UNIVER UNIVERSID SIDAD AD DE LAS FUERZA FUERZAS S ARMAD ARMADAS AS ESPE ESPE
An´ alisis alisis de la viabilidad viabil idad de Saccharomyc Saccharomyces es cerevisia erevisiae e empleada en la fermentaci´ on de cerveza en la empresa on Quinde Brewery Co. mediante pruebas microbiol´ ogicas ogic as y f´ısic ısicoo-qu qu´ ´ımic ımicas as para para su reutilizaci´ on en nuevos procesos on fermentativos.
Tutores:
Autores:
Yanara Naranjo
Lcda. Silvana Granda Ing. Marco Taipe
Carlos Caiza
Departamento de Ciencias de la Vida Carrer Car rera a de Ingen Ing enier´ ier´ıa ıa en Biotec Bio tecno nolog´ log´ıa ıa Sangol San golqu qu´ ´ı-Ecuad ı-Ec uador or Diciembre, 2014.
´ Indice general
Resumen
IV
1. Int Introducci´ roducci´ on on
1
1.1. T´ıtulo del Protecto Pro tecto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
1.2.. Defi 1.2 Definic nici´ i´ on y justificaci´on on on del proyecto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
1.3.. Objet 1.3 Objetoo de Est Estudi udioo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
1.4.. Cam 1.4 Campo po de acc acci´ i´ on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . on
2
1.5.. Objet 1.5 Objetiv ivos os . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
1.5.1. 1.5 .1. Gen General eral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
1.5.2. Espec´ıficos ıficos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
1.6. 1. 6. Hi Hip´ p´ otesis otesis
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2. Mar Marco co Te´ Te´ orico orico
3 4
2.1. Lev Levaduras aduras cerv cervecera eceras: s: Saccharomyces cerevisiae . . . . . . . . . . . . . . .
4
2.2.. Rec 2.2 Recuper uperaci aci´ o´n de S. cerevisiae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . on
5
2.3. Saccharomyces : dos grupos, dos estilos de cerveza . . . . . . . . . . . . . .
5
2.4. Fermen ermentaci´ taci´ on alcoh´ on olica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . olica
5
2.5.. Ela 2.5 Elaborac boraci´ i´ on de lotes de cerveza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . on
6
2.5.1. 2.5 .1. Mac Macerac eraci´ i´ on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . on
6
2.5.2. 2.5 .2. Fil Filtra trado do . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7
i
Contenidos
ii
2.5.3. 2.5 .3. La Lav vado del del grano grano . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7
2.5.4. 2.5 .4. Her Hervid vidoo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7
2.5.5. 2.5 .5. Enf Enfriad riadoo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7
2.5.6. Fermen ermentaci´ taci´ on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . on
7
2.5.7. 2.5 .7. En Env vasa asado do . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8
3. Meto Metodol dolog og´ ´ıa
9
3.1.. Rec 3.1 Recole olecci cci´´on on de muestras de Saccharomyces cerevisiae . . . . . . . . . . . .
9
3.2.. Rec 3.2 Recuper uperaci aci´ o´n de colonias puras de S. cerevisiae . . . . . . . . . . . . . . . on
9
3.2.1. 3.2 .1. Tin Tinci´ ci´ on Gram: Identificaci´on on on morfol´ ogica . . . . . . . . . . . . . . ogica
9
3.2.2. Aisla Aislamien miento to y purific purificaci´ aci´ on de colonias . . . . . . . . . . . . . . . . 10 on 3.2.3. Siem Siembra bra median mediante te dilucio diluciones nes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 3.3.. Pre 3.3 Prepar paraci aci´ o´n de medios de cultivo m´ınimos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 on 3.4.. Inoc 3.4 Inocula ulaci´ ci´ on y crecimiento en medios de cultivo m´ınimos on ınimos . . . . . . . . . . 11 3.4. 3. 4.1. 1. Me Medi dioo S´ olido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 olido 3.4.2. Medio L´ L´ıquido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 3.5. Recue Recuento nto bacte bacteriano riano . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 3.5.1. 3.5 .1. Con Conteo teo en C´ amara de Neubauer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 amara 3.6.. Est 3.6 Estima imaci´ ci´ on de la viabilidad de c´ on elulas de S. cerevisiae . . . . . . . . . . . 12 elulas 3.7.. Ela 3.7 Elaborac boraci´ i´ on de lotes de cerveza con S. cerevisiae recuperadas . . . . . . . 12 on 3.8.. Med 3.8 Medici ici´´on on de la densidad y pH de la cerveza . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 3.9.. Est 3.9 Estima imaci´ ci´ on de contenido de etanol en la cerveza . . . . . . . . . . . . . . . 13 on 4. Res Result ultado ados s y Dis Discus cusi´ i´ on on
14
4.1.. Rec 4.1 Recuper uperaci aci´ o´n y aislamiento de S. cerevisiae . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 on 4.2.. Con 4.2 Conteo teo celu celular lar en C´ C´amara amara de Neubauer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 4.3. Viabil Viabilidad idad celul celular ar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
Contenidos
iii
4.4. 4. 4. An An´ a´li sis F´ısic alisis ısico-Q o-Qu u´ımi ımicos cos de Cerve Cerveza za . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 4.4. 4. 4.1. 1. An An´ a´lisis de grados Brix en cerveza . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 alisis 4.4. 4. 4.2. 2. An An´ a´lisis de pH en cerveza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 alisis 4.4. 4. 4.3. 3. An An´ a´lisis del contenido de alcohol en cerveza . . . . . . . . . . . . . 21 alisis 5. Concl Conclusion usiones es y recome recomendacio ndaciones nes
22
Resumen Este proyecto present´o el an´alisis alisis y factibilidad para la reutilizaci´on o n de S. cerevisiae cerevisiae recuperadas recuperadas de los tanques tanques fermentadores fermentadores en la microcervec microcervecer er´´ıa Quinde Brewery Brewery Co. ubicada en la parroquia pa rroquia de Conocoto, Cono coto, as´ as´ı como la evaluaci´ evaluaci´ on de la calidad de la cerveza on elaborada con ´estas estas hasta el tercer proceso de fermentaci´ f ermentaci´ on. on.
S. cerevisiae cerevisiae se recolectaron de muestras l´ıquidas que fueron debidamente almacenadas y
dirigidas al Laboratorio de Docencia de la Carrera de Ingenier´ Ingenier´ıa en Biotecnolog´ Biotecnolog´ıa donde se las trat´o y analiz´o debidamente de acuerdo a protocolos estandarizados.
El primer paso en laboratorio fue la purificaci´on on de las cepas de S. cerevisiae presentes en todas las muestras recolectadas, para ello se utiliz´o medios selectivos para hongos y levaduras; luego se procedi´o a la formulaci´ on on de medio m edioss de cultivo cul tivo m´ınimos, ınim os, tanto tant o l´ıquido ıqu ido como s´olido. olido. En dichos medios se inocul´o las colonias puras y se incub´o los cultivos por siete d´ıas a temperatura ambiente (17
± 2
o
C). Al cabo de los lo s siete d´ıas de incubaci´on on
los cultivos en medio s´olido olido sirvieron para la determinaci´on on de la morfolog´ morfolog´ıa de Sacmientras que los cultivos cultivos en medio l´ l´ıquido ıquido se utilizaron utilizaron para la charomyces cerevisiae , mientras cuantificaci´ on o n del n´ umero umero de c´ elulas elulas totales y el n´umero umero de c´elulas elulas viables, posterior a esto, el medio l´ıquido inoculado, tambi´ en en fue utilizado para la realizaci´ on on de un nuevo proceso de fermentaci´on on en la micro cervecer´ cervecer´ıa Quinde Brewery Co. Una vez que se concluy´ o la etapa, nuevamente se procedi´o a tomar las muestras y repetir el proceso.
