cabo el plegamiento. la filtración con gel es más rápida. B. Plegamiento por dilución: a. Plegamiento en una única etapa de dilución: este método es más rápido que el anterior. La proteína desnaturalizada se disuelve en la disolución buffer repetidamente de modo que la concentración de desnaturalizante se va eliminado restableciéndose así las fuerzas intramoleculares. El buffer se compone normalmente de 50mM tris-HCL conteniendo diferentes sistemas redox. La dilución se lleva a cabo: i. Añadiendo lentamente la proteína desnaturalizada a la disolución buffer. ii. Vertiendo rápidamente la disolución buffer en proteína desnaturalizada. b. Plegado por etapas de dilución: esta técnica es más adecuada cuando los intermedios de plegado de la proteína son i nsolubles en el medio. Los inconvenientes en método de disolución a la hora de pasar de una escala pequeña de laboratorio a una escala de producción industrial son: i. Grandes tanques de reacción (plegamiento). ii. Elevado volumen de disolución amortiguadora. iii. Requiere sucesivas etapas de concentración.
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C. Plegamiento asistido por aditivos: incorporando aditivos al buffer se puede mejorar la eficiencia del plegado, ya que los aditivos se unen a los intermedios de plegado inhibiendo su agregación o porque estabilizan la conformación plegada de la proteína. Como aditivos de uso habitual encontramos: azucares, aminoácidos, tensioactivos neutros, polímeros…, los cuales se pueden separar fácilmente de la R -prot. Específicamente para los IFN es posible utilizar polietilglicol. D. Modificación química: no es habitual en procesos de obtención de proteínas aunque si tiene más aplicaciones en diagnostico in vitro.
E. Plegamiento de micelas inversas: en este caso cada proteína desnaturalizada se encapsula en una gota de agua mediante un tensioactivo y las micelas se dispersan en un disolvente orgánico. Por un proceso de intercambio selectivo la concentración de desnaturalizante en las micelas se reduce y la proteína se pliega en presencia del buffer.
3.4.4. Mejora de las moléculas bioactivas.
La purificación de proteínas hasta el grado requerido en aplicaciones terapéuticas requiere de una serie de etapas de cromatografía. La selección de estas etapas depende de: -
La concentración y pureza de la proteína. La estabilidad y propiedades físico químicas. Nivel de pureza final requerido para la proteína. Carga de contaminantes y sus límites en producto final.
Normalmente la pureza de la proteína antes de la etapa de mejoramiento es mayor al 90%, suele estar acompañada de contaminantes. Es importante seleccionar una secuencia adecuada para los tratamientos por cromatografía.
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Una elección correcta de la secuencia conlleva; reducción del número de etapas de intercambio buffer, mejora del rendimiento, menor tiempo en el proceso y menor coste. La siguiente tabla resume las posibles técnicas cromatográficas aplicadas en la mejora:
3.4.5. Técnica purificación seleccionada para IFN-α.
Hasta aquí se ha hecho mención de las etapas generales que se han de seguir para la purificación de proteínas recombinantes contenidas en células hospedadoras. Según las referencias consultadas, estas técnicas varían continuamente introduciendo mejoras considerables, de manera que en lo siguiente se describe el proceso de purificación más reciente al que se ha podido tener acceso dados los recursos limitados con que se trabaja. En selección de técnicas de purificación adecuadas para IFN se ha de proceder teniendo en cuenta criterios como (Paul P.Trotta et al.): 35
-
-
-
-
Evitar técnicas que involucren altas concentraciones de agentes desnaturalizantes/plegadores como la urea o la GdHCl ya que dificultan la renaturalización eficaz. Esta consideración es especialmente relevante en IFNα humanos debido a que se deben formar dos enlaces disulfuro, que con altas concentraciones de agentes caotrópicos suele resultar incorrecta. El método de extracción y purificación utilizado debe evitar la contaminación de la proteína con pirógenos bacterianos (liposacáridos de bacterias Gram-negativas que causan fiebre). La proteína resultante debe estar libre de ácidos nucleicos y proteínas de su célula hospedadora. El IFN producido debe ser homogéneo, libre de agregados y restos proteolíticos. Esto es de especial importancia debido a que si se inyectan en humanos pueden provocar reacción antígena. Para ser comercialmente viable, en la purificación se debe alcanzar por lo menos un 20% en actividad antiviral.
