Produccion de Lipidos a Partir de Microalgas

PRODUCCION DE LIPIDOS A PARTIR DE MICROALGAS Indice

I.

INTRODUCCION

Las algas son de gran importancia ambiental ya que fijan más del 40% del carbón de la tierra, además de ofrecer a la biósfera una considerable proporción de oxígeno. Su importancia ecológica radica en su abundancia, su extrema biodiversidad y la habilidad de sobrevivir en una variedad de ambientes, desde los muy extremos, como los suelos desérticos hasta ambientes moderados, como lagos de agua dulce y océanos. Son de gran interés para la producción de compuestos de alto valor agregado y de interés comercial como la astaxantina y el β -caroteno, luteína, cantaxantina y clorofila. Éstas últimas son actualmente una fuente de pigmentos, biodiesel y productos de gran interés comercial. Las microalgas son un grupo diverso de microorganismos unicelulares con la capacidad de efectuar fotosíntesis bajo condiciones de luz y sales suficientes, tienen una estructura simple lo que permite el rápido crecimiento celular y por lo tanto una mayor producción de biomasa con alto rendimiento por superficie. Debido a esta razón, las microalgas son llamados microorganismos fotoautótrofos, siendo la luz su principal fuente de energía y el dióxido de carbono (CO2) su principal fuente de carbono. La composición de la biomasa es determinante para la clasificación de las especies de acuerdo a su función y sus productos, la cual está constituida por tres principales compuestos: carbohidratos, pro teínas y lípidos. Las microalgas han despertado un enorme interés debido a que tienen un alto contenido lipídico (más del 50% en peso de materia seca en algunos casos) y utilizan menos superficie para su cultivo. Además, se obtiene una producción de aceite de 15 a 300 veces mayor que con otras especies para un mismo área y son los microorganismos con mayor capacidad para fijar el CO2 . La acumulación de lípidos se produce durante periodos de stress ambiental, incluyendo el crecimiento en medios con bajas condiciones de nutrientes. Por ello, la biotecnología de microalgas ha ganado relevancia y un progreso considerable en las últimas décadas. A escala de laboratorio se pretende evaluar de manera crítica la concentración de fuentes de carbono óptima para la producción de lípidos a partir de microalgas, esto puede lograrse a través de la selección de las mejores condiciones de cultivo que permitan incrementar su fracción lipídica.

II.

OBJETIVOS 1. OBJETIVO PRINCIPAL Producción de lípidos por microalgas del tipo Chlorellas sp. 2. OBJETIVOS ESPECIFICOS Evaluar fuentes de carbono inorgánico en la producción de lípidos por microalgas. Determinar la concentración optima de la fuente de carbono seleccionada. 



III. MARCO TEORICO 1. Metabolismo de las microalgas Las microalgas son microorganismos microscópicos de aproximadamente de 2 a 200 μm de tamaño, son fotosintéticos, polifiléticos y eucariotas que pueden crecer de manera autotrófica o heterotrófica, contienen clorofila por tanto son capaces de realizar fotosíntesis oxigénica para transformar la energía solar en energía química, para esto necesitan de luz, CO 2, agua y nutrientes como: nitrógeno, fósforo, potasio y magnesio,  los cuales son esenciales porque actúan como cofactor de enzimas esenciales de su metabolismo. En cuanto a los nutrientes necesarios para su crecimiento, fundamentalmente nitrógeno y fósforo, se tienen que adicionar en los sistemas de cultivo. La luz la obtienen del sol por lo que su utilización está limitada por el ciclo de luz natural y la variación estacional y restringida su viabilidad comercial a áreas con alta radiación solar. Se puede utilizar también luz artificial, aunque esta conlleva un mayor consumo energético y mayores emisiones de CO 2. El CO2 que necesitan lo pueden fijar de la atmósfera, de emisiones de gases industriales y de los carbonatos solubles, siendo lo más común la alimentación externa, bien por las emisiones industriales o por carbonatos solubles. Las microalgas son una fuente ideal de bioenergía, ya que no compiten con los cultivos destinados a su alimentación y podrían potencialmente producir mayores rendimientos de biomasa, debido a esta característica existen cuatro grandes condiciones de cultivo: 1. Cultivos Fototróficos Un cultivo fototrófico ocurre cuando las microalgas utilizan luz, tal como la luz del sol, como recurso energético, y carbón inorgánico como fuente de carbón para formar energía química a través de la fotosíntesis. Esta es la condición de cultivo más comúnmente usada para el crecimiento de microalgas. En cultivos fototróficos existe una gran variación en el contenido de lípidos en las microalgas, los cuales van desde el 5% a 68%, dependiendo del tipo de especie de microalgas. 2. Cultivos Heterotróficos Algunas especies utilizan solo componentes orgánicos como fuente de carbón y energía bajo condiciones de oscuridad. Este tipo de cultivo podría evitar los problemas asociados con la limitación de luz que entorpecen la alta densidad de células en los grandes fotobioreactores. Algunas especies de microalgas tiene un contenido más alto de lípidos durante del crecimiento A pesar de que se han reportado altas productividades de biomasa y contenido lipídico en la estructura celular, los sistemas heterótrofos son susceptibles a contaminación, promueven la instauración de los ácidos grasos sintetizados (Pérez-García et al., 2011) y los costos de las

