REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ RECOMBINANT DNA TECHNOLOGY Doç.Dr.Mustafa ERAYMAN Mustafa Kemal Üniversitesi FEF BİYOLOJİ
TERMİNOLOJİ • Rekombinant DNA: Doğal olarak bir arada bulunması mümkün olmayan DNA moleküllerinin birleştirilerek yeni bir kombinasyonun ombinasyonun oluşturulmasıdır oluşturulmasıdır.. • Krosover işlemi ile de rekombinant DNA oluşturulsa da rekombinant DNA çok farklı biyolojik kaynaklardan elde edilen DNA moleküllerinin birleştirlimesi anlamında kullanılır.
Genetik Değişimler • İnsanlar binlerce yıldır diğer canlıların
genetiğini değiştirmişlerdir değiştirmişle rdir.. – Bitki ve hayvanların yapay seleksiyonu
• Doğal proses – Mutasyon, crossing over
Genetik Mühendisliği • Rekombinant DNA teknolojisi bakteri ve virüslerle yapılan çalışmalarda geliştirilen genetik teknikleri ve nükleik asit biyokimyası metotlarını birlikte kullanır. kullanır. • Rekombinant DNA teknolojisi bir genin sınırsız miktarda izolasyonu için güçlü bir araçtır. araçtır. Bu teknikteki temel işlemler:
1. Doku ya da hücrelerden DNA izole edilir. 2. DNA moleküllerini özgül dizilerinden tanıyıp kesen Restrik Res triksiy siyon on endon endonüklea ükleazlar zlar ya da Res Restrik triksiyo siyon n Enzi Enzimleri mleri (RE) ile kesilir esilir. 3. RE ile kesil esiliip olu luşştur urul ulan an DNA DNA pa parrçalar alarıı vektör ya da taşıyıcı molekül ile diğer DNA molekülü birleştirilir. DNA parçası yerleş yerleştir tirilm ilmiş iş vekt vektör ör bir Rek Rekombi ombinant nant DNA molekülüdür. 4. Oluşturulan rekombinant DNA molekülü bir konakçı hücreye akta aktarı rılılırr. Bu saye sayede de bi binl nler erce ce kopya opya (klo (klon) n) ür üret etililir ir.. 5. Konakçı hücre kendisini eşlerken yabancı DNA molekülünü de çoğ çoğalta altarrak yavr yavru u hü hücr crel eler ere e akta aktarı rırr ve kolon olonililer er oluş oluştu turu rulu lurr. 6. Klonlanmış DNA konakçı hücrelerden izole edilerek incelenebilir. 7. Potan ansi siyyel olar larak klo klonl nlaanm nmış ış DNA DNA tran ansk skri rip psiyo iyona uğ uğrrayab abil iliir, mRNA’sı translasyona yönlendirilebilir, gen ürünü izole edil edileb ebililir ir ve araş araştı tırm rmaa için için ya da tic ticari ari olar olarak ak satı satıla labi bililirr
Genetik Mühendisliği • Genler izole edilir, modifiye edilir ve bir organizmaya yerleştirilir. • Rekombinant Rekombinant teknoloji ile mümkün olur. olur. – DNA kesilir ve parçalar birleştirilir – Modifiye Modifiye edilen parçalar çoğaltılır
RESTRİKSİYON RESTRİKSİYON ENZİMLERİ • Hamilton Smith Haemophilus influenzae’nın bakteriyofajla bakteriyofajlardan rdan kendilerini nasıl savunduklarını çalışmışlardır. • Viral DNA’yı DNA’yı parça parçalay layan an bir enzime sahip sahip olan bakteriler keşfedilmiştir. • Bugüne kadar 200’ 200 ’den fazla RE enzimi tanımlanmıştır. • RE enzimleri özgül DNA dizilerini tanıyarak keser.
• İlk tanımlanan RE enzimi E.coli ’den ’den elde edilen EcoRI (Eko-r-bir) olmuştur.
