TALLER DE GENÉTICA 3
PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Guía de actividades 2017
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Taller de Genética III: Pruebas de diagnóstico olecular Para resolver los problemas de este Taller se recomienda estudiar previamente los fundamentos moleculares de la electroforesis de ácidos nucleicos y su uso en las técnicas de Southern blot P!" y secuenciaci#n$ %os ob&etivos del Taller ''' son los si(uientes) 1* 'dentificar en +ué casos son aplicables las técnicas de dia(n#stico molecular 2* 'nterpretar la informaci#n +ue sur(e de la aplicaci#n de esas pruebas
E!ercicio " Introducción. %a anemia de células falciformes es una enfermedad san(uínea caracteri,ada por la presencia de (l#bulos ro&os con forma anormal -de ho,.$ %a forma de ho, está asociada a una pérdida de fle/ibilidad celular y resulta en movimientos restrin(idos de los (l#bulos ro&os a través de los capilares más pe+ueos provocando disminuciones en la disponibilidad de o/í(eno de los te&idos por ellos irri(ados$ %a enfermedad es cr#nica) los individuos se encuentran en buen estado la mayor parte del tiempo pero sufren peri#dicamente de dolorosos ata+ues y su esperan,a de vida está disminuida$ %a anemia de células falciformes es una enfermedad mono(énica con un patr#n de herencia autos#mico recesivo$ %a causa es una sustituci#n puntual - por T. en el (en de la (lobina +ue provoca un cambio de sentido en la cadena polipeptídica en d#nde ácido (lutámico es (lobina reempla,ado por valina$ %a (lobina resultante -(lobina mutante. se denomina hemo(lobina S$ %a hemo(lobina S es soluble cuando está completamente o/i(enada pero cuando las tensiones de o/í(eno disminuyen sufre un marcado cambio conformacional +ue conduce a la deformaci#n del (l#bulo ro&o y a la hem#lisis$ l dia(n#stico molecular para la mutaci#n descripta consiste en amplificar mediante P!" una re(i#n de 34 de 255 pb +ue abarca el sitio de la mutaci#n y lue(o tratar al producto amplificado con la en,ima de restricci#n Dde I $ sta en,ima produce dos fra(mentos de 176 y pb respectivamente$ %a discriminaci#n de esta prueba se debe a +ue la mutaci#n produce la pérdida del sitio de restricci#n para esta en,ima$ 3e esta manera la resoluci#n electroforética puede revelar la presencia o ausencia de la mutaci#n$ Problema. 8na pare&a ha tenido dos hi&os) una nia de die, aos sana y un nio de cuatro aos con anemia de células falciformes$ %a mu&er está esperando un nuevo hi&o y se ha reali,ado un muestreo de vellosidades cori#nicas para determinar si su nuevo hi&o -el probando. heredará la enfermedad$ Se muestra el resultado de la prueba de dia(n#stico tal como se describi# previamente)
#: arcadores de $eso olecular ": control %: $adre 3: adre &: $robando ': (i!a de ") a*os +: (i!o de & a*os
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A, Teniendo en cuenta el resultado de la $rueba olecular deterine el genoti$o de cada uno de los integrantes de la -ailia. /usti-i0ue e1$licando cóo inter$reta el $atrón de bandas en cada caso. 2, Con los datos obtenidos dibu!e el 4rbol genealógico de la -ailia
E!ercicio % Introducción. n funci#n de la tasa de mutaci#n 9+ue en el (enoma humano es muy variable9 se pueden distin(uir dos tipos de mutaciones) mutaciones estáticas y mutaciones dinámicas$ n las primeras la tasa de mutaci#n es la misma tanto para la secuencia ori(inada tras la mutaci#n como para la secuencia predecesora$ Sin embar(o las mutaciones dinámicas +ue ocurren en secuencias de 34 repetitivo se caracteri,an por un tipo muy particular de mutaci#n) la e/pansi#n de tripletes$ n este caso la tasa de mutaci#n depende del n:mero de copias por lo +ue la mutabilidad de una nueva secuencia ori(inada por mutaci#n es diferente de la de la secuencia