fuentes orgánicas de carbono tienden a complicar la factibilidad de escalamiento del proceso a nivel industrial. 3. Cultivos Mixotróficos Realizan la fotosíntesis como principal fuente energética. Las microalgas son capaces de vivir en cualquier condición ya sea heterotróficamente o fototróficamente dependiendo de la concentración de componentes orgánicos e intensidad de luz presente en el medio. Cultivos 4. Fotoheterotróficos En este cultivo la microalga requiere de luz cuando necesita componentes como fuentes de carbono, necesariamente requieren de luz como fuente de energía, por lo tanto este tipo de cultivo necesita de luz y azucares al mismo tiempo. Mediante la manipulación de las condiciones ambientales en los sistemas de cultivo, el metabolismo celular de las microalgas puede dirigirse hacia la biosíntesis de sustancias de elevado interés farmacológico, como ácidos grasos, pigmentos, vitaminas, antibióticos o antivirales. El comportamiento de las microalgas ante condiciones de estrés fisiológico es variable entre especies; la limitación de nutrientes especialmente nitrógeno y fósforo, asociado al crecimiento heterotrófico o a altas intensidades luminosas en fototrofía se consideran como las estrategias más eficientes para incrementar el contenido de lípidos en las microalgas, en particular de triglicéridos constituidos por ácidos grasos saturados. La síntesis de ácidos grasos sigue la ruta metabólica de la fotosíntesis, en la cual las microalgas toman CO2 y lo convierten en moléculas complejas (fijación del carbono), se trata de un proceso con muchas reacciones químicas catalizadas por diversas enzimas como se puede apreciar en la Figura 1.

Figura 1. Mecanismo lipídico de las microalgas

En la Figura 1. El circulo plomo es el cloroplasto, éste toma el CO2 para ser convertido en el ciclo de Calvin (ruta metabólica representada como un círculo dentro del cloroplasto) en ácido 3-fosfoglicérico o molécula de 3PGA con tres carbonos. El 3PGA, o bien se condensa en una molécula de glucosa con seis carbonos, o bien se convierte en piruvato, otra molécula de tres carbonos. Hay que mencionar que las moléculas de glucosa también pueden romperse para producir el piruvato. El piruvato se convierte, en dos pasos de catálisis enzimática con la necesaria presencia de la biotina (vitamina B7), el malonil CoA es una molécula de ácido málico “activada” o preparada para la reacción por acetil CoA , sobre la cual se puede construir un ácido graso. En dicho ciclo el malonil CoA se enriquece con carbono e hidrógeno, se alarga y se convierte en lo que se denomina “ácido graso libre”. Después los ácidos grasos

libres son trasladados al citosol, donde se condensan con las moléculas de glicerol, para formar los triacilgliceridos (grasas) o TAG, que son depositados en forma de “cuerpos lipídicos” en el cuerpo de la microalga, lo cual convierte la microalga en el contenedor de grasas.