• RE enzimleri DNA’yı 4 12 sayıda nükleotid dizisini spesifik olarak tanıyıp tanıyıp keser. eser. • Bu kesim işleminde bazı enzimler küt uçlu DNA parçaları oluştururken, bazıları da yapışkan uçlu DNA parçaları oluştururlar.
Kesilmiş DNA Parçalarının Yapıştırılması • Vektör ile DNA parçası aynı enzimle kesilir. • Rekombinant DNA’yı oluşturacak şekilde bir tüpe bırakılı bırakılırlar rlar.. • DNA ile ile vekt ektör birbi irbiri rin ne yapışır ışırla larr. • Şeker – fosfat iskeleti birleşme noktalarında kaynaş ynaşma ma meyd meydan anaa gelm gelmez ez.. • Bu kısımların birleşmesi için DNA ligaz enzimi kullanılır.
Rekombinant DNA’ların Klonlanması ve Çoğaltılması
• Rekombinant DNA transformasyon yoluyla konuk onukçu hücre hücreler lere e aktarı aktarılır lır,, • Konukçu içinde vektör kendi kopyasını oluşturur, • Yab aban ancı cı DNA DNA’nı nın n da kopy opyası ası oluş oluştu turu rulm lmuş uş olur olur,, • Aynı klondan binlerce koloni oluşturularak büyük miktarlarda rekombinant DNA çoğaltı çoğaltılmış lmış olur. olur.
Vektörler Klonlanacak DNA Parçasının Taşıyıcısıdırlar
• Vektörler taşıyıcı DNA molekülleridirler, bu nedenle vektör olarak görev yapabilmesi için bazı ba zı özel özellilikl kler erii taşı taşıma ması sı gere gerekm kmek ekttedir edir..
1. Kendini ve taşıdığı DNA molekülünü bağımsız olar olarak repli replikke edebil edebilmel melidi idirr. 2. Vektör üzerinde pek çok RE enzimin sadece bir kırılma bölgesi olmalıdır. Bu bölge RE ile kesilerek, aynı enzimle kesilen başka bir DNA parrçası pa çasını nın n bu bölg bölgey eye e sok sokul ulma ması sı için için kul ulla lanı nılılırr. 3. Üzerinde seçilebilir bir belirleyici taşımalıdır. Belirleyici, vektör taşıyan konakçı hücreleri vekt ektör taşım aşımaayan konak onakçı çı hü hücr crel eler erde den n ayırm yırmak ak için kullanı kullanılır lır.. 4. Kona onakçıd çıdan kola olayca izol izole e edi edileb lebili ilir olm olmalıd lıdır. ır.
Rekombinant DNA Klonlanmasında Kullanılan Vektörler 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Plaz Plazmi mid d Klo Klonl nlam amaa V Vek ekttörle örleri ri Lambd Lambdaa ve ve M13 M13 Bakt Bakteri eriyo yoffaj vekt vektörl örleri eri Kozmi zmid vektör ktörle lerr Mekik vektörler YAC vekt ektörle örleri ri BAC vektörleri
Plasmid Plasmid Klonlama Klonlama Vektörleri ektörleri:
Bakteriy riyel plazm lazmiidler, bakterilerde kromozomlara ilave olarak bulunan dairesel şekilli küçük DNA molekülleridir. Kromozomlardan bağımsız olarak kopyalanırlar. Bu özel özellik likle leri ri ile DNA DNA çoğ çoğaltma altmada da kulla kullanı nılır lırlar lar.. ― ― ― ―
Antibiyotiğe direnç geni eni taşırlar, Rekom ekombi bina nan nt pl plaz azmi mitl tler erii ayır yıran seçi seçici ci bi birr sis sisteme eme sahi sahip ptir tir. (LacZ), 20 kb’de b’den n büyük DNA’la ’lar için kul ulllanışlı deği eğildi dirr, Klonlama bölgesi çok sayıda yıda restriksiyon enz nziimi tanımaktadır. Çok sayıda enzimle kesilen DNA’ların klonlanması mümkün olmaktadır. ― β- galaksidase geni içinde bulunan klonlama bölgesine DNA klon klonla land ndığ ığın ında da genin enin yap apıs ısıı bozu bozulu lurr ve klon klonla lanm nmış ış pl plaz azmi mid d taşıy aşıyan an hücreler X-gal maddesi içeren büyüme ortamında koloniler renk değiştirir.