Al cabo de seis semanas de trabajo tanto en la planta cervecera como en el laboratorio se obtuvo tres generaciones de levaduras recuperadas y tres lotes de cervezas elaboradas con ´estas. A cada lote de cerveza se le realizaron realiz aron pruebas prueba s f´ısico-qu´ ısico-qu´ımicas ımicas para evaluar la calidad del producto obtenido y se encontraron resultados positivos.
iv
Resumen
v
Para la cuantificaci´on on celular de cada generaci´ generacion o´n se demostr´o un 95.3 95.3 %, 91. 91.44 % y 82.3 82.3 % de c´elulas elulas viables para la primera, segunda y tercera generaci´on on de S. cerevisiae respectivamente, datos que est´an an en el rango aceptable para levaduras recuperadas. Por otro lado se concluy´o que al cabo de siete d´ıas ıas de incubaci´on on el n´ umero umero total de c´elulas elulas de S. elulas elulas por cerevisiae , en promedio, fue del 20,8 millones, 12 millones y 8,33 millones de c´ mililitro mililit ro de medio l´ıquido en cada cad a generaci´ gener aci´on; on; respect resp ectoo a las prueba pru ebass f´ısicas ısi cas y qu´ımicas ımi cas se obtuvo que la densidad final de la cerveza expresada en grados Brix fueron de 6.2, 5.7 y 5.3 o Brix en la tercera, segunda y primera generaci´on, on, los valores de pH medios obtenidos fueron de 4.3, 4,5 y 4.8 para la primera, segunda y tercera generaci´on on y finalmente los valores medios del contenido de alcohol para la primera, segunda y tercera generaci´on fueron 5.2, 4.6 y 4.2 ABV respectivamente. Todos los valores obtenidos est´an an en el rango permitido seg´ un la normas para cerveza; por lo que se concluy´o que la reutilizaci´on un on de recuperadas de los tanques de fermentaci´on on es una medida factible y viable S. cerevisiae recuperadas en una cervecer´ cerve cer´ıa. ıa.
Cap´ıtulo 1
Introducci´ on on
1.1.
T´ıtulo del Protecto
An´ alisis alisis de la viabilidad de Saccharomyces o n de Saccharomyces cerevisia cerevisiae e empleada en la fermentaci´on cerveza en la empresa Quinde Brewery Co. mediante pruebas microbiol´ogicas ogi cas y f´ısicoısic oqu´ qu´ımicas para su reutilizaci´ reutil izaci´on on en nuevos procesos fermentativos.
1.2. 1.2.
Defin Definic ici´ i´ on on y justificaci´ on on del proyecto
El uso de Saccharomyces cerevisiae en la producci´on on de cerveza se ha dado desde hace varios miles de a˜nos nos y hoy en d´ıa esta bebida alcoh´ olica olica de moderaci´on o n es una de las m´as as consumidas mundialmente. El desarrollo tecnol´ogico ogico ha permitido que en el ´ultimo ultimo siglo se creen peque˜nas nas empresas, denominadas microcervecer´ microcervecer´ıas, encargadas de elaborar cervezas de alta calidad pero p ero a una escala mucho menor que las grandes cervecer´ cervecer´ıas industriales. En Ecuador, desde hace ya 25 a˜nos, nos, se han creado varias microcervecer micro cervecer´´ıas las cuales ofrecen al mercado una amplia variedad de cervezas y, en los ´ultimos ultimos cinco a˜ nos se ha experimentado un acelerado aumento de las mismas. nos
La recuperaci´on on y reutilizaci´on on de levaduras luego de varios procesos de fermentaci´on on es una pr´actica actica que se ha implementado en la mayor parte de las grandes cervecer´ cervecer´ıas a nivel mundial y en una menor proporci´on on en las l as microcer micr ocervecer vecer´´ıas. En Ecuador Ecuado r existe exist e una compa˜ n´ıa multinacion multi nacional, al, Cervecer Ce rvecer´´ıa Nacional Na cional,, que produce pro duce el 98 % de cerveza c erveza consumida co nsumida (cerca de 300 millones de litros anuales, pero la producci´on on neta es de 450 millones de litros por a˜ no) no) y poco m´as as de 45 microcervecer´ microcervecer´ıas que generan aproximadamente 8 millones de litros al a˜no, no, la gran empresa multinacion multinacional al tiene un programa programa de recuperaci´ on on 1
Introducci´ on
2
y reutilizaci´on on de levaduras con lo cual puede ahorrar cerca de 45 millones de d´olares anuales mientras que las peque˜nas nas empresas no cuentan con este tipo de programas. El proceso de recuperaci´on on de levaduras es simple y representa un ahorro de diez centavos por cada d´olar olar de inversi´on on para la elaboraci´ on de cerveza, lo que genera una consideon rable cantidad cantidad de dinero que podr´ podr´ıa ser destinado para otros procesos en las empresas empresas y, tambi´en en se disminuye la producci´ pro ducci´on on de desechos l´ıquidos ıquido s [?, ?, ?].
Seg´ un varios autores, una compa˜ un n´ıa cervecera puede reutilizar levaduras levaduras hasta por ocho etapas de fermentaci´on on siempre que se mantenga procesos muy bien controlados y el almacenamie almacenamiento nto de levaduras levaduras sea adecuado adecuado [?, ?].
Debido al aumento del consumo de cervezas de mejor calidad, es decir, cervezas elaboradas por microcervecer´ microcervecer´ıas; y en funci´on on del cambio de la Matriz Productiva Nacional se ha pensado crear un protocolo para que estas peque˜nas nas empresas puedan aprovechar levaduras recuperadas y utilizarlas en futuros procesos de fermentaci´on. on.
1.3. 1.3.
Objeto Objeto de Estu Estudi dio o
on alcoh´ olica olica en una Saccharomyces Saccharomyces cerevisia cerevisiae e empleadas en el proceso de fermentaci´on cervecer´ cer vecer´ıa ıa local. lo cal.
1.4. 1.4.
Campo ampo de acci´ ci´ on on
El proyecto se orient´o en primera instancia al ´area area microbiol´ ogica donde se desarroll´o la ogica purificaci´ on, on, conteo celular y an´alisis alisis de la viabilidad de las c´elulas elulas de levaduras levaduras recuperadas para posteriormente dirigirlo al ´area area industrial cuando se optimiz´o el proceso de fermentaci´ on al reutilizar las levaduras recuperadas de procesos anteriores. on
1.5. 1.5. 1.5. 1.5.1. 1.
Objeti Objetiv vos Gene Genera rall
Analizar la viabilidad de Saccharomyces cerevisiae empleada empleada en la fermentaci´on on de cerveza en la empresa Quinde Brewery Co. mediante pruebas microbiol´og ogic icas as y f´ısico ıs ico-q -qu u´ımic ım icas as para su reutilizaci´on on en nuevos procesos fermentativos.
Introducci´ on
1.5.2.