Ya desde 1957 sus descubridores plantean un método de purificación del IFN limitado a una precipitación con sulfato amónico seguido de una diálisis [Ref.23]. A lo largo de los sesenta se publicaron estudios sobre la purificación de IFN (leucocitario o fibroblastos) como el correspondiente a la adsorción en aluminosilicatos [Ref.21]. Pero es a partir de los años 80 cuando se ha avanzado más en la purificación de IFN- α producido en E.coli. Friesen et al. de la compañía Hoffman-la Roche [Ref.22] plantean en 1981 un método para la purificación de IFN- β mediante dos etapas principales: una primera etapa de cromatografía por afinidad, seguida de cromatografía liquida a alta presión. Leibowitz et al. de la Schering Corporation [Ref.24] plantean en 1982 un método para la extracción de IFN de un cultivo bacteriano, que requiere acidificar el medio bacteriano varias veces para después neutralizarlo, separando el IFN disuelto del resto. David R. et al. describen en 1986 unos de los métodos para la purificación de IFN-α2 recombinante que más citaciones recibe a nivel general. Este consiste eliminar los componentes celulares solubles (que incluyen la mayor parte de contaminantes) mediante sucesivas etapas de lavado, suspensión y centrifugado. Una vez separado los IFNs atendiendo a su nula solubilidad por el estado agregado (IB) en que se encuentran, se procede al tratamiento con agentes caotrópicos de forma que se vuelven solubles y forman una disolución homogénea que puede purificarse mediante sucesivas etapas de: cromatografía, quelatos metálicos, cromatografía de gel y recristalización.
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En la siguiente tabla se resumen las etapas del proceso y diferentes parámetros para cada etapa que determinan la eficacia y rendimiento global: [Ref.25].
Se observa como a medida que progresa el proceso de purificación: -
El volumen disminuye. La actividad (unidades/mL) disminuye. Las unidades totales disminuyen. El % en la recuperación de actividad antiviral va disminuyendo. La actividad específica aumenta hasta 3’2.10^8 ud/mg
Un estudio más reciente de Paul P.T et al. [Ref.20] en el año 2000 plantea un procedimiento a escala industrial para la purificación de IFN- α2 expresado por el vector plásmido PBR322 based, que consta de las siguientes etapas: 1) Se somete al extracto de E.coli a lisis celular mediante acidificación a pH=2 con posterior neutralización. Esto evita las altas concentraciones de desnaturalizantes y mejora la estabilidad de IFN tipo I. 2) Acidificación a pH=4.5. elimina ácidos nucleicos de las proteínas 3) Centrifugación; separa el sobrenadante concentrando el material insoluble en agregados compactos. 4) Como los IFNs son estables en disolventes orgánicos, se extraen con etanol y después se precipitan con tricloroacético. 37
5) Cromatografía de afinidad; Matrex gel Blue A (cibracron blue F3 GA) Sepharose. La elución de la columna se lleva a cabo con una solución NaCl 2M. 6) La última etapa de purificación se puede llevar a cabo de dos maneras: a. Ciclos repetidos de precipitación por diálisis y redisolución en disolución NaCl 2M b. Precipitación selectiva seguida de cromatografía de intercambio iónico DEAE Sepharose. En ANEXO 1 se adjunta el documento donde se especifica los detalles de su operación. Con este procedimiento la actividad del producto final es de 7.10^7 IU/mg.+ Este es el procedimiento que se propone por los autores de este estudio, ya que es el más adecuado según criterios de producción comercial como: -
Economía: Bajo precio de reactantes empleados. Sencillez: El número de etapas necesarias es reducido y no complicadas. Tiempo: Requiere un menor tiempo por lo que se obtiene una mayor producción. Además cumple con todos los criterios expuestos anteriormente (Paul P.Trotta et al. [Ref.20])