pUC19
Polilinker: kesim alanları lacZ+
gen
Amfisilin direnç geni
Origin dizisi
Lambda (λ) Faj ve M13 Vektörleri • Bir E.coli virüsüdür, • DNA’sı 48,5 kb’dir, • Doğrusal λ kromozomunun merkezi merkezi bölgesi RE ile kesilir ve yabancı DNA yerleştirilir. • Klonlanacak DNA ile Lambda Lambda DNA’ DNA’sı birleştirilir birleştirilir ve protein kılıf içinde paketlenir. • Bu virüs bakteri hücrelerine girerek kendini çoğaltır. çoğaltır. • 10-15 kb’ kb’lik lik klon klon DNA DNA üretilebilir.
Kozmit ozmit Vektö ektörle rlerr 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
Lambda Lambda ile plazmi plazmitt kromo kromozo zomla mların rının ın birl birleşt eştiri irilme lmesiyl siyle e elde edilmi edilmişt ştir ir.. Doğal Doğal yoll yollar arla la mey meyda dana na gel gelme mezl zler er.. Daire Dairese seld ldir ir.. Anti Antibi biyo yoti tikk di dirrenç enç geni geni içer içerir irle lerr. (ampR) Orij Orijin in (ori (ori)) bölg bölges esii bu bulu lunu nurr. Kesi Kesim m enz enzim imle leri ri için için bi birr böl bölge ge bu bulu lunu nurr. Lambda Lambda fajın fajının, ın, faj faj pro protei tein n kılı kılıfın fınaa pak paketlenme etlenmesi si için için gerekl gereklii olan olan cos dizileri içerirler. Yaba abancı ncı DNA DNA’yı ’yı bul bulund undur uran an kozm kozmitl itler er lambda lambda pr prote otein in başı başı içine içine pak paketl etleni enirr ve enfekte edici faj parçacıkları oluşur. 50 kb’l kb’liik DNA DNA taşıy aşıyab abiilirl lirler er..
Mekik Vektörler • Birden fazla konakçı hücrede replike olabilirler. • Kendiliğinden replike olur veya konakçı konakçı replike olunca kendini çoğaltabilir. • Bir organizmadan başka bir bi r organizmaya genleri taşımak için yaygın yaygın olarak olarak kullanılır. kullanılır.
• Örneğin; Ateş böceğinin • Ateş lucif lucifer erase ase geni geni plazmide yerleştirilir ve Agrobacterium’a
aktarılır. • Agrobacterium’da çoğaltılır çoğaltılır ve tütünü enfekt enfekte e edere ederekk gen gen aktarım işlemi tamamlanmış olur.
http://cwx.prenhall.com/bookbind/pubbooks/horton 3/medialib/media_portfolio/23.html
Bakteri Yapay Kromoz Kromozomları omları Bacterial Artificial Chromo Chromosomes somes (BACs ( BACs))
• Büyük DNA parçalarının klonlanmasında kullanılan nispeten yeni bir vektör tipi bakteri yapay kromozomlarıdır. C’lar 100 100-500 kb DNA taşıya taşıyabilir bilirler ler.. • BAC’lar Çalışılmaları rı daha daha kolaydır kolaydır.. • Çalışılmala faktör • Antibiyotik direnç genleri, RE bölgeleri ve F faktör genlerini içermektedirler. Kromozomal DNA’nın DNA’nın büyük miktarlarının • Kromozomal sekan sekansla slanm nması asınd ndaa ve geno genom m sekan sekansl slama ama projelerinde kullanılmaktadır.