3
Espec Espe c´ıficos
Recuperar muestras l´ıquidas de Saccharomyces Saccharomyces cerevisia cerevisiae e de la etapa final del proceso de fermentaci´ fermentaci´ on como material de estudio del proyecto. on Determinar Determ inar medios l´ıquido y s´ s ´olido olido m´ınimos e ideales idea les para par a el cultivo c ultivo y propagaci´ propag aci´on on de Saccharomyces cerevisiae . Identificar an´alisis alisis microbiol´ogicos ogicos adecuados para la determinaci´ on on de la viabilidad de las c´elulas elulas de S. cerevisiae posterior posterior a la fermentaci´on. on. Plantear m´etodos etodos de control de calidad para cerveza.
1.6.
Hipotesis o ´tesis
on puede ser reutiliSaccharomyces cerevisiae recuperada de los tanques de fermentaci´on zada para nuevos procesos de elaboraci´on on de cerveza.
Cap´ıtulo 2
Marco Te´ orico orico
2.1. 2.1.
Levadu Levaduras ras cerv cerveceras eceras:: Saccharomyces Saccharomyces cerevisiae
La habilidad de S. cerevisiae on on ha sido cerevisiae para leudar y generar etanol en la fermentaci´ aprovechada por la humanidad desde hace miles de a˜nos. nos. Adem´as as desde su identificaci´on on como responsable de estos y otros procesos han sido ampliamente estudiadas, y hoy en d´ıa existen muchas aplicaciones de levaduras en diversas ´areas industriales, principalmente en el ´area area de alimentos y bebidas [ ?].
El uso de S. cerevisiae para la producci´ on on de bebidas alcoh´olicas, olicas, vinos y cervezas en especial, ha constituido una empresa muy rentable. En la industria cervecera, estas levaduras, constituyen un aspecto fundamental en el proceso de obtenci´on de productos de buena calidad por ello que el estudio de esta especie se ha desarrollado enormemente hasta el punto punto de manipulacion manipulaciones es a nivel nivel gen´ gen´etico etico para el mejoramient mejoramientoo de cepas espec pe c´ıfica ıfi cass de S. cerevisiae .
organismos unicelulare unicelularess de forma esf´ esf´erica, erica, elipsoide elipsoide u ovoide. ovoide. Su taS. cerevisiae cerevisiae son organismos ma˜ no no var´ ar´ıa con la edad de la c´ elula elula pero p ero generalmen generalmente te oscila oscila entre entre 4 y 14 micras que toman az´ ucares ucares simples simples como glucosa glucosa o maltosa maltosa de su entorno y los utilizan como fuente de energ´ energ´ıa para sobrevivir, como resultado de este proceso producen etanol y di´oxido oxido de carbono [?].
4
Marco Te´ orico
2.2.
5
Recuperaci´ on on de S. cerevisiae
recuperadas de los tanque tanquess de fermen fermentac taci´ i´ on pueden ser reutilizadas de on S. cerevisiae cerevisiae recuperadas inmediato en nuevos procesos fermentativos sin necesidad de tratamientos, siempre y cuando las condiciones de fermentaci´on on y separaci´on on hayan sido muy as´epticas epticas [?, ?]. Este proceso puede ser repetido hasta siete ocasiones pero en cada recuperaci´on se obtienen generaciones distintas y con ello se tiene problemas para elaborar una misma cerveza [?]. Esto Esto se debe a la presen presencia cia de c´ elulas elulas de S. cerevisiae cerevisiae no viables, a las mutacione mutacioness gen´ eticas eticas en las distintas distintas generaciones generaciones y otros factores factores que hacen que las nuevas generaciones no act´uen uen de una manera homog´enea. enea.
2.3. Saccharomyces : dos grupos, dos estilos de cerveza Se ha descrito el mecanismo de obtenci´on on de etanol utilizando la especie S. cerevisiae que que es una levadura levadura conocida como levadura levadura tipo Ale. Este t´ ermino ermino tiene su origen a principios del siglo XIX en varios pa´ pa´ıses europeos donde se utilizaba ´estas estas porque trabajan trabaja n en rangos de temperatura que van desde 15 a 22 o C y por ello las llamaban levaduras 1 de alta fermentaci´on. on. Existe otro tipo de levaduras, S. carlsbergensis por ejemplo, que fermentan a temperaturas bajas, desde 8 a 12 o C, a ´estas estas se las conoce como levaduras levaduras tipo Lager o de baja fermentaci´on on [?, ?].
Las variedades de levaduras de alta y baja fermentaci´on, o n, que han dado su fama a los dos grandes grandes grupos de cervezas cervezas Ale y Lager respectiv respectivamente, amente, tienen tienen una caracter caracter´´ıstica importante desde el punto de vista industrial y artesanal; al finalizar el proceso de fermentaci´ on on ´estas estas tienden a agruparse agruparse y depositarse depositarse en el fondo del tanque, tanque, esta propiedad se conoce como floculaci´on, on, esto se atribuye a la composici´on on de la pared celular de estos microorganismos y su potencial hidrof´obico. obico. Gracias a esto es posible separar a las levaduras por simple decantaci´on on y con ello se las puede reutilizar en posteriores fermentaciones [?].
2.4. 2.4.
Fermen ermentac taci´ i´ on on alco alcoh´ h´ olic ol ica a
Gracias al metabolismo de levaduras como S. cerevisiae se se puede generar etanol a partir de una fuente de compuestos de carbono. En el proceso de producci´on on de cerveza o vino se utiliza ciertos cereales o frutas para obtener az´ucares ucares simples, adem´as as se obtienen 1
La palabra levadura es ampliamente utilizada en referencia del organimo del g´ enero enero Saccharomyces
Marco Te´ orico
6
otros compuestos nitrogenados y fosfatados, todos ellos est´an an presentes en el mosto o caldo azucarado extra´ extra´ıdo de frutas y cereales, que sirve como medio de crecimiento para las levaduras levaduras ya que ´este este contiene todo lo necesario, necesario, fuente fuente de carbono (az´ ucares ucares simples), prote´ınas ınas (compuestos nitrogenados) y gran gr an variedad de sales (fosfatos, sulfatos, etc.) para que estos microorganismos se multipliquen y generen etanol, di´oxido de carbono y otros compuestos propios de las bebidas alcoh´olicas. olicas.
El proceso de conversi´on on de az´ ucar ucar en etanol y di´oxido oxido de carbono se conoce como fermentaci´ on on alcoh´ olica, o simplemente fermentaci´on, olica, on, y ocurre en recipientes donde se tiene el mosto y las levaduras levaduras ba jo ciertas ciertas condiciones condiciones controladas. controladas. Los recipient recipientes es adecuados para este proceso son tanques fermentadores dise˜nados nados espec´ espec´ıficamente para cuando el proceso finalice se pueda separar el l´ıquido ıquido fermentado fermentado y las levaduras levaduras.. El proceso de fermentaci´ on tiene un tiempo de duraci´on on on que var´ var´ıa seg´ seg un u ´ n las condiciones condiciones de crecimiento y estado de las levaduras. En la producci´on de cerveza el tiempo de fermentaci´on va desde tres d´ıas hasta varios meses dependiendo del tipo tip o y estilo de cerveza que se desea obtener. Para cervezas Ale, elaboradas con levaduras de alta fermentaci´on, on, se puede fijar el tiempo de fermentaci´on on en siete d´ıas [?, ?, ?]. Al cabo de este tiempo se separan las levaduras levaduras y, el l´ıquido resultante se conoce como cerveza verde que se almacena en otros fermentadores para su maduraci´on on y posterior acondicionamiento. La levadura separada puede ser tratada y almacenada en bancos criog´enicos enicos para posteriores fermentaciones [?].
