PRACTICA & EL MACRÓ'A(O COMO SISTEMA SISTE MA INMU INMUNOLÓ( NOLÓ(ICO% ICO% EVALUACIO EVALUACION N DE LA PRODUCCION DE OIDO NITRICO I. INTRODUCCIÓN Dent Dentrro de la Medic edicin ina a y demá demás s cien cienci cia as biom bioméd édic icas as,, una una célu célula la es considerada como un sistema biológico que permite al investigador hacer estudios sobre respuesta de una célula frente a un determinado compuesto, también es utilizado para poder expresar genes foráneos, es decir utilizarlos como verdaderas fabricas biológicas en benecio del hombre !na de las células de mam"feros más utilizadas como sistema biológico para hacer investigación en el campo de la #nmunolog"a, son los macrófagos $os macrófagos son glóbulos blancos de la sangre que son especializados en la digestión de part"culas y son distribuidos indistintamente en la sangre y te%idos y participan en la defensa, tanto en la respuesta inmune adaptativa, como en la respuesta inmune innata, a través de la ingestión de patógenos, estas células también participan en el importante rol de limpieza de células da&adas o muertas
II. OBJETIVOS. - 'btener macrófagos activados a través de la infección de ratas con lisado
de bacterias - (xtraer, )islar y *ultivar macrófagos - *uanticar la producción de 'xido +itrico +'-
III. MATERIALES Y REACTIVOS. - .atas adultas - *ultivo de bacterias (coli- - /eringas hipodérmicas hipodérmicas - 0ipetas pasteur - 0ipetas de 1,2 y 3 ml - +a*# 45 6 y +a*# 17 6 - 8ulfanilamida - +aftilendiamina - Medio de *ultivo .0M# 19:4
IV. IV. PROCEDIMIENTO PROCEDI MIENTO A) Preparación Preparación de i!ad" de #ac$eria!% 1 *on la ayuda ayuda de una asa asa de colé cose cosechar char las bacte bacterias rias crecida crecidas s en una placa de agar nutritivo y resuspenderlas en un tubo de ensayo que contiene 1ml de +a*# al 456 2 *alentar *alentar la suspensió suspensión n de células células bacterian bacterianas as hasta ebullición ebullición,, durante durante tres tres vece veces, s, agit agitan ando do cuida cuidado dosa same ment nte e el tubo tubo para para evit evitar ar que que el contenido se proyecte
B) In*ección de ra$a! c"n i!ad" de #ac$eria!. 1 0roceder a inyectar intraperitonialmente los ratones con 14 ml de lisado bacteriano, utilizando una agu%a hipodérmica apropiada 2 )l retirar la agu%a, de la piel de la rata, hacerle masa%es suaves en el vientre durante unos veinte segundos 3. De%ar en incubación al ratón durante tres a cuatro d"as, cuidando que no le falte la alimentación
C) E+$racción , ai!a-ien$" de -acró*a"!. 1 ;ranscurrido los d"as de incubación, en donde los macrófagos migraran desde la sangre hacia el l"quido citico en donde se encuentra restos de lisado bacteriano, inyectar 2 ml de +a*# al 45 6 o 0<8, por v"a intraperitonial 2 =acer masa%es en el vientre del ratón durante 1 min > )brir el abdomen del ratón como indica el esquema y con ayuda de una pipeta, retirar cuidadosamente todo el l"quido c"trico y colocarlo en un tubo de ensayo : 0ara concentrar los macrófagos, centrifugar la suspensión celular a 2444 rpm, durante cuatro minutos 3 .etirar el sobrenadante y resuspender el pellet con 1ml de +a*# a 45 6 9 .ealizar el recuento celular con ob%etivos de mediano aumento +ota? 8i la suspensión celular se encuentra contaminada con glóbulos ro%os, lo que se maniesta con la presencia de una coloración ro%iza, se recomienda eliminarlos mediante un choque osmótico? resuspender el pellet en 2ml de agua destilada, y mezclar durante veinte segundos e inmediatamente a&adir 2ml de +a*# a 17 6 y proceder con el lavado normal