Sistema de Cultivo de biomasa de algas. Se distinguen dos tipos de sistemas de cultivos: los sistemas abiertos tipo piscinas y los sistemas cerrados tipo fotoreactor, biorreactor e invernaderos. 1. Sistemas Abiertos Debido a que las algas necesitan de luz solar, CO2 y agua para crecer, pueden ser cultivadas en estanques y lagos. A estos tipos de cultivos se los llaman “sistemas abiertos”. Son normalmente menos costosos en lo que refiere a su construcción y operación, más duradero que los reactores cerrados y con una capacidad de producción más amplia cuando se compara con sistemas cerrados. Sin embargo, los tanques utilizan más energía para homogenizar los nutrientes. Generalmente estos tanques son más susceptibles a las condiciones ambientales, lo que no permite el control de la temperatura del agua, evaporación e iluminación. Este tipo de sistema produce una gran cantidad de microalgas, pero ocupa grandes áreas y por lo tanto es más susceptible a contaminación de otras microalgas o bacterias. Por otra parte ya que la atmosfera solo contiene 0.03-0.06% es de esperarse que la transferencia de masa sea limitada lo cual puede disminuir el crecimiento celular. En este sistema se tiene poco control frente a condiciones ambientales tales como temperatura del agua, CO2, intensidad lumínica, entre otros, por lo que el crecimiento del cultivo depende de las condiciones del medio y en general se produce en los meses más cálidos. En general, para el cultivo en sistemas abiertos se buscan cepas que puedan crecer bajo condiciones en las que otros organismos les resultaría difícil desarrollarse como pH altos o bajos, temperaturas específicas, requerimientos nutritivos específicos, etc. Es por esta razón que solo pocas especies fueron cultivadas con éxito en este tipo de sistemas. La ventaja que tienen los sistemas abiertos es que son muy baratos y fáciles de construir ya que básicamente lo que se hace es construir estanques. 2. Sistemas Cerrados Un sistema alternativo para el crecimiento de algas es mediante invernaderos, también en estanque. Aunque se reduce el área de cultivo se solucionan muchos problemas que poseen los sistemas abiertos: menor probabilidad de contaminación por especies no deseadas, pueden cultivarse un mayor número de especies, el periodo de cultivo es mayor ya que hay

control de la temperatura y puede incrementarse la cantidad de CO2 en el ambiente, con lo que también aumentaría la tasa de crecimiento de las algas. Los estanques poseen sistemas que permiten a las algas mantenerse en movimiento en el medio, de forma que todas reciban la misma cantidad de luz y nutrientes. Por otro lado se renueva continuamente la cantidad de CO2 y nutrientes del medio. Otro tipo de sistemas cerrados de cultivos son los fotobiorreactores, los cuales son sistemas flexibles que pueden ser optimizados de acuerdo con las características biológicas y fisiológicas de las algas cultivadas lo cual permite cultivar algas que no pueden crecer en campos abiertos. Comúnmente se utilizan fotobiorreactores diseñados como reactores tubulares de lecho empacado en los cuales el cambio directo de gases contaminantes entre el cultivo y la atmosfera es limitado o no es permitido y también una gran proporción de luz no invade directamente sobre la superficie ya que tiene que atravesar las paredes transparentes del reactor. Dependiendo de su forma o diseño este tipo de reactores ofrecen mejor control sobre las condiciones del cultivo y los parámetros de crecimiento (pH, temperatura, mezclado, CO2 y O2), prevenir la evaporación, reduce las pérdidas de CO2, permite obtener una alta densidad de microalgas, y una mayor productividad volumétrica. Microalgas oleaginosas Las microalgas contienen ácidos grasos como componentes de su membrana, productos de almacenamiento, metabolitos y fuente de energía. Estos microorganismos representan una opción viable como materia prima para producir lipidos, debido a la mayor productividad de biomasa y mayor velocidad de replicación con respecto a plantas cultivables, algunas especies pueden acumular entre 20-80% (peso seco) de triglicéridos, entre 1-75% (peso seco) de lípidos contenidos, sin embargo algunas especies pueden alcanzar hasta el 90% (peso seco) bajo condiciones específicas de cultivo. Biosíntesis de lípidos en microalgas El proceso se inicia con el cultivo de la cepa para la obtención de biomasa con una alta productividad de lípidos, seguido de la separación de la biomasa del medio de cultivo y posterior extracción de los lípidos para finalmente obtener el biodiesel por una reacción de transesterificación, observar figura 2.