2.5. 2.5.
Elabo Elabora raci ci´ ´ on de lotes de cerveza on
La elaboraci´ on de cerveza es un proceso sencillo que consta de varias operaciones. Se on puede resumir brevemente dicho proceso en los siguientes pasos [ ?, ?, ?].
2.5.1. 2.5.1.
Macer Maceraci aci´ ´ on on
Aqu´ Aqu´ı se mezcla los granos de cebada malteada previamente triturados con agua a 72 o C, la mezcla se deja en agitaci´on on por 90 minutos. En esta etapa las enzimas presentes en los granos como beta-glucanasas, amilasas y maltasas se activan y degradan el almid´on en az´ ucares simples como maltosa, glucosa, fructosa, maltotriosa, etc.; estos compuestos ucares son disueltos en el agua y forman una soluci´on azucarada conocida como Mosto.
Marco Te´ orico
2.5. 2.5.2. 2.
7
Filt Filtra rado do
Luego de la maceraci´on on se debe separar separar o filtrar el mosto del grano. El l´ıquido ıquido es conducido a la olla de hervido. El proceso de filtardo se lo realiza gracias a un tamiz en el fondo de la olla de maceraci´on. on.
2.5.3. 2.5.3.
Lav Lavado del grano grano
El grano que se separ´o del mosto es lavado con agua caliente a 82 o C para recoger los az´ ucares ucares restantes e inactivar las enzimas catal cata l´ıticas que a´un un se encuentren presentes. Nuevamente se filtra el agua que es conducida a la olla de hervido.
2.5. 2.5.4. 4.
Herv Hervid ido o
El mosto que se filtr´o es almacenado almacenado en una olla para someterlo someterlo a temperaturas elevadas elevadas hasta alcanzar el punto de ebullici´on, on, esta etapa puede durar entre dos a cinco horas dependiendo del volumen manejado. La ebullici´on on debe mantenerse por al menos 70 minutos y durante este tiempo se a˜nade nade dosis alternadas de flores de l´upulo upulo2 y se consigue la esterilizaci´on on completa del mosto.
2.5. 2.5.5. 5.
Enfr Enfria iado do
Al terminar el proceso de ebuillici´on on el mosto se encuentra aproximadamente a 110 o C por lo que es necesario enfriarlo r´apidamente apidamente a temperaturas entre 25-30 o C para lo cual se utilizan intercambiadores de calor de distintas formas seg´un un sea el volumen, para el caso de peque˜nas nas cervecer´ cervecer´ıas los intercambiadores de placas son utilizados por su ba jo costo econ´omico omico y alta eficiencia.
2.5.6. 2.5.6.
Ferment ermentaci´ aci´ on on
Una vez que se tiene el mosto mo sto fr f r´ıo se lo ino cula con una un a cantidad canti dad espec´ es pec´ıfica ıfica de S. cerevisiae para que ´esta esta transforme trans forme los az´ a z´ ucares ucares en etanol y di´oxido oxido de carbono. Este proceso puede durar unos poco p ocoss d´ d´ıas e incluso a˜nos nos en funci´on on del estilo de cerveza que se desea obtener. 2
Planta trapadora de la familia de las cannabinaceas que otorga a la cerveza su amargor caracter´ caracter´ıstico.
Marco Te´ orico
2.5.7. 2.5.7.
8
Env Envasado asado
Finalizada la fermentaci´on on se separa la levadura y la cerveza es almacenada, ya sea en botellas o barriles, para que madure y gane di´oxido de carbono y efervescencia.
Cap´ıtulo 3
Meto dolog´ıa
3.1. 3.1.
Reco Recole lecc cci´ i´ on on de muestras de Saccharomyces cerevisiae
La recolecci´on on de muestras de S. cerevisiae fue realizada realizada directamente directamente de los tanques de fermentaci´ on en la planta de operaci´on on on de la cervecer cervecer´´ıa Quinde Quinde Brewery Brewery Co. y con la ayuda del jefe de planta. En frascos de pl´astico astico est´eriles eriles se tom´o 100 mL de muestra l´ıquida ıquida directamente de las llaves de salida de los fermentadores, el uso de mascarilla y guantes es obligatorio, los recipientes son sellados con parafilm y trasladados al laboratorio en un lapso no mayor de una hora donde se los almacena en refrigeraci´on on a 4 o C para realizar realizar todas las pruebas previstas.
3.2.
Recuperaci´ Recuperaci´ on on de colonias colonias puras de S. cerevisiae
Una vez que se tiene las muestras en el laboratorio primero se procede a identificar los microorganismos presentes para luego aislar y purificar las cepas de S. cerevisiae .
3.2. 3.2.1. 1.
Tinc Tinci´ i´ on Gram: Identificaci´ on on on morfol´ ogica ogica
Para la identificaci´on on de microorganismos presentes en muestras de cerveza artesanal, primero se debe identificar la morfolog´ morfolog´ıa general de los microorganismos de inter´ es es y clasificarlos seg´ un su respuesta a la tinci´on un on Gram. Las c´elulas elulas de S. cerevisiae son son organismos Gram Gr am Positivos y tienen una forma ovoide caracter´ caracter´ıstica [?].
9
10
Metod Me todol olog´ og´ıa ıa
3.2.2. 3.2.2.
Aisla Aislami mien ento to y puri purific ficaci aci´ ´ on on de colonias
Identificadas los organismos presentes en las muestras se prepar´o un medio selectivo para hongos y levaduras para lograr aislar las colonias puras de S. cerevisiae y verificar que no existen organismos contaminantes. El medio utilizado es conocido como PDA (por sus siglas en ingl´es, es, Potato Dextrose Agar) [?, ?].
3.2.3. 3.2.3.
Siembra Siembra median mediante te dilucion diluciones es
La t´ecnica ecni ca de diluci´ dilu ci´on on consiste en inocular 10 tubos de ensayo que contienen 9 mL agua destilada. destilada. Se obtiene obtiene 1 mL de la muestra muestra usando usando una micro pipeta est´eril, eril, se inocula el primer tubo de ensayo, sin retirar la punta se agita el mismo luego se invierte y se retira 1 mL que se inocula en el segundo tubo de ensayo y as´ as´ı se sigue sucesiv sucesivamen amente te hasta llegar al tubo 10. Cada una de los tubos con las distintas diluciones se agita y se toma 1 mL de esta soluci´on on que se vierte en cajas de Petri que contienen el medio PDA s´olido preparado.
Una vez que se inocula el medio con las diluciones se incuba las cajas de Petri por cinco d´ıas a temperatur tempe ratura a promedio pr omedio de 17 1 7±2 o C. Finalmente se tiene colonias aisladas y puras de S. cerevisiae para continuar con los an´ alisis alisis correspondientes.
3.3. 3.3.