Maya Yapay Kromozomları Yeas eastt Art Artifi ificia ciall Chr Chromo omosom somes es (YACs)
• Doğrusal formdadır. Kendine ait ait sentromer sentromer ve her her iki uçta uçta da • Kendine telomerler telomerlerin in bulu bulunması nması kromozom kromozom özelliğ özelliğii katmaktadır. Kendini replik replike e eden sekansa sekansa (ARS) (ARS) sahip • Kendini olduğundan replikasyon replikasyon olmaktadır. olmaktadır. • Her iki kolunda maya genleri içermektedir. • RE kesim bölgesi bulunmaktadır. • 1 Mb (Megabaz) uzunluğunda DNA taşıyabilirler. • Maya hücrelerinde hücrelerin de çoğalabilirler çoğalabilirle r. • İnsan Genom Projesinde kullanılmaktadır.
Rekombinant DNA Kütüphaneleri • Tek bir bireyden türetilen klonlanmış, DNA seti bir kütüphane olarak adlandırılır. Klonlanmış kütüphaneler;
Tüm genomu, Tek bir bi r kromozomu , Tek bir hücre tipinde transkripsiyona uğrayabilen aktif gen takımını temsil eder.
• Rek Rekombinant DNA kütüphaneleri kütüphaneleri 2 tiptir tiptir..
Rekombinant DNA Kütüphaneleri 1. Genom Genomik ik/kr /kromo omozzomal omal kütü kütüph phan ane, e, tüm tüm dizi diziler lerde den n en az az bir bir kopya içerir.
Hücrelerden veya dokulardan DNA ayrıştırılması, DNA’nın RE ile kesimi ve parçaların vektöre takılmasıyla oluşturulur.
2. Tam amam amla layı yıcı cı (Comp (Comple leme ment ntar aryy) DNA (cDNA) library, hücrelerden izole izole edilen mRNA’ mRNA’dan yapılan DNA kopyalarının klonlarının koleksiyonudur.
reverse transkriptaz (RNA’ya (RNA’ya bağlı DNA polimeraz) RNA kalıbından DNA sentezi cDNA kütüphaneleri hücrelerde ifade olan gen veya veya genleri yansıtır.
Genomik Kütüphanenin (plazmit veya Kozmid) Taranması 1.
Parçalanmış genomik DNA içeren Plazmi lazmid d vekt vektör örle lerr E. Coli ’ye akta aktarı rılı lırr ve petr petril iler erde deki ki seçici seçici ortama ortama alınırla alınırlarr. (örneği (örneğin n, amfisilin).
2.
Petri üzerine naylon veya nitroselüloz yapısındaki bir kağıt filtre yavaşça bastırılarak kolo oloni oluş oluşttur uru ulan lan ba bakkteril erile erin rin filtr iltre e üz üze erine rine akt aktarılı rılıp p kopy opyaları larını nın n çıkm çıkmas asıı sağl sağlaanır nır. (Filtr (Filtre e üz üzerin erinde de E.coli hücreler hücrelerii büyümey büyümeye e devam devam ederler) ederler)..
3.
Filt iltrede ede bakteril riler parçalan alanıır ve DNA tek katlı hale gelir lir.
4.
Membrana bağlı DNA tamamlayıcı DNA ile işaretlenir. (örneğin DNA).
5.
Probdaki tamamlayıcı DNA aradığınız DNA sekasından oluşur, homolog sekans tahmin tahminen en kütüph kütüphane anede de de bul bulunu unurr.
6.
Bağla ağlanm nmaayan pr prob ob DNA DNA’sı filtr iltred eden en uz uzak akla laşştırı tırılı lırr.
7.
Probla DNA’nın hibridize olup olmadığı X-ray ray filmi filmi veya veya kemilu kemilumina minasan sansla sla anlaşı anlaşılır lır..
8.
Ray filmi filmi üz üzeri erind nde e num numune uneler ler görül görülür ür.. X-Ray
9.
Pozitif itif ola olan klonla onlarr seçili ilir ve daha fazla analiz liz için izo izole edili dilirrler.
32
radyoakt aktif if etik etiketli etli P radyo
Genomik kütüphaneyi Tarama
cDNA cDNA Kütüp ütüpha hane nesi si 1.
cDNA olgun olgun mRNA’ mRNA’dan elde elde edilir edilir,, intr intronl onları arı içermez içermez..