Figura 2. Etapas del proceso de obtención de biodiesel a partir de microalgas. En general, las microalgas dependen para su crecimiento de un suministro de carbono y de una fuente de luz para realizar la fotosíntesis. Sin embargo, como respuesta a cambios en las

condiciones ambientales, pueden poner en funcionamiento diversos tipos de metabolismo (fotoautotrófico, heterotrófico, mixotrófico, fotoheterotrófico). Al considerar el empleo de microalgas para la producción de biodiesel, es importante definir cuantitativamente la influencia de factores que intervienen en su crecimiento y que favorecen la producción de lípidos, así como su interrelación para poder manipularlos en la obtención de biomasa con determinadas características. Está demostrado que tanto el contenido de lípidos como el perfil de ácidos grasos de las microalgas varía no solo entre especies sino también en función de las condiciones del cultivo, del periodo de cosecha y la edad del cultivo. Entre las condiciones de cultivo afectan factores abióticos como la concentración de nutrientes, la calidad y cantidad de luz, la temperatura, el O2, el CO2, el pH, la salinidad y factores operacionales como mezclado y la edad del cultivo. Los efectos en los cultivos microalgales dependientes de la luz son de gran relevancia, ya que están relacionados directamente con el proceso de fotosíntesis. En microalgas verdes, la ruta metabólica para la síntesis de ácidos grasos empieza por la unión del complejo luz-biomasa, el cual está mediado por la clorofila y carotenoides, los cuales capturan la energía lumínica en forma de fotones. La energía es empleada por el fotosistema en la oxidación catalítica del agua, formando protones, electrones y O 2 molecular. Los electrones se transportan mediante la cadena de transporte fotosintética para promover la producción de NADPH (Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato )  mediante la reducción de ferredoxina. Dentro del lumen tilacoidal se genera un gradiente electroquímico, debido a la liberación de protones después de la oxidación de agua; el cual se emplea para la formación de ATP (Adenosina trifosfato)mediante la vía ATP sintasa. Los productos de la fotosíntesis NADPH y ATP son sustratos del ciclo de Calvin; donde la enzima Rubisco cataliza la conversión de CO 2 y ribulosa5-fosfato en dos triosas, las cuales son convertidas subsecuentemente en piruvato y acetilCoA. Las moléculas de acetil-CoA son carboxiladas dentro del cloroplasto por acetil-CoA carboxilasa para la síntesis de malonil-CoA, molécula que es transferida a la proteína acarreadora de grupos acil del complejo multienzimático sintasa de ácidos grasos; donde la subunidad cetoacil-ACP sintasa cataliza la condensación de malonil-ACP mediante tres reacciones cíclicas: reducción, deshidratación y reducción; condensando el producto con otra molécula de malonil-CoA. El ciclo se repite hasta formar cadenas saturadas de ácido palmítico o esteárico. La enzima ACP-sintasa abre la cadena acil y libera el ácido graso. La formación de triacilgliceroles se lleva a cabo en el retículo endoplasmático, en órganelos especializados llamados plástidos, donde se producen lípidos neutros con la finalidad de almacenar energía y liberar espacio dentro de la célula. La primera reacción para la síntesis de triacilgliceroles es la condensación de glicerol-3-fosfato con acil-CoA para formar lisofosfátido, el cual es catalizado por acil-CoA: glicerol-sn-3-fosfato acil-transferasa y otra molécula de acil-CoA para producir fosfatidato. Posteriormente, el fosfatidato puede ser desfosforilado por la enzima ácido fosfatídico fosfatasa para formar diacilglicerol. Finalmente, la síntesis de TAG es catalizada por acil-CoA: diacilglicerolacil-transferasa, la cual incorpora un tercer grupo acil-CoA a la molécula diacilglicerol, los triacilgliceroles resultantes son almacenados en cuerpos de aceites, los cuales son la materia prima para obtener biodiesel.