Prep Prepar arac aci´ i´ on on de medios de cultivo m´ınimos
Existen varios medios apropiados para el crecimiento de S. cerevisiae , sin embargo, en el presente traba jo se quiere estandarizar un medio de cultivo m´ınimo. ınimo. Este medio debe poseer los nutrientes b´asicos asicos y necesarios para el adecuado desarrollo y crecimiento de ogeno ogeno S. cerevisiae como son una fuente de carbono (generalmente un disac´arido), nitr´ y f´osforo; osforo; a continuaci´on on las tablas 3.1 y 3.2 3.2 muestran muestran la composici´on on para los medios l´ıquid ıqu idos os y s´olidos, olidos, respectivamente: on on Cuadro 3.1: Composici´
de reactivos para un litro de medio l´ıquido.
Reactivo
Cantidad
Cald Caldoo Nutri Nutritiv tivoo
8 gramo gramoss
Sacarosa
20 gramos
Agua Ag ua dest destil ilad adaa
10 1000 00 mL
11
Metod Me todol olog´ og´ıa ıa on on Cuadro Cuadro 3.2: Composici´
3.4.
de reactivos para un litro de medio s´olido.
Reactivo
Cantidad
Cald Caldoo Nutri Nutritiv tivoo
8 gramo gramoss
Sacarosa
20 gramos
Agar agar
15 gramos
Agua Ag ua dest destil ilad adaa
10 1000 00 mL
Inoculaci´ on on y crecimiento crecimiento en medios de cultivo cultivo m´ınimos
3.4. 3.4.1. 1.
Medi Medio o S´ olido olido
Al aislar y purificar correctamente colonias de S. cerevisiae se se procede a preparar medio s´ olido olido en tubos de ensayo de 25 mL, ´estos estos se colocan colo can de manera inclinada para conseguir una buena ´area area de sembrado. Los tubos son inoculados con la muestra recuperada y la ayuda de una asa bacteriol´ogica ogica en forma de estr´ estr´ıas e incubados incubados por siete d´ıas a temperatura promedio de 17±2 o C y luego almacenados en refrigeraci´on o n a 4 o C. Estos cultivos en medio s´olido olido sirvir´ sirviran a´n posteriormente para llevar llevar un control de la morfolog´ morfolog´ıa de las levaduras y posibles contaminaciones a lo largo de todos los an´alisis. alisis.
3.4.2.
Medio L´ıquido
En 250 mL de medio l´ıquido se inocula ino cula 1 mL de la levadura recuperada. Estos medios se incuban a temperatura de 17±2 o C en Erlenmeye Erlenmeyerr de 500mL con agitaci´ agitaci´ on on durante siete d´ıas. Al finalizar finaliza r la l a incubaci´ incubac i´on on se debe tomar to mar 50 mL de cultivo l´ l´ıquido para realizar las pruebas de control, conteo y viabilidad de las c´ elulas elulas de S. cerevisiae , los restantes 200 mL ser´an an trasladados tr asladados a la planta de la cervecer´ cervecer´ıa con los cuales se elaborar´ elab orar´a cerveza.
3.5. 3.5.
Recuen Recuento to bacter bacterian iano o
Para el conteo del n´ umero umero total de c´elulas elulas de S. cerevisiae presentes presentes en las muestras se utiliza el m´etodo etodo de recuento en C´amara amara de Neubauer.
3.5.1.
Conteo en C´ amara amara de Neubauer Neubauer
El recuento en c´amara amara de Neubauer es un m´etodo etodo directo ya que cuenta directamente las c´ elulas elulas presentes en las diferentes diluciones. De las diluciones preparadas se toma una
12
Metod Me todol olog´ og´ıa ıa
peque˜ na na al´ al´ıcuota para colocarla sobre la c´ amara de Neubauer, se cubre con un cubreobamara jetos y se lleva al microscopio donde se cuenta las c´elulas elulas individuales a una amplificaci´on de 40x. Se utiliza el m´etodo etodo corto de conteo por el cual se cuenta ´unicame uni camente nte las c´elulas elu las presentes en ciertos cuadrantes, al final del conteo se aplica una relaci´on num´erica eri ca para par a obtener el n´ umero umero de c´elulas elulas presentes pr esentes en la muestra. La relaci´on on utilizada es: [ ?] N cel cel 3 = N cont cont ∗ n ∗ f d ∗ 10 mL
(3.1)
Donde, N cel umero umero total de c´elulas elulas presentes en la muestra, N cont umero umero de cont el n´ cel es el n´ c´elulas elulas contadas en los cuadrantes, n es el n´umero umero de cuadrantes contados y f d el factor de diluci´ diluci´on. on.
3.6. 3.6.
Esti Estima maci ci´ on o ´n de la viabilidad viabili dad de c´ elulas elulas de S. cerevisiae
La v viabili iabilidad dad de las l as c´elulas elulas de S. Cerevisiae es primordial para su utilizaci´on on en nuevos procesos de fermentaci´on, on, por ello se debe estimar su valor. Se encuentra la relaci´on entre el n´ umero umero total de c´elulas elulas y el n´umero umero de c´ elulas elulas vivas presentes en las muestras recolectadas recolectadas.. Para cuantificar cuantificar el n´ umero umero de c´ elulas elulas vivas vivas se utiliza utiliza una modificaci´ modificaci´on on del m´etodo etodo de conteo en C´amara amara de Neubauer Neubauer en el que se toma una al´ al´ıcuota de las diferentes diluciones y se las ti˜ne ne con una soluci´on on al 0.1 % de Azul Azul de Metile Metileno, no, luego luego se cuenta cuenta de manera id´entica entica a la descrita descrita en el apartado apartado anterior, anterior, la diferencia diferencia es que esta vez se debe contar ´unicamente unicamente las c´ elulas elulas coloreadas de azul ya que ´estas estas son las que est´an an metab´olicamente olicamente activas. El porcentaje de viabilidad se calcula como: V =
3.7. 3.7.
N vivas vivas x100 N cel cel
(3.2)
Elabo Elabora raci ci´ ´ on de lotes de cerveza con S. cerevisiae on erevisiae recuperadas
Luego que las c´eluas eluas de S. cerevisiae recuperadas son propagadas y cuantificadas en el medio l´ıquido por siete d´ıas deben debe n ser se r traslad t rasladas as a la l a planta de la l a cervecer´ c ervecer´ıa ıa en recipientes recipie ntes de vidrio ´ambar ambar est´ est´eriles eriles y sellados sellados donde se elabora un lote con cada generaci´ generaci´ on o n de las mismas. Cada lote de cerveza contiene aproximadamente 18 litros los cuales son preparados siguiendo la metodolog meto dolog´´ıa antes descrita y con los ingredientes que se muestran en la tabla 3.3 tabla 3.3..
13
Metod Me todol olog´ og´ıa ıa Cuadro 3.3: Cantidad
3.8. 3.8.
de materias primas para elaborar 18 litros de cerveza.
Insumo
Cantidad
Agua
26 L
Malta de cebada
5 Kg
L´upulo en pel pellets
40 g
Levadura Levadura l´ıquida ıquida
150 mL
Med Medici´ ici´ on de la densidad y pH de la cerveza on
Al finalizar la fermentaci´on on se procede a tomar muestras de la cerveza para medir su densidad densidad y pH. Para la densidad densidad se utiliza utiliza un m´ etodo etodo indirecto indirecto que consiste consiste en medir los grados Brix de la muestra con ayuda de un equipo calibrado llamado Brix´ometro, para ello se toma una gota de muestra y se coloca en el lector ´optico del aparato, se anota el valor marcado en grados Brix. Tambi´ Tambi´en en se mide el pH en la muestra de cerveza, para este paso se toma cerca de 50 mL de muestra y con el pH-metro se mide el valor medido.
