Laporan Praktikum Struktur dan Fungsi Biomolekul
Hari,Tanggal : Jumat, 14 November 2014 PJP : Inda Setyawati, S.TP, M.Si Asisten : Yuyun Hikmatul Uyun Selvi Muliani Gia Permasku, S.Si Nur Hidayah HL
ASAM NUKLEAT I Kelompok 9 Yanti Fajarwati Siti Khodijah Yahya Ramadhani Melati Devina G
G84120054 G84120013 G84120050 G84120094
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014
3
PENDAHULUAN
Asam deoksiribonukleat atau lebih dikenal dengan DNA merupakan material genetik yang tersimpan di dalam sel yang dikemas sedemikian rupa menjadi struktur superkoil yang kompak. DNA berikatan dengan protein histon membentuk struktur yang disebut dengan kromosom. Molekul DNA umumnya tersusun oleh dua untai polinukleotida yang terpilin secara anti-paralel membentuk struktur untai ganda (double helix) yang terikat oleh ikatan-ikatan hidrogen yang terbentuk antara basa nitrogen untai yang satu dengan untai lain yang saling berkomplementer. Tidak seperti molekul DNA, molekul RNA hanya disusun oleh satu untai polinukleotida. Gula penyusunnya adalah ribosa, sedangkan pada DNA adalah deoksiribosa (Sinaga 2012). Ada tiga macam jenis RNA dalam sel, baik eukariot maupun prokariot yaitu mRNA (RNA messenger), tRNA (RNA transfer), dan rRNA (RNA ribosomal) yang memiliki fungsi berbeda-beda. RNA messenger (mRNA) berfungsi sebagai pembawa pesan atau informasi genetik yang diterjemahkan dari DNA, dan memberitahukan sel tentang struktur molekul protein yang akan dibuat. RNA transfer (tRNA) berperan dalam membawa asam amino tertentu yang dibutuhkan ke ribosom untuk dirangkai menjadi sebuah protein, sedangkan fungsi rRNA merupakan bagian struktur ribosom, kompleks protein-mRNA, yang berperan mensintesis protein sesuai dengan informasi genetik yang dibawa oleh mRNA (Sinaga 2012). Hampir semua sel mengandung protein, DNA, dan RNA yang jumlahnya dalam jaringan tertentu sangat kecil. Sumber DNA yang biasanya digunakan untuk percobaan harus mengandung kadar DNA yang cukup dan kadar DNA-ase yang rendah. Beberapa jaringan mengandung DNA-ase yang aktivitasnya cukup tinggi, sehingga DNA harus dipecah menjadi fragmen yang lebih kecil. DNA mudah mengalami denaturasi, sehingga percobaan yang menggunakan DNA harus dilakukan dengan hati-hati, agar hasil isolasinya sesuai dengan kadar sebenarnya dalam jaringan. DNA berperan dalam semua aktivitas sel, mendorong pengembangan biologi molekular yang bertujuan untuk menerangkan proses proses biologis dalam hal struktur dan interaksinya antara asam nukleat dan protein. DNA juga menyimpan dan mengekspresikan informasi genetik, sehingga berpengaruh besar pada bidang-bidang studi lain seperti imunologi, kedokteran (produksi insulin, interferon), tanaman transgenik, mikrobiologi, dan ilmu forensik (Bintang 2010). Larutan alkali menyebabkan dua untai DNA terpisah, tetapi berbeda dengan efeknya pada RNA, alkali tidak menyebabkan pemutusan ikatan fosfodiester DNA. Pemberian alkali digunakan untuk mengeluarkan RNA dari DNA dan memisahkan untai DNA sebelum atau sesudah elektroforesis pada gel poliakrilamid atau agarosa (Marks DB et al.2000). DNA dan RNA dapat diisolasi dari sel melalui serangkaian tahap tertentu. Metode-metode isolasi ini telah banyak dikembangkan sehingga didapatkan hasil yang terbaik dari segi kualitas dan kuantitas. Metode-metode tersebut di antaranya adalah metode Kit, metode CTAB, dan metode lisis termal. Praktikum bertujuan menghitung kandungan asam deoksiribonukleat (DNA) dan asam ribonukelat (RNA) dalam sampe l.