de la +ue proviene$ Se ha demostrado +ue las mutaciones dinámicas +ue ori(inan un aumento en el n:mero de repeticiones en secuencias polim#rficas de tripletes repetidos constituyen un nuevo mecanismo de mutaci#n +ue conduce finalmente a diversas enfermedades neurol#(icas hereditarias un e&emplo d estas es la distrofia miot#nica -3;. %a 3; es una enfermedad neuromuscular de herencia autos#mica dominante con una incidencia estimada de 1<7$00 siendo la forma más com:n de distrofia muscular en adultos$ l cuadro clínico de los pacientes afectados de 3; es muy variable y aun+ue son características la miotonía y la pro(resiva debilidad consecuente también se ven afectado otros sistemas produciéndose defectos en la conducci#n cardíaca cataratas hipersomnia atrofia testicular y calvicie prematura en los varones$ sta e/traordinaria variaci#n fenotípica +ue tiene lu(ar tanto entre las distintas familias afectadas como entre los individuos de una misma familia es una de las características más notables de la 3;$ l fen#meno de la anticipaci#n -la enfermedad se manifiesta en edades cada ve, más tempranas en (eneraciones sucesivas presentando además síntomas más severos. &unto con el (rado variable de penetrancia son otras características destacables de la 3;$ 3esde el punto de vista clínico los pacientes se clasifican en tres cate(orías principales de acuerdo con la edad de manifestaci#n de la enfermedad y la e/presi#n fenotípica de la misma) 1. De manifestación tardía. n muchos casos es difícil de dia(nosticar por el li(ero (rado de afectaci#n +ue muestran los pacientes$ 2. De manifestación en adultos 3. De manifestación temprana +ue es la forma más severa de la enfermedad y se ve frecuentemente asociada con un profundo retraso mental neonatal$ l defecto molecular subyacente a la 3; se ha identificado como un fra(mento de 34 inestable +ue contiene repeticiones de triplete -!TG.n y +ue sufre e/pansi#n en los pacientes afectados por la enfermedad$ l n:mero de repeticiones del triplete -!TG.n es muy variable en la poblaci#n normal oscilando entre y 27 repeticiones= los pacientes mínimamente afectados tienen al menos 0 repeticiones mientras +ue los individuos más severamente afectados portan e/pansiones de dicha secuencia con cientos e incluso miles de repeticiones$ l triplete !TG se locali,a en el e/tremo 5> no traducido -5>8T". del "4m de la proteína +uinasa de la miotonina -;3P?. es decir por fuera de la re(i#n codificante$ l (en ;3P? está ubicado en el cromosoma 1@ y contiene 1 e/ones +ue se e/tienden apro/imadamente 15 Ab produciendo finalmente un polipéptido de 2B aminoácidos$ 8na ve, identificada la amplificaci#n en el n:mero de repeticiones !TG como la base (enética de la 3; se ha reali,ado un (ran esfuer,o para desentraar c#mo la e/pansi#n podría producir la enfermedad$ l(unos (rupos de investi(aci#n han demostrado +ue en células en cultivo la e/pansi#n del n:mero de tripletes conduce a la ausencia del "4m de la proteína ;3P? i$ l mecanismo molecular responsable de este hecho se desconoce aun+ue se cree +ue un 3
elevado n:mero de repeticiones !TG en el e/tremo 5> del (en podría de al(:n modo producir una disminuci#n en la tasa de síntesis o de procesamiento del "4m correspondiente$ Problema. 8n nio es dia(nosticado clínicamente con la forma temprana de la 3;$ %as entrevistas y el estudio clínico de los familiares determinan +ue su madre posee una forma leve de la enfermedad y permiten la construcci#n del si(uiente árbol (eneal#(ico 1)