3.9. 3.9.
Esti Estima maci ci´ o on ´n de contenido de etanol en la cerveza
Para cuantificar la cantidad de etanol presente en las muestras de cerveza se realiza una destilaci´ on o n r´ apida en la cual se debe utilizar 100 mL de cerveza que se calienta en el apida equipo destilador a 78 o C y por vaporizaci´on on y condensaci´on on se recolecta el etanol en una probeta graduada. El porcentaje de etanol se lo estima con la relaci´on on [?, ?]: ABV =
V etOH x100 Vc
(3.3)
Donde, V etOH es el volumen de etanol recuperado en la destilaci´on y Vc es el volumen de cerveza utilizado. Las siglas ABV significan el volumen de alcohol por volumen de cerveza (Alcohol By Volumen, por sus siglas en ingles).
Cap´ıtulo 4
Resultados y Discusi´ on on
4.1.
Recuperaci´ Recuperaci´ on on y aislamiento aislamiento de S. cerevisiae
En las figuras 4.1 figuras 4.1 y y 4.2 4.2 se se observa las colonias puras de S. cerevisiae aisladas aisladas y cultivadas en medio selectivo PDA, as´ as´ı como la tinci´on on Gram de dichas colonias.
Figura Figura 4.1: S.
cerevisiae aisladas en medio selectivo PDA (Caiza, 2014).
Figura Figura 4.2: S.
cerevisiae aisladas. 100x (Caiza, 2014).
14
15
Resultados y Discusi´ on
Seg´ un un [?] y [?], el crecimiento de S. cerevisiae en en medio de cultivo s´olido olido PDA es r´apido apido ya que las colonias empiezan a ser visibles aproximadamente a las 48 horas de inoculaci´ on on y la morfolog morfo log´´ıa de ´estas estas es muy caracter caract er´´ıstica, ıstica , present´andose andose siempre como discos redondos de color blanco y borde regular. De esta manera se logr´o tener una idea concreta que los organismos que crecieron en tales medios, efectivamente eran levaduras.
La identificaci´on on con tinci´on on Gram permiti´o observar observar la morfolog´ morfolog´ıa de los organismos que crecieron en el medio PDA, los mismos que presentaron formas ovoides de color morado-azul morado-azul demostrando demostrando que son microorganismos microorganismos Gram Positiv Positivos. os. Las c´ eluas eluas de S. ısticas inconfundibles bajo el microscopio a un aumento cerevisiae poseen estas caracte´ısticas de 100x [?, ?, ?].
4.2.
Conteo Conteo celular celular en C´ amara amara de Neubauer Neubauer
Al finalizar la etapa de purificaci´on on y aislamiento de colonias de S. cerevisiae se se inocul´o estas cepas en los medios m´ınimos ınimos preparados previamente como se muestra en la figura 4.3.. La incubaci´on 4.3 on dur´o siete d´ıas ıas y al cabo de esto se cont´o las c´elulas elulas presentes en el medio med io l´ıquid ıqu ido. o.
on on Figura 4.3: Inoculaci´
de S. cerevisiae recupera rec uperadas das en medios me dios m´ınimos s´olido ol ido y l´ıqui ıq ui-do (Caiza, (Caiza, 2014). 2014).
A continuaci´on on en la figura 4.4 figura 4.4 se muestra el conteo en C´amara amara de Neubauer, para esto se realizaron dilusiones consecutivas del medio l´ıquido, se encontr´o que la diluci´on on 10−2 fue la m´as as apta para efectuar el conteo.
La tabla 4.1 muestra el conteo de c´elulas elulas para la dilusi´on o n 10−2 , como se indic´o en la metodolog´ metodolog´ıa, el conteo se realiz´ o en cinco cuadrantes y se aplic´o la ecuaci´on on 3.1 para estimar el n´ umero umero de c´elulas elulas por mL.
16
Resultados y Discusi´ on
elul el ulas as Figura 4.4: C´
de S. cerevisiae amara de Neubauer vistas al microscopio. amara cerevisiae en C´ 40x (Caiza, 2014).
Cuadro 4.1: Datos
observados en C´amara amara Neubauer para las c´ elulas elulas por mL.
f d Generaci´ on on
Repe Repeti tici ci´´on on
N cont cont
n
N cel cel
100
Pr P rimera
1
45
5
2,25 ∗ 107
100
Pr P rimera
2
38
5
1,90 ∗ 107
100
Pr P rimera
3
42
5
2,10 ∗ 107
100
Se Segunda
1
24
5
1,20 ∗ 107
100
Se Segunda
2
27
5
1,35 ∗ 107
100
Se Segunda
3
21
5
1,05 ∗ 107
100
Tercera
1
14
5
7,00 ∗ 106
100
Tercera
2
19
5
9,50 ∗ 106
100
Tercera
3
17
5
8,50 ∗ 106
Como indica la tabla 4.1 tabla 4.1 el el n´ umero umer o de d e de d e c´elulas elul as de S. cerevisiae por por mililitro disminuye de una generaci´on on a otra. Este resultado era de esperar, seg´un un [?], [?] y [?] con cada proceso fermentativo las c´elulas elulas pierden la capacidad de multiplicaci´ on on por algunos factores como la mutaci´on on espont´anea anea o la temperatura de fermentaci´on. on.
El an´ alisis alisis estad´ıstico ıstico muestra las diferencias que existen entre cada generaci´on o n de S. cerevisiae recuperadas.
La figura 4.5 figura 4.5 muestra gr´ aficamente aficamente como el n´umero umero de c´elulas elulas de levadura l evadura disminuye d isminuye en en cada generaci´ on. on. El an´alisis alisis de varianza ANOVA para este gr´afico afico se indica en la figura 4.6.. 4.6 Se observa que hay diferencias significativas para las generaciones de S. cerevisiae (pvalor=0.0001479) en relaci´ on o n al n´ umero umero de c´elulas elulas presentes en las muestras, aunque la segunda y tercera generaci´on on resultan ser iguales estad´ estad´ısticamente hablando. La primera generaci´ on on ser´ ser´ıa la mejor en relaci´ relaci on o´n a este par´ametro. ametro.
17
Resultados y Discusi´ on
umero umero de Figura 4.5: Variaciones del n´
Figura Figura 4.6:
c´ elulas elulas por mL m L para las diferentes di ferentes generacion ge neraciones. es.
An´ alisis de la varianza para el n´umero alisis umero de c´ elulas elulas de lS. cerevisiae .
Debido a esta diferencia se realiz´o una prueba de Duncan para las medias, la figura 4.7 figura 4.7 muestra el rango de diferencias entre generaciones y adem´as as se observ´o que la primera generaci´ on on present´o el mayor n´ umero umero de c´elulas elulas por mL. De acuerdo con la prueba de Duncan se obtuvo valores promedios de 20,8 millones, 12 millones y 8,3 millones de c´ elulas elulas de S. cerevisiae cerevisiae por mL. Dichos valores concuerdan con datos rerportados por [?, ?, ?].