4
METODE Waktu dan Tempat Praktikum
Praktikum Struktur dan Fungsi Biomolekul dilakukan di Laboratorium Pendidikan Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB. Waktu praktikum yaitu hari Jumat, tanggal 14 November 2014, pukul 08.00-11.00 WIB. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini yaitu tabung reaksi, pipet Mohr, Bulp, pipet tetes, spektrofotometer, wadah berisi es, tabung sentrifus, penangas air. Bahan yang digunakan adalah homogenat hati tikus, KOH, air, HClO4 60%, larutan asam trikloroasetat (TCA) 100%, larutan standar RNA, orsinol, FeCl3.6H2O, HCl, larutan standar DNA, larutan asetaldehida, difenilamin, asam asetat, H2SO4, akuades. Prosedur Penentuan Konsentrasi RNA dalam homogenate hati tikus. Homogenat dipipet sebanyak 2,5 mL ke dalam sebuah tabung sentrifus yang telah didinginkan, kemudian ditambahkan 2,5 mL HClO 4 0,6M dingin. Larutan kemudian dikocok dan disimpan dalam es selama 10 menit. Campuran lalu disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 10 menit. Supernatan kemudian dibuang, dan pelet disuspensikan kembali dalam 4,0 mL KOH 0,3 M. Larutan dipindahkan dalam sebuah tabung reaksi yang bersih, dan ditempatkan dalam penangas air bersuhu 40 oC selama 40 menit. Tabung didinginkan dalam es selama 5 menit, dan ditambahkan 2,5 mL HClO 4 1,2 M. Larutan lalu dikocok dan disimpan dalam es selama 10 menit. Selanjutnya, larutan dipindahkan ke dalam sebuah tabung sentrifus dingin dan disentrifugasi kembali seperti pada tahap sebelumnya. Selesai disentrifugasi, larutan supernatan dikumpulkan dan dituangkan ke dalam sebuah tabung reaksi bersih dan diberi label sebagai ekstrak RNA. Pelet disuspensikan kembali dalam 10 mL HClO 4 0,2M dingin dan dipindahkan ke dalam sebuah tabung reaksi dingin, kemudian ditempatkan dalam tempat pembekuan (-20 oC) dalam sebuah lemari es untuk penentuan kadar DNAnya. Disiapkan empat tabung reaksi yang masing-masing diisi oleh pereaksi orsinol sebanyak 3 mL. Tabung 1 kemudian ditambahkan air suling (akuades) sebanyak 4 mL, tabung 2 ditambahkan air suling sebanyak 3,8 mL dan larutan RNA 0,2 mL (supernatan), tabung 3 ditambahkan 3,5 mL air suling dan 0,5 mL larutan RNA (supernatan), sedangkan tabung 4 dit ambahkan 3,5 mL air suling dan 0,5 larutan standar RNA. Standar RNA menggunakan RNA terhidrolisis sebanyak 500 µg/mL dalam asam trikloroasetat 10%, dan pereaski orsinol ditambahkan terakhir, kemudian larutan dikocok. Setelah itu, larutan didinginkan dalam wadah berisi es, dan dibaca absorbansinya (A) pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 660 nm. Sebelumnya, nol-kan dengan tabung 1 (blanko). Konsentrasi RNA dalam tabung 2 dan 3 kemudian dihitung.
5
HASIL DAN PEMBAHASAN
Prinsip isolasi DNA dan RNA adalah pemecahan dinding sel dan yang diikuti dengan pemisahan DNA dan RNA dari komponen-komponen lain sehingga diperoleh DNA dan RNA murni. Penentuan RNA dapat menggunakan cara reaksi orsinol. Prinsipnya reaksi orsinol merupakan reaksi umum untuk pentosa, dan bergantung pada pembentukan furfuralnya apabila pentosa dipanaskan dengan HCl pekat. Orsinol akan bereaksi dengan furfural jika ada katalisator berupa FeCl3 dan membentuk kompleks berwarna hijau. Reaksi positif hanya untuk nukleotida purin (adenin dan guanin). RNA stabil pada suhu 90 oC, sedangkan protein-protein lain pada suhu ini sudah mengalami denaturasi (Bintang 2010). Proses isolasi diawali dengan penambahan larutan HClO4 dingin yang berfungsi untuk mengendapkan makromolekul seperti protein. Kemudian campuran disentrifugasi sehingga diperoleh pelet yang kemudian disuspensikan dengan larutan basa KOH, yang bertindak sebagai alkali. Penambahan larutan alkali dan proses pemanasan pada suhu 40 o C dapat mendepolimerasi RNA, sehingga RNA akan mengendap. Proses sentrifus selanjutnya dilakukan untuk memisahkan DNA dan RNA (Faatih 2009). Pelet yang terbentuk kemudian disentrifus kembali sebanyak tiga kali untuk mengendapkan makromolekul yang masih tersisa, dibantu dengan larutan HClO4 dingin. Berikut data absorban kurva standar RNA setelah dilakukan pemisahan dari DNA. Tabel 1 Absorban kurva standar RNA [RNA] µg/mL