Aplicaciones de las microalgas 1. Usos energéticos Las sociedades se han visto obligadas a buscar nuevas fuentes alternativas de energía debido al elevado precio del petróleo, a factores medioambientales, a la necesidad de independencia energética y por oportunidad de negocio, siendo las microalgas una importante opción. De hecho, el aumento en el cultivo de algas se debe básicamente a sus propósitos energéticos, siendo su principal uso para la obtención del biodiesel, aunque también se pueden obtener otros biocombustibles. El biodiésel de microalgas es el biocombustible más estudiado ya que las microalgas son la mejor fuente de lípidos convertibles a biodiésel debido a su elevado crecimiento. El parámetro clave para que la producción de este biodiésel sea factible es la productividad de lípidos, que depende tanto de la productividad de la biomasa de microalgas como del contenido celular de lípidos en la microalga. El contenido total de lípidos en las microalgas se suele encontrar entre el 20% y el 50% del peso seco, dependiendo de la especie y de las condiciones de cultivo, los factores que más afectan a la alta productividad de lípidos son la deficiencia de nutrientes (nitrógeno, fósforo, azufre y silicio), especialmente el nitrógeno, y las altas intensidades luminosas, ya que incrementan la cantidad de triglicéridos. Las microalgas son ricas también en hidratos de carbono que se pueden utilizar como fuentes de carbono para obtener bioetanol por fermentación. Por lo tanto, las microalgas han generado un gran interés como biomasa para la producción de bioetanol y pueden competir favorablemente con biomasas obtenidas de cultivos alimentarios como la caña de azúcar y el maíz. El bioetanol de microalgas se puede obtener mediante dos tecnologías: fermentación, que consiste en la conversión de los materiales de la biomasa que contienen azúcares en etanol por levaduras, y gasificación, que implica convertir la biomasa en un gas de síntesis y éste se convierte en etanol posteriormente por catálisis. Ambas tecnologías actualmente están en sus inicios, siendo crucial y costoso el pre tratamiento de la biomasa para en la fermentación, liberar los polisacáridos atrapados en las paredes celulares de las microalgas en subunidades susceptibles de fermentar y en la gasificación, obtener un gas de síntesis suficientemente limpio para que sea susceptible de transformarse en bioetanol por catálisis. En base a estudios realizados se han examinado tres aspectos de la obtención de biomasa de microalgas para que la producción de biocombustibles de algas sea económicamente viable y medioambientalmente sostenible. Estos aspectos son el balance energético y de carbono, los impactos medioambientales y los costes de producción. 2. Coprocesos Utilización de las microalgas en coprocesos como la biofijación de CO 2 para reducir las emisiones de CO 2 y el tratamiento de aguas residuales para su depuración. Las microalgas son una interesante opción para mitigar el CO 2, ya que son los mayores biofijadores de CO 2 del planeta. El CO 2 que necesitan para su crecimiento lo pueden obtener del aire, de carbonatos solubles y de emisiones industriales. Éstas últimas son las que proporcionan mayores rendimientos por su mayor contenido en CO 2, el problema es que estas