2.
cDNA cDNA kodla odlana nan n böl bölge geden den dah dahaa az az bil bilgi gi içer içerebi ebililirr.
3.
cDNA cDNA kütü kütüph phane anesi si mRNA mRNA’n ’nın ın izo izole le edild edildiğ iğin in anda andaki ki bir bir hücre hücreni nin n gen aktivitesini göstermektedir. göstermektedir. (Zamanla ve dokudan dokuya göre çeşitlilik gösterir).
4.
mRNA mRNA hücrele hücrelerr öldük öldükten ten sonra sonra hızlı hızlı bir şekilde şekilde par parçal çalnır nır,, derha derhall izole izole edilir.
5.
cDNA cDNA kütü kütüph phan anes esii olu oluşştur turma ma:: 1. 2. 3.
mRNA izole edilir. cDNA sentezlenir. cDNA klonlanır.
cDNA Kütüphanesi Oluşturma – 1. Adım – mRNA mRNA İzol İzolas asyo yonu nu Olgun n ökar ökaryo yoti tikk mRNA mRNA 3’ ucun ucunda da poli poli-A • Olgu kuyruğuna sahiptir sahiptir.
mRNA’l ’lar ar olig oligo o dTs dTs (deoxyth deoxythymidyl ymidylic ic acid) içeren içeren • mRNA bir kolondan geçirilir.
kuyrukla kları rı oligo oligo dTs dTs yapış yapışır ır ve diğ diğer er tüm tüm • Poli-A kuyru
moleküller kolondan kolondan geçerk geçerken en mRNA’lar mRNA’lar kolonda kolonda kalır.
cDNA Kütüphanesi Oluşturma – 2. Adım – cDNA sentezi •
Kısa Kısa bir bir olig oligo o dT pr prim imer erii poli poli-A kuyruğuna bağlanır.
•
Primer Primer reverse reverse transkrip transkriptaz taz enzimi ile uzatılır uzatılır..
•
mRNA Rnase H ile parçalanır. parçalanır. Fakat Fakat kısa RNA parçaları kalır ve bunlar primer olarak kullanılır. kullanılır.
•
DNA polimer polimeraz az I yeni yeni DNA 5’ 5’ - 3’ sentezler sentezler ve RNA primerl primerlerini erini uzaklaştırır.
•
DNA ligaz DNA parçalarını birleştirir.
•
mRNA’dan mRNA’dan çift katlı katlı cDNA kopyası kopyası oluşturulur oluşturulur..
cDNA sentezi
cDNA Kütüphanesi Oluşturma – 2. Adım – cDNA’nın Klonlanması 1. cDNA küt uçlara sahiptir, bu nedenle onları yapışkan uçlara dönü dönüşştür türecek ecek restr estrik iksi siyyon bölg bölges esii link linker erle leri ri veya eya ad adap aptö törl rler er eklenmelidir. 2. T4 DNA ligaz ve cDNA’nın her bir ucuna restriksiyon alanı linkerleri veya adaptörler ekleyecek küt uç ligasyonu kullanılır. 3. Vektör ile cDNA aynı restriksiyon enzimi ile kesilir. 4. DNA ligazın varlı rlığında vektör DNA’sı ile cDNA karış rıştırılı rılırr. 5. Klonlama için bir E. coli konakçısına onakçısına aktarılır aktarılır..
BamHI linkerlerini kullanarak
cDNA klonlama
Alternatif: adaptör kullanımı 5’-GATCCAGAC-3’ GTCTG-5’
cDNA Kütüphanesini Tarama 1.
cDNA kütüpha hane nelleri proteinl einler er için genleri dizilem leme veya bel belirlem rleme ede kull ullanıl nılırla rlar. cDNAla larr tran transkr skrib ibe e edil edilen en genl genler er için için oluş oluştu turul rulur urla larr). (cDNA
2.
Bulmayı istediğiniz proteini kodlayan gen için DNA sekansını biliyorsanız, homolog bir DNA probu probu kullanı kullanılab labili ilirr.
3.
Homolog DNA sekansı mevcut değilse, cDNA proteini tanıyan bir antikorla işaretlenebilir.
