ANÁLISIS DE VITAMINAS EN ALIMENTOS
ANÁLISIS DE VITAMINAS EN ALIMENTOS 1.
Introducción.
2.
Toma de muestra para el análisis de vitaminas
3.
Procedimientos de extracción de las vitaminas
4.
Métodos de cuantificación de vitaminas
5.
Ejemplos
1
1. Introducción.
Compuestos de (relativamente) bajo peso molecular que el ser humano requiere en pequeñas cantidades para el funcionamiento normal del metabolismo
VITAMINAS
-Papel esencial y específico en el metabolismo -No pueden ser sintetizadas por el organismo. -Su deficiencia provoca enfermedades
CLASIFICACIÓN: - Liposolubles - Hidrosolubles INTERÉS DE SU ANÁLISIS: - Caracterización de la composición de los alimentos -Valoración del poder nutritivo del alimento. -Alimentos enriquecidos - Estimación de pérdidas nutricionales en un p g de un p producto a lo largo proceso industrial - Control del fraudes, comprobación etiquetas..
CONTENIDO EN LOS ALIMENTOS: - Frutas ↑↑: Varía según el zumo
2
CLASIFICACIÓN DE LAS VITAMINAS en función de su comportamiento físico: VITAMINAS LIPOSOLUBLES (A,D,E,K) Se consumen junto con alimentos que contienen grasa. Se disuelven en compuestos apolares (grasas, aceites, solventes) Se almacenan en el hígado y en los tejidos grasos (no es necesario tomarlas todos los días). Tóxicas si se consumen en exceso. VITAMINAS HIDROSOLUBLES (B1,B2,B3,B5,B6,B12,Biotina,C,Fólico) Se disuelven en agua (pueden pasar al agua del lavado o de la cocción de los alimentos) Son coenzimas o precursores de coenzimas necesarias para reacciones químicas del metabolismo. No se almacenan en el organismo (necesario el aporte regular) No son tóxicas porque se excretan por la orina.
VITAMINAS LIPOSOLUBLES
(retinol)
(tocoferol)
3
VITAMINAS HIDROSOLUBLES
VITAMINAS HIDROSOLUBLES
de proteínas, hidratos de carbono y grasas
4
VITAMINAS HIDROSOLUBLES
(B9)
CARACTERIZACIÓN ALIMENTOS TABLAS DE COMPOSICIÓN
USDA (Depto Agricultura USA) http://www.nal.usda.gov/fnic/foodcomp/search/ Ej: j Composicicón p Manzana http://ndb.nal.usda.gov/ndb/foods/show/2141?fg=Fruits+and+Fruit +Juices&man=&lfacet=&format=&count=&max=25&offset=&sort=&qlo okup=
5
ETIQUETAS. VALORACIÓN DEL PODER NUTRITIVO
B3
2. Toma de muestra
6
TOMA DE MUESTRA DEPENDENCIA DEL TIPO DE ENSAYO PUNTOS DE VISTA TECNOLÓGICO Y LEGAL: -Plan de Muestreo Normalizado -Muestra representativa -Precauciones: labilidad
PROCEDIMIENTO - Separación de la parte no comestible - Trituración de muestra (picadora mecánica...) ¡¡¡ T !!! - Toma de sub-muestra (~500 g) - Homogeneización de la sub-muestra - Almacenamiento en frascos de plástico (-20ºC) (Vit. C no se almacena)
3. Procedimientos de extracción
7
EXTRACCIÓN: Ó
específica para cada vitamina
► VITAMINAS LIPOSOLUBLES ► VITAMINAS HIDROSOLUBLES VITAMINA C RESTO DE VITAMINAS HIDROSOLUBLES
ANÁLISIS CUANTIFICACIÓN
EXTRACCIÓN DE VITAMINAS LIPOSOLUBLES Procedimiento general
▼▼
Adecuado para todo tipo de alimentos MODIFICACIONES
Saponificación con NaOH (elim. de lípidos) Embudo de decantación
Rotavapor
MÉTODOS QUÍMICOS Neutralización con HCl Extracción del insaponificable con éter de petróleo ó n-hexano Fase orgánica Concentración Cuantificación
Fase acuosa
Adición de antioxidantes para inhibir la oxidación Vit. E y D Uso de KOH etanólica para saponificar Vit. A Empleo de éter etílico en lugar de éter de petróleo
8
EXTRACCIÓN DE VITAMINAS HIDROSOLUBLES Procedimiento general (excepto vit.C)
▼▼
Adecuado para todo tipo de alimentos Romper estructuras celulares: Tratamiento con HCl (30 min/100ºC)
MÉTODOS QUÍMICOS Ajustar pH a 4.5 Hidrólisis con enzimas (amilasa, takadiastasa) para eliminar macromoléculas y liberar la vitamina de sus formas fosforiladas (12 h/37 ºC) C) Filtrar y diluir con H2O Cuantificación