emisiones pueden incluir contaminantes inhibidores de la fijación del CO 2, de manera que es deseable seleccionar especies de algas que toleran elevadas temperaturas, altas concentraciones de CO2. El aporte necesario de CO 2 afecta tanto a la situación de los sistemas de producción como al balance de energía del sistema. Para utilizar el CO 2 de los gases de combustión, el sistema de producción debe estar cerca de una estación de alimentación y estas se concentran cerca de zonas industriales. Además, es preferible utilizar directamente el gas de combustión para evitar el consumo energético que supondría su separación. La utilización de microalgas para la depuración de aguas residuales comenzó a finales de los años 50; en los 70 se desarrollaron en EEUU estanques de cultivo de microalgas para el tratamiento de aguas residuales aunque la extensión de este sistema se frenó por el auge de otros sistemas. Las algas se emplean en numerosas partes del mundo para el tratamiento de aguas residuales, pero a pequeña escala. Se han empleado para eliminar nutrientes en efluentes de residuos porcinos, de acuicultura y en aguas residuales industriales para eliminar metales pesados o compuestos tóxicos orgánicos. Para una eliminación efectiva se necesitan altas productividades de biomasa, y especies de microalgas que soporten las condiciones del medio y los posibles contaminantes. 3. Otras aplicaciones de las microalgas Actualmente, la producción mundial de microalgas se destina principalmente a aplicaciones de elevado valor añadido, ya que la biomasa de algas, además de contener proteínas, lípidos esenciales, pigmentos, carbohidratos, minerales y vitaminas, posee excelentes cualidades para la obtención de productos naturales. La mayor parte de esta biomasa se comercializa como alimentos medicinales en forma de tabletas o polvo como aditivos. También se pueden extraer compuestos con valiosas aplicaciones como pigmentos, aditivos alimentarios, antioxidantes, cosméticos y biofertilizantes. Además, hay que tener en cuenta que las microalgas representan un recurso en gran parte sin explotar ya que sólo se ha estudiado una pequeña parte de ellas. El consumo humano de microalgas está restringido a unas pocas especies debido a las estrictas regulaciones de seguridad alimentaria, factores comerciales y demanda del mercado. Las especies que mayoritariamente se cultivan para consumo humano son Chlorella, Spirulina y Dunaliella y tienen como denominador común, crecer en estanques en medioambientes altamente selectivos siendo inmunes a la contaminación de otras algas y protozoos. Entre los beneficios citados del consumo de Chlorella, se encuentran el tratamiento de úlceras gástricas, acción preventiva frente a la arterioesclerosis e hipercolesterol y actividad antitumoral. La Spirulina (Arthrospira) se utiliza debido a su elevado contenido proteico y su excelente valor nutricional; también es una fuente esencial de ácidos grasos y ácido linoleico que no pueden sintetizar los humanos. Mientras que la Dunaliella salina, se utiliza fundamentalmente por su elevado contenido en Betacaroteno. Las algas contienen carotenoides. Aunque se conocen unos 400 tipos de carotenoides, solo unos pocos se utilizan comercialmente, principalmente el β -caroteno y la Astaxantina, y se usan fundamentalmente como colorantes y suplementos de alimentación humana y animal. La concentración promedio máxima de carotenoides en las algas es de entre 0,1% y 2%; sin embargo la Dunaliella, cuando crece en condiciones de alta salinidad e intensidad de luz,

puede llegar a acumular hasta un 14% de β -caroteno. Las principales aplicaciones de la

Astaxantina son en las granjas acuícolas y como suplemento a la dieta o antioxidante. Las microalgas son también una fuente de ácidos grasos poliinsaturados, suministran estos componentes vitales a plantas más altas y animales que carecen de las enzimas necesarias para sintetizarlos, siendo los ácidos grasos poliinsaturados esenciales para el desarrollo humano y fisiológico. Actualmente, el pescado y sus aceites son las principales fuentes de ácidos grasos poliinsaturados, aunque su aplicación como aditivos para comidas está limitada por la posible acumulación de toxinas, el olor a pescado y su sabor desagradable. Estas limitaciones se han superado empleando los PUFA de las microalgas como aditivos a leches infantiles y a pollos para producir huevos enriquecidos con Omega-3. Aproximadamente un 30% de la producción actual de algas se vende para alimentación animal, siendo esenciales en acuicultura, y forman parte de la cadena alimentaria en cualquier criadero convencional. Numerosos estudios han mostrado que las algas pueden reemplazar a proteínas convencionales como las de la soja o pescados. Algunas especies de microalgas producen extractos que se utilizan en productos cosméticos (cremas antiarrugas, regeneradoras y protectores solares), siendo las principales especies Arthosphira, Chlorella y Spirulina. Estas especies son utilizadas por reputadas marcas internacionales de cosmética. IV.

METODOLOGIA

1. Material biológico. La cepa Raulls Chlorellas sp fue replicada en 100 ml medio líquido BG-11, éste consiste en: 

  

Stock 1 (0.0050 g Na2MGEDTA, 0.0313 g citrato férrico de amonio, 0.0300 g C6H8O7·1H2O ,0.1800g CaCl2·2H2O) Stock 2 (0.3775 g MgSO4·7H2O) Stock 3(0.2000 g K2HPO4·3H2O) Stock 5 (0.1430 g H3BO3, 0.0905 g MnCl2·4H2O, 0.0111 g ZnSO4·7H2O, 0.0039 g CuSO4·5H2O, COCl2 ·6H2O, 0.0195 g Na2Mo7O4·2H2O)