Para reali,ar un estudio detallado de los portadores a los individuos +ue fi(uran en el árbol (eneal#(ico se les reali,# una prueba de dia(n#stico molecular$ Partiendo de san(re periférica la prueba consiste en reali,ar un Southern blot di(iriendo al 34 con la en,ima de restricci#n NcoI y usando como sonda específica una secuencia +ue hibrida con una re(i#n del (en ;3P? muy cercana a la ubicaci#n de los tripletes !TG$ l resultado se muestra a continuaci#n$ %os n:meros corresponden con los individuos del árbol (eneal#(ico$ M: marcador de peso molecular
A, Teniendo en cuenta el resultado de la $rueba olecular deterine el genoti$o de cada uno de los integrantes de la -ailia. /usti-i0ue e1$licando cóo inter$reta el $atrón de bandas en cada caso. 2, E1$li0ue las di-erencias en el $atrón de bandas de los indi5iduos % 3 6 +. Relacione con la e1$resión -enot7$ica C, 8Encuentra discordancias entre los resultados de la $rueba olecular 6 el diagnóstico cl7nico9 En caso a-irati5o indi0ue a 0ué $ueden deberse. 1
%os n:meros +ue fi(uran en el árbol (eneal#(ico hacen referencia al estudio molecular posterior$
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E!ercicio 3 Introducción. La
Fibrosis quística es la enfermedad autosómica recesiva más común en la población de origen caucásico, y se presenta en uno de cada 2000 a 2500 nacidos vivos y tiene una frecuencia de portadores de uno cada 20 a 25 nacidos vivos Los pacientes con fibrosis quística tienen una conducción anormal de cloruros a trav!s de la membrana apical de las c!lulas epiteliales, causando secreciones espesas en las vías a!reas, páncreas, intestinos, y vas deferens La enfermedad es causada por mutaciones en el gen regulador de la conductancia transmembrana de la Fibrosis "uística #$F%&' que está ubicado en el cromosoma (q)*+)2, el cual codifica una proteína de *-0 aminoácidos que funciona como un canal de cloruro regulado por ./ cíclico 1e an descripto más de *000 mutaciones en este gen, mucas de las cuales son muy poco frecuentes ero una mutación se destaca por s er la más frecuente 3stá presente en cerca del 5(4 de los cromosomas fibroquísticos en .rgentina y se denomina F50-, y consiste en una deleción de tres pares de bases #$%%' en el eón *0 que resulta en la p!rdida del aminoácido fenilalanina en la posición 50- de la proteína
Problema. 8na nia recién nacida presenta si(nos compatibles con la fibrosis +uística pero el dia(n#stico es controversial$ Se decide reali,ar una prueba de dia(n#stico molecular para determinar la presencia de la mutaci#n F50- La prueba consiste en amplificar mediante $& una región del gen que contiene el triplete $%% del eón *0 Los productos de amplificación se resuelven luego en un gel de poliacrilamida . continuación se muestra el resultado de la prueba molecular de los miembros de la familia #ver correspondencia num!rica'
C1, C2 : controles indi5iduos de genoti$o conocido;
A, E1$li0ue el $atrón de bandas $ara cada indi5iduo. 8Pude e1$licarse el diagnóstico cl7nico del $robando con esta $rueba9
Posteriormente se reali,# la b:s+ueda de la se(unda mutaci#n más frecuente llamada G13 +ue es una mutaci#n de sustituci#n con cambio de sentido +ue provoca un cambio de un aminoácido de (licina -G. por un ácido aspártico -3. en la posici#n 1 de la cadena polipeptídica$
2, Deterine si la siguiente estrategia e1$eriental es adecuada $ara detectar la utación G''"D. /usti-i0ue su res$uesta: 5
“e utili!an primers adecuados para amplificar una re"ión #ue conten"a a la !ona de la sustitución. $os productos de amplificación se resuel%en en un "el de poliacrilamida& Para reali,ar la b:s+ueda de la mutaci#n G13 se utili,# PCR alelo es$ec7-ica$ n este aborda&e e/perimental uno de los primers del par utili,ado sólo puede hibridar con la secuencia si está presente la mutaci#n buscada$ 3e modo tal +ue s#lo habrá amplificaci#n en ese caso y de allí viene el nombre de esta variante de la técnica de P!"$ l si(uiente es el resultado de la P!" alelo específica -los n:meros hacen referencia los individuos anali,ados.)
