Nama/NIM: Rajini / K4307009
Teknologi DNA Rekombinan Teknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, atau dengan istilah yang lebih populer rekayasa genetika, ini melibatkan upaya perbanyakan gen tertentu di dalam suatu sel yang bukan sel alaminya alaminya sehingga sering pula dikatakan dikatakan sebagai kloning kloning gen. Salah satu definisi definisi teknologi DNA rekombinan yang paling representatif adalah pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang. Teknolo Teknologi gi DNA rekombi rekombinan nan merupa merupakan kan tulang tulang punggung punggung dan pemicu pemicu lahirn lahirnya ya biotek bioteknol nologi ogi molekuler. DNA rekombinan dikonstruksi dengan menggabungkan materi genetik dari dua atau lebih sumber yang berbeda atau melakukan perubahan secara terarah pada suatu materi genetik tertentu. Beberapa contoh rekombinasi dari dua sumber atau lebih antara lain: •
Rekom Rekombi binas nasii saat saat pind pindah ah sila silang ng dalam dalam pembe pembent ntuka ukan n gamet gamet pada pada pros proses es
meiosis. •
Saat sperma dan ovum melebur pada proses fertilisasi.
•
Saat bakteri melakukan transaksi bahan genetic melalui konjugasi transformasi
atau transduksi. Dari contoh-contoh rekombinasi tersebut dapat diketahui bahwa rekombinasi merupakan salah satu cara untuk meningkatkan keanekaragaman hayati.
Teknolo Teknologi gi DNA rekombi rekombinan nan mempuny mempunyai ai dua segi segi manfaa manfaat. t. Pertama , dengan dengan mengis mengisola olasi si dan mempela mempelajar jarii masing masing-mas -masing ing gen akan diperol diperoleh eh pengeta pengetahuan huan tentan tentang g fungsi fungsi dan mekani mekanisme sme kontrolnya. Kedua, teknologi ini memungkinkan diperolehnya produk gen tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional.
Teknologi DNA Rekombinan memiliki beberapa tahapan untuk mendapatkan produk-produk yang diinginkan. Tahapan-tahapan tersebut yaitu mengisolasi DNA, memotong DNA, menyambung DNA, memasukkan DNA ke sel hidup atau sel inang, transformasi sel inang menggunakan molekul DNA rekombinan, reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA rekombinan. 1. Isolasi DNA
Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang dengan cara sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. Jika remukan sel masih tercampur dengan RNA maka perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl. 2. Pemotongan molekul DNA
Pemotongan molekul DNA, baik genomik maupun plasmid dilakukan dengan enzim restriksi. Ada dua macam enzim restriksi yaieu enzim restriksi tipe I dan enzim restriksi tipe II. Enzim restriksi tipe II mempunyai sifat-sifat umum yang penting sebagai berikut: •
mengenali urutan tertentu sepanjang empat hingga tujuh pasang basa di dalam molekul DNA
•
memotong kedua untai molekul DNA di tempat tertentu pada atau di dekat tempat pengenalannya
•
menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran dan urutan basa.
Berdasarkan tempat hasil pemotongan, fragmen-fragmen DNA memiliki dua macam ujung yaitu: •
Ujung lengket ( sticky end ) atau ujung kohesif, terjadi jika tempat pemotongan pada kedua untai DNA terpisah sejauh beberapa pasang basa, sehingga menghasilkan fragmen-fragmen dengan ujung 5’ yang runcing karena masing-masing untai tunggalnya menjadi tidak sama panjang. Dua fragmen DNA dengan ujung yang runcing akan mudah disambungkan satu sama lain.
•
Ujung tumpul (blunt end ), terjadi jika tempat pemotongan DNA pada posisi yang sama. Kedua fragmen hasil pemotongannya akan mempunyai ujung 5’ yang tumpul karena masing-masing untai tunggalnya sama panjangnya. Penyatuan dua fragmen DNA ujung tumpul sulit dilakukan sehingga memerlukan perlakuan tambahan, misalnya pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase.
3. Penyambungan (ligasi) molekul DNA
Ada tiga cara yang dapat digunakan untuk meligasi fragmen-fragmen DNA secara in vitro. Pertama, ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri. Kedua, ligasi menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag T4 atau lazim disebut sebagai enzim T4 ligase. Ketiga yaitu pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’. Suhu optimum bagi aktivitas DNA ligase sebenarnya 37ºC. Akan tetapi, pada suhu ini ikatan hidrogen yang secara alami terbentuk di antara ujung-ujung lengket akan menjadi tidak stabil dan kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat ikatan tersebut. Oleh karena itu, ligasi biasanya dilakukan pada suhu antara 4 dan 15ºC dengan waktu inkubasi (reaksi) yang diperpanjang (sering kali hingga semalam). 4. Transformasi Sel Inang
Setelah tahap ligasi, dilakukan analisis terhadap hasil pemotongan DNA genomik dan DNA vektor serta analisis hasil ligasi molekul-molekul DNA tersebut. menggunakan teknik elektroforesis. Jika hasil elektroforesis menunjukkan bahwa fragmen-fragmen DNA genomik telah terligasi dengan baik pada DNA vektor sehingga terbentuk molekul DNA rekombinan, campuran reaksi ligasi dimasukkan ke dalam sel inang agar dapat diperbanyak dengan cepat. Tahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke dalam sel inang dinamakan transformasi karena sel inang diharapkan akan mengalami perubahan sifat tertentu setelah dimasuki molekul DNA rekombinan. 5. Seleksi Transforman dan Seleksi Rekombinan
Oleh karena DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya DNA rekombinan, maka kita harus melakukan seleksi untuk memilih sel inang transforman yang membawa DNA rekombinan. Selanjutnya, di antara sel-sel transforman yang membawa DNA rekombinan masih harus dilakukan seleksi untuk mendapatkan sel yang DNA rekombinannya membawa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan. Cara seleksi sel transforman akan diuraikan lebih rinci pada penjelasan tentang plasmid. Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah transformasi dilakukan, yaitu: (1) sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti transformasi gagal, (2) sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi gagal, dan (3) sel inang dimasuki vektor rekombinan dengan/tanpa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan. Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase chain reaction (PCR). Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan melalui cara yang dinamakan hibridisasi koloni.
Referensi: Sajidan. 2008. Modul Pendidikan dan Pelatihan Profesi Guru (PLPG) Biologi . Surakarta: Panitia Sertifikasi Guru Rayon 13 http://biologikubiologimu.blogspot.com/2008/09/teknologi-dna-rekombinan.html http://biomol.wordpress.com/bahan-ajar/dasar-tek-dna-rek/ http://pustaka.ut.ac.id/puslata/online.php?menu=bmpshort_detail2&ID=209