4.
kspresy syon on vektö vektörr: klonl klonlanm anmış ış cDNA cDNA akta aktarı rılm lmada adan n önce önce pr prom omot otor or ve tran transkr skrip ipsi siyo yon n Ekspre
termin terminat atörü örü arası arasındak ndakii bir vektör vektöre e yerleş yerleştir tirili ilirr.
5.
mRNA cDNA’dan transkrip edilir ve E. Coli ile trans translas lasyo yonu nu yapıl yapılır ır..
6.
Kolonil niler membr braana transfer edil dilir.
7.
Membr braan pr pro oteini tanıy nıyan tan anııyan radyoaktif etiketli antikor probu ile inkü nkübe edil dilir. (rady (radyoak oaktif tif olmay olmayan an kemilumi emiluminesa nesansla nslarr da mevcut mevcuttur tur..)
8.
Antikorlarla rla bağla ğlana nan n kolonil niler X-Ray Ray film film üz üzer erin inde de kara karanl nlık ık bir bir nokt noktaa bıra bırakı kırr.
cDNA kaseti içeren transkrip olabilir vektör
Fig. 10.5 Screening a cDNA library with antibody probe.
PZR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) Polymerase Polymer ase Chain Reaction (PCR) -Kary Mullis (1983) tarafından tarafından keşfedi keşfedildi. ldi. -Primerleri kullanarak küçük bir DNA parçasının
çoğaltılmasını çoğaltılmasın ı sağlar. sağlar. -DNA’nın istenilen bölgesinde milyonlarca kopyanın üretilmesine izin verir.
41
Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) PCR(Polymerase Chain Reaction) • PCR, genetik materyaller üzerinde seçilmiş bir veya birden fazla bölgenin in vitro koşullar altında oligonükleotid primer ve Taq polimeraz enzim kullanılarak bir otomatik termocycle sistem yardım ardımıyl ıylaa çoğa çoğaltı ltılma lma metodu metodudur dur.. • PCR çalışması için kullanılan genetik materyal kalıp kalıp(t (temp empla late) te) DNA DNA olar olarak adland adlandırı ırılır lır..
PCR Teknolojisi; • Test edilecek organizmalardan saf olarak izole edilmiş kalıp DNA’ DNA’dan az miktarda miktarda (2 ( 2-50ng) alınır ve PCR için özel hazırlanan bir karışıma ( mast master er mix: st steril eril deiyoniz deiyonize e su, PCR tamponu, tam ponu, Taq Taq polimer polimeraz az enzimi, enzimi, MgCl MgCl,, dNTP dNTPss ve primerler primerler)) ilave edilir. mikrosantrifüj tüpleri içerisinde • Hazırlanan bu karışım mikrosantrifüj otomatik DNA termocycler cihazına yerleştirilir ve kalıp DNA üzerindeki bazı spesifik spesifik bölgeler bölgeler yaklaşık yaklaşık 30 PCR döngüsü sonucu en az milyon kez çoğaltılır.