Adem´ as as seg´ un un [?] y [?], el n´ umero umero de c´ elulas elulas por p or mL aceptable para iniciar un proceso fermentativo es de 10-20 millones, los datos reportados en el presente trabajo est´an an
18
Resultados y Discusi´ on
Figura Figura 4.7: Prueba
Dunca para el n´umero ume ro de c´elulas elul as de S. cerevisiae (α = 0,01).
dentro de este rango para la primera y segunda generaci´on de S. cerevisiae recuperadas.
4.3. 4.3.
Viab Viabil ilid idad ad celu celula lar r
Posterior al conteo de c´ elulas elulas en los medios l´ıquidos se ti˜n´ no´ una al´ al´ıcuota de muestra de cada generaci´on on de S. cerevisiae para estimar la viabilidad de c´ elulas, elulas, es decir, para estimar qu´e porcenta por centaje je de c´elulas elulas estuvieron estuvie ron metab´olicamente olicam ente activas. a ctivas. As A s´ı la la v viabili iabilidad dad se calcul´o con la ecuaci´on 3.2 on 3.2 y los resultados se indican en la figura 4.8 y la tabla 4.2 tabla 4.2 .
Figura 4.8: S.
cerevisiae te˜ t e˜ nidas con Azul de Metileno vista bajo el microscopio. 100x, nidas
(Caiza, 2014).
La figura 4.9 4.9 muestra muestra que el porcentaje p orcentaje de c´elulas elulas vivas disminuye en cada generaci´on, on, es decir, en cada proceso de recuperaci´on on y fermentaci´on on la supervivencia de las levaduras es menor; en otras palabras con el transcurso del tiempo las c´elulas elulas de S. cerevisiae disminuyen sus procesos metab´olicos olicos y mueren r´apidamente apidamente [?, ?].
19
Resultados y Discusi´ on on on Cuadro 4.2: Estimaci´
de la viabilidad celular.
Generaci´ on on
Repe Repeti tici ci´´on on
N cel cel
N vivas vivas
V ( %)
Primera
1
2,25 ∗ 107
2,10 ∗ 107
93.3
Primera
2
1,90 ∗ 107
1,85 ∗ 107
97.4
Primera
3
2,10 ∗ 107
2,00 ∗ 107
95.2
Segunda
1
1,20 ∗ 107
1,05 ∗ 107
87.5
Segunda
2
1,35 ∗ 107
1,30 ∗ 107
96.3
Segunda
3
1,05 ∗ 107
9,50 ∗ 106
90.5
Tercera
1
7,00 ∗ 106
6,00 ∗ 106
85.7
Tercera
2
9,50 ∗ 106
7,50 ∗ 106
78.9
Tercera
3
8,50 ∗ 106
7,00 ∗ 106
82.4
Figura 4.9: Variaciones
de la viabilidad para las diferentes generaciones.
Adem´ as as el an´alisis alisis de varianza ANOVA para el porcentaje de viabilidad V mostr´ o que existen diferencias significativas entre las generaciones de S. cerevisiae recuperadas (pvalor=0.00954) seg´ un un la figura 4.10 figura 4.10.. Tambi´en en se realiz´ rea liz´o la prueba de Duncan para esta variable y se mostr´o que el mejor tratamiento se da en la primera generaci´on con un mayor may or porcentaje porcentaje de viavilida viavilidad d de c´ elulas, elulas, pero de acuerdo acuerdo a [?], [?], [?] y [?] el porcentaje de c´elulas elulas vivas vivas m´ınimo aceptado para un proceso de fermentaci´ on o n es de 70% lo que significa que cualquiera de las tres generaciones de S. cerevisiae recuperadas son aptas para un proceso de fermentaci´on on ya que en promedio los porcentajes de viabilidad
20
Resultados y Discusi´ on
obteni obtenidos dos en este trabajo trabajo fueron fueron de 95,3 %, 91,4 % y 82, 82,33 % para la primer primera, a, segunda segunda y tercera generaci´on, on, respectivamente. respectivamente. Esto se muestra expl´ıcitamente ıcitamente en la figura 4.11 figura 4.11..
Figura Figura 4.10:
An´ alisis alisis de la varianza varianza para la viabilidad de c´ elulas elulas de S. cerevisiae .
Figura Figura 4.11: Prueba
4.4. 4.4.
Dunca para la viabilidad de c´ elulas elulas de S. cerevisiae (α = 0,01).
An´ alisi ali siss F´ F´ısico ısico-Qu -Qu´ ´ımico ımicoss de de Cervez Ce rveza a
Con las tres generaciones de S. cerevisiae recuperadas se elabor´o tres lotes de cerveza, cada lote de aproximadamente 18 litros de cerveza. De cada lote se tom´o tres muestras que fueron analizadas en el laboratorio para medir los grados Brix, pH y porcentaje de alcohol (ABV) y tener una referencia de la calidad de cerveza que se obtuvo con cada generaci´ on on de S. cerevisiae . Los datos medidos se muestran en la tabla 4 4.3 .3..
El comportamiento de las variables grados Brix, pH y porcentaje de alcohol (ABV) en funci´ on on de la generaci´on on se muestra en las figuras 4.12 4.12,, 4.13 4.13 y y 4.14 4.14..
21
Resultados y Discusi´ on Cuadro Cuadro 4.3:
An´ alisis alisis F´ısico-Qu ısico-Q u´ımicos de la cerveza elaborada elabo rada con S. cerevisiae .
Generaci´on on
Repe Repeti tici ci´´on on
Primera
o
Brix
pH
ABV ( % )
1
5.3
4.2
5 .2
Primera
2
5.4
4.2
5 .2
Primera
3
5.3
4.5
5 .1
Segunda
1
5.5
4.3
4 .8
Segunda
2
5.7
4.6
4 .5
Segunda
3
6.0
4.6
4 .5
Tercera
1
6.2
4.8
4 .2
Tercera
2
6.2
4.7
4 .3
Tercera
3
6.2
4.8
4 .0
Figura 4.12: Porcentaje
de etanol presente en las cervezas.
Las propie pro piedad dades es f´ısico-q ısi co-qu u´ımicas ımic as de la cerveza cerve za var´ var´ıan en relaci rel aci´´on on a la generaci´on on utilizada para su elaboraci´ on. on. Seg´ un un [?], la capacidad capacidad fermentativ fermentativaa de S. cerevisiae disminuye en cada generaci´ on, on, es decir que S. cerevisiae de cada generaci´on on asimilan en forma diferente los compuestos presentes en el caldo a fermentar. Adem´as el metabolismo de cada generaci´ on disminuye lo que explica las diferentes medidas de las variables estudiadas on [?, ?, ?, ?, ?].
22
Resultados y Discusi´ on
Figura 4.13: Grados
Brix medidos en las cervezas.
Figura 4.14: pH
medido en las cervezas.
23
Resultados y Discusi´ on
Gracias al an´alis alis estad´ıstico ıstico se logr´o establecer claramente las diferencias que existen entre cada generaci´on on de S. cerevisiae y y con ello e llo determinar determi nar qu´e generaci´ gen eraci´on on produjo una mejor cerveza.
4.4.1.
An´ alisis de grados Brix en cerveza alisis cerveza
Para la variable de grados Brix las figuras 4.15 figuras 4.15 y 4.16 4.16 indican indican diferencias significativas entre cada generaci´on o n de S. cerevisiae alisis alisis de varianza, cerevisiae (p-valor=0.00118) para el an´ mientras que la prueba de Duncan indica que la gerneraci´on on tercera presenta el mejor valor medio. Se debe mencionar que respecto a la variable de grados Brix, los valores m´as as bajos son los mejores ya que esto significa que la densidad de la cerveza es menor para dichos valores.