M: arcadores de $eso olecular C', C(: controles indi5iduos de genoti$o conocido;
C, 8Por 0ué es es$ecialente i$ortante en esta técnica usar controles9 E1$li0ué cu4l es el genoti$o de los controles utili
Se reali,aron pruebas con otras 10 mutaciones frecuentes +ue en con&unto permiten e/plicar el 6BC de los casos$ 4o se pudo encontrar una de estas mutaciones en la familia estudiada$ Por esta ra,#n se decidi# pasar a otra estrate(ia e/perimental) secuenciar el (en de secuencia mutada secuencia normal !DT" de los miembros de la familia y compararlo con la secuencia normal$ Se utili,# el método de los E dideoxi > automati,ado en donde cada dideo/i -T!G. está marcado con un fluor#foro diferente y la secuencia aparece como una sucesi#n de picos de fluorescencia de diferentes colores$ 3urante la secuenciaci#n del e/#n 5 en la posici#n 115 apareci# una mutaci#n +ue estaba presente en los individuos 2 y B pero no en los individuos 1 y 5$ continuaci#n se muestra el fra(mento de la secuenciaci#n +ue compara la secuencia normal y la mutada)
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E, 8Por 0ué (a6 un >doble $ico? en la $osición utada9 @, 8Puede concluirse 0ue la utación (allada e1$lica el diagnóstico cl7nico de -ibrosis 0u7stica9 Discuta
E!ercicio & Introducción. e/cepci#n de los (emelos idénticos el material (enético de cada individuo es :nico$ Se ha estimado +ue dos (enomas humanos esco(idos al a,ar difieren apro/imadamente en uno cada 00 nucle#tidos$ Si el (enoma humano contiene 5 10@ bases e/isten entonces F 10@ bases diferentes entre dos personas ii $ sa variabilidad interindividual puede ser estudiada a nivel fenotípico es decir a través del producto (énico o a nivel (enotípico mediante el análisis directo del 34$ 8no de los ob&etivos del estudio de la variabilidad humana de interés cada ve, mayor con el curso de los aos es su aplicaci#n en pruebas de paternidad y otras relaciones (enéticas y para la identificaci#n de seres humanos involucrados en hechos delictivos ya sea como víctimas o criminales$ !on esos ob&etivos la identificaci#n se reali,aba inicialmente con análisis morfol#(icos bio+uímicos e inmunol#(icos correspondientes éstos :ltimos a productos de (enes ubicados en una fracci#n del (enoma menor del 10C$ uedaba así un @0C de 34 no codificante cuyo potencial para el estudio de la variabilidad humana empe,# a ser descubierto a partir de los aos 60 cuando se reconoci# +ue estaba repleto de polimorfismos de secuencia +ue fueron puestos en evidencia con el uso de las en,imas de restricci#n y los fra(mentos de lon(itud variable +ue éstas (eneraban -"D%P. iii$ l (enoma humano nuclear e/tra(énico está constituido por secuencias :nicas y repetidas$ 8n sub(rupo de secuencias repetidas +ue representan apro/imadamente el F0C de ellas son las secuencias repetidas en tándem +ue constituyen un 34 altamente polim#rfico y +ue abrieron nuevas posibilidades inima(inables para la identificaci#n de marcadores con elevado poder de discriminaci#n iv l 34 repetitivo en tándem está constituido por secuencias +ue no incluyen (enes funcionales y +ue se disponen en arre(los de repeticiones una al lado de la otra y cada una de ellas contiene una secuencia central básica Se clasifican de acuerdo al tamao promedio del arre(lo en) 34 satélite 34 minisatélite y 34 microsatélite -Di(ura 1.$ 3e estos tipos de 34 el minisatélite y el microsatélite son los +ue mayor importancia tienen hoy día para resolver problemas en identificaci#n humana y pruebas de paternidad$ %os loci más variables descubiertos en el (enoma humano son las secuencias _