Para 100 ml de cultivo se combinan 1 ml de stock 1, 1 ml de stock 2, 1 ml de stock 3, 0.15 g NaNO3, 0.1 ml de stock 5 y 0.0020 g Na2CO3 con 10 ml de cepa Chlorellas sp en un vaso precipitado de 250 ml con pH de 7.2. Para que el crecimiento de las Chlorellas sea efectivo, el cultivo fue mantenido en 25°C, bajo la iluminación artificial y agitada con pastilla magnética en una cámara de agitación. Se evaluara el porcentaje de OD en el transcurso del crecimiento. 2. Evaluación de fuentes de carbono inorgánico. El carbono constituye el principal macronutriente para el crecimiento y productividad de las microalgas. Por tal motivo es necesario evaluar las diferentes fuentes de carbono orgánico e inorgánico en cultivos de microalgas. En este sentido se estudió el efecto del bicarbonato al 1% (P/V), del acetato al 1% (p/v) y del glicerol al 1% (v/v) sobre el crecimiento y contenido de clorofila de la microalga Chlorellas sp.

Para el tratamiento del cultivo de cepas se modificó el medio de crecimiento algal preparándose 100 ml de cada medio de acuerdo a las concentraciones indicadas en la Tabla1. Medio Stock 1 Stock 2 Stock 3 Stock 5 NaNO3 Fuente de Carbono

Medio 1 1 [ml] 1 [ml] 1 [ml] 0.1 [ml] 0.1533 [g] 1. 0050 [g] Acetato

Medio 2 1 [ml] 1 [ml] 1 [ml] 0.1 [ml] 0.1524 [g] 1. 0116 [g] Bicarbonato

Medio 3 1 [ml] 1 [ml] 1 [ml] 0.1 [ml] 0.1557 [g] 1 [ml] Glicerol

Tabla 1. Concentraciones de fuentes de carbono ara cada medio Manteniendo las condiciones de crecimiento a 25°C de temperatura, bajo iluminación artificial y agitación con pastilla magnética a un pH de 7.5, al cabo de 7 días de crecimiento microalgal se realizara pruebas de peso seco para medir la concentración de biomasa algal producida y, extracción de lípidos para ver el porcentaje de lípidos obtenidos en cada medio con diferentes fuentes de carbono. 3. Efecto de la concentración optima de la fuente de carbono inorgánica seleccionada. La mejor fuente de carbono para la producción de biomasa fue el acetato, de acuerdo a esta conclusión se estudiara el crecimiento de la cepa Chlorellas sp en 400 ml de medio modificado como se observa en la tabla 2. Medio Stock 1 Stock 2 Stock 3 Stock 5 NaNO3 Acetato

Medio 1 4 [ml] 4 [ml] 4 [ml] 0.4 [ml] 0.6132 [g] 0.50 [g]

Medio 2 4 [ml] 4 [ml] 4 [ml] 0.4 [ml] 0.6096 [g] 1 [g]

Medio 3 4 [ml] 4 [ml] 4[ml] 0.4 [ml] 0.6228 [g] 2 [g]

Manteniendo las condiciones de crecimiento a 25°C de temperatura, bajo iluminación artificial y agitación con pastilla magnética a un pH de 7.5, se evaluara la concentración de biomasa y el porcentaje de lípidos producidos en el periodo de 5 días, 10 días y 15 días para ver la tendencia de crecimiento algal. METODOLOGIA ANALITICA A. O.D. La espectrofotometría permite determinar la concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma. La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración: a mayor número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas; también depende de la distancia

que recorre la luz por la solución: a igual concentración, cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra más moléculas se encontrará. Se midió la absorbancia del cultivo de la Chlorella sp a una longitud de onda de 600 nm con 500 µl de medio, tomando como blanco agua destilada. B. Peso seco La concentración de biomasa fue determinada midiendo el peso de seco algal en 3 ml de cada medio (acetato, bicarbonato y glicerol). Para esta prueba se realizaron los siguientes pasos: 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Extraer 1.5 ml de medio en un ependor de 2 ml. Centrifugar el ependor durante 5 minutos a 10000 revoluciones por minuto. Vaciar el líquido remanente. Sobre la biomasa en el ependor agregar 1.5 ml del medio a analizar. Repetir el paso 2 y el paso 3. Secar en la estufa a 90°C durante una noche para obtener el peso seco de biomasa.