PCR döngüsü; • Kalıp DNA üzerindeki spesifik bir bölgenin termocycler cihazı yardımıyla tek bir defa sentezlenmesine bir PCR döngüsü döngüsü denir. denir. • Herbir PCR döngüsü birbirini takip eden 3 farklı aşamadan oluşur: 1. DNA zincirlerinin ayrış ayrıştırılması(Den tırılması(Denatur aturation) ation) 2. Prim Primerleri erlerin n bağlanma bağlanması(A sı(Annea nnealing) ling) 3. DNA sen sente tezi(Ext zi(Extent ention) ion)
100
e r u t a r e p 50 m e T
PCR
Melting 94 oC
Melting Extension
Annealing Primers
30x
94 oC
72 oC
50 oC
0
T i m e 3’
3’
5’
5’ 3’
5’ 5’
5’ 3’
5’ 5’
3’
5’
5’
3’
5’ 5’
3’ 5’
5’ 5’
5’ 3’
3’
e r u 100 t a r e p m 50 e T
Melting 94 oC
0
PCR
T i m e
3’
5’
5’
3’
e r u 100 t a r e p m 50 e T
Melting 94 oC
0
PCR
T i m e 3’
5’
Heat 5’
3’
e r u 100 t a r e p m 50 e T
Melting 94 oC
0
PCR
T i m e 3’
5’
Heat 5’
3’
e r u 100 t a r e p m 50 e T
Melting 94 oC
0
PCR
Melting o Extension 94 C Annealing 72 oC Primers 50 oC
T i m e 3’
5’
Heat 5’
5’
Heat 5’
30x
e r u 100 t a r e p m 50 e T
Melting 94 oC
0
PCR
Melting o Extension 94 C Annealing 72 oC Primers 50 oC
T i m e 3’
5’ 5’
5’ 5’
5’ 5’
5’
30x
e r u 100 t a r e p m 50 e T 0 3’
5’
5’
Melting 94 oC
PCR
Melting o Extension 94 C Annealing 72 oC Primers 50 oC
T i m e 5’
5’ 5’
3’
Heat 5’
5’
Heat
30x
e r u 100 t a r e p m 50 e T 0 3’
5’
5’
Melting 94 oC
PCR
Melting o Extension 94 C Annealing 72 oC Primers 50 oC
T i m e 5’ 5’
5’ 5’
3’
5’ 5’
5’ 5’
5’
30x
e r u 100 t a r e p m 50 e T
Melting 94 oC
0 3’
5’
5’
Melting o Extension 94 C Annealing 72 oC Primers 50 oC
T i m e 5’
5’ 5’
PCR
5’
3’
5’
Fragments of defined length
5’
5’
5’
5’
30x
DNA Between The Primers Doubles With Each Thermal Cycle Number 1
2
4
8
16
0 1 Cycles
2
3
4
32
5
64
6
Polymerase chain reaction (PCR) -DNA’nın küçük örneklerinin araştırlımasına
olanak sağladığı için tıp ve bilim dünyasında devrim niteliğinde olmuştur. olmuştur. -Adli tıp -Embriyodaki genetik bozuklukların tanısında -İlk insan ve hayvan türlerinden mitokondriyal mitokondriyal DNA’nın DNA’nın analizi analizi -Zirai araştırmalarda kullanım alanları 55
estriksiyon Enzim Alanlarının Analizi Restriksiyon 1.
Restriksiyon alanları, seçilmiş restriksiyon enzimleriyle DNA’yı keserek, agaroz gelde elektrof elektroforez orez yaparak yaparak haritalanabi haritalanabilir lir..
2.
Restriksiyon alanlarının pozisyonunu haritalama pek çok uygulamaya sahip olabil olabilen en linka linkajj harita haritasın sınıı oluştu oluşturur rur.. DNA farklı enzimlerle kesilir ve her bir DNA-enzim karışımı jelde bir ayırma kuyusuna kuyusuna yüklenir yüklenir.
3.
4.
Negatif yükle DNA elektrik alanda büyüklüğüne göre ayrılır (daha küçük olanlar daha da ha hızl hızlıı ilerl ilerler) er)
5.
Etidy tidyum um br bro omü mürl rle e boy boyan anan an jel jelle ür üre etile tilen n pa parrça nu numu mune nele leri ri fotograf grafla lanı nırr.
6.
DNA ladder der ile karşılatırıldığında her bir ban antt farklı şek şekilde hareket eder der.
7.
Farklı enzimlerle kesilen parçaların farklı sayı ve büyüklüklerinin sonuçları yoruml yorumlandı andığın ğında da bir restri restriksi ksiyo yon n haritas haritasıı yapmak yapmak için için kullan kullanılı ılırr.
Eco RI RI kesilmemiş
Eco RI RI
Bam Ba m HI
Büyük bantlar daha yavaş yürür
+ Bam Ba m HI
5.0 kb
4.5 kb
3.0 kb
2.5 kb
0.5 kb
2.0 kb
2.0 kb
0.5 kb
Küçük banlar- daha hızlı yürür
0. 5
2 .5
EcoRI EcoRI
2. 0
BamHI
USDA-ARS - RFLP (restriction fragment length polymorphism) analysis of PCR -amplified 16S rDNA sequences.
