1. Qué método utilizaría para reconocer un cultivo para reconocer un cultivo puro, joven, injuriado y envejecido. CULTIVOS PUROS: MEDIOS DE OBTENCIÓN Los microorganismos en estado natural crecen de forma heterogénea o mixta. Cuando queremos estudiar un microorganismo dado, debemos aislarlo. Un cultivo puro es aquel que contiene un solo tipo de microorganismo. El modo de obtener estos cultivos consiste en obtener colonias aisladas, que provienen de una sola célula (son clones). Hay diferentes métodos para obtenerlas: MÉTODO DE SIEMBRA POR AGOTAMIENTO O EN ESTRÍA Necesitamos: Placa petri con medio de cultivo Muestra (sólida o líquida) Asa de siembra de platino Con el asa estéril tomamos la muestra y hacemos extensiones en la placa. Volvemos a esterilizar el asa de siembra y extendemos parte de la extensión anterior en otra dirección. Volvemos a esterilizar el asa de siembra y volvemos a extender parte de la segunda extensión en otra dirección. Esterilizamos y repetimos la operación. Incubamos a 37 º durante 24 horas y, en la primera zona, habrá un amasijo de células. En la segunda, parte de la primera zona estará mejor extendida, y en la tercera y en la 4ª mejor aún. Si tomamos una colonia y la ponemos sobre una placa petri, tendremos un cultivo puro. MÉTODO DE LAS DILUCIONES SUCESIVAS Consiste en diluir una muestra hasta conseguir muy pocas células que, tras inocularse en un medio de cultivo, generen colonias aisladas. Metodología: Ahora tomamos 0.1 ml de cada tubo y lo depositamos en una placa petri con medio de cultivo. Con un asa de vidrio se extiende esa cantidad sobre la placa, e incubams a 37 ºC durante 24 horas. En la primera dilución habrá un amasijo de colonias. En la siguiente habrá diez veces menos número de colonias, y así sucesivamente hasta conseguir colonias aisladas. Este método nos permite calcular el número de microorganismos viables que existen en la muestra que estamos analizando: N=C · 1/D · 1/i donde: N es el número de microorganismos presentes en la muestra C es el número de colonias contadas UFC (unidades formadoras de colonias) D es la dilución I es el inóculo
Debe haber entre 30 y 300 colonias. Si hay menos, no es significativo (puede tratarse de una contaminación) y, si hay más, no están aisladas. TÉCNICA DEL CULTIVO POR ENRIQUECIMIENTO Consiste en ajustar las condiciones de cultivo para seleccionar el microorganismo que nos interesa aislar. Ejemplo: Nos interesa aislar bacterias fotoautótrofas. Tomamos un matraz con agua y sales y lo incubamos a la luz, de manera que crezcan las bacterias fotoautótrofas. Ejemplo 2: Queremos aislar bacterias quimiolitótrofas del azufre; ponemos azufre, CO2 como fuente de carbono (disuelto en agua) e incubamos en la oscuridad para eliminar fotoautótrofos. Para incubar enterobactrias como enterobacter hay que incubar a 37º, mientras que para incubar otra enterobacteria, E. Coli, hay que incubar a 45º. Una de las características principales de las bacterias es su apariencia seguida del crecimiento en diferentes medios de cultivo. Estas características generales como el color, abundancia de crecimiento y aun el olor del cultivo nos pueden servir de guías para la identificación. Para determinar las características de desarrollo de un cultivo puro es costumbre observar lo siguiente: Tipo de colonias en agar. Desarrollo en agar inclinado. Desarrollo en caldo. Desarrollo en gelatina por picadura. Después de la siembra del medio de cultivo y después de la incubación se pueden determinar las características de cultivo del microorganismo. Los aspectos más peculiares de desarrollo son: -
COLONIAS EN PLACAS CON AGAR:
Tamaño: los tamaños de las colonias son desde fracciones de milímetro de diámetro hasta 5 o 10mm de diámetro. Margen o borde: pueden formar un círculo perfecto o mostrar gran variedad de irregularidades como salientes redondos, hendiduras irregulares, proyecciones filiformes, o proyecciones en forma de raíz. Elevación: pueden ser muy finas (aplanadas) o gruesas (elevadas). Cromogénesis o pigmentación: las colonias pueden estar coloreadas o sin color. Características ópticas: hay opacas, trasnparentes u opalescentes. DESARROLLO EN AGAR (INCLINADO) POR ESTRÍAS: Cantidad: escaso, moderado o abundante. Margen o borde de desarrollo: uniforme o presentando varias irregularidades. Consistencia de la masa desarrollada: mantecosa o de mantequilla, fácilmente removibles con una aguja de siembras. Cromogénesis o pigmentación: colonias pueden estar coloreadas o sin color. DESARROLLO EN CALDO NUTRITIVO: Cantidad de desarrollo: escaso, moderado o abundante. Distribución del desarrollo en el caldo: uniformemente distribuido (turbidez), desarrollo confinado (nata o pelusa) o desarrollo que se acumula como sedimento. Olor: pútrido, a frutas o aromático, o imperceptible. -
DESARROLLO EN GELATINA POR PICADURA:
Desarrollo (sin licuefacción) a lo largo de la línea de inoculación. El desarrollo puede estar limitado a la zona de la picadura o puede haberse expandido. Licuefacción de la gelatina: se puede presentar desde arriba suavemente o adquirir aspectos varidos de embudos al licuar la gelatina. Para detectar Coliformes injuriados (CI) en el agua considerada apta para el consumo humano según la normatividad peruana,se tomaron y procesaron 100 muestras de agua de edificios del distrito de Lima-Cercado. Se determinó el cloro libre residual(CLR) mediante la técnica DPD y el pH usando varillas indicadoras Merck. Para el recuento de bacterias heterotróficas (BH)se empleó la técnica de spread plate; para cuantificar Coliformes totales (CT) y Coliformes fecales (CF) se empleó la técnicade tubos múltiples y defiltración por membrana. Para recuperar y enumerar CT y
CF injuriados se utilizó el medio m-T7. Parala especi fi
cación bacteriana las pruebas estándar y el sistema API 20E. Para la detección de CI se utilizaron las muestras queresultaron negativas para CT y CF y/o tenían un recuento de BH igual o inferior a 500 UFC/mL. Empleando los métodos con-vencionales se demostró que el 15% de las muestras de agua eran inaptas para el consumo humano. De las 85 consideradasaptas, el 29.41% (25) contenía CI. En las muestras inaptas empleando los métodos convencionales, el 60% (9) tenía entre 0,1y 0,5 ppm de CLR y en las muestras consideradas inaptas por tener CI, el 88% (22) tenía entre 0,1 y 1,0 ppm. No se demostrórelación entre el pH y las muestras inaptas. Entre los CI se identi fi
caron: Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, E. cloacae,Enterobacter sp, Citrobacter freundii, Citrobacter spp y Klebsiella sp. El agua para consumo humano considerada apta por lanormatividad peruana puede estar contaminada con microorganismos intestinales y constituir un riesgo para la salud; el CLRentre 0,1 y 1,0 ppm no garantiza la eliminación de las bacterias intestinales 2. Por qué algunos microorganismos de importancia industrial desarrollan en caldo una característica de forma de película. 3. ¿Cómo se visualiza el polisacárido extracelular y a qué bacteria puede corresponder?
4. ¿Qué es la prueba de catalasa, cómo se realiza y qué utilidad tiene? La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias. Descompone el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. El desprendimiento de burbujas procedentes del oxígeno indica que la prueba es positiva.
Materiales y reactivos
Para el correcto desarrollo de la práctica serán necesarios los siguientes materiales: Portaobjetos. H2O2 de 10 volúmenes Cultivos en fase exponencial de bacterias. Asas e hilos de siembra. Pipetas Pasteur. Método
1. Colocar una gota de agua oxigenada sobre un portaobjetos con ayuda de una pipeta Pasteur. 2. Suspender la bacteria. 3. Detectar la formación de burbujas. Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepción es Streptococcus. Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros: Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+). Bacillus (+) de Clostridium (-). Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-) Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos técnicas: Método del portaobjetos (recomendado): Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio. Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo. Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo). Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante. Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos. Método del tubo de ensayo: Agregar 1ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo puro de agar en slant densamente inoculado. Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo). Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la precaución de no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dará un falso resultado positivo. 5. ¿Cómo se interpretan los resultados de una prueba de fermentación de hidratos de carbono?
Capitulo 9
1. ¿Por qué se calibra el espectrofotómetro a 100% de transmitancia con medio de cultivo estéril? Porque con este medio sin inoculo la muestra no presenta turbidez y es transparente lo que determina un estado inicial donde la luz emitida no es absorbida por la muestra, sino únicamente por el medio Cuando el medio no contiene aun al microorganismo se considera un estado cero, por tanto al calibrar el espectrofotometrocon el medio únicamente, los valores de absorbancia registrados solo considerará a los microorganismos 2. ¿Por qué motivo puede ser de alguna forma útil conocer la curva de multiplicación de una bacteria? Para conocer los tiempos en que duran cada una de las etapas del crecimiento de un microorganismo, reconocer los periodos de Acostumbramiento, de crecimiento, estacionario y el periodo de muerte; para nuestro caso solo se puede identificar las fases de acostumbramiento y de crecimiento Estos datos se pueden utilizar en el control de un análisis de este mismo microorganismo, ya sea de control de crecimiento para aprovechar su velocidad de multiplicación, o también para conocer la velocidad de infección que puede producir 3. Identificar en la grafica las fases del desarrollo microbiano.