Absorbansi terukur
Absorban terkoreksi
Blanko
0.102
0.000
6.25
0.420
0.318
12.5
0.669
0.567
25.0
1.143
1.041
62.5
1.418
1.316
125.0
1.436
1.334
Kurva Standar RNA 2
i s n a b1 r o s b A
y = 0,009x + 0,399 R² = 0,664
0 0
50
100 [RNA] μg/mL
Gambar 1 Grafik kurva standar RNA
150
6
Konsentrasi RNA diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 660 nm. Pembuatan kurva standar sangat diperlukan dalam penentuan kadar sampel yang menggunakan metode spektrofotometri. Tujuan pembuatan kurva standar adalah untuk menentukan konsentrasi RNA berdasarkan absorbansi serta untuk menentukan ketepatan hasil analisa yang sesuai dengan hukum Lambert-Beer. Kurva standar digunakan sebagai standar eksternal. Kurva standar dibuat melalui hubungan konsentrasi DNA dan absorbansinya (Paramita dan Sukesi 2009). Hasil kurva standar didapatkan persamaan garis y=0,009x + 0,399 dengan R =0,664. Nilai r yang didapat tidak begitu baik, karena belum mendekati 1,0 sehingga dapat disimpulkan kurva standar yang dibuat tidak diperoleh dengan baik karena kurva yang didapat belum linier. Menurut Paramita dan Sukesi (2009), nilai r harus terletak pada interval 0.9 – 1.0 yang menunjukkan bahwa antara absorbansi dan konsentrasi memiliki korelasi yang linier. Hasil perhitungan kurva standar akan mempengaruhi nilai konsentrasi sampel. Nilai absorbansi yang diperoleh kemudian disubstitusi pada persamaan untuk menghitung konsentrasi RNA terukur. Berikut data konsentrasi RNA yang terukur. 2
Tabel 2 Konsentrasi RNA V larutan RNA (mL)
Absorban
[RNA] µg/mL
0.2
-0.008
-45.22
0.5
0.134
-29.44
Contoh perhitungan [RNA]: Y
= a+ bx
Y
= 0.399+0.009x
0.134 = 0.399+0.009x [RNA] = -29.44 R
=0.664
Menurut Ratnayani et al (2009), nilai absorbansi yang memenuhi hukum Lambert Beer berada pada rentang 0,2 sampai dengan 1,0. Hasil percobaan yang didapat nilai absorbansinya hanya berkisar dari -0,008 sampai 0,134. Nilai absorbansi ini belum memenuhi hukum Lambert Beer. Konsentrasi RNA yang diperoleh pada volume 0,2 mL sebesar -45,22 sedangkan pada volume 0,5 mL sebesar -29,44. Hasil ini menunjukkan adanya kenaikan konsentrasi dari volume 0,2 mL ke 0,5 mL. Data yang diperoleh menunjukkan bahwa nilai absorbansi berbanding lurus dengan konsentrasi. Semakin besar absorbansi, maka semakin besar juga konsentrasi RNA yang terukur.
7
SIMPULAN
Molekul DNA dan RNA dapat dihitung konsentrasinya menggunakan metode spektrofotometri. Nilai absorbansi yang terukur akan setara dengan konsentrasinya. Akan tetapi sebelumnya harus dilakukan isolasi DNA dan RNA terlebih dahulu dengan teknik sentrifugasi. Hasil pengukuran kurva standar RNA diperoleh persamaan garis y=0,009x + 0,399 dengan R 2=0,664. Kemudian dengan memasukkan nilai absorbansi yang diperoleh pada persamaan tersebut, didapatkan konsentrasi RNA pada volume 0,2 mL sebesar -45,22 sedangkan pada volume 0,5 mL sebesar -29,44. Hasil ini menunjukkan adanya hubungan antara nilai absorbansi dengan konsentrasi yang terukur. Nilai absorbansi berbanding lurus dengan konsentrasi, sehingga apabila absorbansinya meningkat, maka nilai konsentrasi yang diperoleh juga meningkat. DAFTAR PUSTAKA
Bintang M. 2010. Biokimia Teknik Penelitian. Jakarta(ID): Erlangga. Faatih M. 2009. Isolasi dan digesti DNA kromosom. Jurnal Penelitian Sains dan Teknologi. 10(1): 61-67. Marks DB, Marks AD, Smith CM. 2000. Biokimia Kedokteran Dasar : Sebuah Pendekatan Klinis. Jakarta(ID): Penerbit Buku Kedokteran EGC. Murray RK, Bender DA, Botham KM, Kennelly PJ, Rodwell VW, Weil PA. 2014. Biokimia Harper Edisi 29. Jakarta(ID): Penerbit Buku Kedokteran EGC. Paramita GA, Sukesi. 2009. Produksi abon daging ikan pari (rayfish): karakterisasi kimia daging ikan pari. Prosiding Skripsi. Surabaya(ID): Institut Teknologi Sepuluh November. Ratnayani K, SC Yowani, SL Syane. 2009. Amplifikasi fragmen 0, 4 kb daerah dloop DNA mitokondria lima individu suku Bali tanpa hubungan kekerabatan dengan metode polymerase chain reaction (PCR). Journal of Chemistry. 3(1): 14-20. Sinaga E. 2012. Biokimia Dasar . Jakarta(ID): PT. ISFI Penerbitan.
1
2