EXTRACCIÓN DEL ÁCIDO ASCÓRBICO
(VIT HIDROSOLUBLE)
Muestra de alimento ↓ Molienda (10 – 20g) ↓ Tamizado (Malla 40 mesh) ↓ Extracción de la vitamina C con ácido metafosfórico (4-6%): agitación a 25°C ↓ Centrifugación (10 min/4000 r.p.m.) ↓ Dilución del sobrenadante con ácido perclórico (0.005M) ↓ Filtración ↓ Determinación por HPLC
9
4. Métodos analíticos de cuantificación
MÉTODOS ANALÍTICOS - BIOLÓGICOS: BIOENSAYOS miden la cantidad de nutrientes aprovechables por un animal (métodos de referencia p para la determinación de vit. B12 Y D) - MICROBIOLÓGICOS se sigue el crecimiento de microorganismos como una función de la concentración de ciertas vitaminas (Sólo hidrosolubles) - FISICOQUÍMICOS miden la cantidad total presente en una muestra: CROMATOGRAFÍA, ESPECTROFOTOMETRÍA FLUOROMÉTRIA, ESPECTROFOTOMETRÍA, FLUOROMÉTRIA METODOS ENZIMÁTICOS…
10
MÉTODOS BIOLÓGICOS O BIOENSAYOS -Requieren mucho tiempo -Su uso se limita a casos en los que no hay métodos alternativos de análisis o cuando se requiere información sobre el valor biológico o la biodisponibilidad de la vitamina. -Tienen la ventaja de que no se requiere la etapa de extracción
1. Selección de diferentes grupos de animales 1 raza 2. Aplicación de sustancias que queremos estudiar (a unos animales sí y a otros no) 3. Aplicación de dosis con contenido creciente 4. Observación del efecto final Glóbulos rojos Músculos 5. Curva estándar de respuesta
MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS (vitaminas hidrosolubles) -Son métodos muy sensibles y específicos para cada vitamina. -Requieren tiempo de incubación y seguir estrictamente el protocolo analítico. Principio: el crecimiento de un determinado microorganismo es proporcional a su requerimiento de una vitamina específica→ Comparar el crecimiento del microorganismo en la muestra y en cantidades conocidas de vitamina. El crecimiento del microorganismo se mide en términos de turbidez, producción de ácido, gravimetría…
Piridoxal
piridoxamina
B6
poridoxina
B12
El método se basa en medir la turbidez producida por el crecimiento de microorganismos (saccharomyces carlsbergensis, uvarum…) cuando se inoculan en un medio que contiene vitaminas. La turbidez del medio producida por los microorganismos es proporcional a la concentración de vitamina B6 o B12 presente.
11
MÉTODOS FISICOQUÍMICOS -Son más simples, exactos y precisos (sobre todo los métodos cromatográficos). - Aplicables para la cuantificación de la mayoría de vitaminas y gran variedad de matrices biológicas (pequeñas adaptaciones) - Se requiere etapa previa de extracción
- Clásicos: volumetría - Instrumentales: Espectrofotometría Fluorimetría Cromatografía - GC - HPLC Polarigrafía
12
MÉTODOS FISICOQUÍMICOS Vitamina liposoluble
Método más utilizado
A (retinol) y carotenoides
Espectrofotometría (450 nm) HPLC
D2, D3 y sus metabolitos
HPLC GC
E(tocoferol) ( f )
Espectrofotometría p f HPLC GC
K
Espectrofotometría (585 nm)
MÉTODOS FISICOQUÍMICOS Vitamina hidrosoluble
Método más utilizado
B1
Espectrofotometría Fluorimetría HPLC HPLC GC Fluorimetría HPLC HPLC Espectrofotometría(325 nm) HPLC HPLC Volumetría Espectrofotometría
Riboflavina metabolitos E(tocoferol) PP B6 B12 C
13
ESPECTROFOTOMETRÍA DATOS ESPECTRALES DE ABSORCIÓN EN EL UV-VISIBLE A - GRÁFICAS DE ABSORBANCIA log ε
vs λ
- LEY DE LAMBERT-BEER: * LAMBERT: A α c
λ
A = log Po/P = ε c l
* BEER: A α l
Procedimiento 1. Establecer condiciones de trabajo 2. Preparar curva de calibración que relacione A con C: 3. Medir muestra e interpolar.