Seg´ un un indica la figura 4.16 los valores medios para los grados Brix fueron de 6.2, 5.7 y 5.3 o Brix para la tercera, segunda y primera generaci´on. on. De acuerdo a [?], [?] y [?], la densidad expresada en grados Brix al finalizar la fermentaci´on puede ir de 2.5 hasta 6.5 grados Brix por lo que los valores obtenidos de las muestras de S. cerevisiae en este trabajo est´ an en el rango aceptable. an
Figura 4.15:
An´ alisis de la varianza para la densidad expresada en grados Brix. alisis
Figura 4.16: Prueba
Dunca para la densidad expresada en grados Brix ( α = 0,01).
24
Resultados y Discusi´ on
4.4.2.
An´ alisis alisis de pH en cerveza cerveza
Las figura 4.17 figura 4.17 indica que no hay diferencias estad´ estad´ısticas (p-valor=0.0215) (p-valor=0.0215) para el pH entre las tres muestras de cervezas. Los valores medios obtenidos para esta variable fueron de 4.3, 4,5 y 4.8 para la primera, segunda y tercera generaci´on on respectivamente, esto se muestra en la figura 4.18 4.18.. La prueba de Duncan mostr´o claramente que las tres generaciones de S. cerevisiae presentan presentan valores de pH dentro de un mismo rango.
Figura 4.17:
An´ alisis de la varianza para el pH de las cervezas. alisis
Figura 4.18: Prueba
Dunca para el pH de las cervezas ( α = 0,01).
Los valores medidos para el pH de todas las muestras de cerveza est´an de acuerdo con la norma ecuatoriana para bebidad alcoh´ olicas, donde se indica que el pH de cerveza olicas, est´ a en el rago de 3.5 a 5.0 5.0,, estos estos valo alores res tambi tambi´´en en se refere referenci ncian an en otros otros estudi estudios os y normas internacionales [?, ?, ?].
4.4.3.
An´ alisis alisis del contenido contenido de alcohol en cerveza
Finalmente se realiz´o una destilaci´on on r´ apida con cada muestra de cerveza para estimar apida el contenido de alcohol en la cerveza (ABV). Los resultados para la prueba de varianza mostraron que s´ı existen diferencias significativas significativas (p-valor=0.000341) (p-valor=0.000341) para cada lote de cerveza elaborados con cada generaci´on on de levadura, esto se indica el la figura 4.19 4.19.. A
25
Resultados y Discusi´ on
continuaci´ on on la figura 4.20 indica los valores medios del contenido de alcohol para la primera, primera, segunda segunda y tercera tercera generaci´ generaci´ on, los valores fueron 5.2, 4.6 y 4.2 ABV respectivaon, mente. Tambien se muestra que las generaciones est´an an distribuidas en distintos rangos, siendo la primera generaci´on on la mejor ubicada con el valor m´as as alto.
Seg´ un un [?], el rango permitido de alcohol en una cerveza va desde 2.0 a 5.0 ABV, esto indica que s´olo olo las cervezas elaboradas con la segunda y tercera generaci´on on est´an a n del rango permitido. Por otro lado, seg´ un normas internacionales indicadas en [ ?], [?], [?], un [?], [?] y [?] los valores para el contenido de alcohol en cervezas van de 1 a 12 ABV.
Figura 4.19:
An´ alisis de la varianza para el porcentaje de alcohol en cervezas. alisis
Figura 4.20: Prueba
Dunca para el porcentaje de alcohol en cervezas ( α = 0,01).
Cap´ıtulo 5
Conclusiones y recomendaciones on on alSaccharomyces cerevisiae es el organismo unicelular responsable de la fermentaci´ coh´ olica olica en la elaboraci´on on de cerveza. cerveza. Cada d´ıa hay m´as as demanda de esta levadura debido al incremento de empresas cerveceras alrededor del mundo.
La recuperaci´on on y posterior reutilizaci´on on de esta levadura representa un ahorro de recursos econ´omicos omicos para las empresas cerveceras multinacionales y para las microcervecer micro cervecer´´ıas. Adem´ as el proceso para esta recuperaci´on as on y reutilizaci reutilizaci´´on on es sencillo pero requiere de un correcto uso de t´ecnicas ecnicas de asepsia y manejo ma nejo adecuado de materiales de laboratorio. labor atorio.
En este trabajo se recuper´o y reutiliz´o levaduras de primera, segunda y tercera fermentaci´ on con las cuales se elabor´o lotes est´andar on andar de cerveza, se encontr´o que existen diferencias diferencias respecto a ciertos ciertos par´ ame tross f´ısico-qu´ ametro ısic o-qu´ımicos ımi cos evaluados evalua dos en la cerveza, cer veza, as´ı como diferencias a nivel microbiol´ogico ogico en el crecimiento de las mismas.
Se estandariz´o el protocolo para dos medios m´ m´ınimos: ınimos: uno s´ olido olido y uno l´ıquido, en los cuales se realizaron todos los an´alisis. alisis. Estos medios contienen una fuente de carbono 20 gramos (sacarosa), (sacar osa), fuente de nutrientes espec esp ec´´ıficos 8 gramos (caldo nutritivo), agua destilada 1000 mL y para el caso del medio s´olido olido agar 15 gramos.
Durante el trabajo se determin´o par´ ametros necesarios en levaduras cerveceras y par´ameametros ametros requeridos en la cerveza elaborada. Respecto al crecimiento celular se determin´o que a los siete d´ıas de incubaci´on o n a 17±2 o C exist´ exist´ıan 20,8 millones millon es de c´elulas elulas por mL para la primera primera generaci´ generaci´ on, on, 12 millones de c´elulas elulas por p or mL para la segunda generaci´on on y 8,33 millones de c´ elulas elulas en la tercera generaci´on, on, datos que est´an an en concordancia con otros 26
Conclusiones y recomendaciones
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estudios y datos bibliogr´aficos. aficos.
Respecto a la viabilidad se calcul´o 95.3 95.3 %, 91.4 91.4 % y 82.3 % para para la prim primer era, a, segun segunda da y tercera generaci´on on de S. cerevisiae respectivamente. resp ectivamente. La L a viabilidad viab ilidad m´ınima recomendada recomen dada es de 70%.
Los valores valore s f´ısico-qu ısico-q u´ımicos para la densidad de nsidad final de la cerveza expresada expresa da en grados grado s Brix Bri x fueron de 6.2 5.7 y 5.3 o Brix en la tercera, segunda y primera generaci´on, on, los valores de pH medios obtenidos fueron de 4.3, 4,5 y 4.8 para la primera, segunda y tercera generaci´ on y finalmente los valores medios del contenido de alcohol para la primera, segunda on y tercera generaci´on on fueron 5.2, 4.6 y 4.2 ABV respectivamente.
Por lo tanto se pudo concluir que la recuperaci´on on y reutilizaci´on o n de S. cerevisiae cerevisiae es posible dentro de una cervecer´ cervecer´ıa local.
La recomendaci´on on para un futuro proyecto est´a en la recuperaci´on o n de S. cerevisiae de hasta una octava octava generaci´ generaci´ on. on.