Otra posible alternativa consiste en usar cromatografía de inmunoadsorción con anticuerpos monoclonales inmovilizados. La siguiente tabla muestra un resumen de las etapas y de los principales parámetros en este procedimiento: [Ref.20]
Según K.R. Babu et al. (2000) es posible otro procedimiento para la purificación de IFN-α activo en una sola etapa (columna Q-sepharose) previo tratamiento de purificación, solubilización y plegado. Con este procedimiento se logran valores de actividad biológica más elevados (2’5.10^8 IU/mg). Aunque los 38
autores sostienen la versatilidad en su aplicación a escala industrial, la cantidad y precio de los solventes utilizados puede indicar lo contrario, se requiere un estudio más detallado sobre este tema. El proceso puede resumirse en las siguientes etapas: 1) Preparación y purificación de IBs a. Buffer A (trisHCL 10mM,pH=8 + EDTA 10mM + NaCl 100mM). b. Centrifuga (10000rpm,10min). c. Lavado Buffer A + PMSF (phenylmethylsulfonylfluoride). d. Sonoporacion (p30s, pausa15s, 15min). e. Urea + Buffer A + PMSF en Tanque Agitado (1h,4ºC) f. Centrifuga (10000rpm,45min). Se retira el sobrenadante. g. Buffer B (trisHCL 10mM,pH=8 + EDTA 1mM+ NaCl 1M) en TA h. Centrifuga (lavado agua destilada). Se retira el sobrenadante quedando unos pellets IBs con 70-80%pureza IFN- α. 2) Solubilización y plegado a. Buffer C (trisHCl 100mM,pH=8 + EDTA 0’2mM + GuHCl 8M) TA(2h,Tªamb). b. Centrifuga (17000rpm, 1h,4ºC) se recoge el sobrenadante con IBs solubilizados c. Buffer D (trisHCl 100mM,pH=8 + L-arginina 0’5M + EDTA 0’2mM), añadir IB solubilizados lentamente sobre buffer TA d. Incubación 24-36h. 3) Purificación en columna Q-sepharose a. Diálisis (elimina argina) con trisHCl 50mM + urea 100mM + EDTA 1mM. b. Centrifuga (10000rpm, 30min, 4ºC). c. Ultrafiltración (0.45μm). d. Columna Q-sepharose. Se selecciona la fracción de interés. e. Diálisis con PBS. f. Congelado (-70ºC).
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4. SIMULACION DINAMICA Un proceso de producción de proteína de alto valor añadido como es el caso del IFN, requiere de un conocimiento detallado de los parámetros que lo rigen. La producción vía fermentativa es un proceso complejo que engloba reacciones bioquímicas y fenómenos de transporte, de forma que, para lograr una producción en condiciones óptimas se requiere de un modelo que permita predecir y describir el comportamiento del proceso. Además, a la escala de producción con la que se trabaja, no se puede optimizar el proceso por simple prueba y error, sino que es necesario desarrollar un modelo matemático representativo.
1. Modelo complejo
La descripción del proceso requiere tener en cuenta la estequiometria, análisis de flujo, cinética microbiana, fluidodinamica y transferencia de masa. Brevemente, se van a exponer los fundamentos teóricos necesarios para el desarrollo del modelo dinámico, siendo necesario un análisis más detallado para una mejor comprensión. (Isabel C. [Ref.11]) De forma general para un reactor fed-batch, se puede expresar el balance a cada componente:
Siendo D la velocidad de dilución:
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Se ha considerado:
Ecuaciones cinéticas:
Dado que la E.coli presenta tres vías metabólicas, se han propuesto tres ecuaciones cinéticas, correspondientes cada una a: la oxidación de la glucosa, la fermentación de la glucosa y la oxidación del acético.
Dinámica de gases disueltos:
En el proceso de fermentación aerobio de la E.coli es necesario considerar la dinámica en las concentraciones de gases, en particular de : oxígeno y dióxido de carbono. La velocidad de transferencia de oxigeno (OTR): factor limitante.
