Definisi, Prinsip, Kelebihan dan Kekurangan Cawan Gores dan Cawan Tuang TEKNIK ISOLASI BAKTERI
Dalam kegiatan mikrobiologi pembuatan isolat dilakukan dengan cara mengambil sampel mikrobiologi dari lingkungan lingkungan yang yang ingin diteliti. Dari sampel tersebut kemudian kemudian dibiakkan dengan menggunakan menggunakan media universal atau media selektif, tergantung tujuan yang ingin dicapai. Jika menggunakan menggunakan media universal akan diperoleh diperoleh biakan mikroba campuran. campuran. Untuk proses identifikasi maupun isolasi jenis tertentu saja, dilakukan proses pembuatan isolat tunggal dari isolat campuran tersebut. Isolat tunggal atau biakan murni merupakan biakan yang asalnya dari pembelahan satu sel tunggal. Ada beberapa metode untuk untuk memperoleh biakan biakan murni dari isolat campuran. campuran. Dua di antaranya yang sering digunakan digunakan adalah teknik cawan cawan gores dan teknik cawan tuang. tuang. Prinsip dari kedua teknik tersebut sama, yaitu mengencerkan biakan campuran hingga setiap individu spesies dapat dipisahkan, sehingga sehingga setiap koloni yang terbentuk merupakan hasil dari pembelahan satu sel. a. Metode Cawan Gores Kuadran (Strike Plate) Metode ini praktis, hemat hemat biaya dan waktu, hanya membutuhkan membutuhkan keterampilan. keterampilan. Hasil penggoresan diharapkan tampak seperti gambar di bawah ini.
Kesalahan-kesalahan Kesalahan-kesalahan yang umum dilakukan dalam metode ini antara lain : (1) tidak memanfaatkan permukaan medium untuk digores sehingga pengenceran kurang optimal, (2) penggunaan inokulum inokulum yang terlalau banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel waktu digores.
b. Metode Cawan Tuang (Pour Plate) Metode cawan tuang merupakan teknik lain yang dapat digunakan untuk mendapatkan koloni murni mikroorganisme. mikroorganisme. Kelemahan metode ini ini adalah membutuhkan membutuhkan waktu dan bahan yang lama dan banyak, akan tetapi tidak memerlukan keterampilan tinggi. Biakan campuran diencerkan dengan menggunakan medium agar yang telah dicairkan dan didinginkan. didinginkan. Pengenceran dilakukan dalam beberapa tahap hingga diperoleh koloni tunggal.
Isolasi Dengan Cara Pengenceran ( D i l u t i o n ) 1. Teknik Preparasi Suspensi
Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril. Tujuan dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Macam-macam preparsi bergantung kepada bentuk sampel :
a. Swab (ulas), dilakukan menggunakan cotton bud steril steril pada sampel yang memiliki permukaan luas dan pada umumnya sulit dipindahkan atau sesuatu pada benda tersebut. Contohnya adalah meja, batu, batang kayu dll. Caranya dengan mengusapkan cotton bud memutar memutar sehingga seluruh permukaan kapas dari cotton bud kontak dengan permukaan sampel. Swab akan lebih baik jika pepton water . cotton bud dicelupkan terlebih dahulu ke d alam larutan atraktan semisal pepton
b. Rinse (bilas) ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel pada permukaan substrat yang luas tapi relatif berukuran kecil, misalnya daun bunga dll. Rinse merupakan prosedur kerja dengan mencelupkan sampel ke dalam akuades dengan perbandingan 1 : 9 (w/v). Contohnya sampel daun diambil dan ditimbang 5 g kemudian dibilas dengan akuades 45 ml yang terdapat beaker glass glass. dalam beaker
c. Maseration (pengancuran), sampel yang berbentuk padat dapat ditumbuk di tumbuk dengan mortar dan pestle sehingga mikroba yang ada dipermukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan ke dalam air. Contoh sampelnya antar alain bakso, biji, buah dll. Perbandingan antar berat sampel dengan pengenceran pertama adalah 1 : 9 (w/v). Unutk sampel dari tanh tak perlu dimaserasi
1. Teknik Pengenceran Bertingkat
Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya. Cara Kerja :
a. Sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung pengenceran pertama (1/10 atau -1
10 ) secara aseptis (dari preparasi suspensi). Perbandingan berat sampel dengan volume tabung pertama adalah 1 : 9 dan ingat akuades yang digunakan jika memakai teknik rinse dan swab sudah -1
termasuk pengencer 10 . Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan mengocoknya (pengocokan yang benar dapat dilihat pada gambar disamping) -1
-2
b. Diambil 1 ml dari tabung 10 dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ke tabung 10 secara aseptis kemudian dikocok dengan membenturkan tabung ke telapak tangan sampai homogen. Pemindahan dilanjutkan hingga tabung pengenceran terakhir dengan cara yang sama, hal yang perlu diingat bahwa pipet ukur yang digunakan harus selalu diganti, artinya setiap tingkat pengenceran digunakan pipet ukur steril yang berbeda/baru. Prinsipnya bahwa pipet tidak perlu diganti jika memindahkan cairan dari sumber yang sama. 3. Teknik Penanaman a. Teknik penanaman dari suspensi
Teknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran terakhir. a.1. Spread Plate (agar tabur ulas) (agar Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di permukaan agar
diperoleh kultur murni. Adapun prosedur kerja yang dapat dilakukan adalah sebagai berikut :
· Ambil suspensi cairan senamyak 0,1 ml dengan pipet ukur kemudian teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat. · Batang L atau batang drugal diambil kemudian disemprot alkohol dan dibakar diatas bunsen beberapa saat, kemudian didinginkan dan ditunggu beber apa detik. · Kemudian disebarkan dengan menggosokannya pada permukaan agar supaya tetesan suspensi merata, penyebaran akan lebih efektif bila cawan ikut diputar. · Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas dapat menyebabkan sel-sel mikroorganisme dapat mati karena panas.
te (agar a.2. P o u r P l a te (agar tuang) o
Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45 C) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen. Adapun prosedur kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut : · Siapkan
cawan steril, tabung pengenceran yang akan ditanam dan media padat yang masih cair (>45oC) · Teteskan 1 ml secara aseptis.suspensi sel kedalam cawan kosong · Tuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian putar cawan untuk menghomogenkan menghomogenka n suspensi bakteri dan media, kemudian diinkubasi.