D) C/$i0" de -acró*a"! (n una placa de cultivo celular de 2: pozos que contiene 4,3 ml de medio de cultivo para macrófagos medio .0M# 19:4- sembrar 1x149 células e incubar a >@A* en un atmosfera de '2 y 36 *'2 durante >4 a :4 minutos
E) C/an$i1cación de O+id" N2$ric" 3NO) 1 ;erminado el tiempo d cultivo transferir los macrófagos de la placa de cultivo a un tubo eppendorf 2 *entrifugar la suspensión celular a 2444 rpm, durante cuatro minutos > ;ransferir 344ul del sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf : )gregar 344ul del reactivo de Brees 3 #ncubar en oscuridad durante 14 min 9 $eer en el espectrofotómetro a 334nm @ Multiplicar la )bsorbancia de la muestra por el factor de calibración obtenido a partir de una curva de calibración con nitrito de sodio
V. RESULTADOS 1 (squematizar el proceso de obtención de los macrófagos murinos 2 Determinar el nCmero de células por ml de suspensión
> olumen de suspensión que contiene 1444 444 de células : .eportar el porcenta%e de viabilidad celular
4% E!5/e-a$i6ar% 1)brir el abdomen del ratón como indica el esquema y con ayuda de una pipeta, retirar cuidadosamente todo el l"quido c"trico y colocarlo en un tubo de ensayo
2E0ara concentrar los macrófagos, centrifugar la suspensión celular a 2444 rpm, durante cuatro minutos
>E.etirar el sobrenadante y resuspender el pellet con 1ml de +a*# a 45 6
:E.ealizar el recuento celular con ob%etivos de mediano aumento
Re!/$ad"!%
•
(l conteo de macrófagos fue?
11@3x2x144F 2>344 células por 144 mililitros de suspensión =ay 2>3 células por mililitro de suspensión
VIABLES NO VIABLES TOTAL
NO ACTIVOS
ACTIVOS
24 3
23> EE
78
78&
•
8i
hay 2>3 por mililitro de suspensión en 1444444 células el volumen seria? :233,>2ml
VI. CUESTIONARIO. 1. ¿Qué es un sistema biológico? Es un conjunto de órganos y estructuras similares que trabajan en conjunto para cumplir alguna función fisiológica en un ser vivo relacionado con la biología. El sistema inmunitario es aquel conjunto de estructuras y procesos biológicos en el interior de un organismo que le protege contra enfermedades identificando y matando células patógenas y cancerosas Detecta una amplia variedad de agentes, desde virus asta par!sitos intestinales, y necesita distinguirlos de las propias células y tejidos sanos del organismo para funcionar correctamente
2. Describa una aplicación que daría al sistema macrófago para hacer investigación en nmunología. El sistema macrófago tiene aplicación en la aplicación de vacunas y trasplante de órganos, también en el nuevo tratamiento de enfermedades autoinmunes como el "#$ y lupus. 3. ndique ! características de un macrófago activado " %resenta antígenos, produce citoquinas, produce sustancias to&icas como '(, $('( '$-,)'. *ienen m!s prolongaciones de membrana, mayor n+mero de vacuolas, de lisosomas, fagosomas y cuerpos residuales.
!. Describa la respuesta inmunológica al in#ectar $%& 'lipopolisacaridos(. os lipopolisacaridos al ser detectados por los macrófagos se unen al receptor D y ocurre la formación de una vesícula endolitica dentro del macrófago llamada fagosoma.
). ¿*u+l es el mecanismo por el cual el macrófago produce ,-? os macrófagos activados contienen el interferon gama el cual induce y activa a la en/ima i)'0, esta estimula la producción de )' que ataca a virus y células tumorales.