-
Al incrementar la velocidad de transferencia de oxigeno es posible alcanzar una mayor productividad celular. Se puede incrementar OTR si se incrementa KL.a o Oeq. 41
Como el producto KL.a varia principalmente con el flujo de la aireación y la velocidad de agitación y la viscosidad, para determinar OTR de una manera mas precisa, se usa la ley de gases ideales a presión y temperatura constante.
Usando el mismo balance para el nitrógeno y considerándolo como inerte; no reacciona y su acumulación en despreciable:
Cuando las velocidades de reacción no cambian significativamente, se puede asumir un estado estacionario para la fase gas de modo que los términos de acumulación pueden obviarse.
El balance al oxigeno disuelto en la fase liquida queda:
El termino Oin puede despreciarse ya que la alimentación al introducirse en el reactor se esteriliza, causando que la concentración de los gases disueltos se reduzca a cero Velocidad de transferencia de dióxido de carbono(CTR): el CO2 presenta una situación más compleja que el oxígeno (es 5 veces más soluble ), ya que su solubilidad en agua aumenta debido al carácter iónico del bicarbonato. 42
Se debe tener en cuenta por tanto el equilibrio acido base para las distintas especies del CO2:
La constante para el equilibrio entre CO2 y bicarbonato
Donde B es la concentración de bicarbonato, H la de protones y C la de CO2. El balance a CO2 en fase liquida:
La transferencia de CO2 en la interfase gas líquido:
Considerando la fase gas-líquido bien mezclada, la concentración de equilibrio puede calcularse de: 43
Los valores de la constante de Henry se pueden consultar en bibliografía, aunque diferentes estudios proponen una dependencia de esta constante con la temperatura. La solubilidad del CO2 en el medio se puede ver influenciada por la presencia de compuestos no polares y de especies iónicas. De la consideración de equilibrio entre gas y líquido se puede obtener una estimación para la concentración de bicarbonato. La concentración de CO2 y bicarbonato se estiman mediante medidas en pH y análisis de gases:
De forma que la concentración de CO2 y carbonato se puede expresar:
En condiciones de no equilibrio las concentraciones de CO2 y bicarbonato pueden calcularse:
El coeficiente de transferencia de masa para el CO2 puede expresarse en términos de la transferencia de oxígeno. La correlación entre ambos coeficientes de masa se puede expresar:
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Balance al sustrato:
Al tratarse de un reactor fed-batch, al realizar los balances se debe tener en cuenta que la masa del reactor no permanece constante. Además en concreto para el sustrato debemos considerar que entrará en la alimentación y se consume tanto en la vía oxidativa como en la fermentativa.
Dónde: MS, gramos de sustrato en el medio de reacción. Fins, son los kg/h de alimentación. Sin concentración de glucosa en la alimentación. K1 y K2, son los coeficientes estequiométricos que relacionan la cantidad de sustrato consumido con la cantidad de biomasa generada. Sus inversas son más conocidas como Y x/s.
Fintot, será la variación total de la masa dentro del reactor, teniendo en cuenta: la alimentación, la base y ácido añadido; el flujo de gas residual; el líquido evaporado y el volumen de muestras tomadas. Si despejamos
:
Quedando finalmente:
Balance al microorganismo:
Habrá que tener en cuenta que el crecimiento del microorganismo se produce por las tres vías metabólicas y no se introduce nada por la alimentación.
Donde MX es la masa de microorganismo en el interior del reactor 45
Despejando
:
Balance al acetato:
En este caso el acetato es producto de la vía fermentativa pero a la vez es oxidado, por lo que tendremos un término que lo aumente y otro que lo disminuya.
Dónde: MA es la masa de acetato en el reactor K3 y K4, son los coeficientes estequiométricos que relacionan la cantidad de acetato generado o consumido respectivamente con la cantidad de biomasa generada
Despejando
:
Balance al oxígeno:
El oxígeno se consume en las tres vías y es alimentado como aire enriquecido.