Restriksiyon Enzim Alanı Analizlerinin Uygulaması 1. Farklı restriksiyon enzimlerini kullanarak geniş ve fine skalalı hari ha rita tala lama malılı gen gen yap apıs ısıı an anal aliz iz edili edilirr. 2. Oluşan DNA parçalarının numuneleri Kesilmiş Parça Uzunluğu Polimorfizmi (Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLPs)) olarak olarak adlandırı adlandırılır lır.. 3. Suçla uçlarrın tespi espiti tind nde e ve filo filoggene enetik tik ana nali lizl zler er için için kul ulla lanı nıla labi bili lirr. 4. DNA sekanslama veya diğer genotipleme eme metotlarına göre daha ucuzdur. 5. Kesik esik DNA DNA’lar ’lar Sout Southe herrn Blot lot kul ulla lana narrak işa işaretle etlene nebi bili lirr.
Southern Blot:
•
Edward Edward Southern Southern tarafından tarafından icat icat edildi
Bu tekniğin basamakları
1. Uygun Uygun restriksiyo restriksiyon n enzimi enzimi ile DNA nın kesilmesi 2. Kesilen DNA nın aga agaroz roz jelde jelde yürütü yürütülme lmesi si 3. DNA nın de dena natü türe re ed edililme mesi si 4. Denatü Denatüre re edilen edilen DNA DNA nın naylon veya nitroselüloz membra membrana na transf transfer er ed edilm ilmesi esi 5. Tek ipli iplikçi kçikli kli DNA probu probu ile membranın muamelesi 6. Görüntüleme
Fig. 10.8, Southern Blot Components: (top to bottom) Weight Paper towels Membrane Gel Blotting paper Glass plate Tray with buffer b uffer
Northern Blot: •
Southern Blot’a Blot’a benzerdir b enzerdir, fakat DNA değil RNA’yı işaretlemek için kullanılır.
•
mRNA’nın mRNA’nın büyüklüğünü büyüklüğün ü belirlemek için kullanılabilir, kullanılabilir, örneğin örne ğin promotör ve terminatör vb. alanlarındaki farklılıkları belirlemede kullanılabilir. kullanılabilir.
Example: Expression sybII gene at different life stages in the frog Xenopus laevis http://www.xenbase.org/WWW/Marker_p ages/CNS/sybII.html
DNA Dizi Analizi • Bir DNA parçasının nükleotid dizisini belirleme işlemidir. • İki metod vardırMaxam and Gilbert / Sanger • Zircir Sonlardırma Metodu modifiye nükleotid substratlarını kullanarak in vitro DNA sentez reaksiyonunun sekansa özel sonlandırmadır. • Uzama kısa bir DNA primerini kullanarak kalıp ssDNA üzerinde özel bir alanda başlatılır.
DNA Sequencing Cont. • 4 deoksinükleotid deoksinükleotid bazı (dNTPs dNTPs)) zincir sonlandırma nükleotidi dideoksinükleotid (ddNTPs)’nin düşük bir konsantrasyon la birliktedir. •
Eg. a mixture of a particular ddNTP (such (s uch as ddATP) with its normal dNTP (dATP in this case), and the other three dNTPs (dCTP, (dCTP, dGTP, dGTP, and dTTP) are added. adde d. This reaction is performed four times using a different different ddNTP (each labeled with a different different fluorescent dye) for each reaction
• DNA parçaları ddNTP’nin DNA polimerazla polimerazla eklendiği eklendiği noktalarda sadece sonlanır.
DNA Sequencing Cont. • DNA sekansı biyolojik çalımalarda faydalı olmaktadır. • Genetik hastalıklar için teşhis ve tanı da önemlidir. • Mutasyonları belirlemede kullanılabilir.
DNA Sequencing Cont.
Gel with ladder of DNA
DNA sequencing gel. Sequence Seque nce visua visualized lized by autoradiography
DNA Sekans (Dizi) Analizi
Carrot plant
Zebrafish
Rabbit
Teşekkürler