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Figura 1. Repeciones en tándem de número variable:
mini y microsatélites
minisatélites conocidas como re(iones hipervariables y posteriormente como repeticiones en tandem de n:mero variable -H4T".$ Su hipervariabilidad es debida a la diversidad en el n:mero de reiteraciones de determinadas secuencias de nucle#tidos las cuales para estos loci oscilan entre 7 y unos 50 nucle#tidos$ /isten (randes similitudes en las secuencias de la unidad central +ue se repite en un (ran n:mero de minisatélites$ sta similaridad le su(iri# a lec Ieffreys en 'n(laterra +ue si se empleaban sondas +ue contuvieran repeticiones de esa unidad central se podrían detectar fra(mentos de 34 de lon(itud variable a través del método de transferencia de Southern y producir para cada individuo un patr#n específico de bandas de 34 al cual denomin# J34 fin(erprintin(J o huella di(ital de 34 Metodolo"ía. ste proceso involucra la di(esti#n del 34 por una en,ima de restricci#n se(uida por la separaci#n de los fra(mentos mediante una electroforesis transferencia del 34 y la hibridaci#n con una sonda marcada +ue reconoce la unidad repetitiva -Southern propiamente dicho.$ %a identificaci#n de individuos mediante el análisis de 34 se basa en el alto nivel de polimorfismo e/istente en los loci anali,ados +ue (eneran un n:mero muy alto de (enotipos posibles a diferencia de los sistemas biol#(icos de identificaci#n clásicos proteicos tales como en,imas (rupos san(uíneos etc permitiendo distin(uir un individuo de otro prácticamente en cada caso Ktra venta&a del análisis del 34 con respecto a los marcadores proteícos es su ubicuidad ya +ue puede aplicarse en cual+uier célula nucleada y es muy resistente a la de(radaci#n !on las sondas multilocus o con una batería de a F sondas unilocus con heteroci(osis de alrededor del @0C el poder de e/clusi#n puede lle(ar a @@@@C$ 1v5
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Problema. %os casos 1 y 2 +ue se muestran más aba&o intentan determinar si un individuo +ue ale(a ser el padre de un nio es su padre biol#(ico$ tal fin se ha anali,ado los H4T" de un locus de minisatélite con la metodolo(ía descripta previamente$
A, E1$li0ue $or 0ué el $atrón de bandas de cada indi5iduo consta de dos bandas 2, Teniendo en cuenta los $atrones de bandas 8=ué conclusiones $uede sacar en cada uno de los casos acerca del la
E!ercicio '
6etermine para cada uno de los siguientes casos si aría alguna prueba molecular para reali7ar el diagnóstico 3n caso afirmativo, diga cuál es la prueba que considera más adecuada, y describa brevemente como discrimina un diagnóstico positivo de uno negativo *+
3nfermedad monog!nica con gen identificado La mutación más frecuente es una sustitución #. por %' en una posición puntual 2+ 3nfermedad monog!nica con patrón de erencia ligado al 8 recesivo y gen no descripto )+
3nfermedad autosómica dominante con gen identificado 9na de las mutaciones más frecuentes es una inserción de un par de bases en una posición particular
+
3nfermedad autosómica dominante con gen conocido 3l mecanismo mutacional implica epansión de tripletes
5+
3nfermedad multifactorial .lgunos de los genes involucrados se conocen
:+
3nfermedad cromosómica %ranslocación robertsoniana entre el cromosoma * y el 2*
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