Dónde: MO es la masa de oxígeno disuelta en el reactor K5, k6 y k7, son los coeficientes estequiométricos que relacionan la cantidad de oxígeno consumido en cada vía con la cantidad de biomasa generada. 46
OTR es el caudal de oxigeno alimentado por unidad de masa.
Despejando
:
Balance al CO2:
Al contrario que el oxígeno el dióxido de carbono se produce en las tres vías metabólicas, además se perderá en la corriente de gases residuales.
Dónde: MCt es la masa de CO 2 dentro del reactor. K8, k9 y k10, son los coeficientes estequiométricos que relacionan la cantidad de CO2 generado en cada vía con la cantidad de biomasa generada. CTR es el flujo de CO2 perdido en los gases de salida por unidad de masa.
Selección de la cinética adecuada:
Para la selección de la ecuación cinética que mejor se ajuste a cada una de las vías metabólicas se han propuesto varias alternativas. Mediante programación con MATLAB se comparan los valores teóricos obtenidos para cada ecuación cinética con los valores experimentales y se minimiza la diferencia. En base a esto se selecciona la opción que al final del proceso tenga menor diferencia entre los valores teóricos y los experimentales. 47
Las ecuaciones cinéticas propuestas para la vía oxidativa-fermentativa de la glucosa son:
Y para la vía oxidativa del acetato son:
Después de la optimización se obtiene que las ecuaciones cinéticas que mejor se ajustan a los datos son: Vía oxidativa-fermentativa de la glucosa:
Vía oxidativa del acetato:
48
Simulación del modelo con Berkeley Madonna.
El modelo anteriormente visto ha sido transcrito en el programa para proceder a su ejecución y obtener la simulación del proceso: METHOD RK4 STARTTIME = 0 STOPTIME=30 DT = 0.001 {MODELO=17} X'=(U1+U2+U3)*X - D*X S'=(-K1*U1-K2*U2)*X + (FIN/W)*SI - D*S A'=(K3*U2-K4*U3)*X-D*A O'=(-K5*U1 - K6*U2 - K7*U3)*X + OTR-D*O CT'=(K8*U1 + K9*U2 + K10*U3)*X - CTR - D*CT W'= FIN + FB + FA - FEVAP - FGAS - FSMP FIN=0.0102*EXP(0.1019*TIME) {ALIMENTACIÓN EXPONENCIAL FEDBATCH, SACADA DE LOS DATOS EXPERIMENTALES MEDIANTE AJUSTE EXPONENCIAL, R2=0.9934} D=FIN/W {VELOCIDAD DE DILUCIÓN, VARIABLE YA QUE LA ALIMENTACIÓN NO ES CTE} FA= CA*U3*X*W FB= CB*U2*X*W FEVAP= CE FGAS=(CTR-OTR)*W
{FLUJO DE ÁCIDO AÑADIDO} {FLUJO DE BASE AÑADIDO} {FLUJO DE LÍQUIDO EVAPORADO} {FLUJO NETO DE GAS}
CTR= 0.0084* TIME^2+0.0227*TIME+0.2155 { ECUACIÓN AJUSTE POLINÓMICO DATOS EXPERIMENTALES, R2=0.9979} OTR=0.009*TIME^2-0.08*TIME+0.5973 { ECUACIÓN AJUSTE POLINÓMICO DATOS EXPERIMENTALES, R2=0.9857} U1=QSMAX*S/(KS+S) U2=QSMAX*S/(KS+S) U3=QACMAX*A/(A+KA)*KIA/(KIA+A) { VARIABLES=39 K1, K2, K3, K4, K5, K6, K7, K8, K9, K10 QSMAX, KS, KOS, QOMAX, KIO, QACMAX, KA KOA , KIA, CB, CA, CE, SI X, S, A, O, CT U1, U2, U3 D, FIN, W OTR, CTR 49
FA, FB, FEVAP, FGAS } { PARÁMETROS=22 } K1=3.164 K2=25.22 K3=10.90 K4=6.382 K5=1.074 K6=11.89 K7=6.098 K8=1.283 K9=19.01 K10=6.576 QSMAX=1.832 KS=0.1428 KOS=2.02 QOMAX=0.7218 KIO=6.952 QACMAX=0.0967 KA=0.5236 KOA=1.996 KIA=5.85 CB=0.1034 CA=0.095 CE=0.0444 SI=250 {CONDICIONES INICIALES=6} INIT X=10; INIT S=5; INIT A=0; INIT O=0.0021; APROX. 30% Osaturación INIT CT= 0; INIT W=3 ; Para poder construir el modelo se han tenido que realizar una serie de consideraciones: -se asume una alimentación de forma exponencial ya que no se conoce al detalle cómo se lleva a cabo. Se ha realizado un ajuste exponencial a los datos experimentales y se ha introducido en el modelo una exponencial en función del tiempo.