A C
14
FLUORIMETRÍA
Método luminiscente molecular: Las moléculas de analito se excitan para dar una especie cuyo espectro de emisión va a dar información para realizar un análisis cualitativo y cuantitativo. Ventajas: * Sensibilidad (límites de detección de partes por billón) * Selectividad * Gran intervalo lineal de concentraciones Desventajas: * Es limitado el número de sistemas que presentan luminiscencia
RELACIÓN ENTRE INTENSIDAD DE FLUORESCENCIA Y CONCENTRACIÓN
15
POLAROGRAFÍA Permite determinar la cantidad y el tipo de sustancias electroquímicamente activas durante una reacción de oxidación o reducción en función del comportamiento tensión-corriente de un electrodo polarizable.
16
I( A) I(μA)
patrones
Altura del pico
Muestra patrones
E(V)
CROMATOGRAFÍA
17
En Cromatografía: - Componentes que se desean separar deben ser solubles en la fase móvil - Deben ser capaces de interaccionar con la fase estacionaria: - disolviéndose en ella - adsorbiéndose - reaccionando de forma química CONSECUENCIA
durante la separación los componentes se distribuyen en ambas fases CLASIFICACIÓN
18
-sólido
19
CROMATOGRAMA
EJEMPLOS DE LA DETERMINACIÓN DE ALGUNAS VITAMINAS
20
DETERMINACIÓN ANALÍTICA DE LA VITAMINA A (Liposoluble)
PRECURSOR
FORMAS ACTIVAS
DETERMINACIÓN ANALÍTICA DE LA VITAMINA A (Liposoluble)
Cristales de retinol vistos con Luz polarizada
HPLC-UV Columna: C8, 250x4mm, 5μm Fase móvil: metanol/agua (92:8) UV absorbancia a 330 nm UV, HPLC-FD Columna: Sílice, 250x4mm, 7μm Fase móvil: hexano/éter Fluorescencia, exc:330 nm em: 470 nm
Trans-retinol
21
DETERMINACIÓN ANALÍTICA DE LA VITAMINA E (Liposoluble)
HPLC-UV Columna: C8, 250x4mm, 5μm Fase móvil: metanol/agua (92:8) UV, absorbancia a 288 nm HPLC-FD Columna: Sílice, 250x4mm, 7μm Fase móvil: hexano/isopropanol p p (99:1) ( ) Fluorescencia, exc:290 nm em: 330 nm
DETERMINACIÓN ANALÍTICA DE LA VITAMINA B1 (Hidrosoluble)
HPLC-FD Columna: Sílice, 250x4mm, 7mm Fase móvil: MeOH,H MeOH H2O,acético O acético Fluorescencia, ec: 360 nm em: 435
Tiamina
Tiamina
22
DETERMINACIÓN ANALÍTICA DE LA VITAMINA C (Hidrosoluble)
Degradación oxidativa del AA: AA: ácido ascórbico AH-: monoanión ascorbato ADA: ácido dehidroascórbico DCG: ácido 2,3-dicetogulónico
Volumetría redox Oxidante: O id 2,6-dicloroindofenol 2 6 di l i d f l Reductor: Vitamina C Punto final: exceso de reactivo valorante (rosa púrpura a pH<4)
DETERMINACIÓN ANALÍTICA DE LA VITAMINA C (Hidrosoluble) Indicador
Indicador
(2,6 diclorofenolindofenol)
(2,6 diclorofenolindofenol)
Oxidación de la vit C
Disolución patrón de Ascórbico (250 ppm)
Vindicador=5.5 mL ⇒ ¿1mL?
Oxidación de la vit C
Zumo con contenido en Ascórbico desconocido
Vindicador= 2 mL
23