Al finalizar dicha prueba para cada medio, el contenido de biomasa fue calculado de la ecuación Ps = Xt-X0, donde Xt y X0 son la concentración de peso seco. C. Extracción de lípido La extracción de lípido contenidos en las microalgas se realizó con solvente orgánico: Hexano, en 3 ml de cada medio (acetato, bicarbonato y glicerol). Para esta prueba se realizaron los siguientes pasos: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.

Extraer 1.5 ml de medio en un ependor de 2 ml. Centrifugar el ependor durante 5 minutos a 10000 revoluciones por minuto. Vaciar el líquido remanente Sobre la biomasa en el ependor agregar 1.5 ml del medio a analizar. Repetir paso 2 y paso 3 hasta completar 3 ml de medio Agregar 200 µl de hexano al ependor con la biomasa de los 3ml de medio. Vortexear el ependor con hexano durante 1 minuto. Centrifugar el ependor durante 5 minutos a 13000 revoluciones por minuto. Vaciar el hexano a otro ependor vacío. Repetir paso 6, paso 7, paso 8 y paso 9 hasta haber extraído los lípidos de la microalga con 500 µl 11. Dejar evaporar el hexano del segundo ependor durante una noche. 1. Registrar el peso seco de la biomasa residual. Al finalizar dicha prueba para cada medio, la concentración de lípido fueron expresados como el porcentaje, calculado de la ecuación %Lip = peso seco de biomasa algal.

 

, donde Xt y X0 son la concentración de

V.

RESULTADOS Y DISCUSION

Los resultados obtenidos muestran que la Raulls Chlorella asimilo y creció en la presencia de las fuentes de carbono inorgánico. Como se muestra en la Tabla 3, los efectos de las fuentes de carbono en la producción de biomasa y la acumulación de lípidos en la biosíntesis de Raulls Chlorella fueron significativos. Después de seis días el cultivo que obtuvo la máxima concentración de biomasa es el medio con glicerol ya que el peso seco obtenido es 0.0177 g, siendo el mayor valor que los de acetato y bicarbonato, esto se debe a su alta densidad celular. Para el contenido de lípidos, que van desde 7.34 hasta 13.33% La productividad de los lípidos más alto de se logró en el cultivo con 1 g / l de acetato en el medio. De acuerdo a los resultados obtenidos vemos que de acuerdo a la fuente de carbono utilizada la capacidad de asimilación de la Raulls Chlorella varia, es decir, la adición fuentes de carbono orgánico como el glicerol promovió la biomasa, sin embargo, en cuanto a la acumulación de lípidos no se observa un efecto notable. Considerando que, los sustratos inorgánicos pueden estimular la síntesis de pigmentos a través de mejorar la fotosíntesis en consideración del contenido de clorofila a nivel de peso seco. Los resultados anteriores sugieren que indican que el acetato estimula la producción de lípidos mientras que el bicarbonato estimula la producción de clorofila en condiciones autotróficas, esto se verifica observando que el medio con bicarbonato presentaba una tonalidad más verde que el de acetato. Medio

Peso Seco

Lípidos

Acetato

0.0090 [g]

13.33 [%]

Bicarbonato

0.0273 [g]

1834 [%]

Glicerol

0.0177 [g]

7.34[%]

Tabla 3. Resultados de las pruebas de fuentes de carbono

Efecto de la concentración de acetato en la producción de biomasa y la acumulación de lípidos. Para determinar qué efecto tiene la concentración de acetato se realizó pruebas con distintas concentraciones de acetato cada 5 días durante un periodo de 15 días. Medio 1 [0.5 % de Acetato de sodio]

Medio 2 [1 % de Acetato de sodio]

Medio 3 [2 % de Acetato de sodio]

Tiempo[días]

Peso Seco [g] % Lípidos [%]

5

0.0020

380

14

0.0048

24

VI.

BIBLIOGRAFIA

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VII.

ANEXOS