50
Alimentación-tiempo 0.25 y = 0.0102e0.1019x R² = 0.9934
h 0.20 / g k , n 0.15 ó i c a t n 0.10 e m i l A0.05
0.00 0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
30.00
35.00
Tiempo, h
-Los parámetros OTR y CTR se calculan en función de la transferencia de materia de forma que hay que determinar los coeficientes de transferencia de materia para ambos componentes en este medio. Debido a la complejidad de estos cálculos se procede realizando un ajuste polinómico para los datos experimentales, obteniendo una función polinómica que representa la variación de estos parámetros en función del tiempo.
Ajuste CTR 10 9 8 7 h g k / g , R T C
6 5 4 y = 0.0084x 2 + 0.0227x + 0.2155 R² = 0.9979
3 2 1 0 0
5
10
15
20
25
30
35
Tiempo, h
51
Ajuste OTR 8 7 6 h g 5 k / g 4 , R T 3 O
y = 0.009x2 - 0.08x + 0.5973 R² = 0.9857
2 1 0 0
5
10
15
20
25
30
35
Tiempo, h
52
2. modelo simple
Con la intención de obtener una aproximación en los valores de los parámetros cinéticos característicos, se ha procedido a realizar una estimación sobre datos del estudio (K. R. Babu et al.[Ref.18]).
Para la obtención de los parámetros cinéticos se han propuesto dos modelos; uno para la etapa discontinua y otro para la semicontinua.
Modelo discontinuo
{MÉTODO NUMÉRICO} STOPTIME = 10 ;h DT = 0.01;h 53
{ECUACIONES = 7} X' = rX S' = rS A' = rA rX = U*X U = UM*S/(KS+S+A/KA) rS = -rX/Y rA = (k1+k2*U)*X {VARIABLES = 12 X, S, P, KS: g/L rX, rS, rP: g/(L·h) U, UM, k1: 1/h Y, k2: ad} {GRADOS DE LIBERTAD = 5} UM =0.9 KS = 0.14 k1 = 0 k2 = 0.1 KA=0.1 Y = 0.41 {CONDICIONES INICIALES = 3} INIT X = 0.01 INIT S = 30 INIT A = 0 Se obtiene:
54
Los valores de S, A, X obtenidos en la simulación se asemejan a los obtenidos experimentalmente, por lo que se puede considerar que el modelo propuesto con los siguientes valores para los parámetros cinéticos es adecuado para esta etapa. Los parametros obtenidos son: KS=0.14, K1=0, K2=0.1, KA=0.1, Y=0.41 Modelo fed-batch
{MÉTODO NUMÉRICO} STOPTIME = 15 ;h DT = 0.01;h {ECUACIONES =12} V'=F VS'=F*S0+rS*V VX'=rX*V VA'=rA*V rX=U*X rS=-rX/Y U=UM*S/(KS+S+A/KA) rA=(K1+K2*U)*X X=VX/V S=VS/V A=VA/V F = F0 {VARIABLES = 21 X, S, A, S0, KS, KA, Y, K1, K2 : g/L VX, VS, VA: g rX, rS, rA: g/(L·h) F, F0: L/h V: L U, UM: 1/h Y: ad} {GRADOS DE LIBERTAD = 8} F0=0.2 {F0= k0*EXP(K00*TIME) K0=0.0102 K00=0.1019 } S0=250 UM=1.75 KS=1.75 K1=0 K2=0.1 55
KA=0.22 Y=0.65 {CONDICIONES INICIALES = 3 (valores finales de la fase de reactor discontinuo)} INIT V=3 INIT VX=3*12.5 INIT VS=0.01*3 INIT VA= 0.6*3 Obteniéndose:
Solo los valores para la concentración de microorganismos obtenidos por la simulación se aproximan a los datos experimentales, además los valores en los parámetros cinéticos resultan diferentes a los obtenidos en la etapa discontinua. Por tanto, dada la incoherencia en estos resultados se hace necesario un estudio más detallado para la obtención de parámetros adecuados. Parámetros obtenidos: UM=1.75, KS=1.75, K1=0, K2=0.1, KA=0.22, Y=0.65