Alasan diteteskannya bakteri sebanyak 0,1 ml untuk spread plate dan 1 ml untuk pour plate karena spread
plate
ditujukan
untuk
menumbuhkan
dipermukaanya
saja,
sedangkan pour
plate membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih banyak
dari padaspread plate.
b. Teknik Penanaman dengan Goresan ( Streak )
Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru. b.1 Goresan Sinambung Cara kerja : · Sentuhkan
inokulum loop pada koloni dan gores secara kontinyu sampai setengah permukaan agar. o · Jangan pijarkan loop, lalu putar cawan 180 C lanjutkan goresan sampai habis. Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni tunggal, melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru.
b.2 Goresan T Cara kerja : · Bagi
cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker · Inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag · Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan streak zig-zag pada daerah 2 (streak ( streak pada pada gambar). Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna · Lakukan hal yang sama pada daerah 3
B.3 Goresan Kuadran ( Streak q u a d r a n t ) Cara kerja :
Hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda yaitu dibagi empat. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel mikroorganisma.Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal.
Cara Kerja Isolasi Bakteri dari Sampel Tanah : -1
· Tanah seberat 1 g dimasukan ke dalam tabung pengenceran 10 secara aseptis dan selanjutnya -8
dilakukan pengenceran bertingkat sampai 10
· Tiga pengenceran terakhir diambil 0,1 ml untuk ditanam secara spread plate pada medium NA, o
setelah selesai, diinkubasi pada 37 C selama 1x24 jam · Koloni akan tumbuh pada ketiga cawan tersebut kemudian dipilih koloni yang relatif terpisah dari koloni lain dan koloni yang mudah dikenali · Koloni yang terpilih kemudian ditumbuhkan atau dimurnikan ke NA baru dengan teknik streak kuadran · Inkubasi 1x24 jam.
Cara Kerja Isolasi Jamur dari Tanah : o Tanah dalam cawan petri dipanaskan dengan oven pada suhu 80 C selama 30 menit dengan cawan petri untuk membunuh sel vegetatiftetap bertahan Tanah yang telah dioven diambil 1 g kemudian dimasukan ke dalam tabung pengenceran bertingkat
Tiga pengenceran terakhir diambil untuk ditanama secara spread plateke media PDA yang ditambah streptomycin atau penicillin. Kemudian diinkubnasi pada suhu ruang 5-7 hari Koloni jamur yang tumbuh dimurnikan dan ditanam pada medium PDA baru,
Inkubasi pada suhu ruang 5-7 hari.
1.
Metode apa saja yang dapat digunakan untuk mengisolasi biakan murni mirkoorganisme ?
a)
Metode
Gores
Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi memerlukan ketrampilan-ketrampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum digoreskan di permukaan media agar nutrien dalam cawaan petri dengan jarum pindah (lup inokulasi). Di antara garis-garis goresan akan terdapat selsel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh menjadi. Cara penggarisan dilakukan pada medium pembiakan padat bentuk lempeng. Bila dilakukan dengan baik teknik inilah yang paling praktis. Dalam pengerjaannya terkadang berbeda pada masing-masing laboratorium tapi tujuannya sama yaitu untuk membuat goresan sebanyak mungkin pada lempeng medium pembiakan. c)
Metode
tuang
Isolasi menggunakan media cair dengan cara pengenceran. Dasar melakukan pengenceran adalah penurunan jumlah mikroorganisme sehingga pada suatu saat hanya ditemukan satu sel di dalam tabung.
Persyaratan utama bagi isolasi dan kultivasi fage adalah harus adanya kondisi optimum untuk pertumbuhan organisme inangnya. Sumber bakteriofage yang paling baik dan paling utama adalah habitat inang. Sebagai contoh fage koli yang di jumpai di dalam pencernaan dapat diisolasi dari limbah atau pupuk kandang. Hal ini dilakukan dengan sentifugasi atau filtrasi bahan sumbrnya dan penambahan kloroform untuk membunuh
sel-sel
bakterinya
(Adams,
2000).
Ada beberapa metode yang digunakan untuk mengisolasi bakteri, fungi, dan khamir dengan
menggunakan
metode
gores,
metode
tuang,
metode
sebar,
metode
pengenceran serta micromanipulator. Dua diantaranya yang paling sering digunakan adalah tekhnik cawan tuang dan cawan gores. Kedua metode ini didasarkan pada prinsip yang sama yaitu mengencerkan organisme sedemikian rupa sehingga individu spesies
individu
spesies
dapat
dipisahkan
dari
lainnya.
Mikroorganisme dibiakkan di laboratorium pada medium yang terdiri dari bahan nutrient. Biasanya pemilihan medium yang dipakai bergantung kepada banyak faktor seperti seperti apa jenis mikroorganisme yang akan ditumbuhkan (Pelezar, 1986). Perbenihan untuk pertumbuhan bakteri agar dapat tetap dipertahankan harus mengandung semua zat makanan yang diperlukan oleh organisme tersebut. Faktor lain seperti PH, suhu, dan pendinginan harus dikendalikan dengan baik (Buckle, 1987)