56
5. ANEXO 1: DIAGRAMA PROCESO
57
6. REFERENCIAS BIBLIOGRAFIA 1. Blight, M. A. and Holland, I. B. Heterologous protein secretion and the versatile Escherichia coli haemolysin translocator. Trends in Biotechnology. 12, 450-455. 1994. 2. Villaverde A, Carrió MM, Protein aggregation in recombinant bacteria: biological role of inclusion bodies. Biotechnol Lett. 2003, 25(17):1385-95. 3. C. Perry Chou. Engineering cell physiology to enhance recombinant protein production in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol (2007) 76:521 –532. 4. Amulya K. Panda. Bioprocessing of Therapeutic Proteins from the Inclusion Bodies of Escherichia coli. Adv Biochem Engin/Biotechnol (2003) 85: 43 –93. 5. Asok Mukhopadhyay. Inclusion Bodies and Purification of Proteins in Biologically Active Forms. (1997) Adv Biochem Eng Biotechnol 56:61. 6. Grace, Eric S., La biotecnología al desnudo: promesas y realidades / Eric S. Grace, Anagrama, 1998. 7. Smith, John E., Biotecnología / John E. Smith, Acribia, 2006 8. B. Wipf, E. K. Weibel, S. Vogel . Computer controlled large scale production of oc-interferon by E. coli. Bioprocess Engineering (1994), 145-153. 9. Lee, S. Y. High cell-density culture of Escherichia coli. Trends in Biotechnology. 14, 98-105.1996. 10. Lars Strafberg and Sven-Olof Enfors. Batch and Fed-Batch cultivations for the temperature induced production of a recombinant protein in Escherichia Coli. Biotechnology Letters Vol No 8, 609-614. (1991). 11. Isabel Cristina de Almeida Pereira da Rocha. Model-Based strategies for computer-aided operation of recombinant E. Coli Fermentation (2003) 12. Kim, E., Fu, J, Wilson, D. B., and Shuler, M. L. Expression of human epidermal growthfactor by Escherichia coli in continuous culture. Biotechnology Letters. 14, 339-344. 1992 13. Fu, J., Wilson, D. B., and Shuler, M. L. Continuous, high level production and excretion of a plasmid-encoded protein by Escherichia coli in a twostage chemostat. Biotechnology and Bioengineering. 41, 937-946. 1993. 14. Park, S. H., Ryu, D. D. Y., and Kim, J. Y. Effect of cell growth rate on the performance of a two-stage continuous culture system in a recombinant Escherichia coli fermentation. Biotechnology and Bioengineering. 36, 493-505. 1990. 15. Yang, X.-M. Optimization of a cultivation process for recombinant protein production by Escherichia coli. Journal of Biotechnology. 23, 271-289. 1992. 16. Lars Strandberg, Kristina Kiihler & Sven-Olof Enfors. Large-Scale Fermentation and Purification of a Recombinant Protein from Escherichia coli. Process Biochemistry 26 (1991) 225-234. 58
